本發(fā)明屬于生物醫(yī)學組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種復合神經(jīng)導管及其制備方法。

背景技術(shù)：

神經(jīng)損傷之后，周圍神經(jīng)系統(tǒng)在一定程度上能夠?qū)崿F(xiàn)自我修復，雪旺氏細胞反應性增殖形成細胞索，同時軸突枝芽生長，穿過損傷區(qū)后延伸入細胞索，在細胞索內(nèi)軸突枝芽不斷向靶細胞生長，最終與靶細胞形成突觸聯(lián)系。但若損傷距離過長，或由于周圍結(jié)締組織的阻礙作用，神經(jīng)斷端無法直接吻合，在神經(jīng)損傷處形成增生的神經(jīng)瘤樣組織，則會影響肢體功能。

中樞神經(jīng)損傷則會造成更加嚴重的后果，如脊髓損傷往往導致?lián)p傷節(jié)段以下肢體嚴重的功能障礙，給患者本人帶來身體和心理的嚴重傷害，還會對整個社會造成巨大的經(jīng)濟負擔。目前國際上尚無有效的治療脊髓損傷的方法，這是因為，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，存在著許多抑制再生的因素。首先由于膠質(zhì)細胞包裹損傷區(qū)，形成再生軸突很難越過的膠質(zhì)瘢痕；其次，損傷細胞周圍存在著許多再生抑制因子(如硫酸軟骨素蛋白多糖)；并且受損神經(jīng)元自身再生能力有限，因此中樞神經(jīng)被認為是無法完成自我修復的。

再生軸突生長足夠長的距離以穿越損傷區(qū)，與靶細胞重新形成功能性連接是神經(jīng)再生的關(guān)鍵條件。目前，通過組織工程支架，橋接神經(jīng)缺損兩側(cè)是一種被廣泛接受的治療神經(jīng)損傷的方法。通常使用的組織工程支架是神經(jīng)導管。如中國專利cn1986006a，公布了一種生物型神經(jīng)導管，該導管由經(jīng)過非醛類固定劑交聯(lián)固定和活潑試劑及強氫鍵試劑去除抗原處理的生物膜材料，通過醫(yī)用膠粘合而成。如中國專利cn101138656a，公布了一種殼聚糖復合神經(jīng)導管，通過殼聚糖-明膠酸性復合溶液，在模具上層層固化制得。上述專利只能進行神經(jīng)缺損斷端的橋接，不能提供神經(jīng)細胞再生和生長所需的神經(jīng)營養(yǎng)因子等生化線索，并且其表面形貌不利于神經(jīng)細胞的黏附和生長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種復合神經(jīng)導管及其制備方法，該復合神經(jīng)導管不但可以進行神經(jīng)缺損斷端的橋接，還能提供神經(jīng)細胞再生和生長所需的神經(jīng)營養(yǎng)因子。

本發(fā)明提供了一種復合神經(jīng)導管的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備外層導管；

(2)制備內(nèi)層納米纖維膜；

(3)在引發(fā)劑的作用下，步驟(2)制備得到的內(nèi)層納米纖維膜與多肽生長因子 發(fā)生反應，得到加載多肽生長因子的內(nèi)層納米纖維膜；

(4)將步驟(3)制得的加載多肽生長因子內(nèi)層納米纖維膜套裝在步驟(1)中所述外層導管中，即可得到所述復合神經(jīng)導管。

上述的制備方法，步驟(1)中，所述外層導管的制備方法如下：在用于導管成型的模具上蘸取用于制備外層導管的材料的溶液，并使所述模具自轉(zhuǎn)至溶液干燥成膜；重復上述步驟，直至膜厚達0.05～0.5mm(如0.2mm)，經(jīng)脫模后即可得到所述外層導管。

上述外層導管的制備方法中，所述模具的規(guī)格如下：長度為2～10cm，直徑為2～10mm(如4mm)。所述自轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速可為100～3000rpm，具體可為700rpm。所述脫模的步驟如下：將所述模具在堿性溶液(如氫氧化鈉溶液)中浸泡即可。所述堿性溶液的質(zhì)量濃度可為0.5％～5％，具體可為2％。所述浸泡的時間可為15分鐘～2小時，具體可為30分鐘。

上述的制備方法，步驟(2)中，所述內(nèi)層納米纖維膜的制備方法如下：將用于制備內(nèi)層納米纖維膜的材料的溶液作為紡絲液進行靜電紡絲，然后采用戊二醛進行交聯(lián)，即可得到所述內(nèi)層納米纖維膜。

所述靜電紡絲的條件可如下：紡絲電壓為10～30kv(如25kv)；紡絲接收距離為10～20cm(如15cm)；紡絲液的流速為0.2～1.0ml/h(0.5ml/h)；紡絲針頭內(nèi)徑為0.2～0.5mm(如0.3mm)。

所述戊二醛可以質(zhì)量濃度為10％～50％(如25％)的戊二醛水溶液的蒸汽的形態(tài)存在；所述蒸汽具體可在25℃～80℃(如37℃)水浴條件下加熱所述戊二醛水溶液得到。所述交聯(lián)的時間可為1～4h，具體可為3h。

上述的制備方法中，步驟(1)和步驟(2)中，用于制備外層導管和用于制備內(nèi)層納米纖維膜的材料為可降解的生物材料；所述可降解的生物材料可為殼聚糖、甲殼素、絲素蛋白、膠原蛋白、聚乳酸羥基乙酸、明膠、藻酸鹽、聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚乙內(nèi)酯和聚對苯二甲酸乙二醇酯中的至少一種。優(yōu)選地，所述可降解的生物材料可為質(zhì)量比為1：(1～10)的殼聚糖和聚乙烯醇，不僅在體內(nèi)可降解，還具有良好的機械性能。更優(yōu)選地，所述可降解的生物材料可為質(zhì)量比為1：2的殼聚糖和聚乙烯醇。

用于制備外層導管的材料的溶液以及用于制備內(nèi)層納米纖維膜的材料的溶液為可為殼聚糖溶液和聚乙烯醇溶液的混合液；所述殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度可為5％～10％(如6％)，溶劑可為酸，如醋酸；所述聚乙烯醇的質(zhì)量濃度為10％～15％(如12％)，溶劑可為酸，如醋酸。

上述的制備方法，步驟(3)中，所述反應為交聯(lián)反應，步驟(3)的操作可如下：將步驟(2)制備得到的內(nèi)層納米纖維膜浸泡在含有引發(fā)劑的多肽生長因子溶液中，得 到加載多肽生長因子的內(nèi)層納米纖維膜；優(yōu)選地，

所述多肽生長因子溶液的濃度可為10～300ng/ml(如3ng/ml)，溶劑可為ph為7.0～7.8(如ph7.4)的緩沖溶液(如磷酸鹽緩沖溶液)、水或者生理鹽水；和/或，

所述多肽生長因子包括但不限于：神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)素-3、神經(jīng)營養(yǎng)素-4、神經(jīng)營養(yǎng)素-5、神經(jīng)營養(yǎng)素-6、神經(jīng)營養(yǎng)素-7、膠質(zhì)細胞株源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子-1、運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子-2或硫酸軟骨素抗體；和/或，

所述多肽生長因子溶液中，所述引發(fā)劑的質(zhì)量濃度可為0.1％～1％(如0.1％)，所述引發(fā)劑可為京尼平或者質(zhì)量比為1：(0.1～1)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(簡稱edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(簡稱nhs)；和/或，

所述浸泡的溫度可為1℃～6℃(如4℃)，時間可為4h～48h(如24h)；和/或，

所述加載之后還包括采用所述多肽生長因子的溶劑對內(nèi)層納米纖維膜進行清洗的步驟。

上述的制備方法，步驟(4)中，所述加載多肽生長因子內(nèi)層納米纖維膜與所述外層導管的質(zhì)量比可為1：(10～1000)，具體可為1：500。

所述復合神經(jīng)導管的結(jié)構(gòu)如下：它包括外層導管和加載多肽生長因子的內(nèi)層納米纖維膜，所述內(nèi)層納米纖維膜套裝在所述外層導管的內(nèi)部；所述外層導管和所述內(nèi)層納米纖維膜由可降解的生物材料制成。所述外層導管可為神經(jīng)細胞的生長創(chuàng)建穩(wěn)定的微環(huán)境，所述內(nèi)層納米纖維膜可為神經(jīng)軸突的生長提供可附著的物理線索，所述多肽生長因子可為神經(jīng)細胞的發(fā)育及再生提供生化線索。

所述外層導管和所述內(nèi)層納米纖維膜的長度可為0.1mm～100mm(如50mm)。所述外層導管的壁厚可為0.05～0.5mm(如0.2mm)，直徑可為0.5～10mm(如4mm)。所述內(nèi)層納米纖維膜的厚度可為0.005～0.02mm(如0.01mm)。

由上述的制備方法制備得到的復合神經(jīng)導管，也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

上述的復合神經(jīng)導管在制備重建或修復組織或器官缺損的產(chǎn)品中的應用，也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。所述組織包括但不限于神經(jīng)組織。

本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明提供了一種復合神經(jīng)導管的制備方法，該導管包含外層導管及加載多肽生長因子的內(nèi)層納米纖維膜。外層導管具有優(yōu)異的力學性能，能為內(nèi)部神經(jīng)細胞的生長增殖提供穩(wěn)定的微環(huán)境。內(nèi)層納米纖維膜為神經(jīng)細胞的附著通過了物理支撐，內(nèi)層納米纖維膜上加載的多肽生長因子能夠模擬神經(jīng)細胞的發(fā)育生長環(huán)境，為神經(jīng)突起的生長提供生化線索。

(2)內(nèi)層納米纖維膜的纖維尺寸接近天然細胞外基質(zhì)尺度范圍，能夠模仿天然 細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，有利于神經(jīng)細胞的附著和神經(jīng)突起的生長。

(3)通過設(shè)計的導管成型設(shè)備制備的外層導管壁厚均勻，力學性能強，并且該方法簡單易行。

(4)通過靜電紡絲技術(shù)制備內(nèi)層納米纖維膜高效靈活，便宜簡便。

(5)本發(fā)明公開的復合神經(jīng)導管制備方法簡單，且具有多種直徑和長度，能夠適用于不同的脊髓損傷和外周神經(jīng)損傷。

附圖說明

圖1為導管成型設(shè)備示意圖，其中，a表示電機控制器，b表示無刷電機，c表示圓柱不銹鋼模具，d表示支架。

圖2為殼聚糖-聚乙烯醇靜電紡絲納米纖維膜的掃描電鏡照片。

圖3為外層殼聚糖-聚乙烯醇導管力學曲線圖。其中外層導管的參數(shù)為：直徑4mm，壁厚0.2mm。

圖4為采用本發(fā)明復合神經(jīng)導管培養(yǎng)雞胚背根神經(jīng)節(jié)的掃描電鏡照片。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。所用神經(jīng)生長因子的通用名為注射用鼠神經(jīng)生長因子(mousenervegrowthfactforinjection)，商品名為恩經(jīng)復，生產(chǎn)廠家為廈門北大之路生物工程有限公司，購自國藥集團化學試劑有限公司，規(guī)格為18ug(≥9000au)/支。

下述實施例中所用的設(shè)備等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。所用的導管成型設(shè)備的結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括電機控制器(a)、無刷電機(b)、圓柱不銹鋼模具(c)和支架(d)。使用時，使用不銹鋼模具蘸取生物材料溶液，將不銹鋼模具固定在無刷電機上，通過電機控制器控制模具轉(zhuǎn)速，當溶液干燥后，重復蘸取，旋轉(zhuǎn)模具，直至外層導管達到壁厚要求。

實施例1、制備復合神經(jīng)導管

按照如下步驟制備復合神經(jīng)導管：

(1)制備外層導管：

1)室溫條件下，將一定量的殼聚糖溶于2wt％的醋酸中，配制質(zhì)量分數(shù)為6wt％的溶液。將一定量的聚乙烯醇溶于相同濃度的醋酸中，95℃水浴加熱1h，配制質(zhì)量分數(shù)為12wt％的溶液。將上述兩種溶液以不同比例混合，攪拌均勻，使用前離心去除氣泡?；旌弦褐袣ぞ厶桥c聚乙烯醇的質(zhì)量比為1:2。

2)使用導管成型設(shè)備，在長度為5cm、直徑為4mm的模具上蘸取殼聚糖-聚乙烯醇混合液，將不銹鋼模具固定在無刷電機上，通過電機控制器控制模具以700rpm的 速度水平自轉(zhuǎn)。溶液干燥后，重復在溶液中蘸取，干燥，每次干燥后測導管的外層，直至外層導管的壁厚達0.2mm。將模具在2wt％的氫氧化鈉溶液中浸泡30分鐘即可脫模，得到外層導管。掃描電鏡照片如圖2所示。

(2)制備內(nèi)層納米纖維膜：

1)室溫條件下，將一定量的殼聚糖溶于2wt％的醋酸中，配制質(zhì)量分數(shù)為6wt％的溶液。將一定量的聚乙烯醇溶于相同濃度的醋酸中，95℃水浴加熱1h，配制質(zhì)量分數(shù)為12％的溶液。將上述兩種溶液以不同比例混合，攪拌均勻，使用前離心去除氣泡?；旌弦褐袣ぞ厶桥c聚乙烯醇的質(zhì)量比為1:2。

2)將混合液裝入5ml規(guī)格的注射器中，注射器配有內(nèi)徑為0.3mm的毛細針頭，在正負極靜電壓差25kv，接收距離15cm，推注速度為0.5ml/h的條件下，靜電紡絲6h，制備殼聚糖-聚乙烯醇納米纖維膜(膜厚為0.01mm)。

3)37℃水浴加熱25wt％的戊二醛溶液，將納米纖維膜置于銅網(wǎng)上，銅網(wǎng)放置在戊二醛溶液的培養(yǎng)皿上。利用戊二醛蒸汽對納米纖維膜進行交聯(lián)，交聯(lián)時間為3h。

(3)在步驟(2)中制得的內(nèi)層納米纖維膜上加載多肽生長因子：

將神經(jīng)生長因子溶解在無菌磷酸鹽緩沖液(pbs，ph7.4)中，配置濃度為3ng/ml的溶液20ml，在其中加入20mg京尼平。4℃下，將交聯(lián)后的殼聚糖-聚乙烯醇納米纖維膜在該溶液中浸泡24h，取出后用pbs充分洗滌，得到加載神經(jīng)生長因子的殼聚糖-聚乙烯醇納米纖維膜。

(4)將步驟(3)中制得的加載多肽生長因子的內(nèi)層納米纖維膜裁剪至與外層導管相同的長度并卷成圓柱形套裝在步驟(1)中外層導管(長度為50mm)中(加載多肽生長因子的內(nèi)層納米纖維膜和外層導管的質(zhì)量比為1：500)，即可得到復合神經(jīng)導管。

實施例2、性能測試

一、力學性能

將實施例1中步驟(1)中制備的外層導管通過萬能力學拉伸試驗機測試其力學性能，標定距離為30mm，拉伸速率為5mm/min。結(jié)果顯示(圖3)，外層導管力學性能優(yōu)越，最大載荷達19n。

二、生物活性

以e8雞胚背根神經(jīng)節(jié)(drg)為試驗對象，用雞胚背根神經(jīng)節(jié)(drg)培養(yǎng)法對實施例1中制備的復合神經(jīng)導管的生物活性進行驗證。具體操作如下：

從8日齡雞胚中提取的雞胚背根神經(jīng)節(jié)放入復合神經(jīng)導管中，將復合神經(jīng)將導管與其共培養(yǎng)48h后，剪開復合神經(jīng)導管，在掃描電子顯微鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)的生長情況。

結(jié)果顯示(圖4)，雞胚背根神經(jīng)節(jié)附著在納米纖維膜表面，與材料形成緊密連接，并且在神經(jīng)生長因子的作用下，背根神經(jīng)節(jié)有明顯的突起，突起從神經(jīng)元出發(fā)，呈現(xiàn)放射狀生長。該結(jié)果說明實施例2制備的加載神經(jīng)生長因子的殼聚糖-聚乙烯醇外層導管及納米纖維膜具有優(yōu)異的生物相容性，在外層導管提供的穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境中，神經(jīng)細胞胞體及突起緊密附著在納米纖維膜上，并且加載的神經(jīng)生長因子能促進神經(jīng)突起的生長。背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)突起的生長長度大于胞體直徑的兩倍，證明了該復合導管能夠促進神經(jīng)突起生長足夠長的距離，以與靶細胞形成功能性連接，這滿足了神經(jīng)再生的關(guān)鍵條件。