本發(fā)明涉及一種附子甘草多糖提取物及其制備方法，屬于醫(yī)藥領域。

背景技術：

附子來源于毛莨科烏頭屬植物烏頭(aconitumcarmichaelidebx.)的子根及加工品，具有回陽救逆、補火助陽、祛風寒濕邪之功，用于亡陽虛脫、肢冷脈微、陽萎、宮冷、心腹冷痛、虛寒吐瀉、陰寒水腫。

甘草為豆科植物甘草(glycyrrhizauralensisfisch)、光果甘草(g.glabral.)或脹果甘草(g.inflatabatalin)的根及根莖，具有補心氣、益脾氣、祛痰止咳平喘、緩急止痛、清熱解毒、調和藥性之功，多用于氣虛諸證及減毒。

中醫(yī)臨床上，常用附子、甘草、干姜等組成回陽救逆劑，主治陽氣衰弱等證。而對于僅將附子和甘草配伍使用的研究，目前主要集中在兩者配伍的減毒作用方面，鮮有涉及相關產品的利用和開發(fā)。cn103272012a公開了一種附子甘草提取物，由附子、甘草加水合煮，煎煮液離心、所得的沉積物干燥所得；藥效實驗證明其具有抗心衰的功效。然而，該提取物以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等毒性物質為指標性成分，在用藥的安全性方面存在較大問題，限制了附子甘草提取物的進一步應用。另有分別對附子多糖以及甘草多糖藥理作用進行研究的報道(1、熊海霞等.附子多糖的藥理作用研究進展[j].世界科學技術—中醫(yī)藥現代化，2013，15(9)：1948～1951；2、劉三俠等.甘草多糖藥理作用研究進展[j].中國獸藥雜志，2013，47(1):64～67)。然而，上述文獻都是針對附子多糖或甘草多糖單獨進行的研究，未見從甘草和附子中最大限度提取出多糖組分，研究其免疫調節(jié)功能和抗氧化作用的協(xié)同效應的報道。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種附子甘草多糖提取物及其制備方法。

本發(fā)明提供了一種附子甘草多糖提取物的制備方法，包括如下步驟：

a、取附子1～4重量份、甘草4重量份；

b、加入10～30倍體積量水，于70℃～90℃溫浸提取4～8h，濃縮提取液；

c、向b步驟所得濃縮液中加入乙醇，邊加邊攪拌；

d、靜置，沉淀，抽濾，收集濾渣；

e、洗滌濾渣，干燥，即得。

優(yōu)選的，a步驟取附子1重量份、甘草4重量份。

進一步優(yōu)選的，b步驟加入20倍體積量水，提取溫度90℃，提取時間8h。

更進一步的，b步驟將提取液濃縮至原體積10％～20％；c步驟加入濃縮液4倍體積量的95％v/v乙醇水溶液；d步驟于4℃靜置；e步驟依次用無水乙醇、丙酮洗滌濾渣，于60℃干燥。

本發(fā)明提供了一種根據所述制備方法制備得到的附子甘草多糖提取物。

本發(fā)明提供了所述附子甘草多糖提取物在制備抗氧化、增強免疫的藥物中的用途。

本發(fā)明提供了一種藥物組合物，它是以有效量的所述附子甘草多糖提取物為活性成分，加入藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。

本發(fā)明提供了一種附子甘草多糖提取物的制備方法，采用該方法可最大限度從甘草和附子中提取得到多糖，多糖提取率高達6.4％。本發(fā)明還提供了根據該方法得到的附子甘草多糖提取物，藥效實驗證明兩種多糖組分相輔相成，協(xié)同作用，其抗氧化、增強免疫作用明顯提高，且對正常肝細胞增殖無抑制作用，生物安全性佳，具有良好的臨床應用前景。

顯然，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為本發(fā)明多糖組合物清除dpph自由基的能力圖；

圖2為本發(fā)明多糖組合物清除dpph自由基能力的穩(wěn)定性圖；

圖3為本發(fā)明多糖組合物對正常肝細胞增殖作用的影響圖；

圖4為本發(fā)明多糖組合物對巨噬細胞raw264.7細胞增殖的影響圖。

具體實施方式

本發(fā)明具體實施方式中使用的原料、設備均為已知產品，通過購買市售產品獲得。

實施例1本發(fā)明多糖組合物的制備

稱取附子100g、甘草400g，加入20倍體積量水，于90℃溫浸提取一次，共8h，收集濾液。60℃減壓蒸發(fā)濃縮至原體積的15％，濃縮液加入95％乙醇水溶液至乙醇濃度為80％，于4℃冰箱中靜置過夜，抽濾，依次用無水乙醇溶液、丙酮洗滌沉淀2次，60℃干燥得本發(fā)明提取物13.5g。

實施例2本發(fā)明多糖組合物的制備

稱取附子100g、甘草400g，加入10倍體積量水，于70℃溫浸提取2次，每次4h，收集濾液。60℃減壓蒸發(fā)濃縮至原體積的15％，濃縮液加入95％乙醇水溶液至至乙醇濃度為80％，于4℃冰箱中靜置過夜，抽濾，依次用無水乙醇溶液、丙酮洗滌沉淀2次，60℃干燥得本發(fā)明提取物10.2g。

實施例3本發(fā)明多糖組合物的制備

稱取附子100g、甘草400g，加入10倍體積量水，于80℃溫浸提取3次，每次6h，收集濾液。60℃減壓蒸發(fā)濃縮至原體積的15％，濃縮液加入95％乙醇水溶液至乙醇濃度為80％，于4℃冰箱中靜置過夜，抽濾，依次用無水乙醇溶液、丙酮洗滌沉淀2次，60℃干燥得本發(fā)明提取物24.1g。

實施例4本發(fā)明多糖組合物的制備

稱取附子100g、甘草400g，加入20倍體積量水，于90℃溫浸提取1次，每次4h，收集濾液。60℃減壓蒸發(fā)濃縮至原體積的15％，濃縮液加入95％乙醇水溶液至乙醇濃度為80％，于4℃冰箱中靜置過夜，抽濾，依次用無水乙醇溶液、丙酮洗滌沉淀2次，60℃干燥得本發(fā)明提取物8.6g。

以下通過效果實驗證明本發(fā)明的有益效果。

實驗例1本發(fā)明附子甘草多糖提取率對比實驗

多糖檢測方法：采用硫酸苯酚法測定多糖含量，精確稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品適量，置于容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得濃度為0.2mg/ml的葡萄糖標準品溶液。分別精確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml葡萄糖標準品溶液置于離心管中，精確加入新制成的苯酚溶液1ml及5ml濃硫酸溶，常溫下放置30min取出，放入冷水浴中15min，放至室溫，以等體積水按同樣顯色操作作為空白對照，采用紫外可見分光光度計在490nm波長處測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(x//mg/ml)、吸光度為縱坐標(y)繪制標準曲線，得回歸方程為：y＝8.36x-0.042，r2＝0.9993。

取1ml多糖樣品溶液(0.5mg/ml)置于離心管中，加入5％苯酚-硫酸0.5ml，再加入濃硫酸0.5ml，振蕩，室溫放置30min，采用紫外可見分光光度計在490nm波長處測吸光度，根據上述回歸方程計算多糖濃度。

提取方法：稱取附子100g、甘草400g粗粉放入三角錐瓶中，設定9個實驗組進行提取。提取時間分別為4、6、8h，溫浸溫度分別為70、80、90℃，料液比分別為1：10、1：20、1：30。

表1采用不同提取條件所得多糖提取率結果比較

實驗結果：實驗組9所得多糖提取率最高(達6.4％)，相較于實驗組1提取率增加了83％，上升幅度非常顯著。以上結果表明，附子甘草多糖的最佳提取工藝為：提取時間8h、提取溫度90℃、料液比為1:20。

實驗例2本發(fā)明多糖提取物抗氧化作用

1、采用清除dpph(二苯代苦肼基自由基)自由基的能力，測定本發(fā)明多糖組合物的抗氧化活性。預先配置1.0×10^-4mol/l的dpph，在10ml比色管中先后加入上述dpph溶液和2.0ml試樣的溶劑(蒸餾水)，混勻、靜置30min后，用比色皿在490nm波長處，測吸光度值，記為a0；加入2.0ml1.0×10^-4mol/l的dpph的溶液和2ml本發(fā)明多糖組合物試樣混勻后測定吸光度值，記為ai。將本發(fā)明多糖組合物采用蒸餾水分別稀釋至1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/ml等6個梯度，每一吸光度平行測定3次，取其平均值，按以下公式計算清除率：清除率＝[(a0-ai)/a0]×100％，以樣品濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，建立本發(fā)明提取物與dpph自由基清除率的關系。結果見圖1。

圖1表明，本發(fā)明多糖組合物具有顯著的抗氧化能力，對dpph自由基的清除作用隨多糖組合物濃度的增大逐漸增強。

2、考察ph、溫度和時間對本發(fā)明多糖組合物溶液抗氧化能力穩(wěn)定性的 影響。ph：取濃度為1mg/ml的本發(fā)明多糖組合物分別調整ph2、4、6、8、10、12，室溫放置2h后，測定其對dpph自由基的清除率。溫度：將本發(fā)明多糖組合物溶液置于有蓋離心管，分別于40、60、80、100℃水浴中加熱2h，測定其對dpph自由基的清除率。時間：將本發(fā)明多糖組合物溶液常溫放置2、4、8、12、24h，測定其對dpph自由基的清除率。結果見圖2。

圖2表明，本發(fā)明多糖組合物的抗氧化能力具有耐酸性、耐高溫性及貯藏穩(wěn)定性。

實驗例3本發(fā)明多糖提取物正常細胞毒性作用

取對數生長期正常肝細胞l02，消化、重懸，調節(jié)細胞濃度并接種至96孔培養(yǎng)板，5000個細胞/孔,繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，吸棄細胞培養(yǎng)液，并添加由細胞培養(yǎng)液配制的不同濃度本發(fā)明多糖組合物，另有對照組，每孔加入空白細胞培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24、48小時后，吸棄培養(yǎng)液，每孔添加新細胞培養(yǎng)液稀釋的mtt溶液(0.5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入0.1mldmso，振搖充分溶解細胞內生成的紫色甲臜結晶，于570nm下測定每孔吸光度(od值)。結果見圖3。

圖3表明，本發(fā)明多糖組合物對正常肝細胞增殖無抑制作用，生物安全性好。

實驗例4本發(fā)明多糖提取物體外免疫調節(jié)作用

用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液調整raw264.7細胞密度為5×105個/ml，接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，將細胞培養(yǎng)板置于5％co2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，細胞貼壁后吸去上清液，加入濃度為100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml和1200μg/ml本發(fā)明多糖組合物樣品100μl，以加入等體積濃度為10μg/ml的脂多糖(lps)為陽性對照(lps組)，僅加培養(yǎng)基的孔為陰性對照(control組)，平行6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h，吸去上層培養(yǎng)液，加入新細胞培養(yǎng)液稀釋的mtt溶液(0.5mg/ml)100μl/孔，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清，加入100μldmso震蕩10min，置室溫10min后，用酶標儀在570nm處測定吸光值。計算公式如下：巨噬細胞存活率＝a1/a2×100。其中a1為樣品組吸光度值，a2為陰性對照組吸光度值。結果見圖4。

促進巨噬細胞增殖是激活機體免疫應答的重要途徑之一，本實驗采用lps作為陽性物質刺激巨噬細胞增殖。由圖4可知，本發(fā)明多糖組合物具有有絲分裂原作用，可促進巨噬細胞增殖，且呈濃度依賴性，說明本發(fā)明多糖 組合物具有免疫增強作用。

實驗例5本發(fā)明多糖提取物的臨床實驗結果

病例：患者，男，75歲，癥狀為面色蒼白，少氣懶言，倦怠乏力，動則喘息，張口抬肩，自汗，食少便溏，舌淡苔白，脈虛弱。為心脾兩虛，免疫功能低下，常見畏寒、虛弱無力等癥。

治療：將附子甘草合煎所得多糖用于該患者口服，每天2次，每次3-5g，連續(xù)使用6個月，以上癥狀均得到明顯改善。