本發(fā)明涉及一種殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜改性的鈦基醫(yī)用生物材料及其制備方法，具體說，是涉及一種采用層-層共價鍵固定法制備的，具有抗感染和促進骨整合的殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜改性鈦基醫(yī)用生物材料。屬于醫(yī)用生物涂層技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

理想的硬組織植入材料應(yīng)當同時具有良好的骨整合能力和抗感染性能。植入物感染是骨外科手術(shù)后最嚴重的并發(fā)癥之一。術(shù)后感染不僅延長傷口的愈合時間，還損害植入物的骨整合及使用效果。趙(Zhao，Journal of biomedical materials research Part B,Applied biomaterials 2009,91(1):470-480)提出抗菌涂層是提高內(nèi)植物感染的重要手段。Badea (Badea M,Influence of Ag content on the antibacterial properties of SiC doped hydroxyapatite coatings.Ceramics International.2016,42(1):1801-1811.)將銀摻雜在羥基磷灰石涂層中。Pishbin(Pishbin F.Electrophoretic Deposition of Gentamicin-Loaded Bioactive Glass/Chitosan Composite Coatings for Orthopaedic Implants.ACS Applied Materials&Interfaces.2014,6(11):8796-8806.)將慶大霉素負載在生物活性玻璃/殼聚糖復(fù)合涂層中。然而，銀和慶大霉素均會影響干細胞的成骨分化，進而影響植入體的骨整合；慶大霉素等抗生素的長期使用還會引起耐藥致病菌的產(chǎn)生，使得硬組織感染的治療更加復(fù)雜，其結(jié)果可能是災(zāi)難性的。

Peng(Peng Z.Quaternised chitosan coating on titanium provides a self-protective surface that prevents bacterial colonisation and implant-associated infections.RSC Advances.2015,5:54304-54311.)將殼聚糖季銨鹽用于鈦植入體表面改性，獲得良好的抗感染表面，而該植入體的骨整合能力有待提高。

層-層共價鍵固定法結(jié)合了層-層技術(shù)與共價鍵固定法，能夠在材料表面制備結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的復(fù)合膜涂層。敖海勇等(敖海勇等。一種構(gòu)建I型膠原-透明質(zhì)酸類細胞外基質(zhì)的方法。專利號：201210431868.8)用該方法制備了I型膠原/透明質(zhì)酸復(fù)合膜改性鈦涂層，鈦基植入體的骨整合能力得到顯著提高。然而，該植入體的抗感染性能尚需改善。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種技能抗感染和又能促進骨整合的殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜改性鈦基醫(yī)用生物材料及其制備方法。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜改性的鈦基醫(yī)用生物材料，包括由利用層-層共價鍵接枝法交替形成于鈦基醫(yī)用生物材料表面的生物活性大分子層和殼聚糖季銨鹽層形成的殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜，所述層-層共價鍵接枝法包括交替循環(huán)進行的共價鍵固定至少一種生物活性大分子和共價鍵固定殼聚糖季銨鹽。

本發(fā)明發(fā)利用生物活性大分子與殼聚糖季銨鹽的共價鍵聚合反應(yīng)和層層疊加的方式構(gòu)建醫(yī)用鈦基殼聚糖季銨鹽基復(fù)合涂層。其中，殼聚糖季銨鹽為殼聚糖與2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨等季銨鹽反應(yīng)合成的殼聚糖衍生物，具有良好的水溶性、廣譜抗菌性能和生物相容性。與殼聚糖相比，殼聚糖季銨鹽的抗菌活性更高。中等取代度的殼聚糖季銨鹽不僅有著理想的抗菌活性，同時對干細胞無明顯的毒副作用。殼聚糖季銨鹽保留了殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中大量的氨基，能夠與生物活性大分子中的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成共價鍵結(jié)合；而生物活性大分子上的羧基和氨基亦可以與經(jīng)處理后的鈦基材料表面的活性基團共價鍵結(jié)合，因此，分子層之間以及復(fù)合膜與基體之間均能夠形成穩(wěn)定的結(jié)合，使得復(fù)合膜具有長期效用。該復(fù)合膜又能在體內(nèi)酶的作用下緩慢降解，能夠緩慢釋放抗菌劑殼聚糖季銨鹽，對未粘附在材料表面的細菌亦有殺滅作用。

較佳地，所述生物活性大分子涂層為膠原蛋白、纖粘連蛋白、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸、肝素和硫酸軟骨素中的至少一種。

較佳地，所述殼聚糖季銨鹽為殼聚糖和季銨鹽反應(yīng)合成的殼聚糖衍生物，所述季銨鹽包括2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨、十二烷基二甲基芐基氯化銨、氯丙胺三甲基氯化銨、羥丙基三甲基氯化銨。

較佳地，所述殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜的厚度為100～400nm。

本發(fā)明中，所述鈦基醫(yī)用生物材料可為鈦、鈦其合金以及多孔鈦基醫(yī)用生物材料中的一種。

本發(fā)明還提供了一種殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜改性的鈦基醫(yī)用生物材料的制備方法，包括：

(1)采用強堿溶液或強酸溶液對鈦基醫(yī)用生物材料表面進行活化處理；

(2)利用官能團化反應(yīng)在步驟(1)所得活化處理后的鈦基醫(yī)用生物材料的表面引入反應(yīng)性基團，所述反應(yīng)性基團為氨基、羧基中的一種；

(3)利用層-層共價鍵接枝法在步驟(2)所得表面含有反應(yīng)性基團的鈦基醫(yī)用生物材料的表面構(gòu)建殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜。

較佳地，所述活化處理為鈦基醫(yī)用生物材料超聲清理后在5～10M的強堿溶液中，60～80℃下反應(yīng)6～12小時；或者鈦基醫(yī)用生物材料超聲清理后在的濃硫酸/雙氧水混合處理液中，反應(yīng)5～15分鐘。

較佳地，利用官能團化反應(yīng)為硅烷化引入氨基、多巴胺交聯(lián)法引入氨基、或者丙烯酸接枝法引入羧基。

較佳地，所述層-層共價鍵接枝法包括：交替地將鈦基醫(yī)用生物材料浸泡在1～3mg/ml的生物活性大分子/乙酸溶液中以及5～10mg/ml的殼聚糖季銨鹽/乙酸溶液中，每次浸泡15～45分鐘；如此循環(huán)3～10次，將鈦基醫(yī)用生物材料去離子超聲清洗并真空干燥后在鈦基醫(yī)用生物材料表面上得到所述殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜。

又，較佳地，所述生物活性大分子/乙酸溶液中含有濃度為2～3.5mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和濃度為0.25～0.875mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺。

又，較佳地，所述殼聚糖季銨鹽/乙酸溶液中含有濃度為2～3.5mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和濃度為0.25～0.875mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺。

本發(fā)明工藝簡單、效率高、可重復(fù)性好。本發(fā)明制備的殼聚糖季銨鹽及復(fù)合膜改性鈦基醫(yī)用生物材料具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在酶的作用下能夠緩慢釋放殼聚糖季銨鹽。本發(fā)明制備的殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜改性鈦基醫(yī)用生物材料不僅具有抗菌性能，還能更好地促進干細胞的粘附、增殖和成骨分化。

附圖說明

圖1示出多孔鈦涂層(TC)、經(jīng)堿處理的多孔鈦涂層(TC-A)、經(jīng)硅烷化處理的多孔鈦涂層(TC-AA)、以及I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層(TC-AA(C/H/H)₆)的光電子能譜圖；

圖2示出復(fù)合膜改性鈦的原子力顯微鏡拓撲結(jié)構(gòu)照片；

圖3示出I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層的膠原酶隨時間降解曲線圖A及殼聚糖季銨鹽隨時間的釋放曲線圖B；

圖4為I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性的鈦基植入體的機械穩(wěn)定性的拔出實驗，其中圖4a中c為復(fù)合膜改性鈦棒，圖4a中b為復(fù)合膜改性的鈦涂層棒；

圖5為多孔鈦涂層(TC)和I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層(TC-AA(C/H/H)₆)的細菌電鏡照片(A為培養(yǎng)4小時，B為培養(yǎng)24小時)；

圖6示出多孔鈦涂層(TC)和I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層(TC-AA(C/H/H)₆)的細胞生物學(xué)性能，A為人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)的粘附實驗，B為hMSCs的增殖實驗，C為hMSCs的堿性磷酸酶活性定量測定，D為hMSCs的堿性磷酸酶定性染色；

圖7示出普通鈦涂層組(TC+MRSA，注入MRSA，植入TC)、I型膠原/透明質(zhì)酸復(fù)合膜改性鈦涂層組(TC-AA(C/H)₆+MRSA，注入MRSA，植入TC-AA(C/H)₆)、I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層組(TC-AA(C/H/H)₆+MRSA，注入MRSA，植入TC-AA(C/H/H)₆)以及陽性對照組(TC-AA(C/H/H)₆+PBS，注入PBS，植入TC-AA(C/H/H)₆)的體內(nèi)抗感染性能，A為X光觀察，B為Micro-CT三維重建；

圖8為鈦片(Ti)和透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦(Ti-(H/H)₆)的抗菌性能。A為孵育6小時后的涂板計數(shù)，B為孵育24小時后的涂板計數(shù)；

圖9為鈦涂層(TC)和I型膠原/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層(TC-(C/H)₆)的抗菌性能，A為孵育6小時后的死活細菌染色激光共聚焦觀察，B為孵育24小時后的死活細菌染色激光共聚焦觀察。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和實施方式進一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，下述實施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

本發(fā)明以具有抗菌性能的殼聚糖季銨鹽和具有成骨活性的生物活性大分子為原料，通過層層疊加并共價鍵聚合反應(yīng)的方式，在鈦基醫(yī)用生物材料的表面構(gòu)建復(fù)合膜。以下示例的說明本發(fā)明提供的殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜改性的鈦基醫(yī)用生物材料的制備方法。

在鈦基醫(yī)用生物材料表面進行活化處理。鈦基醫(yī)用生物材料可為但不僅限于鈦、鈦其合金以及多孔鈦基醫(yī)用生物材料中的一種。所述活化處理可為鈦基醫(yī)用生物材料超聲清理后在5～10M的強堿溶液中，60～80℃下反應(yīng)6～12小時?；蛘呋罨幚磉€可為鈦基醫(yī)用生物材料超聲清理后濃硫酸/雙氧水混合處理液在(例如體積比為7：3的濃硫酸/雙氧水混合處理液)中，反應(yīng)5～15分鐘。處理后的鈦基醫(yī)用生物材料種植體浸泡在超純水中，40～60℃下水浴，以除去種植體表面的酸或堿，然后風(fēng)干。

利用官能團化反應(yīng)在活化處理后的鈦基醫(yī)用生物材料的表面引入反應(yīng)性基團。利用官能團化反應(yīng)可為但不局限于硅烷化引入氨基、多巴胺交聯(lián)法引入氨基、或者丙烯酸接枝法引入羧基。其中，所述反應(yīng)性基團包括但不局限于氨基、羧基等。反應(yīng)性基團的來源包括但不局限于丙烯酸、多巴胺以及硅烷偶聯(lián)劑。

上述引入反應(yīng)基團的方法可為硅烷化，引入氨基。硅烷偶聯(lián)劑包括但不局限于乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三叔丁基過氧硅烷、氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三異丙氧基硅烷等。作為一個示例，將活化的鈦基植入體浸泡在濃度為5～10％的硅烷偶聯(lián)劑/甲苯溶液中，溶液加熱至沸騰，冷凝回流反應(yīng)6～12小時。冷卻后鈦基植入物依次用酒精、去離子水超聲清洗1～2次，每次5分鐘，真空干燥。

上述引入反應(yīng)基團的方法還可為多巴胺交聯(lián)法，引入氨基。作為一個示例，將活化的鈦基植入體浸入1～5mg/ml的多巴胺/Tris-HCl溶液中，pH值為8～9，常溫下反應(yīng)6～12小時。去離子水超聲清洗，真空干燥。

上述引入反應(yīng)基團的方法還可為丙烯酸接枝法，引入羧基。作為一個示例，配制40％丙烯酸水溶液，攪拌均勻，同時充入氬氣10分鐘。加入3％的硝酸鈰銨酸溶液，攪拌均勻，繼續(xù)充入氬氣。2分鐘后，將活化的鈦基植入體浸泡在上述所得混合溶液中，室溫下反應(yīng)45分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，去離子水超聲清洗干凈后，真空干燥。

利用層-層共價鍵接枝法在表面含有反應(yīng)性基團的鈦基醫(yī)用生物材料的表面構(gòu)建殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜。所述層-層共價鍵接枝法包括：交替地將鈦基醫(yī)用生物材料浸泡生物活性大分子溶液中以及殼聚糖季銨鹽溶液中。例如先將表面含有反應(yīng)性基團的鈦基醫(yī)用生物材料浸泡在生物活性大分子/乙酸溶液。再將所得鈦基醫(yī)用生物材料去離子水清洗后浸泡殼聚糖季銨鹽/乙酸溶液中。然而應(yīng)理解，浸泡順序不限于此，也可以先浸泡在殼聚糖季銨鹽溶液中在浸泡在生物活性大分子溶液。如此循環(huán)3～10次，將鈦基醫(yī)用生物材料去離子超聲清洗并真空干燥后在鈦基醫(yī)用生物材料表面上得到所述殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜。殼聚糖季銨鹽的接枝量無法測標定他們之間的比例關(guān)系對復(fù)合膜的影響不大，但若考慮到抗菌效果，殼聚糖季銨鹽的量盡量多些，因此可設(shè)定生物活性大分子溶液濃度為1-3mg/ml，殼聚糖季銨鹽的濃度為5-10mg/ml。其中，生物活性大分子溶液中以及殼聚糖季銨鹽溶液可事先配制有縮合劑，縮合劑可選用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺。例如，生物活性大分子/乙酸溶液中可含有濃度為2～3.5mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和濃度為0.25～0.875mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺。殼聚糖季銨鹽/乙酸溶液中可含有濃度為2～3.5mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和濃度為0.25～0.875mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺。

作為一個詳細的示例，先將表面含有反應(yīng)性基團的鈦基醫(yī)用生物材料浸泡在1～3mg/ml的生物活性大分子/乙酸溶液中15～45分鐘。再將所得鈦基醫(yī)用生物材料去離子水清洗后浸泡在5～10mg/ml的殼聚糖季銨鹽/乙酸溶液中15～45分鐘。如此循環(huán)10次，將鈦基醫(yī)用生物材料去離子超聲清洗并真空干燥后在鈦基醫(yī)用生物材料表面上得到所述殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜。

上述生物活性大分子可為但不僅限于膠原蛋白、纖粘連蛋白、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸、肝素和硫酸軟骨素中的至少一種。生物活性大分子賦予復(fù)合膜改性鈦基醫(yī)用生物材料良好的成骨活性。

上述聚糖季銨鹽為殼聚糖和季銨鹽反應(yīng)合成的殼聚糖衍生物，所述季銨鹽包括但不局限于2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，十二烷基二甲基芐基氯化銨、氯丙胺三甲基氯化銨、羥丙基三甲基氯化銨。

上述殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜的厚度可為100～400nm。

下面進一步例舉實施例以詳細說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護范圍。下述示例具體的工藝參數(shù)等也僅是合適范圍中的一個示例，即本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本文的說明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。

實施例1 本發(fā)明的I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層的制備及表征將等離子體噴涂多孔鈦涂層(TC)浸入10M NaOH溶液中，在80℃下水浴12h，去離子水超聲清洗后，60℃下熱水陳化3天，每天換一次水，風(fēng)干。堿處理樣品標記為TC-A。將干燥的堿處理樣品浸泡在濃度為10％的氨丙基三乙氧基硅烷(APS)/甲苯溶液中，溶液加熱至沸騰，冷凝回流，反應(yīng)12h。冷卻后用無水乙醇超聲清洗1次，去離子水超聲清洗2次，每次3分鐘，真空干燥。硅烷化樣品標記為TC-AA。配制1mg/ml I型膠原/5mM乙酸溶液、1mg/ml透明質(zhì)酸/5mM乙酸溶液和10mg/ml殼聚糖季銨鹽/5mM乙酸溶液。往上述溶液中滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)水溶液和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)水溶液，使得EDC最終溶度為2.5mg/ml，NHS最終溶度為0.63mg/ml。將TC-AA浸泡在I型膠原溶液中，反應(yīng)30min后取出，去離子水沖洗；然后浸泡在透明質(zhì)酸溶液中，反應(yīng)30min后取出，去離子水沖洗；接著浸泡在殼聚糖季銨鹽溶液中，反應(yīng)30min后取出，去離子水沖洗；再浸泡在I型膠原溶液中，如此循環(huán)6次。去離子水清洗后，真空干燥。樣品標記為TC-AA(C/H/H)₆。

用光電子能譜對所得材料進行表征。圖1示出多孔鈦涂層(TC)、經(jīng)堿處理的多孔鈦涂層(TC-A)、經(jīng)硅烷化處理的多孔鈦涂層(TC-AA)、以及I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層(TC-AA(C/H/H)₆)的光電子能譜圖。從圖中可以看出，TC-AA(C/H/H)₆圖中出現(xiàn)了Cl2p峰，這是因為殼聚糖季銨鹽的分子結(jié)構(gòu)中含有氯離子。

表1 不同樣品的表面元素組成

從表1中可以看出，與TC-AA相比，樣品TC-AA(C/H/H)₆表面的Ti、O、Na和Si元素含量減少，而C和N元素含量增加，并出現(xiàn)氯元素。

實施例2 I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦的制備及表征

將干凈鈦片(Ti)浸入5M NaOH溶液中，在60℃下水浴10h，去離子水超聲清洗后，60℃下熱水陳化2天，每天換一次水，風(fēng)干。堿處理樣品標記為Ti-A。將干燥的堿處理樣品浸泡在濃度為5％的氨丙基三乙氧基硅烷(APS)/甲苯溶液中，溶液加熱至沸騰，冷凝回流，反應(yīng)12h。冷卻后用無水乙醇超聲清洗1次，去離子水超聲清洗2次，每次3分鐘，真空干燥。硅烷化樣品標記為Ti-AA。配制1mg/ml I型膠原/5mM乙酸溶液、1mg/ml透明質(zhì)酸/5mM乙酸溶液和10mg/ml殼聚糖季銨鹽/5mM乙酸溶液。往上述溶液中滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)水溶液和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)水溶液，使得EDC最終溶度為2.5mg/ml，NHS最終溶度為0.63mg/ml。將Ti-AA浸泡在I型膠原溶液中，反應(yīng)30min后取出，去離子水沖洗；然后浸泡在透明質(zhì)酸溶液中，反應(yīng)30min后取出，去離子水沖洗；接著浸泡在殼聚糖季銨鹽溶液中，反應(yīng)30min后取出，去離子水沖洗；再浸泡在I型膠原溶液中，如此循環(huán)6次。去離子水清洗后，真空干燥。樣品標記為Ti-AA(C/H/H)₆。用原子力顯微鏡觀察材料表面拓撲結(jié)構(gòu)并測定復(fù)合膜厚度。

圖2為材料表面的原子力顯微鏡拓撲結(jié)構(gòu)。從圖中可以看出，堿處理后，鈦片表面產(chǎn)生了較尖銳的針狀結(jié)構(gòu)；硅烷化后，針狀結(jié)構(gòu)變鈍；復(fù)合膜覆蓋后，針狀結(jié)構(gòu)消逝，由一層膠狀物質(zhì)代替。測量結(jié)果顯示，該復(fù)合膜厚度為300±100nm。

實施例3 I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜涂層的穩(wěn)定性

將若干復(fù)合膜改性鈦涂層樣品分別浸泡在Tris-HCl溶液(pH＝7.4)和1mg/ml I型膠原酶/Tris-HCl溶液中。規(guī)定時間后取出，利用天狼猩紅染色法，考察兩組樣品表面殘留的I型膠原量；用糖蒽酮-硫酸化學(xué)反應(yīng)比色法測定溶液中殼聚糖季銨鹽的含量。

為了考察復(fù)合膜涂層的耐磨性能，利用上述方法將復(fù)合膜構(gòu)建在鈦涂層棒和鈦棒表面，進行插入拔出實驗，電鏡下觀察涂層的磨損情況。

圖3為復(fù)合膜涂層的穩(wěn)定性分析。圖3中A為在兩種溶液中浸泡后，樣品表面殘留的I型膠原量；A中a為Tris-HCl溶液，b為1mg/ml膠原酶/Tris-HCl溶液；B為在兩種溶液中浸泡后，復(fù)合膜中的殼聚糖季銨鹽的累計釋放量，其中c為Tris-HCl溶液，d為1mg/ml膠原酶/Tris-HCl溶液。從圖中可以看出，18天內(nèi)復(fù)合膜降解了55％左右，殼聚糖季銨鹽累計釋放量為1.7mg左右，因此殼聚糖季銨鹽的接枝量為3mg左右。復(fù)合膜涂層具有良好的固定穩(wěn)定性，在酶的作用下會緩慢降解，能夠緩慢釋放殼聚糖季銨鹽。

圖4為復(fù)合膜改性鈦基植入體的插入拔出實驗。圖4a中b為復(fù)合膜改性鈦涂層棒，c為植入的復(fù)合膜改性鈦棒。圖4b為鈦涂層棒插入部位的局部放大圖，圖4b1為圖4b中b1部位的放大圖。圖c為鈦棒插入部位的局部放大圖，圖4c1為圖4c中c1部位的局部放大圖，圖4c2為圖4c中c2局部放大圖。從圖中可以看出經(jīng)插入拔出后，復(fù)合膜改性鈦的表面只有少數(shù)地方有磨損。在磨損最厲害的圖4c中c2處，鈦表面仍有生物活性大分子的殘留。復(fù)合膜涂層具有良好的耐磨性能。

實施例5 I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜的抗菌性能

將鈦涂層及上述制備的復(fù)合膜改性鈦涂層與三種致病菌(金黃色葡萄球菌ATCC 25923，耐藥金黃色葡萄球菌ATCC 43300，耐藥表皮葡萄球菌MRSE 287)在37℃培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)4小時及24小時。掃描電鏡觀察材料表面細菌粘附和生長情況。

圖5材料細菌電鏡照片。圖5中A為材料與細菌一起孵育4小時后的掃描電鏡照片，可以看到，4小時后，三種細菌在未改性鈦涂層表面均粘附很多，而在復(fù)合膜改性鈦涂層表面粘附的非常少，表明殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層具有良好的抗細菌粘附性能。圖5中B為材料與細菌一起孵育24小時后的掃描電鏡照片?？梢钥吹?，24小時后，三種細菌均在未改性鈦涂層表面形成了生物膜，而復(fù)合膜改性鈦涂層表面未見生物膜形成，表明該復(fù)合膜涂層能夠抑制細菌生物膜形成。

實施例6 I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層的細胞生物學(xué)

用人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)來考察新型改性鈦涂層的生物學(xué)性能：用MTT法考察hMSCs在材料表面的粘附和增殖行為；用pNPP法對hMSCs的堿性磷酸酶(ALP)的活性進行定量測定。

圖6為殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜改性鈦涂層的生物學(xué)性能。A為細胞的粘附行為；B為細胞的增殖行為；C為細胞的堿性磷酸酶活性定量測定；D為細胞的堿性磷酸酶定性染色。從圖5中可知，與未改性的鈦涂層相比，該復(fù)合膜改性鈦涂層能夠更好地促進干細胞的粘附、增殖和成骨分化。

實施例7 殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜改性鈦基植入體的動物體內(nèi)抗感染性能研究

參照實施例1的方法，將殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜固定在鈦涂層棒表面，環(huán)氧乙烷滅菌。選取5月齡SD大鼠若干，麻醉、消毒以實施手術(shù)。用電鉆從干骺端將動物后肢股骨擴髓后，注入10⁴cfu的耐藥金黃色葡萄球菌，而后立即植入鈦基材料，并將傷口逐層嚴密縫合。飼養(yǎng)期間，定期X光觀察。6周后處死動物，取出標本，經(jīng)多聚甲醛處理后進行Micro-CT掃描。

圖7示出普通鈦涂層組(TC+MRSA，注入MSRA，植入TC)、I型膠原/透明質(zhì)酸復(fù)合膜改性鈦涂層組(TC-AA(C/H)₆+MRSA，注入MRSA，植入TC-AA(C/H)₆)、I型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦涂層組(TC-AA(C/H/H)₆+MRSA，注入MRSA，植入TC-AA(C/H/H)₆)以及陽性對照組(TC-AA(C/H/H)₆+PBS，注入PBS，植入TC-AA(C/H/H)₆)的體內(nèi)抗感染性能，A為X光觀察、B為Micro-CT三維重建。從X光照片中可以看出(圖7A)，植入3周時，普通鈦涂層組(TC+MRSA)及不含殼聚糖季銨鹽的復(fù)合膜改性鈦涂層組(TC-AA(C/H)₆+MRSA)均出現(xiàn)骨溶解及骨膜反應(yīng)等感染癥狀，6周后還出現(xiàn)新骨和死骨的形成。而含有殼聚糖季銨鹽的復(fù)合膜改性鈦涂層組(TC-AA(C/H/H)₆+MRSA)與陽性對照組(TC-AA(C/H/H)₆+PBS)一樣并無明顯的骨感染影像學(xué)征象。Micro-CT(圖7B)結(jié)果顯示，兩個陰性對照組(TC和TC-AA(C/H)₆)的感興趣區(qū)域均出現(xiàn)皮質(zhì)骨被腐蝕的中空及毛刺，而實驗組(TC-AA(C/H/H)₆+MRSA)完好無損。表明殼聚糖季銨鹽基復(fù)合膜改性鈦基植入體具有良好的抗感染性能。

實施例8 本發(fā)明的透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽改性鈦的制備及其抗菌性能

將干凈的鈦片(Ti)浸入濃硫酸/雙氧水(體積比為7:3)混合處理液中，反應(yīng)10分鐘。處理后的鈦片浸泡在超純水中，60℃下水浴24小時，以除去種植體表面的酸，然后風(fēng)干。將活化的鈦片浸入3mg/ml的多巴胺/Tris-HCl溶液中，pH值為8，常溫下反應(yīng)6小時。去離子水超聲清洗，真空干燥。將多巴胺改性的鈦片的樣品浸泡在1mg/ml透明質(zhì)酸/乙酸(5mM)溶液中(含EDC 2mg/ml，NHS 0.25mg/ml)，反應(yīng)25min后取出，去離子水沖洗；然后浸泡在10mg/ml殼聚糖季銨鹽/乙酸(5mM)溶液中(含EDC 2mg/ml，NHS 0.25mg/ml)，反應(yīng)25min后取出，去離子水沖洗；再浸泡在透明質(zhì)酸溶液中，如此循環(huán)6次。反應(yīng)結(jié)束后蒸餾水超聲清洗，常溫風(fēng)干。用涂板計數(shù)法考察該改性鈦(Ti-(H/H)₆)的抗菌性能。經(jīng)原子力顯微鏡檢測后，可知本實施例的所得涂層的厚度為200±40nm。

圖8為材料與三種細菌孵育6h(圖8中A)及24h(圖8中B)之后的涂板計數(shù)實驗結(jié)果。如圖所示，透明質(zhì)酸/殼聚糖季銨鹽復(fù)合膜改性鈦對金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、耐藥金黃色葡萄球菌(ATCC43300)以及耐藥表皮葡萄球菌(MRSE287)均有良好的抗細菌粘附性能，孵育6h時，抑菌率均在90％以上；孵育24g后，抑菌率能達到95％。

實施例9 本發(fā)明的I型膠原/殼聚糖季銨鹽改性鈦涂層的制備及其抗菌性能

將等離子體噴涂鈦涂層浸入5M NaOH溶液中，在60℃下水浴12h，去離子水超聲清洗后，60℃下熱水陳化2天，每天換一次水，風(fēng)干。配制40％丙烯酸水溶液，攪拌均勻，同時充入氬氣10分鐘；加入3％的硝酸鈰銨酸溶液，攪拌均勻，繼續(xù)充入氬氣。2分鐘后，將活化的鈦涂層浸泡在上述所得混合溶液中，室溫下反應(yīng)45分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，去離子水超聲清洗干凈后，真空干燥。將丙烯酸處理的樣品浸泡在1mg/ml I型膠原/乙酸(5mM)溶液中(含EDC 3mg/ml，NHS 0.3mg/ml)，反應(yīng)25min后取出，去離子水沖洗；然后浸泡在7.5mg/ml殼聚糖季銨鹽/乙酸(5mM)溶液中(含EDC 3mg/ml，NHS 0.3mg/ml)，反應(yīng)25min后取出，去離子水沖洗；再浸泡在I型膠原溶液中，如此循環(huán)6次。反應(yīng)結(jié)束后蒸餾水超聲清洗，常溫風(fēng)干。經(jīng)原子力顯微鏡檢測后，可知本實施例的所得涂層的厚度為150±50nm。用死活細菌染色法考察該改性鈦(TC-(C/H)₆)的抗菌性能。

死活細菌染色結(jié)果如圖9所示。圖9中A為材料與細菌共孵育6小時后死活細菌染色的激光共聚焦照片，B為材料與細菌共孵育24小時后，死活細菌染色的激光共聚焦照片。6h時(圖9A)，鈦涂層表面已有大量細菌定植，而粘附在復(fù)合膜改性鈦涂層表面的細菌基本死亡；24h時(圖9B)，三種細菌在鈦涂層表面已形成生物膜，鈦涂層表面的細菌大量死亡，并沒有生物膜出現(xiàn)。結(jié)果表明I型膠原/透明質(zhì)酸復(fù)合膜改性鈦涂層具有良好的抗菌性能。