本發(fā)明涉及鼠麹草提取物，及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

尿酸是人類嘌呤化合物的最終代謝產(chǎn)物，嘌呤代謝紊亂會導(dǎo)致高尿酸血癥。高尿酸血癥(hua)是指在正常嘌呤飲食狀態(tài)下，非同日兩次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/l，女性高于360μmol/l。高尿酸血癥是由于體內(nèi)尿酸生成增加或排出減少引起。高尿酸血癥是痛風(fēng)的發(fā)病基礎(chǔ)，當(dāng)尿酸濃度過飽和形成結(jié)晶，沉積在關(guān)節(jié)滑膜，軟組織，軟骨和腎臟等處就會引發(fā)″痛風(fēng)″，從而觸發(fā)機體固有免疫反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)及其周圍組織炎癥反應(yīng)和腎功能損害。高尿酸血癥患者，體內(nèi)糖和脂肪的代謝功能會明顯降低，容易引發(fā)各種嚴(yán)重的疾病，主要有糖尿病，高血壓、高血脂、冠心病、心肌梗塞，動脈粥樣硬化等，嚴(yán)重威脅人體健康。

隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，在我國高尿酸血癥人群已呈現(xiàn)逐年上升趨勢。臨床降尿酸藥物需求量將逐年增大。

黃嘌呤氧化酶是參與高尿酸血癥、痛風(fēng)等代謝綜合癥發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵酶，主要通過催化嘌呤代謝的最后兩步，即次黃嘌呤氧化為黃嘌呤再經(jīng)氧化為尿酸，使體內(nèi)尿酸水平升高。因此，黃嘌呤氧化酶成為開發(fā)抗高尿酸血癥及痛風(fēng)等疾病藥物的重要靶標(biāo)之一，現(xiàn)有的黃嘌呤氧化酶(xod)抑制劑有別嘌呤醇，非布索坦等。

鼠麴草，(gnaphaliumaffine，又稱鼠曲草、佛耳草、白艾)，為菊科鼠麹草屬植物，味微甘、性平，有祛風(fēng)化痰瀉濁之效。《名醫(yī)別錄》明確記載“主痹寒，寒熱”；《藥典》1977版記載“祛風(fēng)濕，用于風(fēng)濕痹痛”。清明節(jié)前后，我國多地各民族民間有采其嫩莖葉食用的習(xí)慣。根據(jù)文獻linw，xiej，wux，yangl，wangh.inhibitionofxanthineoxidaseactivitybygnaphaliumaffineextract.chinesemedicalsciencesjournal，2014.29(4)：225-230.中公開了一種鼠麹草95％乙醇提取物，其抑制黃嘌呤氧化酶的ic50值為11.38μg/ml；該鼠麹草乙醇提取物中分離得到的木犀草素(luteolin2.63μmol/ml)、芹菜素(apigenin0.5μmol/ml)、槲皮素、山柰酚、異澤蘭黃素(eupatilin0.37μmol/ml)、5-羥基6，7，3’，4’-四甲氧基黃酮(3.15μmol/ml)等黃酮類成分具有一定的黃嘌呤氧化酶抑制活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中鼠麹草提取物的黃嘌呤氧化酶抑制活性不高，而提供了一種鼠麹草提取物，及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明制得的鼠麹草提取物具有較強的黃嘌呤氧化酶抑制活性；且鼠麹草野生資源豐富，藥材成本低廉，開發(fā)潛力巨大。

本發(fā)明提供了一種鼠麹草提取物的制備方法，其包括以下步驟：將鼠麹草與乙醇水溶液混合，提取，濃縮得濃縮液；石油醚萃取所述的濃縮液得到水相；乙酸乙酯萃取所述的水相，收集乙酸乙酯相，即可；其中，所述的乙醇水溶液為體積百分含量為50％～80％的乙醇水溶液。

其中，所述的乙醇水溶液優(yōu)選為體積百分含量為60％的乙醇水溶液。所述的提取的溫度可以為50～100℃，更優(yōu)選70～80℃。所述的乙醇水溶液的用量可以參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明中所述的鼠麹草與所述的乙醇水溶液的重量體積比優(yōu)選1∶10～1∶20kg/l，更優(yōu)選1∶10～1∶15kg/l。所述的提取的次數(shù)可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，本發(fā)明優(yōu)選2～4次，更優(yōu)選3次。所述的提取中單次提取的時間可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明優(yōu)選1～2h。

其中，所述的鼠麹草優(yōu)選為陰干后的鼠麹草。本領(lǐng)域中，所述的陰干一般指即將藥材放置于室內(nèi)、室外或大棚的陰涼處、利用流動的空氣，吹去水分而達到干燥的目的，本發(fā)明中所述的“陰干后的鼠麹草”一般指水分的質(zhì)量含量約為4％的鼠麹草。所述的鼠麹草與所述的濃縮液的質(zhì)量體積比可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明優(yōu)選1∶0.5～1∶2kg/l，更優(yōu)選1∶0.5～1∶1kg/l。所述的石油醚的用量可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明中所述的濃縮液與所述的石油醚的體積比優(yōu)選1∶1～1∶2；所述的石油醚萃取的次數(shù)可以參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明優(yōu)選2～4次，更優(yōu)選3次。所述的乙酸乙酯的用量可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明中所述的水相與所述的乙酸乙酯的體積比優(yōu)選1∶1～1∶2；所述的乙酸乙酯萃取的次數(shù)可以參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明優(yōu)選2～4次，更優(yōu)選3次。

本發(fā)明所述的鼠麹草提取物的制備方法，還可進一步包括濃縮，干燥所述的乙酸乙酯相的步驟；其中，所述的濃縮優(yōu)選減壓濃縮。

本發(fā)明還提供了一種由上述的制備方法制備得到的鼠麹草提取物。

本發(fā)明還提供了一種如式i所示化合物的制備方法，包括以下步驟：(1)將上述的鼠麹草提取物采用硅膠層析柱進行分離純化，依次以二氯甲烷∶甲醇的體積比為100∶0、50∶1、20∶1、10∶1、4∶1、2∶1、0∶100的洗脫液進行梯度洗脫，收集二氯甲烷∶甲醇為4∶1的洗脫液并濃縮；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物采用c18鍵合硅膠柱進行分離純化，依次以體積濃度為20％、40％、60％、80％以及100％甲醇水溶液洗脫，收集40％甲醇水溶液洗脫液并濃縮；(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物經(jīng)羥丙基葡聚糖凝膠柱進行分離純化，洗脫液為甲醇，收集含式i化合物的洗脫液并濃縮；(4)將步驟(3)所得產(chǎn)物經(jīng)制備型薄層層析板進行分離，以氯仿∶甲醇體積比為4∶1為展開劑，收集rf值為0.79的產(chǎn)物，得到化合物1；或?qū)⒉襟E(3)所得產(chǎn)物經(jīng)制備型薄層層析板進行分離，以氯仿∶甲醇體積比為5∶1為展開劑，收集rf值為0.6的產(chǎn)物，得到化合物3；或?qū)⒉襟E(3)所得產(chǎn)物用制備型高效液相色譜進行分離純化，流動相為體積含量為30％～50％的甲醇水溶液，收集含化合物2的洗脫液，即可；

其中，當(dāng)r¹為h、r²為r³為h、r⁴為r⁵為ch3時，為化合物1；

當(dāng)r¹為r²為h、r³為r⁴為r⁵為h時，為化合物2；

當(dāng)r¹為h、r²為h、r³為r⁴為r⁵為ch3時，為化合物3。

其中，步驟(1)中，所述的鼠麹草提取物優(yōu)選為經(jīng)過“所述的濃縮，干燥所述的乙酸乙酯相”后得到的鼠麹草提取物。所述的鼠麹草提取物與每個梯度洗脫液的用量的質(zhì)量體積比可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明優(yōu)選5～15g/l，更優(yōu)選9.6g/l。所述的硅膠層析柱中，硅膠的規(guī)格可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明優(yōu)選200～300目的硅膠。

其中，步驟(2)中，所述的c18鍵合硅膠柱的規(guī)格可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明中所述的c18鍵合硅膠柱的柱內(nèi)徑×柱長優(yōu)選為4×36cm。步驟(2)中每個梯度洗脫液的用量可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明中，步驟(1)中所述的鼠麹草提取物與步驟(2)中每個梯度洗脫液的用量的質(zhì)量體積比優(yōu)選50～150g/l，更優(yōu)選96g/l。

其中，步驟(3)中，所述的羥丙基葡聚糖凝膠柱的規(guī)格可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明中所述的羥丙基葡聚糖凝膠柱的柱內(nèi)徑×柱長優(yōu)選3×90cm。

其中，步驟(4)中，所述的制備型高效液相色譜的色譜柱優(yōu)選為c18鍵合硅膠柱；所述的c18鍵合硅膠柱優(yōu)選為kromasil生產(chǎn)的100-5-c18柱，柱內(nèi)徑×柱長為10×250mm。所述的制備型薄層層析板優(yōu)選hsgf254薄層層析板。

本發(fā)明還提供了一種上述的鼠麹草提取物在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種上述的鼠麹草提取物在制備用于治療和/或預(yù)防由尿酸水平高引起的相關(guān)病癥藥物中的應(yīng)用，或在制備用于調(diào)節(jié)尿酸水平功能食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其含有上述的鼠麹草提取物和藥學(xué)可接受的賦形劑。

本發(fā)明所述的“由尿酸水平高引起的相關(guān)病癥”可為高尿酸血癥和/或痛風(fēng)。所述的調(diào)節(jié)尿酸水平功能食品一般指降低尿酸水平的功能食品。

在不違背本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明所述的鼠麹草提取物中活性提取物的活性成分較為集中，具有較強的黃嘌呤氧化酶抑制；且鼠麹草野生資源豐富，藥材成本低廉，開發(fā)潛力巨大。

附圖說明

圖1為實施例1制得的鼠麹草提取物的hplc-uv指紋圖譜(280nm)以及活性成分的指認。

具體實施方式

下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

實施例1

陰干后鼠麹草切段，稱取5kg，與60％(v/v)乙醇水溶液75l(1∶15，kg/l)比例混合，加熱回流提取4次，每次2h，合并提取液。提取液減壓濃縮(60℃)至5l(鼠麹草∶濃縮液體積1∶1，kg/l)，得提取濃縮液。

提取濃縮液加入60～90℃石油醚萃取3次，每次濃縮液與石油醚體積比1∶1(v/v)，棄掉石油醚相，得水相。水相加入乙酸乙酯，萃取3次，每次水相與乙酸乙酯體積比1∶1(v/v)，萃取之后合并乙酸乙酯相，減壓至干，得鼠麹草提取物102.3g。

將制得的鼠麹草提取物(96g)經(jīng)200-300目硅膠柱層析(規(guī)格：7×60cm)分離，依次用二氯甲烷∶甲醇(體積比100∶0、50∶1、20∶1、10∶1、4∶1、2∶1以及0∶100)洗脫，每個梯度使用溶劑10l，蒸干溶劑，分別收集每個梯度的洗脫溶劑，蒸干。后將梯度二氯甲烷∶甲醇為4∶1的洗脫部分經(jīng)c18鍵合硅膠柱層析(規(guī)格：4×36cm)分離，分別經(jīng)20％、40％、60％、80％以及100％甲醇水溶液洗脫，洗脫體積各為1l，分別收集每個梯度的洗脫溶劑，蒸干。將收集到的40％甲醇水溶液洗脫部分經(jīng)羥丙基葡聚糖凝膠柱(sephadexlh20柱)(規(guī)格：3×90cm)分離，洗脫溶劑為甲醇，收集洗脫液后再經(jīng)①制備型薄層層析板(煙臺江友，20×20cm，hsgf254；展開劑氯仿∶甲醇4∶1，rf值0.79)精制得化合物1(8mg)；②制備型高效液相色譜(島津lc20adxr雙泵，檢測器20a；色譜柱：kromasil，100-5-c18，10×250mm；色譜條件：50％甲醇水溶液(v/v)等度洗脫)純化得到化合物2(20mg)；③制備型薄層層析板(煙臺江友，20×20cm，hsgf254；展開劑氯仿∶甲醇5∶1，rf值0.6)精制得化合物3(21mg)。

圖1為實施例1制備得到的鼠麹草提取物的hplc-uv指紋圖譜(280nm)以及活性成分的指認圖。從圖1中可以看出，該實施例1制得的鼠麹草提取物中富含：木犀草素(峰3)、芹菜素(峰6)、槲皮素(峰1)、山柰酚(峰7)、3，5-二咖啡酰奎寧酸甲酯(化合物1，methyl3，5-di-o-caffeoylquinate，峰2)、1，4，5-三咖啡酰奎寧酸(化合物2，1，4，5-tri-o-caffeoylquinicacid，峰5)、4，5-二咖啡?？鼘幩峒柞?化合物3，methyl4，5-di-o-caffeoylquinate，峰4)等活性成分。

hplc的測試條件如下：uflc-dad檢測，泵：島津lc-20adxr；自動進樣器：sil-20axr；檢測器：spd-m20a；柱溫箱：cto-20a；色譜柱：安捷倫zorbaxrrhdeclipsexdb-c18，2.1×150mm，1.8μm；a相：h2o+0.2％(v/v)的甲酸；b相：乙腈；初始流動相濃度12％(v/v)b相；流速：0.3ml/min；柱溫：40℃；初始壓力：38.2mpa；pda：200-400nm；波長280nm檢測；進樣體積：2μl；洗脫程序：0-5min12％b，5-10min12-15％b，10-15min15％b，15-20min15-20％b，20-30min20-30％b，30-45min30-100％b，45-50min100％b，50-53min12％b。

山柰酚和槲皮素通過與其相應(yīng)的對照品比較確認其結(jié)構(gòu)。對照品：山柰酚(≥97％，hplc)，槲皮素(≥95％，hplc)均購于sigma-aldrich(美國)。

木犀草素、芹菜素、3，5-二咖啡?？鼘幩峒柞?、1，4，5-三咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩峒柞?，從鼠麹草提取物中分離得到，并通過光譜數(shù)據(jù)與文獻對比鑒定其結(jié)構(gòu)。光譜數(shù)據(jù)總結(jié)如下：

芹菜素：黃色粉末：esi-ms，m/z：269.05[m-h]^-；539.06[2m-h]^-；575.03[2m+cl]^-；¹h-nmr(400mhz，cd3od+cdcl31∶1)，δh7.80(2h，d，j＝8.4，h-2′and6′)，6.93(2h，d，j＝8.4，h-3′and5′)，6.53(1h，s，h-3)，6.45(1h，brs，h-8)，6.25(1h，brs，h-6).

木犀草素：黃色粉末：esi-ms，m/z：309.05[m+na]⁺；285.06[m-h]^-；571.08[2m-h]^-；¹h-nmr(400mhz，cd3od)，δh7.40(1h，dd，j＝2.0，8.9，h-6′)，7.39(1h，d，j＝2.0，h-2′)，6.92(1h，d，j＝8.9，h-5′)，6.55(1h，s，h-3)，6.45(1h，d，j＝1.8，h-8)，6.22(1h，d，j＝1.8，h-6).

3，5-二咖啡?？鼘幩峒柞?化合物1，methyl3，5-di-o-caffeoylquinate)：黃色粉末：esi-ms，m/z：553.09[m+na]⁺；1083.17[2m+na]⁺；529.03[m-h]^-；¹h-nmr(400mhz，cd3od)，twocaffeoylgroups：δh7.61，7.54(1heach，d，j＝16.0，h-7′，7″)，7.06，7.05(1heach，d，j＝1.8，h-2′，2″)，6.96，6.95(1heach，dd，j＝8.2，1.8，h-6′，6″)，6.79，6.77(1heach，d，j＝8.2，h-5′，5″)，6.34，6.21(1heach，d，j＝16.0，h-8′，8″)；quinicacidsegment：δh5.39(1h，m，h-3)，5.30(1h，m，h-5)，3.97(1h，dd，j＝3.2，6.6，h-4)，2.33(1h，dd，j＝13.2，3.8，h-2eq)，2.19-2.28(2h，m，h-6)，2.11-2.17(1h，m，h-2ax)，3.68(3h，s，-och3).¹³c-nmr(100mhz，cd3od)，twocaffeoylgroups：δc168.8，167.9(c-9′，9″)，149.8，149.8(c-4′，4″)，147.5，147.2(c-7′，7″)，146.9，146.8(c-3′，3″)，127.9，127.6(c-1′，1″)，123.1，123.0(c-6′，6″)，116.6，116.5(c-5′，5″)，115.4，115.2(c-2′，2″)，114.8(c-8′，8″)；quinicacidsegment：δc175.6(c-7)，74.6(c-1)，72.2(c-5)，72.0(c-3)，69.7(c-4)，36.7(c-6)，35.6(c-2)，53.0(-och3).

1，4，5-三咖啡?？鼘幩?即化合物2，1，4，5-tri-o-caffeoylquinicacid)：黃色粉末：esi-ms，m/z：701.02[m+na]⁺；676.95[m-h]^-；¹h-nmr(400mhz，cd3od)，threecaffeoylgroups：δh7.62，7.62，7.53(1heach，d，j＝15.8，h-7′，7″，7″′)，7.10，7.03，7.02(1heach，d，j＝2.0，h-2′，2″，2″′)，6.98，6.91，6.91(1heach，dd，j＝8.3，2.0，h-6′，6″，6″′)，6.81，6.76，6.76(1heach，d，j＝8.3，h-5′，5″，5″′)，6.36，6.30，6.21(1heach，d，j＝15.8，h-8′，8″，8″′)；咖啡酸片段：δh5.71(1h，m，h-5)，5.16(1h，dd，j＝9.5，3.3，h-4)，4.44(1h，m，h-3)，2.63-2.71(2h，m，h-2eq，6eq)，2.44(1h，m，h-2ax)，2.18(1h，m，h-6ax).¹³c-nmr(125mhz，cd3od)，threecaffeoylgroups：δc168.6，168.4，168.3(c-9′，9″，9″′)，149.5，149.5，149.4(c-4′，4″，4″′)，147.7，147.7，147.6(c-7′，7″，7″′)，146.7(c-3′，3″，3″′)，128.0，127.7，127.6(c-1′，1″，1″′)，123.1，123.1，123.0(c-6′，6″，6″′)，116.5(c-5′，5″，5″′)，115.2(c-2′，2″，2″′)，115.2，114.8，114.7(c-8′，8″，8″′)；quinicacidsegment：δc173.2(c-7)，82.4(c-1)，75.9(c-4)，68.8(c-5)，68.3(c-3)，36.3(c-2)，38.3(c-6).

4，5-二咖啡酰奎寧酸甲酯(即化合物3，methyl4，5-di-o-caffeoylquinate)：黃色粉末：esi-ms，m/z：553.09[m+na]⁺；1083.17[2m+na]⁺；529.03[m-h]^-；¹h-nmr(400mhz，cd3od)，twocaffeoylgroups：δh7.50，7.60(1heach，d，j＝16.0，h-7′，7″)，7.03，7.01(1heach，d，j＝1.8，h-2′，2″)，6.92，6.90(1heach，dd，j＝8.2，1.8，h-6′，6″)，6.76(2h，d，j＝8.2，h-5′，5″)，6.29，6.16(1heach，d，j＝16.0，h-8′，8″)；quinicacidsegment：δh5.55(1h，ddd，j＝5.4，6.9，8.0，h-5)，4.36(1h，ddd，j＝3.1，3.1，6.1，h-3)，5.11(1h，dd，j＝3.1，8.4，h-4)，2.31(1h，dd，j＝13.9，3.2，h-2a)，2.10(1h，dd，j＝13.9，5.9，h-2b)，2.24(2h，d，j＝6.9，h-6)，3.73(3h，s，-och3).¹³c-nmr(100mhz，cd3od)，twocaffeoylgroups：δc168.5，168.0(c-9′，9″)，149.6，149.5(c-4′，4″)，147.7，147.6(c-7′，7″)，146.6(c-3′，3″)，127.7，127.5(c-1′，1″)，123.1(c-6′，6″)，116.5(c-5′，5″)，115.2(c-2′，2″)，114.7，114.5(c-8′，8″)；quinicacidsegment：δc175.3(c-7)，75.9(c-1)，75.0(c-4)，68.9(c-3)，68.7(c-5)，38.7(c-6)，38.3(c-2)，53.2(-och3).

實施例2

陰干后鼠麹草切段，稱取0.6kg，與50％(v/v)乙醇水溶液6l(1∶10，kg/l)比例混合，加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液。提取液減壓濃縮(60℃)至1.2l(鼠麹草∶濃縮液體積1∶2，kg/l)，得提取濃縮液。

提取濃縮液加入60～90℃石油醚萃取2次，每次濃縮液與石油醚體積比1∶2(v/v)，棄掉石油醚相，得水相。水相加入乙酸乙酯，萃取2次，每次水相與乙酸乙酯體積比1∶2(v/v)，萃取之后合并乙酸乙酯相，減壓至干，得鼠麹草提取物11.7g。

實施例3

陰干后鼠麹草切段，稱取2kg，與80％(v/v)乙醇水溶液40l(1∶20，kg/l)比例混合，加熱回流提取2次，每次2h，合并提取液。提取液減壓濃縮(60℃)至1l(鼠麹草∶濃縮液體積1∶0.5，kg/l)，得提取濃縮液。

提取濃縮液加入60～90℃石油醚萃取4次，每次濃縮液與石油醚體積比1∶1(v/v)，棄掉石油醚相，得水相。水相加入乙酸乙酯，萃取4次，每次水相與乙酸乙酯體積比1∶1(v/v)，萃取之后合并乙酸乙酯相，減壓至干，得鼠麹草提取物42.3g。

對比實施例1：按照現(xiàn)有文獻linw，xiej，wux，yangl，wangh.inhibitionofxanthineoxidaseactivitybygnaphaliumaffineextract.chinesemedicalsciencesjournal，2014.29(4)，225-230中的第226頁“plantmaterial部分第8行”的制備方法制備得到鼠麹草提取物(體積百分比為95％的乙醇水溶液進行提取)。

對比實施例2：陰干后鼠麹草切段，稱取0.5kg，與95％(v/v)乙醇4l(1∶8，kg/l)混合，加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液。提取液減壓濃縮(60℃)至干，得鼠麹草提取物64.8g。

對比實施例3：陰干后鼠麹草切段，稱取0.5kg，與60％(v/v)乙醇7.5l(1∶15，kg/l)混合，加熱回流提取4次，每次2h，合并提取液。提取液減壓濃縮(60℃)至干，得鼠麹草提取物78.7g。

效果實施例1黃嘌呤氧化酶體外抑制活性實驗

藥品與試劑：別嘌醇購自百靈威j&k；黃嘌呤購自百靈威j&k；黃嘌呤氧化酶購自sigmaaldrich，美國。

儀器：酶標(biāo)儀-thermoscientificvarioskanflash，美國。

待測化合物用二甲亞砜(dmso)溶解，4℃保存，實驗前取出解凍，并用70mm磷酸鹽緩沖液稀釋，使最終反應(yīng)體系終濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.1、1.5μg/ml或μm。

96孔板孔內(nèi)加入30μl酶溶液(0.01u/ml，溶劑：70mm磷酸鹽緩沖液)，加入35μl70mm磷酸鹽緩沖液(ph＝7.5)，加入50μl受試樣品溶液(溶劑：70mm磷酸鹽緩沖液，其中dmso占反應(yīng)體系總體積不高于0.25％，v/v)，25℃孵育15min，使受試樣品與酶充分接觸。反應(yīng)開始：孔內(nèi)加入60μl黃嘌呤溶液(濃度：300μm，溶劑：70mm磷酸鹽緩沖液)，25℃孵育30min，使反應(yīng)充分。反應(yīng)終止：加入25μl1n鹽酸溶液。295nm下檢測od值。每個反應(yīng)重復(fù)3次，取均值。

酶抑制率％＝(1-b/a)×100，其中b為既含有受試樣品又含酶和底物反應(yīng)體系的od值，a為不含受試樣品只含酶和底物反應(yīng)體系的od值。

實驗結(jié)果表明，實施例1-3制得的鼠麹草提取物均有很強的黃嘌呤氧化酶抑制活性，與對比實施例1～3相比，實施例1～3制得的鼠麹草提取物的黃嘌呤氧化酶抑制活性更強。結(jié)果如表1所示：

表1.受試樣品黃嘌呤氧化酶抑制活性

與對比實施例1比較：^*p＜0.05，^**p＜0.01；與對比實施例2比較^#p＜0.05，^##p＜0.01，^###p＜0.001；與對比實施例3比較^&&p＜0.01。