本發(fā)明涉及糞菌移植在治療帕金森病方面的應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)神經(jīng)藥理學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：帕金森病(parkinson’sdisease，pd)是最常見的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為：靜止震顫、行動(dòng)遲緩、站立不穩(wěn)以及姿勢反射障礙。帕金森病患者腦部的主要病變部位為黑質(zhì)及紋狀體，其中黑質(zhì)致密部內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的死亡和數(shù)量減少是造成投射到紋狀體內(nèi)多巴胺減少的直接原因。作為僅次于阿爾茨海默癥的第二大神經(jīng)退行性疾病，帕金森病隨年齡的增加其發(fā)病率和患病率均急劇增加，在60歲以上老年人中患病率達(dá)1％，85歲以上人群達(dá)5％-6％，目前我國的帕金森病患者數(shù)量超過200萬。pd的發(fā)病與老化、環(huán)境及遺傳因素有關(guān)，但pd發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。研究表明，氧化應(yīng)激損傷、自噬、免疫炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡等病理機(jī)制相互作用，可能影響了pd的發(fā)生和發(fā)展。最近研究表明腸道菌群失衡或與pd的發(fā)生及臨床表型有關(guān)。目前我國已逐漸進(jìn)入老齡化社會(huì)，隨著老齡人口的增加，pd患者的數(shù)量也將迅速增加。由于該病病程長、致殘率高、缺乏有效治愈手段，患者、家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)極其沉重。因此，找到有效治療pd的治療方式和藥物已經(jīng)到了刻不容緩的地步。目前臨床針對帕金森病的治療主要有藥物干預(yù)治療以及神經(jīng)核團(tuán)毀損術(shù)、腦深部電刺激術(shù)或神經(jīng)組織及干細(xì)胞移植等外科手術(shù)的治療，以及仍處于實(shí)驗(yàn)階段的細(xì)胞治療和基因治療。其中藥物治療大多是對癥治療，可暫時(shí)緩解癥狀，但不能抑制或延緩疾病的進(jìn)程，而手術(shù)治療具有一定的適應(yīng)癥，且費(fèi)用較高。與藥物治療不同，糞菌移植(fecalmicrobiotatransplantation，fmt)作為一種特殊的器官移植和可以重建腸道菌群的療法被臨床所關(guān)注，目前主要應(yīng)用于復(fù)發(fā)性難辨梭菌感染、炎癥性腸病、腸易激綜合征等腸道疾病以及代謝性疾病和自閉癥，具有治愈率高，不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，對于治療pd方面的報(bào)道極少，其巨大作用潛力有待發(fā)掘。fmt是將健康人糞便中的功能菌群移植至患者胃腸道內(nèi)，重建具有正常功能的腸道菌群，以此治療腸道和腸道外疾病。東晉時(shí)期，葛洪所編著《肘后方》就有關(guān)于fmt的記載。明朝時(shí)期由李時(shí)珍編著的《本草綱目》中也有人糞(黃龍湯)治療嚴(yán)重腹瀉和食物中毒的內(nèi)容。目前，fmt已開始應(yīng)用于臨床難辨梭菌感染、炎性腸病、腸易激綜合征等腸道疾病，fmt還可能用于治療腸道免疫缺陷和過敏、肥胖、非酒精性脂肪肝、兒童自閉癥等疾病。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有臨床治療帕金森病的治療方式和藥物的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有潛在治療帕金森病作用的治療方式和藥物。本發(fā)明通過建立c57bl/6j小鼠帕金森病模型，觀察糞菌移植對帕金森病小鼠運(yùn)動(dòng)障礙癥狀，通過實(shí)驗(yàn)論證，fmt能改善帕金森病小鼠的運(yùn)動(dòng)遲緩癥狀，改善黑質(zhì)致密部神經(jīng)元，從而證明fmt對帕金森病具有神經(jīng)保護(hù)作用。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種緩解和/或輔助治療和/或治療帕金森病的藥物或者藥物組合物，所述藥物或者藥物組合物以糞便菌群作為有效成分或者主要有效成分。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物或者藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的賦型劑。所述藥學(xué)上可接受的賦型劑是指任何可用于藥學(xué)領(lǐng)域的稀釋劑、輔助劑和/或載體。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物或者藥物組合物中含有質(zhì)量百分比大于99％的糞便菌群和質(zhì)量百分比小于1％的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的糞便菌群可以與其他活性成分組合使用，只要它們不產(chǎn)生其他不利的作用，例如過敏反應(yīng)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療物可配制成若干種劑型，其中含有藥學(xué)領(lǐng)域中常用的一些賦形劑；例如，口服制劑(如片劑，膠囊劑，溶液或混懸液)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，用于本發(fā)明藥物組合物的載體是藥學(xué)領(lǐng)域中可得到的常見類型，包括：口服制劑用的粘合劑、潤滑劑、崩解劑、助溶劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、無色素、矯味劑等。藥物制劑可以經(jīng)口服或胃腸外方式(例如腸內(nèi)腸外營養(yǎng))給藥，如果某些藥物在胃部條件下是不穩(wěn)定的，可將其配制成腸衣片劑。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種改善運(yùn)動(dòng)能力的藥物，所述藥物以糞便菌群作為有效成分或者主要有效成分。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種提高紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶表達(dá)的藥物，所述藥物以糞便菌群作為有效成分或者主要有效成分。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種緩解和/或輔助治療和/或治療帕金森病的保健食品、飲品、腸內(nèi)營養(yǎng)制劑或者膳食補(bǔ)充劑，所述保健食品、飲品、腸內(nèi)營養(yǎng)制劑或者膳食補(bǔ)充劑以糞便菌群為主要有效成分。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供糞菌移植的新應(yīng)用。所述應(yīng)用，是制備緩解和/或輔助治療和/或治療帕金森病的藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑。在本發(fā)明中，所述糞便菌群是指無帕金森病的正常動(dòng)物體或健康人的糞便菌群。在本發(fā)明中，所述糞便菌群是指健康人糞便中的菌群。在本發(fā)明中，所述糞便菌群是取正常動(dòng)物體的糞便，稀釋、振蕩，過濾得到的菌液。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過建立小鼠帕金森病模型，觀察糞菌移植對帕金森病小鼠運(yùn)動(dòng)障礙癥狀，通過實(shí)驗(yàn)論證，糞菌移植能改善帕金森病小鼠的運(yùn)動(dòng)遲緩癥狀，改善黑質(zhì)致密部神經(jīng)元，從而證明糞菌移植對帕金森病具有神經(jīng)保護(hù)作用。本發(fā)明使用糞菌移植，明顯改善紋狀體內(nèi)多巴胺含量，小鼠的運(yùn)動(dòng)能力、黑質(zhì)致密部的酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元細(xì)胞等有了顯著的提高或者改善。附圖說明圖1：糞菌移植對mptp誘導(dǎo)帕金森模型小鼠的體重變化影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖2：糞菌移植對mptp誘導(dǎo)帕金森模型小鼠運(yùn)動(dòng)行為學(xué)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；其中，圖2a為爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖2b為懸掛實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖3：糞菌移植對mptp誘導(dǎo)帕金森模型小鼠糞便短鏈脂肪酸含量影響圖；其中，圖3a為乙酸含量，圖3b為丙酸含量，圖3c為正丁酸含量，圖3d為正戊酸含量；圖4：糞菌移植對mptp誘導(dǎo)帕金森模型小鼠腸道炎癥影響圖；其中，圖4a為tnfαmrna含量，圖4b為traf2mrna含量，圖4c為tlr4mrna含量，圖4d為nfκbmrna含量；圖5：糞菌移植對mptp誘導(dǎo)的pd小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用；圖6：空白組小鼠(c)和pd小鼠模型(m)糞便菌群構(gòu)成差異。具體實(shí)施方案下面通過具體實(shí)施進(jìn)一步闡述本發(fā)明方法，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1：動(dòng)物模型的建立和分組體重20-25g，8周齡，雄性c57bl/6j小鼠，隨機(jī)分為對照組，mptp模型組(先給mptp后給甘油pbs混合液)，fmt給菌組(先給mptp后給正常小鼠糞便菌液)，每組20只。置于23±2℃，照明時(shí)間為12h/day，動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境一周后開始給予藥物。mptp模型組每日腹腔注射mptp(30mg/kg)一次，連續(xù)5天，后每日甘油pbs混合液灌胃一次，連續(xù)7天。給藥組每日腹腔注射mptp(30mg/kg)一次，連續(xù)5天，后每日正常小鼠糞便菌液灌胃一次，連續(xù)7天。對照組全程給予腹腔注射生理鹽水，連續(xù)12天。實(shí)驗(yàn)過程中記錄各組小鼠的體重變化并采集各組小鼠糞便。隨后通過爬桿實(shí)驗(yàn)對小鼠的行為學(xué)進(jìn)行評價(jià)，然后通過gc-ms檢測糞便短鏈脂肪酸的含量，qpcr檢測腸內(nèi)炎癥因子表達(dá)情況。通過以上方法來評價(jià)糞菌移植對帕金森病小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。一、體重監(jiān)測各組小鼠分別在進(jìn)行給藥操作前進(jìn)行稱重并記錄，連續(xù)稱重至給藥結(jié)束。體重監(jiān)測結(jié)果如圖1所示，在進(jìn)行mptp第一天給藥后，模型組與給菌組小鼠均出現(xiàn)體重下降現(xiàn)象，適應(yīng)后體重均緩慢上升。給菌治療操作后，給菌組小鼠體重較模型組小鼠體重有升高的現(xiàn)象。體重監(jiān)測證實(shí)fmt能改善帕金森小鼠的體重減輕現(xiàn)象。二、行為學(xué)評價(jià)各組小鼠分別在給予行為學(xué)檢測前三天進(jìn)行訓(xùn)練，每天一次，于給藥結(jié)束后第一天進(jìn)行行為學(xué)檢測。爬桿實(shí)驗(yàn)(poletest)：自制爬桿架：選擇長55cm，直徑lcm的金屬管，外緊裹紗布防滑，上端覆以直徑2cm的球形突起(實(shí)驗(yàn)時(shí)作為小鼠的附著點(diǎn))，然后將其固定于金屬底座，放置在鼠籠中，底座用敷料覆蓋。測試時(shí)將小鼠頭朝上置于球形突起，記錄其自放置桿至爬至桿底后肢著地的時(shí)間，測3次取平均值，每次間隔10分鐘以上。如小鼠出現(xiàn)中途停頓或反向攀爬，則重新測量。該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要經(jīng)過提前訓(xùn)練3天。利用爬桿實(shí)驗(yàn)檢測小鼠運(yùn)動(dòng)能力，如圖2a所示。檢測結(jié)果顯示，空白組、模型組、給菌組的小鼠的爬桿平均時(shí)間分別為3.635s、5.153s、4.325s。與空白組小鼠比較，模型組小鼠爬桿所需時(shí)間增加，運(yùn)動(dòng)的速度減慢。結(jié)果證實(shí)注射mptp的小鼠活動(dòng)能力減弱。給菌組的小鼠較模型組小鼠所需時(shí)間減少，速度較快，與模型組比較具有顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果證實(shí)fmt能改善帕金森病小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。懸掛實(shí)驗(yàn)(tractiontest)：在兩金屬立柱之間水平拉緊一條金屬線，直徑1mm，距地面30cm。實(shí)驗(yàn)時(shí)讓小鼠用兩前爪懸掛在一水平金屬線上停留10s，測3次取平均值，每次間隔10分鐘以上。小鼠懸掛能力評分標(biāo)準(zhǔn)：在測試時(shí)間內(nèi)，小鼠能夠用兩后爪抓住金屬線計(jì)為3分，小鼠僅用一后爪抓住金屬線計(jì)為2分，兩后爪均抓不住金屬線計(jì)為1分，小鼠跌落計(jì)為0分。同時(shí)每次實(shí)驗(yàn)前觀察每只小鼠是否有震顫、豎毛、前腿抬高、豎尾、動(dòng)作緩慢、減少等異常行為。該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要經(jīng)過提前訓(xùn)練3天。利用懸掛實(shí)驗(yàn)檢測小鼠運(yùn)動(dòng)能力，如圖2b所示。檢測結(jié)果顯示，空白組、模型組、給菌組的小鼠的懸掛實(shí)驗(yàn)平均得分分別為2.788s、2.091s、2.667s。與空白組小鼠比較，模型組小鼠懸掛得分低，運(yùn)動(dòng)靈活性下降。結(jié)果證實(shí)注射mptp的小鼠活動(dòng)能力減弱。給菌組的小鼠較模型組小鼠懸掛得分高，靈活性高，與模型組比較具有顯著性差異(p<0.01)給菌結(jié)果證實(shí)fmt能改善帕金森病小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。三、gc-ms檢測糞便短鏈脂肪酸的含量(1)樣品處理每組收集8只小鼠的糞便組織于1.5mlep管中，所得取材立即轉(zhuǎn)移到-80℃保存。測量時(shí)每1mg糞便加入10μlddh2o(10％，w/v)，用混懸儀制備成勻漿，13000r/min，4℃離心5min，0.2μm濾膜過濾，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用gc-ms法檢測小鼠糞便短鏈脂肪酸含量。(2)gc-ms檢測(a)色譜條件：日本shimadzu公司rtx-wax(0.25mm×30.0m，0.25μm)；分流進(jìn)樣；載氣，超純氦；柱溫箱溫度：100℃；進(jìn)樣口溫度：240℃；升溫程序見下表；分流進(jìn)樣，總流速:12.7ml/min，分流比：10.0:1；總程序時(shí)間：9.67min。(b)質(zhì)譜條件：離子源(ei源)溫度：220℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲：2.5min；選擇離子掃描：43m/z、74m/z；具體條件如表1。表1速率最終溫度保持時(shí)間7.50140.00.0060.00230.03.00(c)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將短鏈脂肪酸品用超純水制成濃度為1mg/ml的貯備液，再用超純水稀釋成5，10，20，40，60，80，100μg/ml的對照品溶液，取10μl注入色譜儀進(jìn)行分析，得到對照品溶液色譜圖。以各標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)(x)，各組分的峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，與空白組的正常小鼠比較，模型組帕金森病小鼠糞便短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸)含量明顯上升，具有顯著性差異(p<0.05，其中乙酸p<0.01)；給菌組小鼠糞便短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸)含量較模型組小鼠明顯下降(乙酸p<0.001，丙酸p<0.01，正丁酸p<0.05，正戊酸p<0.01)，結(jié)果證明模型組小鼠腸道菌群出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，導(dǎo)致腸道短鏈脂肪酸代謝異常，fmt能改善腸道菌群失衡狀態(tài)并調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸代謝。四、qrt-pcr檢測結(jié)腸炎癥水平變化(1)樣品處理每組取8只小鼠，使用異氟烷吸入式麻醉，剪破右心耳，從左心室進(jìn)針灌注生理鹽水，找到盲腸解剖位置后在其下方1～2cm處取結(jié)腸組織2cm于1.5mlep管中，所有操作均在冰浴上進(jìn)行，所得取材立即轉(zhuǎn)移到-80℃保存。(2)總rna提取(a)用精密天平稱量10mg結(jié)腸組織1.5mlep管中，先加入500μlbufferly，后加入10μlβ-巰基乙醇，用超聲破碎儀破碎組織，使組織完全裂解。(b)將裂解的組織液移入dna柱子(置于2ml的收集管中)，13000rpm離心2min，棄掉dna柱子，保留收集管中的液體。(c)在收集管中加入500μl的乙醇，混勻。(d)將收集管中的液體移入rna柱子(置于2ml的收集管中)，13000rpm離心1min，棄掉收集管，將rna柱子放入一個(gè)新的收集管中。(e)在rna柱子中加入500μl的bufferrb，13000rpm離心30s，棄掉收集管中的液體，將rna柱子放回收集管中。(f)在rna柱子中加入500μl的rnawashbuffer，13000rpm離心1min，棄盡收集管中的液體，將rna柱子重新放回收集管中。(g)在rna柱子中加入500μl的rnawashbuffer，13000rpm離心30s，棄掉收集管，將rna柱子放入一個(gè)新的收集管中。(h)13000rpm離心2min，打開離心管蓋子，并在室溫中放置10min，以確保乙醇完全揮發(fā)。(i)將rna柱子轉(zhuǎn)移到無rna酶的離心管中(1.5ml)，加入30μldepc水，13000rpm離心1min，收集rna溶液，-80℃保存?zhèn)溆谩?3)將rna反轉(zhuǎn)成cdna反應(yīng)體系(10μl)：5×primescriptbuffer2μl、totalrna8μl；反應(yīng)條件：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保持。(4)熒光定量pcr反應(yīng)反應(yīng)體系(10μl)：2×sybrpremixextaqⅱ5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、cdna模板1μl、滅菌水3μl；反應(yīng)條件：95℃30秒；95℃5秒，55℃30秒，72℃30秒，40個(gè)循環(huán)，記錄ct值階段；添加溶解曲線。(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖4所示。與空白組正常小鼠對比，未經(jīng)給藥的帕金森病小鼠的結(jié)腸的炎癥因子(tnfα、traf2、tlr4、nfκb，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)表達(dá)明顯升高，給菌組小鼠結(jié)腸的炎癥因子(tnfα、traf2、tlr4、nfκb，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)較模型組小鼠明顯下降。結(jié)果證明模型組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)炎癥，本發(fā)明使用糞菌移植有助于降低帕金森病小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥現(xiàn)象。五、fmt對mptp誘導(dǎo)的pd小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用對小鼠黑質(zhì)行th(多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物，綠色熒光)及iba-1免疫熒光染色(激活的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，紅色熒光)。th染色結(jié)果(圖5)顯示模型組th陽性細(xì)胞數(shù)量少于空白組，而給菌組th陽性細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，說明fmt能明顯改善mptp誘導(dǎo)的pd小鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡的現(xiàn)象。iba-1染色結(jié)果顯示模型組小鼠iba-1陽性細(xì)胞較空白組明顯增多，而給菌組iba-1陽性細(xì)胞較模型組減少，說明fmt能抑制mptp誘導(dǎo)的pd小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的現(xiàn)象，對神經(jīng)炎癥有抑制作用(n＝3～4)。六、糞便菌群構(gòu)成差異如圖6所示，方點(diǎn)代表空白組小鼠，圓點(diǎn)代表pd小鼠。pc1為第一主坐標(biāo)，pc3為縱坐標(biāo)。本發(fā)明納入的10個(gè)樣本在pc1-pc3坐標(biāo)系中的分布顯示空白小鼠和pd小鼠兩組樣本有明顯的分開趨勢且兩組樣品聚類明顯，說明兩組間腸道菌群構(gòu)成具有明顯差異且同組樣品間相似性明顯(n＝5)。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁12