本發(fā)明涉及基于與牙釉質(zhì)、牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)表面強(qiáng)結(jié)合的非晶形聚磷酸鈣(ca-聚p)納米顆?；蛭⒘?，封閉由于釉質(zhì)缺損而暴露于牙齒表面的牙本質(zhì)小管的方法。本發(fā)明的方法也可用于制備具有形態(tài)發(fā)生活性的牙齒植入物。本發(fā)明另一方面涉及在視黃醇包封之后(“視黃醇/aca-聚p納米球或微球”)，將此類納米顆?；蛭⒘饺雮诜罅虾屠缤ㄟ^(guò)靜電紡絲制備的相關(guān)材料中。得到的本發(fā)明的視黃醇/aca-聚p納米球或微球纖維墊顯示出抗微生物特性和傷口愈合特性，并且發(fā)現(xiàn)其以協(xié)同作用的方式增加編碼瘦素和瘦素受體以及脂肪酸結(jié)合蛋白4(fabp4)的基因的表達(dá)。本發(fā)明的材料是第一種可用于通過(guò)影響瘦素/瘦素受體的表達(dá)來(lái)促傷口愈合的材料。

發(fā)明背景

齲齒和牙齒過(guò)敏癥屬于全世界最常見(jiàn)的疾病。它們?cè)斐傻墓残l(wèi)生系統(tǒng)的費(fèi)用是巨大的。由于釉質(zhì)或牙骨質(zhì)損失，牙本質(zhì)小管變得暴露于牙齒表面。后果是諸如牙本質(zhì)過(guò)敏癥、齲齒和牙髓炎癥的一系列牙科疾病/損傷的風(fēng)險(xiǎn)增加。釉質(zhì)和牙骨質(zhì)的去礦化由細(xì)菌生物膜的形成引起，特別是由產(chǎn)酸的變異鏈球菌(streptococcusmutans)引起。

生理學(xué)上，牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)通過(guò)去礦化和再礦化過(guò)程經(jīng)歷持久的重塑。然而，這些過(guò)程，特別是牙齒修復(fù)是緩慢的。可以施用鈣和磷酸根離子以及氟化物，以便部分地重構(gòu)去礦化后留下的表面下?lián)p傷上的晶體殘余。與原生礦物質(zhì)相比，再礦化的晶體對(duì)酸更加耐受，但是更難溶并且更易碎。牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)的生物礦物主要由羥基磷灰石(ha)組成。通過(guò)某些生長(zhǎng)因子(例如牙釉蛋白和成釉蛋白)和酶(例如alp和碳酸酐酶)等控制ha沉積物的形成。

牙本質(zhì)被稱作牙本質(zhì)小管的管狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)所貫穿。這些管受釉質(zhì)(冠)和牙骨質(zhì)(根)的防護(hù)，其形成針對(duì)外部物理和化學(xué)影響如溫度變化和酸的牙髓保護(hù)層，并防止神經(jīng)突起和牙本質(zhì)過(guò)敏癥的影響。伸入牙本質(zhì)層并向牙齒表面開(kāi)口的牙本質(zhì)小管的直徑在1-2.5μm變化。牙齒過(guò)敏癥患者具有更大量的開(kāi)口的牙本質(zhì)小管和/或直徑比正常管大的管。

已經(jīng)采取的再封閉以及使牙本質(zhì)小管脫敏的策略包括：用草酸鈉阻塞牙本質(zhì)小管(greenhilljd,pashleydh(1981)theeffectsofdesensitizingagentsonthehydraulicconductanceofhumandentininvitro.jdentres60:686-698；rusinrp,etal.(2010)effectofanewdesensitizingmaterialonhumandentinpermeability.dentmater26:600-607)。然而：形成的礦物質(zhì)緩慢溶解于人工唾液中(suget,etal.(1995)durationofdentinaltubuleocclusionformedbycalciumphosphateprecipitationmethod:invitroevaluationusingsyntheticsaliva.jdentres74:1709-1714)。

應(yīng)用氟化鈉，其經(jīng)歷僅保持與表面相對(duì)松散附連的晶體的瞬變形成(schluetern,etal.(2009)tin-containingfluoridesolutionsasanti-erosiveagentsinenamel:aninvitrotin-uptake,tissue-loss,andscanningelectronmicrographstudy.eurjoralsci117:427-434)。

通過(guò)用例如下述所列的產(chǎn)品來(lái)再封閉牙齒表面，從而阻塞更多牙本質(zhì)小管表面暴露的部分(達(dá)到10μm深)：舒適達(dá)(sensodyne)、諾華敏(novamin)和高露潔(colgate)舒緩抗過(guò)敏牙膏(sensitivepro-relief)(petroui,etal.(2009)abreakthroughtherapyfordentinhypersensitivity:howdentalproductscontaining8％arginineandcalciumcarbonateworktodelivereffectivereliefofsensitiveteeth.jclindent20:23-31；ayadf,etal.(2009)comparingtheefficacyinreducingdentinhypersensitivityofanewtoothpastecontaining8.0％arginine,calciumcarbonate,and1450ppmfluoridetoacommercialsensitivetoothpastecontaining2％potassiumion:aneight-weekclinicalstudyoncanadianadults.jclindent20:10-16；vahid-golpayeganim,etal.(2012)remineralizationeffectoftopicalnovaminversussodiumfluoride(1.1％)oncaries-likelesionsinpermanentteeth.jdent(tehran)9:68-75)。然而：已發(fā)現(xiàn)這些嘗試不足以針對(duì)牙齒所暴露于的日常機(jī)械力進(jìn)行保護(hù)(moritza,etal.(1998)long-termeffectsofco2laserirradiationontreatmentofhypersensitivedentalnecks:resultsofaninvivostudy.jclinlasermedsurg16:211-215；orchardsonr,gilliamd(2006)managingdentinhypersensitivity.jamdentassoc137:990-998；chiangyc,etal.(2014)amesoporoussilicabiomaterialfordentalbiomimeticcrystallization.acsnano8:12502-12513)。

此外，本發(fā)明產(chǎn)品的其它應(yīng)用市場(chǎng)-傷口愈合市場(chǎng)快速增長(zhǎng)。在2021年，估計(jì)世界傷口處理市場(chǎng)將達(dá)到超過(guò)$185億。主要的市場(chǎng)細(xì)分是先進(jìn)的傷口護(hù)理的市場(chǎng)和潰瘍治療的終止，特別是糖尿病足潰瘍處理的市場(chǎng)。傷口愈合過(guò)程包括至少四個(gè)階段(參見(jiàn)綜述：guos,dipietrola.factorsaffectingwoundhealing.jdentres2010；89:219-229)：a)止血，b)發(fā)炎，c)增殖，以及d)重塑。

階段1：在傷口處理之后立即開(kāi)始的止血階段期間，發(fā)生血管收縮和纖維蛋白凝塊形成。

階段2：在出血被控制之后，釋放促炎性細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，包括血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子。同樣地，發(fā)生了有助于預(yù)防出血的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞以及血小板的連續(xù)浸潤(rùn)。這些細(xì)胞的功能是清除入侵的微生物，以及移除受損組織區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞碎片。這些細(xì)胞產(chǎn)生并釋放具有形態(tài)發(fā)生活性的聚合物，例如來(lái)自血小板的聚磷酸鹽(聚p)(morrisseyjh,choish,smithsa.polyphosphate:anancientmoleculethatlinksplatelets,coagulation,andinflammation.blood2012；119:5972-5979；l,etal.puttingpolyphosphatestothetest:evidenceagainstplatelet-inducedactivationoffactorxii.blood2013；122:3818-3824)。

階段3：在肉芽組織形成期間，特別是在皮膚傷口修復(fù)的早期階段期間，賦予新基質(zhì)(neostroma)其顆粒外觀的新生毛細(xì)血管以及巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管遷移至傷口內(nèi)。

階段4：重塑發(fā)生，其導(dǎo)致疤痕形成。特別地，在該階段期間，對(duì)于功能性再生，參與重塑的細(xì)胞的相互作用需要由成纖維細(xì)胞來(lái)合成細(xì)胞外基質(zhì)。

影響傷口愈合的主要因子包括：

(i)氧化/超氧化物自由基的形成，其參與能量產(chǎn)生和/或氧化殺傷病原體，和/或

(ii)經(jīng)由微生物的感染，所述微生物通常局限于皮膚表面，但有可能侵入下面的組織層。

在傷口愈合期間釋放的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子啟動(dòng)并維持細(xì)胞間的相互作用，并控制浸潤(rùn)細(xì)胞的再生應(yīng)答。除了這些蛋白因子，視黃酸及其前體視黃醇是有效的促進(jìn)再生的刺激物(jettenam.multi-stageprogramofdifferentiationinhumanepidermalkeratinocytes:regulationbyretinoids.jinvestdermatol1990；95:44s–46s；fishergj&voorheesjj.molecularmechanismsofretinoidactionsinskin.fasebj1996；10:1002-1013)。視黃酸通過(guò)激活控制參與視黃酸酯化、由其前體的合成以及代謝的通路的基因，引起差異性基因表達(dá)(leed,etal.retinoid-responsivetranscriptionalchangesinepidermalkeratinocytes.jcellphysiol2009；220:427-439)；同時(shí)，在角化細(xì)胞分化期間視黃酸下調(diào)編碼脂質(zhì)代謝的基因的表達(dá)。與視黃酸相比，視黃醇已被證明顯著改善傷口愈合(keleidarib,etal.theeffectofvitaminaandvitaminconpostoperativeadhesionformation:aratmodelstudy.jresmedsci2014；19:28-32)。

視黃醇代謝轉(zhuǎn)化為視黃酸，特別是在體內(nèi)通過(guò)酶介導(dǎo)的兩步轉(zhuǎn)化，經(jīng)視黃醛轉(zhuǎn)化為視黃酸，并引起視黃酸核受體復(fù)合物內(nèi)的差異性基因表達(dá)(wangl,etal.regulationofalpha2(i)collagenexpressioninstellatecellsbyretinoicacidandretinoidxreceptorsthroughinteractionswiththeircofactors.archbiochembiophys2004；428:92-98)。作為應(yīng)答，細(xì)胞增殖和分化被調(diào)節(jié)。

經(jīng)由內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的恢復(fù)，傷口愈合的新方面是下述發(fā)現(xiàn)：全身施用和局部施用的瘦素改善了小鼠中傷口的上皮再形成(franks,etal.leptinenhanceswoundre-epithelializationandconstitutesadirectfunctionofleptininskinrepair.jclininvest2000；106:501-509)。此外，已經(jīng)顯示在修復(fù)階段期間，位于傷口周邊的角化細(xì)胞表達(dá)瘦素受體。此外，瘦素在體外引發(fā)針對(duì)人角化細(xì)胞的促有絲分裂刺激。那些數(shù)據(jù)通過(guò)以下發(fā)現(xiàn)被證實(shí)：ob/ob(瘦素?zé)o效)和db/db(瘦素受體無(wú)效)小鼠品系在皮膚傷口修復(fù)中顯示出嚴(yán)重缺損(leegh,etal.abnormalsplicingoftheleptinreceptorindiabeticmice.nature1996；379:632-635；friedmanjm,halaasjl.leptinandtheregulationofbodyweightinmammals.nature1998；395,763-770)。

靜電紡絲技術(shù)可用于制備由與高表面區(qū)域松散連接的纖維組成的三維(3d)多孔墊。該技術(shù)利用電場(chǎng)力以產(chǎn)生直徑范圍為2nm至數(shù)微米的聚合物纖維(參見(jiàn)綜述：agarwals,wendorffjh,greinera.progressinthefieldofelectrospinningfortissueengineeringapplications.advmater2009；21:3343-3351；bajia,etal.electrospinningofpolymernanofibers:effectsonorientedmorphology,structuresandtensileproperties.compositesscitechnol2010；70:703-718)。

先前，發(fā)明人描述了由聚p鈣鹽組成的納米顆粒材料，所述聚p鈣鹽是非晶形的納米尺寸或微米尺寸且生物可降解的，并且保留了無(wú)機(jī)聚合物的形態(tài)發(fā)生活性(müllerweg,etal.anewpolyphosphatecalciummaterialwithmorphogeneticactivity.materialslett2015；148,163-166；專利申請(qǐng)gb1420363.2(2014)，通過(guò)引入并入)。可將形成該材料的聚p納米顆?；蛭⒘ＴO(shè)計(jì)為非晶形的磷酸鈣納米顆粒[aca-聚p-np]。

此外，發(fā)明人描述了使視黃醇包含于那些納米顆?；蛭⒘Ｖ幸灾苽溆砂庥赾a-聚p殼內(nèi)的視黃醇內(nèi)含物組成的納米球或微球的方法。這些納米球或微球被稱為非晶形ca-聚p/視黃醇納米球或微球[視黃醇/aca-聚p-n/ms]。該材料引起iii型膠原在單一組分視黃醇和aca-聚p-n/mp不具有生物活性的濃度下表達(dá)(gb1502116.5)。此外，下述關(guān)于聚p的專利申請(qǐng)被認(rèn)為是相關(guān)的：gb1406840.7和gb1403899.6。

相關(guān)的進(jìn)一步研究揭示，聚p包含抗菌活性(lorencováe,etal.antibacterialeffectofphosphatesandpolyphosphateswithdifferentchainlength.jenvironscihealthatoxhazardsubstenvironeng2012；47:2241-2245)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明基于兩種通用方法。

a)由na-聚p和鈣鹽制備納米顆?；蛭⒘５姆椒?，所述na-聚p和鈣鹽：(i)在顆粒形成之后保留了它們的非晶形狀態(tài)，并且(ii)顯示已知來(lái)自na-聚p的形態(tài)發(fā)生活性(gb1420363.2，將其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)。由較后的顆粒aca-聚p-np形成的polyp材料通過(guò)如下特性來(lái)表征。該材料：

a)是非晶形的(非晶態(tài))；b)具有不同尋常的硬度(例如，1.3gpa的彈性模量[磷：鈣配比為1:2的ca-聚p2顆粒])；c)由直徑為約0.2μm(ca-聚p2顆粒)的納米顆?；蛭⒘＝M成；d)可在溫和條件下制備(室溫)；e)具有形態(tài)發(fā)生活性(誘導(dǎo)骨堿性磷酸酶活性和骨羥基磷灰石的形成)；以及f)是生物可降解的(通過(guò)堿性磷酸酶降解)；

b)制備由納米顆?；蛭⒘：鸵朁S醇一起組成的納米球或微球(視黃醇/aca-聚p-ns)的方法(gb1502116.5，將其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)，其顯示下述特性：

1.尺寸高度同質(zhì)(尺寸～45nm)。該尺寸對(duì)于胞吞作用的細(xì)胞攝取是最優(yōu)的(zhangs,etal.size-dependentendocytosisofnanoparticles.advmater2009；21:419-424)；與納米顆粒相比，aca-聚p-np是更大(>50μm尺寸)的磚樣顆粒。2.視黃醇和聚p這兩種組分的協(xié)同作用。3.視黃醇和聚p這兩種組分對(duì)i型和ii型膠原，并且特別是iii型膠原的表達(dá)的協(xié)同效應(yīng)。4.在細(xì)胞外間隙中通過(guò)酶法水解，以及聚p(或其水解產(chǎn)物正磷酸鹽)和視黃醇的釋放。5.由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用來(lái)攝取的合適尺寸。6.兩種活性組分聚p和視黃醇，經(jīng)由細(xì)胞外途徑(細(xì)胞膜結(jié)合受體的激活)以及經(jīng)由跨膜/細(xì)胞內(nèi)途徑(通過(guò)胞吞作用)的雙重生物效應(yīng)；以及7.無(wú)細(xì)胞毒性。

迄今為止，僅開(kāi)發(fā)了少數(shù)將預(yù)防微生物浸潤(rùn)和刺激傷口細(xì)胞再生相結(jié)合的傷口敷料(abrigom,mcarthursl,kingshottp.electrospunnanofibersasdressingsforchronicwoundcare:advances,challenges,andfutureprospects.macromolbiosci2014；14:772-792)。在當(dāng)前的本領(lǐng)域狀態(tài)下，未開(kāi)發(fā)出生物活性靜電紡絲網(wǎng)(abrigom,mcarthursl,kingshottp(2014)electrospunnanofibersasdressingsforchronicwoundcare:advances,challenges,andfutureprospects.macromolbiosci14:772-792)。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明的發(fā)明人成功開(kāi)發(fā)將參與傷口愈合的細(xì)胞的抗菌特性與形態(tài)發(fā)生活性組合的網(wǎng)/墊。他們將視黃醇包封進(jìn)由聚p納米顆?；蛭⒘Ｐ纬傻募{米球或微球，并成功將其制備為由聚(d,l-丙交酯)(pla)構(gòu)成的靜電紡絲纖維。出人意料地，那些墊保留了形態(tài)發(fā)生活性，以增加脂肪酸結(jié)合蛋白4(fabp4)以及瘦素和其受體的表達(dá)，這由未嵌入pla中的聚p納米球或微球引發(fā)。

發(fā)明人還證實(shí)，制備為納米顆粒或微粒的聚p，如果與視黃醇一起施用，并包裝進(jìn)纖維墊，則其引發(fā)mc3t3-e1細(xì)胞中編碼瘦素/瘦素受體以及編碼fabp4的基因的協(xié)同表達(dá)。這兩種級(jí)聯(lián)均不僅參與調(diào)控細(xì)胞的整體能量代謝，還參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化控制。

此處描述的發(fā)明涉及在形成適合作為用于傷口愈合的抗微生物和再生敷料的3d墊的情況下，將以上納米球或微球摻入由pla組成的靜電紡絲纖維中的方法?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明如下所述來(lái)制備由摻入有非晶形視黃酸/ca-聚p納米球或微球的3d靜電紡絲pla纖維墊組成的本發(fā)明材料：

a)將纖維材料與乳化劑混合，并將混合物溶解于有機(jī)溶劑中，

b)添加第二協(xié)同作用的生物活性組分，

c)添加非晶形聚磷酸鈣納米顆?；蛭⒘?aca-聚p-n/mp)，以及

d)對(duì)混合物進(jìn)行靜電紡絲。

該程序在室溫下進(jìn)行，并且優(yōu)選在避光條件下進(jìn)行。

作為優(yōu)選實(shí)例，可以利用聚(d,l-丙交酯)(pla)作為纖維材料，聚(乙二醇)作為乳化劑，異丙醇作為有機(jī)溶劑，na-聚p作為聚p鹽(鏈長(zhǎng)：約30個(gè)磷酸鹽單元)，氯化鈣作為鈣鹽以及視黃醇作為第二協(xié)同作用的生物活性組分，按如下所述制備摻入有非晶形視黃醇/ca-聚p納米球或微球(視黃醇/aca-聚p-n/ms)的3d靜電紡絲pla纖維墊。

a)制備納米顆?；蛭⒘＃?/p>

i)在室溫，將于30ml蒸餾水中的2.8gcacl2，滴入溶于50ml蒸餾水的1gna-聚p中，

ii)在程序期間，用naoh水溶液將ph調(diào)節(jié)至10.0，

iii)攪拌12h，

iv)通過(guò)過(guò)濾收集得到的aca-聚p-np納米顆?；蛭⒘?比例為，磷酸根：ca²⁺＝2)；以及

v)在50℃干燥納米顆?；蛭⒘?。

b)制備pla纖維，并摻入納米顆粒：

i)將pla與peg混合(以80wt％：20wt％的比例)，然后以20％(w/v)的終濃度添加至氯仿中，

ii)將pla/peg-氯仿懸液在40℃攪拌6h，直至聚合物完全溶解，

iii)向pla溶液中添加視黃醇，以得到20wt％(相對(duì)于pla)的終濃度，

iv)以10wt％的固定濃度，向含有視黃醇的pla溶液中添加ca-聚p納米顆?；蛭⒘?aca-聚p-n/mp)，以及

v)在進(jìn)行靜電紡絲之前即刻將懸液進(jìn)行超聲處理，持續(xù)15min。

c)靜電紡絲

a)將所述溶液注入配備有與高壓電源相連的鈍頭不銹鋼針頭(18規(guī)格)的塑料注射器內(nèi)，

b)在17kv的電壓下，以每小時(shí)1ml的進(jìn)料速率旋轉(zhuǎn)所述溶液；在該過(guò)程期間，將噴嘴和收集器之間的距離維持在150mm，

c)除了墊的靜電紡絲，在所有情況中，使用金屬網(wǎng)作為收集器，以及

d)將從收集器中移出的纖維墊干燥過(guò)夜。

聚p分子的鏈長(zhǎng)范圍可以是，約3至約1000個(gè)磷酸鹽單元。用具有大約30個(gè)磷酸鹽單元的平均鏈長(zhǎng)的聚p分子得到了最優(yōu)結(jié)果。

“約”或“大約”一般意為給定數(shù)值+/-10％。

可將根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)用于制備傷口敷料或傷口敷料的組分。含有視黃醇和聚p納米顆?；蛭⒘?非晶形聚磷酸鈣納米球或微球；視黃醇/aca-聚p-n/ms)的基于pla的纖維墊，作為生物活性網(wǎng)發(fā)揮功能。迫切需要此類網(wǎng)作為慢性傷口的敷料。

本發(fā)明又一方面涉及通過(guò)以上所述的方法獲得的材料在基于瘦素和瘦素受體的有利誘導(dǎo)作用的醫(yī)療中的應(yīng)用/用途。優(yōu)選這樣的治療，其中所述醫(yī)學(xué)病況選自傷口愈合不足。

由包含視黃醇和聚p納米顆粒或微粒的基于pla的纖維墊引發(fā)瘦素和瘦素受體的表達(dá)，所述纖維墊是具有再生、傷口愈合特性的新型敷料?？蓳饺雮诜罅现幸栽黾舆@些基因的表達(dá)的材料，目前還是未知的。發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，包含包封的視黃醇的aca-聚p-np納米顆?；蛭⒘?視黃醇/aca-聚p-ns)以協(xié)同方式增加這兩種基因的表達(dá)。

本發(fā)明又一方面涉及本發(fā)明的納米球或微球在藥物遞送中的應(yīng)用。

此處描述的本發(fā)明的方法還涉及非晶形聚磷酸鈣材料的創(chuàng)新用途，其以具有約300nm(直徑)尺寸范圍的微粒的形式，用于(再)封閉暴露于牙齒表面的牙本質(zhì)小管，以及填充牙體缺損(牙釉質(zhì)、牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)中的缺損)。本發(fā)明基于下述發(fā)明人意料之外的發(fā)現(xiàn)：這些ca-聚p微粒能夠在ha表面形成緊密結(jié)合的聚p層。這一發(fā)現(xiàn)是出人意料的，因?yàn)榫踦的鈣鹽或鈣復(fù)合物不結(jié)合這些表面。如果在顆粒制備期間利用1:1的磷酸根比鈣的比例，可能的解釋是微粒表面游離的離子化合價(jià)的存在，其未被鈣離子飽和并且能夠與ha材料的暴露于表面的鈣相互作用。

本發(fā)明又一方面涉及下述發(fā)現(xiàn)：這些聚磷酸鈣(ca-聚p)微粒能夠刺激成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為成熟的成骨細(xì)胞(表達(dá)參與ha形成的堿性磷酸酶)。

依然出人意料的是，盡管它們的直徑(300nm)在允許受體介導(dǎo)的胞吞作用的范圍(約50nm)之外，ca-聚p微粒也顯示出此種生物活性。

可將本發(fā)明的方法用于再封閉暴露于牙齒表面的牙本質(zhì)小管，以及包被牙齒以改善牙齒過(guò)敏癥并預(yù)防蛀牙(預(yù)防齲齒的應(yīng)用)。還可將本發(fā)明的方法用于制備牙齒植入物，所述植入物通過(guò)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化并激活成熟的成骨細(xì)胞而引起身體自身的牙齒材料(ha)形成。

在牙齒表面形成的聚p層，被證實(shí)具有與天然釉質(zhì)類似的硬度和彈性模量。

用于本發(fā)明方法的ca-聚p微粒的優(yōu)選平均尺寸(直徑)范圍為約50nm至約500nm，優(yōu)選300nm。

用于本發(fā)明的方法的ca-聚p微粒的優(yōu)選組成是約0.1比約10(磷酸根比鈣)的重量比，優(yōu)選0.5比1的重量比，并且最優(yōu)選1比1的重量比。

ca-聚p微粒的聚p組分的鏈長(zhǎng)范圍可以是3至1000個(gè)磷酸鹽單元。用具有大約200至20，并且最好約40個(gè)磷酸鹽單元的平均鏈長(zhǎng)的聚p分子得到最優(yōu)結(jié)果。

聚p材料是生物可降解的，并且與通過(guò)常規(guī)技術(shù)制備的ca-聚p鹽相比，其顯示出更優(yōu)的形態(tài)發(fā)生活性。

本發(fā)明的方法的又一方面是，該方法在改善牙本質(zhì)過(guò)敏癥或者預(yù)防齲齒中的應(yīng)用/用途。

本發(fā)明的方法的另一方面是，該方法在制備刺激成牙本質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化和激活的牙齒植入物中的應(yīng)用/用途。

現(xiàn)在將在下述優(yōu)選實(shí)例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是其不限于此。出于本發(fā)明的目的，將本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文。在附圖列表中，

圖1顯示了基于pla的靜電紡絲墊的制備。(a)將基礎(chǔ)纖維基質(zhì)pla溶于氯仿中。(b)向該溶液中添加視黃醇(20wt％)，隨后添加納米顆?；蛭⒘?aca-聚p-n/mp)(20wt％)。短暫攪拌時(shí)間之后，即刻將懸液超聲處理，然后進(jìn)行(c)靜電紡絲。嵌入圖(a)中示出了紡織墊，sem圖片；(b)中描繪了含有其整合的視黃醇/ca-聚p納米顆粒(視黃醇/ca-聚p-np)的纖維的放大的示意圖。顯示了由下述材料形成的制備的墊：(d)單獨(dú)的pla，(e)pla和視黃醇，以及(f)pla、視黃醇和ca-聚p。

圖2顯示了包封于納米顆粒或者與視黃醇一起的納米球中的聚p對(duì)細(xì)胞活力的影響(xtt比色測(cè)定)。如所示，將mc3t3-e1細(xì)胞與不同濃度的聚p(以μg/ml給出)或視黃醇(μm)孵育72h。然后用xtt分析細(xì)胞。將細(xì)胞暴露于不同濃度的na-聚p，與ca²⁺復(fù)合的僅包含聚p的aca-聚p-np納米顆粒，除聚p之外還包含視黃醇的視黃醇/aca-聚p-ns納米球，以及視黃醇。結(jié)果表示為平均值(n分別＝10次實(shí)驗(yàn))±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤；*p<0.01。

圖3顯示了用耐爾藍(lán)a對(duì)mc3t3-e1細(xì)胞進(jìn)行的染色。將細(xì)胞在下述情況下孵育72h：(a)不添加任何組分；或者(b)添加3μg/mlna-聚p；(c)添加aca-聚p-np；或者(d)添加視黃醇/aca-聚p-ns；以及(e)添加3μm視黃醇。觀察到聚p-視黃醇處理的細(xì)胞明顯為粉紅色，而對(duì)照呈藍(lán)色。

圖4顯示了在未處理的mc3t3-e1細(xì)胞(斑點(diǎn)柱)，或者在暴露于3μg/ml的可溶na-聚p(空心柱)、aca-聚p-np納米顆粒(交叉線)、視黃醇/aca-聚p-ns納米球(黑色柱)，或者在暴露于3μm視黃醇(斜線)3d的細(xì)胞中，測(cè)定的編碼fabp4受體以及瘦素或瘦素受體的基因的穩(wěn)定狀態(tài)表達(dá)。在孵育之后，將rna從培養(yǎng)物中分離，并利用gapdh作為參考基因，通過(guò)rt-qpcr進(jìn)行分析。在各培養(yǎng)系列中，表達(dá)比率與gapdh相關(guān)；將得到的比率設(shè)定為1。顯示了sd(5次實(shí)驗(yàn)/時(shí)間點(diǎn))；*p<0.01。

圖5顯示了如下文“材料和方法”部分所述的pla(pla)、視黃醇(ret)、包含20wt％視黃醇的pla(pla-ret)，以及最終由視黃醇和aca-聚p-np納米顆粒組成的pla(pla-ret/aca-聚p-np)的ftir光譜。光譜記錄為(a)波數(shù)4000至775cm^-1，以及(b)波數(shù)2000至775cm^-1。

圖6顯示了用于靜電紡絲的聚合物的edx分析。用下述材料進(jìn)行分析：(a)僅pla聚合物，(b)除視黃醇之外還包含的pla纖維材料，或者(c)在紡織過(guò)程之前補(bǔ)充有aca-聚p-np納米顆粒的pla。標(biāo)記c、o、na、p和ca的信號(hào)。

圖7顯示了細(xì)胞培養(yǎng)之后纖維墊的sem分析。切割精確匹配的墊樣本，并將其浸沒(méi)于24孔板內(nèi)；接種5·10³個(gè)細(xì)胞/孔，并持續(xù)孵育3d。然后取墊，將其固定并脫水，隨后進(jìn)行sem分析。(a和b)僅用pla紡成的纖維墊；可鑒定出極少的細(xì)胞/細(xì)胞簇(-c)。(c和d)相比之下，在孵育期間觀察到，在由pla/視黃醇/aca-聚p-ns形成的纖維上形成了緊密的細(xì)胞層(cl)。偶然地，在邊緣區(qū)域(r)內(nèi)，可以分辨由緊密堆積的細(xì)胞(在c中右側(cè))至較少定居的區(qū)域的轉(zhuǎn)變(左側(cè))。分界線用兩個(gè)單箭頭標(biāo)記。

圖8顯示了rt-qpcr分析，以評(píng)估fabp4、瘦素和瘦素受體這三種基因的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目。接種之后，將mc3t3-e1細(xì)胞在下述材料之上培養(yǎng)3d：僅由pla制備的墊(數(shù)目不可測(cè)定[n.d.])，由pla和aca-聚p-np制備的紡織纖維(交叉線柱)，或者由pla和視黃醇/aca-聚p-np制備的紡織纖維(黑色柱)。fabp4、瘦素和瘦素受體的表達(dá)值參考gapdh的表達(dá)。反過(guò)來(lái)，那些數(shù)目與在用于接種的細(xì)胞(從培養(yǎng)板底部分離之后，隨后處理持續(xù)2h的時(shí)間)中測(cè)量的研究的基因和gapdh的表達(dá)值相關(guān)；將那些比率設(shè)定為1。顯示了sd(5次實(shí)驗(yàn)/時(shí)間點(diǎn))；*p<0.01。

圖9顯示了聚p和視黃醇對(duì)脂肪酸結(jié)合蛋白4(fabp4)和瘦素/瘦素受體的表達(dá)的可能影響。已經(jīng)提出，聚p經(jīng)mapk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(p38)mapk通路和/或mtor復(fù)合物1和2發(fā)揮作用。fabp4表達(dá)可能包含轉(zhuǎn)錄因子ets1。該通路正向地作用于與聚p/dll4-notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及foxo1相關(guān)聯(lián)的fabp4表達(dá)水平。在與其受體(vegfar)結(jié)合并激活dll4(δ樣配體-4)之后，vegfa(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)誘導(dǎo)notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的旁分泌激活，導(dǎo)致fabp4表達(dá)。其間，notch受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(nicd)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，并與由foxo1和dna結(jié)合蛋白rbp-jκ組成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物結(jié)合，由此誘導(dǎo)fabp4轉(zhuǎn)錄。fabp4蛋白遷移至細(xì)胞質(zhì)，并結(jié)合ra(視黃酸)。已提出ra與fabp4再次進(jìn)入細(xì)胞核，并形成rxr-rar(視黃酸x受體-視黃酸受體異二聚體)。在該轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中，在ra應(yīng)答元件(rare)處，編碼瘦素和瘦素受體的基因的轉(zhuǎn)錄增加。ra經(jīng)視黃醇(rol)合成，這由細(xì)胞經(jīng)stra6(膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)吸收，其中其結(jié)合crbp(細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白)，通過(guò)adh4(乙醇脫氫酶4)經(jīng)歷至ral(視黃醛)并最終至ra的氧化，最終經(jīng)crabp(視黃酸結(jié)合蛋白)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，在rxr/rar復(fù)合體形成的情況下，其在此結(jié)合dna的rare(視黃酸響應(yīng)元件)?？傊踦引起結(jié)合蛋白fabp4的上調(diào)，這促進(jìn)視黃醇對(duì)瘦素和瘦素受體的表達(dá)的影響。增加的fabp4合成和rar轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性這兩項(xiàng)(arm)，正向地影響細(xì)胞分化和再上皮化。

圖10顯示了非晶形的ca-聚p微粒(aca-聚p-mp)及推測(cè)的其與牙齒的磷酸鈣表面的相互作用。(a和b)aca-聚p-mp；sem分析。(c)推測(cè)的所述微粒與牙齒的羥基磷灰石(ha)釉質(zhì)的相互作用。釉質(zhì)(en)形成牙本質(zhì)(de)區(qū)域周圍的牙冠，并在牙髓(pu)周圍。礦物質(zhì)釉質(zhì)和牙本質(zhì)由主要由po4^3-和ca²⁺離子構(gòu)造的ha板組成。在既有的牙腔內(nèi)(齲齒或蛀牙)，填充aca-聚p-mp。已提出，微粒內(nèi)的ca²⁺離子形成至釉質(zhì)的ha的橋接。

圖11顯示了含有聚p的來(lái)自根部區(qū)域的牙齒樣品的涂層。將牙齒樣本在10mg/ml的na-聚p[ca²⁺](a和c)或aca-聚p-mp(b和d)中孵育2d。然后取樣，將其進(jìn)行切片并通過(guò)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢查。從切割區(qū)域(a和b)或相應(yīng)的表面(c和d)拍攝照片。標(biāo)記不同的層：粘合層(ce)和牙本質(zhì)(de)層以及聚p層。

圖12顯示了在與aca-聚p-mp孵育之后，牙齒樣品上聚p層的形成；sem。并行地，將牙齒樣本浸沒(méi)于na-聚p[ca²⁺]或aca-聚p-mp(各10mg/ml)中，持續(xù)2d。然后在洗滌之后，將樣本切割，然后通過(guò)sem進(jìn)行分析。從暴露于na-聚p[ca²⁺]的樣本拍攝圖片a、c和e，同時(shí)從在aca-聚p-mp中孵育的牙齒樣本拍攝b、d和f的那些照片。在所有樣本中均觀察到粘合層(ce)和牙本質(zhì)(de)層，而僅在用aca-聚p-mp處理的那些樣本中觀察到另外的聚p層(聚p)。在na-聚p[ca²⁺]樣本中牙本質(zhì)小管是暴露的(e；..::dt::..)，而在aca-聚p-mp樣本表面未觀察到來(lái)自牙本質(zhì)小管的開(kāi)口(f)。

圖13顯示了含聚p的涂層的動(dòng)力學(xué)；sem。(a)具有牙本質(zhì)小管(dt)開(kāi)口的牙本質(zhì)表面。(b和c)將根部樣本與aca-聚p-mp孵育30min；微粒(ca-聚p-mp)在管的開(kāi)口中累積。(d和e)在層形成的條件下，與aca-聚p-mp的更長(zhǎng)孵育時(shí)間導(dǎo)致聚p沉積的擴(kuò)大；在更高的放大率下，可以分辨單個(gè)微粒。

圖14顯示了聚p在牙齒表面沉積的時(shí)間進(jìn)程；edx分析。(a)未處理的釉質(zhì)。用aca-聚p-mp將釉質(zhì)樣品處理30min(b)或2d(c)；在孵育2d之后的樣本中觀察到p和ca信號(hào)的強(qiáng)烈增加。

圖15顯示了釉質(zhì)上的聚p涂層的機(jī)械特征。制備來(lái)自人牙齒的切片，并直接測(cè)量或者在補(bǔ)充有10mg/mlaca-聚p-mp的鹽水溶液中孵育。在25℃的孵育進(jìn)行3h或2d。孵育之后，將樣品干燥10min，然后測(cè)量。顯示了對(duì)照樣本(實(shí)線)或聚p處理2d(斷線)或3h(點(diǎn)線)后，樣本的典型載荷穿透深度曲線。給出了82mn的壓入載荷。在曲線內(nèi)標(biāo)記以下載荷-穿透階段：負(fù)載階段、最大載荷處的停留期以及卸載部分。

圖16顯示了暴露于聚p之后，hmsc中alp轉(zhuǎn)錄本水平的增加。細(xì)胞未被處理或者暴露于30μg/mlna-聚p[ca²⁺]或aca-聚p-mp。在第1天、第3天和第7天，收集樣本。收獲細(xì)胞，提取rna，并進(jìn)行qrt-pcr分析；針對(duì)未處理的細(xì)胞(對(duì)照；空心柱)以及na-聚p[ca²⁺](na-聚p；交叉線)和aca-聚p-mp處理的培養(yǎng)物(ca-聚p-mp；實(shí)心柱)，測(cè)定與參考基因gapdh的表達(dá)相關(guān)聯(lián)的表達(dá)水平。對(duì)于四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)表示為平均值±sd。利用未配對(duì)的t檢驗(yàn)評(píng)估組間的差異。*p<0.05。

圖17顯示了aca-聚p-mp雙重作用模式的概要。微粒與牙齒表面強(qiáng)附連，特別是在牙本質(zhì)小管(dt)暴露的開(kāi)口中。那些管位于牙本質(zhì)(de)內(nèi)，其通常由釉質(zhì)(en)層覆蓋。第一作用模式(形態(tài)發(fā)生)：在牙本質(zhì)小管內(nèi)，微粒通過(guò)成牙本質(zhì)細(xì)胞(od)釋放的酶alp經(jīng)歷水解。與成牙本質(zhì)細(xì)胞一致，alp和ca-聚p的水解產(chǎn)物正磷酸鹽形成羥基磷灰石(ha)，并由此修復(fù)牙本質(zhì)小管。第二作用模式(再封閉)：終止之后，微粒(aca-聚p-mp)在蛀牙表面形成涂層。

實(shí)施例

在下述實(shí)施例中，僅本發(fā)明的方法描述了具有約30至約40個(gè)磷酸鹽單元的平均鏈長(zhǎng)的聚p分子?？梢酝ㄟ^(guò)利用具有較低或較高鏈長(zhǎng)(如100至20個(gè)單位)的聚p分子得到類似的結(jié)果。

負(fù)載聚p和聚p-視黃醇的納米顆粒/納米球?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的影響

在下述實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人成功證實(shí)了如果將聚p和視黃醇一同施用于細(xì)胞，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝顯示出交互效應(yīng)。分別添加的這兩種化合物，在體外均對(duì)細(xì)胞顯示出各種各樣的合成代謝影響。作為實(shí)例，聚p引起對(duì)生物礦化/羥基磷灰石形成的誘導(dǎo)效應(yīng)，其與編碼堿性磷酸酶的基因的誘導(dǎo)增加并行(müllerweg,etal.inorganicpolymericphosphate/polyphosphateasaninducerofalkalinephosphataseandamodulatorofintracellularca²⁺levelinosteoblasts(saos-2cells)invitro.actabiomaterialia2011；7；2661-2671)。同樣地，視黃醇有助于一系列過(guò)程中的合成代謝通路，例如胚胎發(fā)育或者上皮細(xì)胞分化和造血細(xì)胞分化的調(diào)控(mianojm,etal.retinoidreceptorexpressionandall-transretinoicacid-mediatedgrowthinhibitioninvascularsmoothmusclecells.circulation1996；93:1886-1895)。在本文所述的實(shí)驗(yàn)中，利用mc3t3-e1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在72h孵育期間，在低于3μg/ml的濃度下，與ca²⁺復(fù)合的無(wú)顆粒na-聚p以及通過(guò)非晶形ca-聚p形成的納米顆粒，對(duì)于細(xì)胞的數(shù)目無(wú)影響(圖2)。然而，如果以10μg/ml的濃度向細(xì)胞中添加納米顆粒制備物(aca-聚p-np)，則基于xtt還原分析，在孵育期間測(cè)量到活細(xì)胞數(shù)目的顯著增加。以3μm的濃度作為單一組分添加的視黃醇，也不顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

如果將視黃醇包封于基于ca-聚p的納米顆粒，并由此形成視黃醇/ca-聚p納米球，則測(cè)量到細(xì)胞生長(zhǎng)的強(qiáng)擴(kuò)增(圖2)。盡管在3μg/ml的濃度下，視黃醇/aca-聚p-ns將xtt分析中的吸光度從≈1.3a260個(gè)單位增加至2.88個(gè)單位，在包含10μg/ml的分析中該數(shù)值增加至4.18個(gè)單位。3μg/ml納米球中視黃醇的濃度為大約0.3μg/ml(≈1μm)，發(fā)現(xiàn)視黃醇的水平不改變細(xì)胞的生長(zhǎng)。這是反映在本文使用的系統(tǒng)中，ca-聚p與視黃醇一起協(xié)同作用的第一指示。

用耐爾藍(lán)a對(duì)生長(zhǎng)為單層的細(xì)胞進(jìn)行染色(圖3)。將細(xì)胞與3μg/mlna-聚p、aca-聚p-np或視黃醇/aca-聚p-ns，以及與3μm視黃醇孵育。在對(duì)照中(圖3a)，細(xì)胞主要被染成藍(lán)色，而暴露于可溶的na-聚p(圖3b)、聚p納米顆粒(圖3c)、納米球(圖3d)或視黃醇(圖3e)的所有細(xì)胞明顯呈淺色/亮粉色。該結(jié)果被認(rèn)為是，在聚p以及視黃醇存在下，孵育的細(xì)胞比對(duì)照含有更多脂肪酸、脂色素(chromolipid)和/或磷脂的指示。此外，顯而易見(jiàn)的是，與對(duì)照相比，在聚p處理的細(xì)胞以及視黃醇處理的細(xì)胞中，細(xì)胞層的密度更高。

聚p和視黃醇對(duì)基因表達(dá)(fabp4、瘦素和瘦素受體)的影響

利用看家基因gapdh作為參考，通過(guò)rt-qpcr評(píng)估脂肪酸結(jié)合蛋白4(fabp4)以及瘦素和相應(yīng)的瘦素受體的表達(dá)水平。mc3t3-e1細(xì)胞未被處理，或者被暴露于3μg/ml可溶的na-聚p、aca-聚p納米顆粒或視黃醇/aca-聚p納米球。在該系列，也包括用游離的視黃醇(3μm)進(jìn)行的孵育。將細(xì)胞的孵育時(shí)間設(shè)定為3d。然后，提取rna，并測(cè)定表達(dá)水平，并且其與gapdh相關(guān)聯(lián)；該比率設(shè)定為1。

如果將細(xì)胞與ca²⁺復(fù)合的可溶的na-聚p孵育，相對(duì)于未處理的對(duì)照，所有fabp4、瘦素和瘦素受體這三種基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著改變(圖4)。然而，添加聚p納米顆粒、aca-聚p-np引起fabp4(2.3倍)、瘦素(4.2倍)和瘦素受體基因(3.8倍)穩(wěn)定狀態(tài)表達(dá)的顯著上調(diào)。如果向細(xì)胞添加納米球、視黃醇/aca-聚p-ns，則增加更顯著；在那些分析中，fabp4(5.8倍)、瘦素(11.6倍)和瘦素受體基因(8.3倍)的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量增加。如果將細(xì)胞單獨(dú)暴露于視黃醇，則僅測(cè)量到非顯著的增加(圖4)。

靜電紡絲墊的制備

如果嵌入靜電紡絲纖維墊中，測(cè)定視黃醇和非晶形的ca-聚p納米顆粒對(duì)fabp4、瘦素和瘦素受體的表達(dá)的影響。如下文“方法”部分所概述的，將組分視黃醇和ca-聚p納米顆粒摻入基于pla的纖維網(wǎng)中(圖1)。如下文“方法”部分所概述的，將pla與peg以80wt.％：20wt.％的比例混合，然后溶于氯仿中。隨后以20wt％(相對(duì)于pla)向pla溶液中添加視黃醇。此外，也添加aca-聚p-np納米顆粒，到達(dá)10wt％的終濃度。將形成的懸液進(jìn)行超聲處理，并用于靜電紡絲程序。

制備具有高至20cm直徑的墊，其由平均網(wǎng)格尺寸為10-20μm的≈2μm纖維紡成。如果纖維包含視黃醇，則墊的顏色變?yōu)榈S色；因此必須避光保護(hù)它們。盡管純的pla墊呈白色(圖1d)，由pla/視黃醇溶液紡成的墊(圖1e)以及由pla/視黃醇/aca-聚p-np懸液紡成的墊呈黃色(圖1f)。

墊的特征

進(jìn)行ftir分析以評(píng)估pla:納米球纖維墊內(nèi)的結(jié)構(gòu)改變和/或分子鏈相互作用。包括下述樣本：pla基質(zhì)、視黃醇、含有20％視黃醇的pla，以及含有20％視黃醇和20％ca-聚p納米顆粒的pla。如圖5中所示，測(cè)試的所有5個(gè)樣本均引起pla聚酯的明顯峰值，其中在1746/1749cm^-1處具有強(qiáng)羰基帶(c＝o)，在2982和2930以及在1445和1380cm^-1處具有ch3的c-h彎曲振動(dòng)，以及在1300-1000cm^-1處具有不對(duì)稱的c-o伸縮振動(dòng)。相對(duì)于純的pla樣本，pla中的羰基c＝o的吸收帶從1746cm^-1移位至1749cm^-1或1748cm^-1；在添加視黃醇和ca-聚p之后，該吸收強(qiáng)度也移位(圖5)。此外，在1300至1000cm^-1的波數(shù)范圍內(nèi)，對(duì)于伸縮振動(dòng)也發(fā)生類似的移位。

視黃醇的ftir光譜顯示了在1549cm^-1處的特征性視黃醇帶(視黃醇的羥基)，該信號(hào)在包含視黃醇的pla的光譜中消失(圖5)。此外，在視黃醇中，波數(shù)1100至800cm^-1范圍各種各樣的信號(hào)。這些發(fā)現(xiàn)指示，包封有組分聚p和視黃醇的pla顯示出與pla基質(zhì)的弱相互作用。

pla纖維材料(圖6a)以及pla/視黃醇紡織材料(圖6b)的edx分析，僅顯示預(yù)期的c和o的信號(hào)。相比之下，如果分析pla-aca-聚p-np聚合物，則除c和o之外，還出現(xiàn)ca、p和na的信號(hào)(圖6c)。na峰反映來(lái)源于原始的na-聚p材料，用于至不可溶的ca-聚p的轉(zhuǎn)化的剩余的na⁺。

包含聚p的纖維墊的功能研究

將mc3t3-e1細(xì)胞接種于紡織墊的圓片樣本上，并孵育3d。在第一系列實(shí)驗(yàn)中，在孵化固定之后取墊，脫水，然后進(jìn)行sem分析。結(jié)果顯示，在單獨(dú)用pla紡織的那些纖維墊上，幾乎觀察不到細(xì)胞(圖7a和7b)。相比之下，如果將細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有aca-聚p-np或視黃醇/aca-聚p-np的pla上，則觀察到緊密填充的細(xì)胞層(圖7c和7d)。

為了定量支持不同墊的細(xì)胞活性功能特性，通過(guò)rt-qpcr分析測(cè)定在此研究的fabp4、瘦素和瘦素受體這三種基因的穩(wěn)定狀態(tài)表達(dá)水平。表達(dá)值與參考基因gapdh的表達(dá)相關(guān)聯(lián)；最后使那些值與在用于接種(在脫離之后即刻處理2h的時(shí)長(zhǎng))的細(xì)胞中測(cè)量的那些基因和gapdh的比率成比例。觀察到，給不出培養(yǎng)在純的pla墊上的細(xì)胞中的基因的可靠表達(dá)值，因?yàn)閮H存在少數(shù)細(xì)胞存活于那些纖維上(圖8)。相比之下，fabp4、瘦素和瘦素受體的穩(wěn)定狀態(tài)表達(dá)水平，在pla-aca-聚p-np纖維墊上分別經(jīng)歷1.2倍、2.3倍和2.6倍的顯著升高。如果在pla-視黃醇/aca-聚p-ns纖維上生長(zhǎng)3d，觀察到那些基因分別3.7倍、5.8倍和6.1倍的同樣的強(qiáng)誘導(dǎo)(圖8)。

基于這些實(shí)驗(yàn)，我們得出如下結(jié)論：如果補(bǔ)充有aca-聚p-np或視黃醇/aca-聚p-np，則如對(duì)編碼fabp4、瘦素和瘦素受體的基因的表達(dá)所監(jiān)測(cè)的，那些pla纖維引發(fā)形態(tài)發(fā)生活性。

與na-聚p孵育的牙齒相對(duì)于與aca-聚p-mp孵育的牙齒：光學(xué)顯微鏡

將人牙齒樣品浸沒(méi)于na-聚p[與ca²⁺復(fù)合]或aca-聚p-mp的溶液或懸液(10mg/ml)中。在持續(xù)2d的孵育時(shí)間段之后，取樣，通過(guò)粘合-牙本質(zhì)區(qū)向內(nèi)切片，并通過(guò)光學(xué)顯微鏡檢查(圖11)。在用na-聚p[ca²⁺]處理的樣品中，在粘合表面未觀察到附加層(圖11a)。未觀察到對(duì)照、未處理的樣本切片之間的差異(圖片未顯示)。相比之下，如果來(lái)自類似的區(qū)域，檢查用aca-聚p-mp處理切片，在粘合頂部觀察到明顯的50-μm厚的附加層(聚p層)(圖11b)。對(duì)來(lái)自用na-聚p[ca²⁺]處理的樣本的粘合層的表面檢查顯示了粗質(zhì)地(圖11c)，而聚p(aca-聚p-mp)處理的牙齒的表面粗糙度更精細(xì)(圖11d)。

與na-聚p孵育的牙齒相對(duì)于與aca-聚p-mp孵育的牙齒：sem分析

并行地，通過(guò)sem檢查樣本(圖12)；用各聚p樣本將它們處理2d。再次，用10mg/mlna-聚p[ca²⁺]處理的那些樣品，在粘合頂部未顯示出任何可見(jiàn)的附加層(圖12a和12c)。在僅含有薄的粘合層的區(qū)域，當(dāng)觀察橫斷面時(shí)，暴露出牙本質(zhì)小管(圖12e)。然而，如果檢查用10mg/mlaca-聚p-mp處理的樣本，它們覆蓋≈50μm厚的附加的聚p層(圖12b和12d)。未檢測(cè)到對(duì)照樣本、未用聚p處理的樣本或者用na-聚p[ca²⁺]處理的樣本之間的差異(未顯示)。

在用aca-聚p-mp孵育期間，含有聚p的牙齒涂層取決于孵育期(圖13)。在任何聚p制備物均不存在的情況下(圖13a)或者在與na-聚p[ca²⁺]孵育之后，在根部的牙本質(zhì)區(qū)域的表面觀察到一些牙本質(zhì)小管(未顯示)。如果將那些牙齒樣本暴露于aca-聚p-mp持續(xù)30min，則全部牙本質(zhì)小管已填充聚合物(圖13b)；在較高放大率下，可以看到那些管的開(kāi)口內(nèi)的微粒(圖13c)。如果孵育時(shí)間延長(zhǎng)至2d，則在低放大率下，通過(guò)sem可以分辨(幾乎)同質(zhì)的聚p涂層(圖13d)；在較高的分辨率下，可以看到微粒(圖13e)。

聚p沉積物的edx分析

采用edx光譜學(xué)技術(shù)以表征牙齒根部釉質(zhì)表面上的聚p沉積。分析未處理的釉質(zhì)表面的元素分布顯示，o、p和ca的特征信號(hào)尤其顯示牙齒的礦物質(zhì)部分，而顯著的c信號(hào)反映牙齒的有機(jī)成分。此外，觀察到低的na和mg的量(圖14a)。在用10mg/mlaca-聚p-mp進(jìn)行持續(xù)30min短的孵育期期間，僅測(cè)量到低的p和ca信號(hào)(圖14b)；然而，在2d的孵育期之后，p和ca信號(hào)大幅增加，這反映了來(lái)自所述微粒的聚p的沉積(圖14c)。

聚p涂層的機(jī)械特性

用三角形berkovich金剛石壓痕計(jì)進(jìn)行硬度測(cè)量。對(duì)于每個(gè)給定的值，在(聚p)釉質(zhì)上進(jìn)行30次單一測(cè)量。施加82mn的最大負(fù)載，導(dǎo)致最大1000nm的位移。通常，壓痕的最大穿透深度是250±21nm。在一組內(nèi)，所有負(fù)載位移曲線均顯示出與圖15中給出的形狀類似的形狀。顯示了三組實(shí)驗(yàn)中各組的典型測(cè)試周期中的典型負(fù)載、保持和卸載階段。在卸載部分，通過(guò)擬合冪律函數(shù)計(jì)算最大負(fù)載下的接觸剛度。反過(guò)來(lái)，將在最大負(fù)載處得到的函數(shù)的斜率，用于計(jì)算壓痕的接觸深度。應(yīng)用oliver和pharr描述的算法(oliverwc和pharrgm(1992)animprovedtechniquefordetermininghardnessandelasticmodulususingloadanddisplacementsensingindentationexperiments.jmaterres7:1564-1583)，用該參數(shù)計(jì)算馬氏硬度和降低的彈性模量。對(duì)于未處理的釉質(zhì)，計(jì)算出4.33±0.69gpa的馬氏硬度以及101.61±8.52gpa的降低的彈性模量(平均測(cè)量30次)。聚p包被的釉質(zhì)樣本的各值僅略微下降；在3h孵育期之后[2d孵育期]，計(jì)算出3.85±0.64[4.05±0.59]gpa的馬氏硬度以及94.72±8.54[85.62±5.33]gpa的降低的彈性模量。

aca-聚p-mp的功能分析：hmsc細(xì)胞中的alp表達(dá)

在聚p存在或不存在下，培養(yǎng)在條件培養(yǎng)基存在下分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞hmsc。作為聚p樣本，na-聚p[ca²⁺]和aca-聚p-mp均在30μg/ml的濃度下使用。在單獨(dú)的分析中，在孵育1、3或7d之后收獲細(xì)胞，以測(cè)定alp基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在聚p不存在下的7-d孵育期期間，alp的穩(wěn)定狀態(tài)表達(dá)幾乎不變，與參考基因gapdh表達(dá)的比率大約為0.02(圖16)。相比之下，如果向培養(yǎng)物中添加na-聚p[ca²⁺]，則測(cè)量到表達(dá)水平顯著增加至0.53±0.01。如果將細(xì)胞暴露于aca-聚p-mp，則觀察到更強(qiáng)的影響。盡管在3d的孵育期之后，測(cè)得alp轉(zhuǎn)錄本水平2.6倍的顯著增加，在總共7d的孵育期期間該數(shù)值進(jìn)一步增加至7倍。

新型基于aca-聚p-mp的牙齒再封閉生物材料

非晶形的ca-聚p微粒(aca-聚p-mp)強(qiáng)結(jié)合牙齒表面，并通過(guò)堿性磷酸酶(alp)經(jīng)歷在牙本質(zhì)小管水解為正磷酸鹽。反過(guò)來(lái)，該產(chǎn)物引發(fā)形態(tài)發(fā)生活性，在這期間編碼alp的基因得到誘導(dǎo)；該過(guò)程有助于蛀牙的牙本質(zhì)小管內(nèi)羥基磷灰石的修復(fù)。最后，通過(guò)ca-聚p層再封閉牙本質(zhì)小管(圖17)。

方法

材料

可以從例如merckmillipore(#106529；darmstadt；germany)或者從chemischefabrikbudenheim(budenheim；germany)獲得具有30至40個(gè)磷酸鹽單元的平均鏈長(zhǎng)的聚磷酸鈉(na-聚p)，從例如sigma(#95144；≥97.5％,mr286.45；taufkirchen；germany)獲得全反式視黃醇。

ca-聚p納米顆粒和微粒以及ca-聚p/視黃醇納米球的制備

按照描述的程序，進(jìn)行略微改變來(lái)制備非晶形的磷酸鈣納米顆?；蛭⒘?aca-聚p-np或aca-聚p-mp)(müllerweg,etal.anewpolyphosphatecalciummaterialwithmorphogeneticactivity.materialslett2015；148:163-166；gb1420363.2)。aca-聚p-np：簡(jiǎn)言之，在室溫下，向溶于50ml蒸餾水的1gna-聚p中，逐滴添加溶于30ml蒸餾水的2.8gcacl2。在該程序期間，用naoh水溶液將ph調(diào)節(jié)至10.0。攪拌12h之后，經(jīng)nalgene過(guò)濾單元(孔徑0.45μm；cole-parmer)通過(guò)過(guò)濾收集納米顆粒。將得到的aca-聚p-np(比率為磷酸根：ca²⁺＝2)在50℃下干燥。aca-聚p-mp：簡(jiǎn)言之，將10gna-聚p溶于蒸餾水中，并在室溫添加14.2gcacl2·2h2o。在制備期間，將ph調(diào)節(jié)至10.0。攪拌(4h)之后，收集顆粒，用乙醇洗滌并在60℃干燥。

在避光條件下制備非晶形的視黃醇/ca-聚p納米球、視黃醇/aca-聚p-ns。向na-聚p溶液(100ml水中含有1g)中逐滴添加含有2.8gcacl2的視黃醇溶液(100mg/50ml無(wú)水乙醇)。為了避免相位分離，向na-聚p溶液中添加2g聚(乙二醇)(peg)(p5413；sigma-aldrich；平均分子量8,000)。攪拌6h之后，通過(guò)過(guò)濾收集形成的顆粒。應(yīng)用基于sbcl3的光譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)納米球包含100mg/g視黃醇(≈1μm)(subramanyamgb,parrishdb.colorimetricreagentsfordeterminingvitaminainfeedsandfoods.jassocoffanalchem1976；59:1125-1130)。與在視黃醇不存在下形成的納米顆粒(aca-聚p-np)相比，所述納米球的顏色呈淡黃色。

通過(guò)ftir進(jìn)行化學(xué)表征

可以例如通過(guò)應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜學(xué)，證實(shí)納米顆粒和微粒內(nèi)的聚p的聚合物特征；可以使用x射線衍射分析來(lái)證明材料是非晶形的。微粒的平均尺寸是300nm，并且它們?cè)?00至600nm的尺寸范圍內(nèi)變化(圖10a和10b)?？梢岳美缇哂術(shù)oldengateatr輔助設(shè)備的varian660-ir光譜儀(agilent)，應(yīng)用衰減全反射(atr)模式的傅里葉變換紅外(ftir)光譜學(xué)。記錄波數(shù)4000至600cm-1下的光譜。

聚(乳酸)纖維墊的制備

如所述制備基于聚(乳酸)的納米纖維(müllerweg,etal.biosilica-loadedpoly(ε-caprolactone)nanofibersmatsprovideamorphogeneticallyactivesurfacescaffoldforthegrowthandmineralizationoftheosteoclast-relatedsaos-2cells.biotechnolj2014；9:1312-1321)；圖1中給出了示意圖。從sigma(分子量75,000-120,000；p1691)獲得聚(d,l-丙交酯)(pla)。將pla與peg混合(以80wt.％：20wt％的比例)，然后以20％(w/v)的終濃度添加至氯仿中。將pla/peg-氯仿懸液在40℃攪拌6h，直至達(dá)到聚合物的完全溶解。向pla溶液中添加視黃醇，以得到20wt％的終濃度(相對(duì)于pla)。如所指示的，以10wt％的混合濃度向已包含視黃醇的pla溶液中添加根據(jù)müller等人(müllerweg,etal.anewpolyphosphatecalciummaterialwithmorphogeneticactivity.materialslett2015；148:163-166)所述制備的ca-聚p納米顆粒(aca-聚p-np)。在靜電紡絲之前即刻將懸液進(jìn)行超聲處理，持續(xù)15min，以確保納米球在pla溶液中的適當(dāng)分散。

用具有一些適應(yīng)于基于pla的紡織材料的改變的靜電紡絲單元進(jìn)行靜電紡絲(spraybase；profectorlifesciences,dublin；ireland)。將溶液注入配備有與高壓電源相連的鈍頭不銹鋼針頭(18規(guī)格)的塑料注射器。在17kv的電壓下，以每小時(shí)1ml的進(jìn)料速率旋轉(zhuǎn)溶液；在所述過(guò)程期間，將噴嘴與收集器之間的距離維持在150mm。除了墊的靜電紡絲之外，在所有情況中均使用金屬網(wǎng)作為收集器。將纖維墊從收集器中移出，并干燥過(guò)夜。在整個(gè)程序期間，盡可能地避免曝光。

mc3t3-e1細(xì)胞的培養(yǎng)

在包含20％胎牛血清(fcs；gibco)的a-mem(gibco-invitrogen,darmstadt；germany)中，培養(yǎng)小鼠顱骨細(xì)胞mc3t3-e1細(xì)胞(atcc-crl-2593；#99072810；sigma)。此外，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有2mml-谷氨酰胺、1mm丙酮酸鈉和50μg/ml慶大霉素。在培養(yǎng)箱中，于37℃和5％co2下，在25cm²瓶或24孔板中孵育細(xì)胞。在達(dá)到80％的匯合度之后，利用胰蛋白酶/edta分離細(xì)胞，然后以5·10³個(gè)細(xì)胞/ml的密度再培養(yǎng)。以5·10³個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種細(xì)胞。每3天更換培養(yǎng)基/血清。

如所指示的，向細(xì)胞中添加以下聚p制備物：(i)與ca²⁺化學(xué)計(jì)量地復(fù)合的“na-聚p”(摩爾比為1:2[磷酸鹽單體：ca²⁺]；müllerweg,etal.inorganicpolymericphosphate/polyphosphateasaninducerofalkalinephosphataseandamodulatorofintracellularca²⁺levelinosteoblasts(saos-2cells)invitro.actabiomaterialia2011；7:2661-2671)，(ii)“aca-聚p-np”納米顆粒，(iii)“視黃醇/aca-聚p-ns”納米球，或者(iv)“視黃醇”。將視黃醇溶于乙醇(1mg/ml)中，然后稀釋于dmso(二甲亞砜)中。進(jìn)行孵育，持續(xù)3d。

在指示的實(shí)驗(yàn)中，將圓形纖維墊樣本(直徑15mm)插入24孔板的各孔中，并以5·10³個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種mc3t3-e1細(xì)胞。然后將分析物孵育3d，并進(jìn)行顯微鏡分析以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析。

人多能基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

在條件培養(yǎng)基存在下，人多能基質(zhì)細(xì)胞(hmsc)從發(fā)育的牙胚細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞；如(huon,etal.(2010)differentiationofdermalmultipotentcellsintoodontogeniclineageinducedbyembryonicandneonataltoothgermcell-conditionedmedium.stemcellsdev19:93-104)所述制備條件培養(yǎng)基。關(guān)于hmsc培養(yǎng)程序的描述已經(jīng)公開(kāi)(wangxh,etal.(2014)themarinesponge-derivedinorganicpolymers,biosilicaandpolyphosphate,asmorphogeneticallyactivematrices/scaffoldsfordifferentiationofhumanmultipotentstromalcells:potentialapplicationin3dprintinganddistractionosteogenesis.marinedrugs12:1131-1147)。在責(zé)任倫理委員會(huì)批準(zhǔn)之后，可以從知情同意的供體的骨髓抽取物獲得人細(xì)胞。在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中，于37℃和5％co2下進(jìn)行孵育。將第六代用于研究。在補(bǔ)充有20％胎牛血清(fcs；gibcoinvitrogen)以及100個(gè)單位/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的α-mem(biochrom)中孵育細(xì)胞。此外，向分析物中添加5％的條件培養(yǎng)基。

在條件培養(yǎng)基存在下，第三代之后在聚p不存在或者在30μg/mlna-聚p[ca²⁺]或aca-聚p-mp存在下，繼續(xù)在48孔板中培養(yǎng)細(xì)胞(cat.no.677102；greiner)。然后收獲細(xì)胞用于qrt-pcr分析。

細(xì)胞活力分析

可以利用例如“細(xì)胞增殖試劑盒ii”(roche)，通過(guò)比色xtt方法([na-3’[1-(苯基氨基-羰基)-3,4-四唑]-雙(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸])測(cè)定細(xì)胞增殖/細(xì)胞活力。在650nm下測(cè)定吸光度，并將其減去背景值(500nm)。在實(shí)施例所述的實(shí)驗(yàn)中，在72h之后測(cè)定活細(xì)胞。

細(xì)胞染色

如(nakanishit,katos.impactofdiabetesmellitusonmyocardiallipiddeposition:anautopsystudy.patholrespract2014；210:1018-1025)所述，用耐爾藍(lán)a(basicblue12,nilebluesulfate；sigman0766)對(duì)mc3t3-e1細(xì)胞進(jìn)行染色。該染色試劑在組織樣本中明顯，中性脂質(zhì)(甘油三酯、膽固醇脂、類固醇)呈粉色，而酸(脂肪酸、脂色素、磷脂)被染成藍(lán)色。

反轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)pcr分析

可以通過(guò)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-qpcr)，測(cè)定基因表達(dá)水平。如實(shí)施例所述的各實(shí)驗(yàn)所指示，在3μg/ml聚p(以可溶形式，或以納米顆粒/納米球)或者3μm視黃醇存在或不存在下，在培養(yǎng)基/血清中孵育細(xì)胞，持續(xù)3d。然后收獲細(xì)胞，分離它們的rna，并進(jìn)行rt-qpcr。在實(shí)施例所述的實(shí)驗(yàn)中，使用與各小鼠基因匹配的下述引物對(duì)：脂肪酸結(jié)合蛋白4(小家鼠(musmusculus)；登錄號(hào)nm_024406)fwd：5’-cgatgaaatcaccgcagacgac-3’[nt278至nt299](seqidno：1)，和rev：5’-accaccagcttgtcaccatctc-3’[nt412至nt392](seqidno：2)；產(chǎn)物大小135bp；瘦素(小家鼠；nm_008493)fwd：5’-gaagagaccgggaaagagtgacag-3’[nt2888至nt2911](seqidno：3)，和rev：5’-tgaccaaggtggcatagcacag-3’[nt3040至nt3019](seqidno：4)；大小153bp；以及瘦素受體，轉(zhuǎn)錄本變體2(小家鼠；nm_010704)fwd：5’-gtgtgaggaggtacgtggtgaag-3’[nt2570至nt2592](seqidno：5)，和rev：5’-ccgagggaattgacagccagaac-3’[nt2708至nt2686](seqidno：6)；大小139bp。將gapdh[甘油醛3-磷酸脫氫酶(musgapdh；nm_008084)用作參考基因fwd：5’-tcacggcaaattcaacggcac-3’[nt200至nt220](seqidno：7)，和rev：5’-agactccacgacatactcagcac-3’[nt338至nt316；大小139bp](seqidno：8)。

為了定量hmsc中編碼alp的基因的表達(dá)水平，在30μg/mlna-聚p[ca²⁺]或aca-聚p-mp存在下，將細(xì)胞孵育1、3和7d，收獲細(xì)胞，分離rna，并進(jìn)行qrt-pcr?？梢允褂闷ヅ淙薬lp基因(登錄號(hào)nm_000478.4)的引物對(duì)fwd：5′-tgcagtacgagctgaacaggaaca-3′(seqidno.9)[nt1141至nt1164]，和rev：5′-tccaccaaatgtgaagacgtggga-3′(seqidno.10)[nt1418至nt1395；pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度278bp]，以及使用匹配參考基因gapdh(甘油醛3-磷酸脫氫酶；nm_002046.3)的引物對(duì)fwd：5′-ccgtctagaaaaacctgcc-3′(seqidno.11)[nt845至nt863]，和rev：5′-gccaaattcgttgtcatacc-3′(seqidno.12)[nt1059至nt1078；215bp]。

可以例如在icycler(bio-rad)中，應(yīng)用各icycler軟件進(jìn)行擴(kuò)增。在確定ct值之后，計(jì)算各轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。測(cè)定各基因的表達(dá)水平，并且計(jì)算的值與未處理的細(xì)胞中基因的表達(dá)值相關(guān)聯(lián)；將該值設(shè)定為1。

牙齒的體外孵育

為了測(cè)定aca-聚p-mp再封閉牙本質(zhì)層的效果，并核查微粒封閉牙本質(zhì)小管的效力，使用人牙齒。在使用牙齒之前，機(jī)械清除軟組織，在3％次氯酸鈉中處理5h以移除剩余的軟組織，然后于4℃在100％相對(duì)濕度的室中保存。

將牙齒樣品浸沒(méi)于鹽水(0.90％[w/v]nacl)中，如文中所提及的，所述鹽水包含10mg/ml的與ca²⁺化學(xué)計(jì)量地復(fù)合的aca-聚p-mp或na-聚p(摩爾比為2:1/磷酸鹽單體：ca²⁺[müllerweg,etal.(2011)inorganicpolymericphosphate/polyphosphateasaninducerofalkalinephosphataseandamodulatorofintracellularca²⁺levelinosteoblasts(saos-2cells)invitro.actabiomater7:2661-2671])。在25℃進(jìn)行孵育。然后如(wangxh,etal.(2014)enzyme-basedbiosilicaandbiocalcite:biomaterialsforthefutureinregenerativemedicine.trendsbiotechnol32:441-447)所述，通過(guò)在牙髓內(nèi)部切開(kāi)1-2mm厚的圓片，而對(duì)樣本進(jìn)行切片；如所指示的，該測(cè)量中包括牙本質(zhì)或釉質(zhì)區(qū)域以及粘合層。

顯微分析

例如用配備有低電壓(<1kv；近表面有機(jī)表面的分析)探測(cè)器的hitachisu8000(hitachihigh-technologieseuropegmbh)，進(jìn)行掃描電子顯微鏡檢查(sem)。在各孵育之后，將牙齒樣本在pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)中洗滌三次。經(jīng)蒸餾水短暫遍歷之后，將樣本干燥并進(jìn)行檢查。如所提及的，切開(kāi)樣本?？梢岳缬门鋫溆衯h-z100變焦鏡頭的vhx-600數(shù)碼顯微鏡(keyence)，進(jìn)行數(shù)碼光學(xué)顯微鏡檢查。

電子顯微鏡檢查

對(duì)于掃描電子顯微(sem)分析，例如可以應(yīng)用hitachisu8000電子顯微鏡。為了使與紡織墊相連的細(xì)胞可視化，在孵育之后移出樣品，并進(jìn)行固定、脫水和風(fēng)干。

x射線能量色散譜

可以例如用與掃描電子顯微鏡(例如，nova600nanolab；fei)相連，在10kv下操作，具有30-45s的收集時(shí)間的edaxgenesisedxsystem，進(jìn)行edx光譜學(xué)。在實(shí)施例所述的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)edx分析了大約10μm²的面積。

機(jī)械納米壓痕測(cè)定

利用例如nanotestvantage系統(tǒng)(micromaterialsltd)，通過(guò)深度敏感壓痕，在25℃評(píng)估未處理的或者包被聚p的牙齒樣品的表面。利用三面berkovich金剛石壓頭，以在涂層表面產(chǎn)生三角形的壓痕標(biāo)記；齒頂圓角半徑測(cè)量大約50-100nm?？偣策M(jìn)行30次單一測(cè)量。負(fù)載率以及卸載率固定為0.5mns^-1。為了測(cè)定“蠕變效應(yīng)”，在最大負(fù)載處引入30s停留期。在卸載曲線中，將在10％的最大負(fù)載處的第二停留期(60s)用于測(cè)定系統(tǒng)的熱漂移。根據(jù)oliver和pharr方法(oliverwcandpharrgm(1992)animprovedtechniquefordetermininghardnessandelasticmodulususingloadanddisplacementsensingindentationexperiments.jmaterres7:1564-1583)，用卸載數(shù)據(jù)計(jì)算樣本的馬氏硬度和降低的模量。對(duì)于計(jì)算，可以使用軟件“nanotestplatformfourv.40.08(micromaterialsltd)”。

統(tǒng)計(jì)分析

可以利用配對(duì)的學(xué)生t檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。

序列表

<110>維爾納·恩斯特·路德維格·格奧爾格·米勒

<120>基于具有形態(tài)發(fā)生活性的非晶形聚磷酸鈣的生物活性傷口敷料和牙齒涂層

<130>m32732wo03

<150>gb1420363.2

<151>2014-11-17

<150>gb1505629.4

<151>2015-04-01

<150>gb1510772.5

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<213>小家鼠(musmusculus）

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<213>智人(homosapiens)

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