本申請涉及在包括韌帶例如前交叉韌帶(acl)的軟組織中修復(fù)軟組織缺損的無縫合方法。所述修復(fù)包括修復(fù)部分或完全撕裂。具體地，本申請涉及修復(fù)軟組織缺損的無縫合方法，所述方法包括使用致敏劑使含有膠原的貼劑粘附于軟組織缺損的部位，其中圍繞所述軟組織缺損形成生物活性腔，其提供有助于修復(fù)所述組織的微環(huán)境。

背景技術(shù)：

肌腱組織、韌帶組織、血管組織、皮組織等通常統(tǒng)稱為軟組織。韌帶為特殊的結(jié)締軟組織，其連接不同的器官或組織且使骨和骨接附。在后者情況下，韌帶由于足夠柔韌以使骨自然運(yùn)動(dòng)而為關(guān)節(jié)提供穩(wěn)定性，但同時(shí)是強(qiáng)壯且不能延伸的以防止對所施加的力產(chǎn)生抵抗。肌腱連接肌肉與骨并能夠承受張力。此外，肌腱被動(dòng)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)過程中的力，這提供額外的穩(wěn)定性而無需主動(dòng)工作。它們的彈性使肌腱能夠高效儲存并回收能量。在肌腱和韌帶中，膠原纖維束嵌入由蛋白聚糖組分構(gòu)成的連接矩陣。這些膠原纖維束提供承載元件。在肌腱中，膠原纖維以幾乎平行的形式排列，由此使它們能夠承受單向高載量。在韌帶中，膠原纖維以較不平行的形式排列，由此使它們能夠承受一個(gè)方向上的主要張力及其它方向上的較小張力。

每年數(shù)十萬人發(fā)生韌帶扭傷、撕裂或斷裂，特別是在膝蓋、肩膀及踝中，或遭受上肢和下肢肌腱損傷，特別是在肩膀、膝蓋、足和踝中。經(jīng)常受到這些類型的損傷的影響的一種韌帶為膝蓋的前交叉韌帶(acl)。acl用作前脛骨平移的主要穩(wěn)定結(jié)構(gòu)且用作膝蓋外翻內(nèi)翻角度的次要穩(wěn)定結(jié)構(gòu)且通常由于與運(yùn)動(dòng)損傷和交通事故相關(guān)的屈曲-旋轉(zhuǎn)-外翻力而易發(fā)生斷裂或撕裂。斷裂或撕裂通常導(dǎo)致：嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)受限；疼痛和不適；及不能參與運(yùn)動(dòng)和鍛煉。僅在美國每年就有超過200,000人發(fā)生acl撕裂或斷裂，這導(dǎo)致用于acl再造手術(shù)和全面康復(fù)的開支為約30億美元。通常已知的是acl具有差的治愈能力。當(dāng)acl遭受導(dǎo)致關(guān)節(jié)不穩(wěn)定的嚴(yán)重撕裂或斷裂時(shí)，需要全面的手術(shù)置換和再造。最常見的措施為通過將撕裂的韌帶用患者自身的組織替換而對撕裂的acl進(jìn)行再造(也稱為自體移植)。用于替換韌帶的其它選擇包括來自另一個(gè)生命體的供體組織(也稱為同種異體移植)及合成移植。

使用膠原纖維、生物可降解聚合物和復(fù)合材料對軟組織破損進(jìn)行的再造已與由蛋白質(zhì)、水凝膠或膠原構(gòu)成的三維支架一起使用。然而，所有這些措施通常都需要某種形式的縫合。

消除對縫合的需要且避免旁系組織損傷的手術(shù)技術(shù)就顯微外科修復(fù)韌帶、肌腱、血管和神經(jīng)而言是未完成的目標(biāo)。置于精細(xì)結(jié)構(gòu)例如韌帶和肌腱中的縫線不可避免地引起持續(xù)的問題。例如，永久性縫線的存在導(dǎo)致在修復(fù)部位發(fā)生包括炎癥和瘢痕化在內(nèi)的免疫反應(yīng)?？p線材料還產(chǎn)生內(nèi)皮不規(guī)則及由此產(chǎn)生血栓形成作用。此外，縫線的存在與其它封閉技術(shù)相比不提供瞬時(shí)防水密封，如相對低的滲漏點(diǎn)壓力所示。

為了克服對縫合修復(fù)韌帶、肌腱、血管、神經(jīng)等的一些限制，研究人員先前已使用了環(huán)、夾子、膠水和激光焊接。這些方法學(xué)中的一些參見zeebregts等人(2003),brjsurg；90:261-271；然而，所有這些可選方法都具有與明顯異物反應(yīng)或相關(guān)組織損傷相關(guān)的顯著缺點(diǎn)，這已阻止了廣泛的臨床使用。

激光輔助修復(fù)已成為25年多以來的研究主題且涉及遞送激光能量以加熱修復(fù)部位以實(shí)現(xiàn)“焊接”(wolf-dejonge等人(2004),eurjvascendovascsurg.,27:466-476)。自20世紀(jì)70年代末已出現(xiàn)大量關(guān)于使用氬氣、co2、近紅外二極管和nd:yag激光對組織進(jìn)行焊接的報(bào)道(參見例如gelli等人(1997),j.reconstr.microsurg.,13:199-205；jain和gorisch(1979),surgery,85:684-688；lewis和uribe(1993),laryngoscope,103:850-853；neblett等人(1986),neurosurgery,19:914-934；samonte和fried(1991),laserssurgmed.,11:511-516；serure等人(1983),surg.forum,34:634-636；tang等人(1994),laserssurgmed.,14:229-237；vale等人(1986),plast.reconstr.surg.,77:759-766)。在這些及許多其它報(bào)道中，激光能量轉(zhuǎn)化為熱以使局部組織溫度升高且使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白變性，由此實(shí)現(xiàn)組織焊接和修復(fù)。

盡管激光焊接有很多理論益處，但所述技術(shù)尚未在臨床上使用。原因有很多，但加熱組織必然引起損傷且由此尚未實(shí)現(xiàn)在臨床領(lǐng)域中的使用而無視在激光焊接領(lǐng)域中的所有臨床前研究。

因此，仍需要對軟組織缺損包括肌腱組織缺損、韌帶組織缺損、血管組織缺損、皮組織缺損等進(jìn)行修復(fù)的方法，其減輕就使用支架和縫合所出現(xiàn)的問題或至少在克服以上問題中發(fā)揮作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在第一方面，本申請?zhí)峁┬迯?fù)軟組織缺損的無縫合方法，所述方法包括：

(i)提供適于包圍至少部分所述軟組織缺損的含有膠原的貼劑；

(ii)使所述軟組織缺損和/或含有膠原的貼劑與致敏劑接觸；

(iii)將所述軟組織缺損包圍在所述含有膠原的貼劑中以形成生物活性腔；和

(iv)使所述含有膠原的貼劑粘附于所述軟組織缺損而不進(jìn)行縫合。

在一些實(shí)施方案中，軟組織缺損存在于選自以下的軟組織中：韌帶組織、肌腱組織、靜脈組織、動(dòng)脈組織和神經(jīng)管組織。在一些實(shí)施方案中，軟組織缺損存在于韌帶例如前交叉韌帶(acl)中。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在已閱讀本說明書通篇后將認(rèn)識到的是，致敏劑具有以下作用：由放射線或光線吸收能量且將能量傳遞至含有膠原的貼劑和/或軟組織以使含有膠原的貼劑粘附或“焊接”于所處理的軟組織。

可用于本申請的致敏劑的非窮舉性實(shí)例包括苯乙酮類、二苯甲酮類、萘類、雙乙酰、曙紅、玫瑰紅、芘類、蒽類、吩噻嗪類等。在一些實(shí)施方案中，致敏劑為玫瑰紅。

含有膠原的貼劑優(yōu)選具有以下性質(zhì)：

a)以有利于組織整合和血管化的方式相互連接的孔；

b)使正常組織最終替換支架的生物可降解性和/或生物可再吸收性；

c)促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖和分化的表面化學(xué)；

d)強(qiáng)度和柔性；和

e)低抗原性。

含有膠原的貼劑包含大于80％的i型膠原。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑包含至少85％的i型膠原。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑包含大于90％的i型膠原。

含有膠原的貼劑中的膠原纖維或束包含編織結(jié)構(gòu)。本申請使用的術(shù)語“編織結(jié)構(gòu)”是指包含第一和第二組纖維或束的結(jié)構(gòu)，其中第一組中的纖維或束主要在第一方向上延伸且第二組中的纖維或束主要在第二方向上延伸，其中第一和第二方向彼此不同且第一組中的纖維或束與第二組中的纖維或束交錯(cuò)或以其它方式編織。方向上的不同可為約90°。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑所具有的最大拉伸負(fù)荷強(qiáng)度大于20n。在一些實(shí)施方案中，本申請含有膠原的貼劑所具有的最大拉伸負(fù)荷強(qiáng)度大于25n、40n、60n、80n、100n、120n或140n。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑所具有的模量大于100mpa。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑所具有的模量大于200mpa、300mpa、400mpa或500mpa。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑在最大負(fù)荷時(shí)所具有的延伸小于原始長度的85％。

最重要的是，本申請含有膠原的貼劑的厚度必須足以為正在修復(fù)的軟組織提供支撐；然而，又不能過厚以使所述含有膠原的貼劑與所述軟組織粘附的能力受損。因此，在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為25μm至200μm。在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為30μm至180μm。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為35μm至170μm。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為40μm至160μm。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為45μm至150μm。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為50μm至140μm。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為50μm至100μm。最后在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為約50μm。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑通過使所述貼劑成形來調(diào)整以提供較好方式的原位處理。在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑對應(yīng)于圖2所示的含有膠原的貼劑。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到的是，含有膠原的貼劑可使用多種技術(shù)來制備。在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑如下制備：

(i)分離含有膠原的組織并使其在乙醇溶液中溫育；

(ii)使來自步驟(i)的含有膠原的組織在包含無機(jī)鹽和陰離子表面活性劑的第一溶液中溫育以使其所含有的非膠原蛋白變性；

(iii)使在步驟(ii)中產(chǎn)生的含有膠原的組織在包含無機(jī)酸的第二溶液中溫育直到所述物質(zhì)中的膠原變性；和

(iv)在同時(shí)進(jìn)行機(jī)械刺激的情況下使在步驟(iii)中產(chǎn)生的含有膠原的組織在包含無機(jī)酸的第三溶液中溫育足以使所述含有膠原的組織中的膠原束能夠?qū)R的時(shí)間；

其中所述機(jī)械刺激包括將張力循環(huán)施加于所述含有膠原的組織。

在第二方面，本申請?zhí)峁┯糜跓o縫合修復(fù)軟組織的含有膠原的貼劑，其中所述貼劑的厚度為25μm至200μm，所述貼劑包含大于90％的i型膠原，所述貼劑所具有的最大拉伸負(fù)荷強(qiáng)度大于100n，所述貼劑所具有的模量大于200mpa且所述貼劑能夠包圍所述軟組織以形成生物活性腔。

在一些實(shí)施方案中，用于無縫合修復(fù)軟組織的含有膠原的貼劑如下產(chǎn)生：

(i)分離含有膠原的組織并使其在乙醇溶液中溫育；

(ii)使來自步驟(i)的含有膠原的組織在包含無機(jī)鹽和陰離子表面活性劑的第一溶液中溫育以使其所含有的非膠原蛋白變性；

(iii)使在步驟(ii)中產(chǎn)生的含有膠原的組織在包含無機(jī)酸的第二溶液中溫育直到所述物質(zhì)中的膠原變性；和

(iv)在同時(shí)進(jìn)行機(jī)械刺激的情況下使在步驟(iii)中產(chǎn)生的含有膠原的組織在包含無機(jī)酸的第三溶液中溫育足以使所述含有膠原的組織中的膠原束能夠?qū)R的時(shí)間；

其中所述機(jī)械刺激包括將張力循環(huán)施加于所述含有膠原的組織。

在第三方面，本申請?zhí)峁┬迯?fù)前交叉韌帶(acl)部分或完全撕裂的方法，所述方法包括：

(i)提供適于包圍至少部分所述acl的含有膠原的貼劑；

(ii)使所述acl和/或含有膠原的貼劑與致敏劑接觸；

(iii)將所述acl包圍在所述含有膠原的貼劑中以形成生物活性腔；和

(iv)使所述含有膠原的貼劑粘附于所述acl而不進(jìn)行縫合。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到的是，使本申請含有膠原的貼劑粘附于軟組織的步驟可為本領(lǐng)域已知的任何方法，包括使用激光所發(fā)射的光能或射頻(“rf”)能量對組織進(jìn)行“焊接”的組織焊接方法?？墒褂闷渌强p合粘附方式例如生物相容性膠水例如纖維蛋白膠水或pla/plg聚合物。

在一些實(shí)施方案中，通過使用激光對組織進(jìn)行焊接使含有膠原的貼劑粘附于軟組織。激光的最佳脈沖長度將由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定；然而，例如可使用33-600ms脈沖歷時(shí)1-6分鐘來粘附厚度為100μm的含有膠原的貼劑。

附圖說明

圖1的掃描電子顯微鏡圖像顯示了通過實(shí)施例1的方法制備的含有膠原的貼劑的表面形態(tài)。可觀察到貼劑具有兩種不同的表面：特征為壓實(shí)膠原束的平滑表面(a)和松散膠原纖維的粗糙多孔表面(b)。比例尺：500μm。

圖2顯示了通過本申請方法產(chǎn)生的膠原膜的掃描電子顯微鏡(sem)圖像(×100)。

圖3顯示了本申請貼劑的“蝶狀”排列。

具體實(shí)施方式

除非另有定義，本申請使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語)具有與本申請所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常理解相同的含義。還將理解的是，術(shù)語例如常用字典所定義的那些術(shù)語應(yīng)當(dāng)被解釋為具有與其在本說明書和相關(guān)領(lǐng)域中的含義一致的含義且不應(yīng)當(dāng)以理想化或過于形式的方式被解釋，除非本申請明確如此定義。出于簡要和/或清楚的目的而可能沒有對眾所周知的功能或構(gòu)造進(jìn)行詳細(xì)描述。

本申請使用的術(shù)語學(xué)僅用于描述具體實(shí)施方案的目的而不意在限制本申請。本申請使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”意在同時(shí)包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有明確說明。還將理解的是，本說明書使用的術(shù)語“包含”和/或“包括”是指存在所描述的特征、整數(shù)、步驟、操作、要素和/或組分，但不排除存在或添加一個(gè)或多個(gè)其它特征、整數(shù)、步驟、操作、要素、組分和/或其組合。本申請使用的術(shù)語“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)所列項(xiàng)目中的任何一個(gè)和各種組合。本申請使用的短語例如“在x和y之間”及“在約x和y之間”應(yīng)當(dāng)被解釋為包括x和y。本申請使用的短語例如“在約x和y之間”是指“在約x和約y之間”。本申請使用的短語例如“約x至y”是指“約x至約y”。

本申請記載的數(shù)值范圍明確包括在所述范圍之間的具有相同精度的每個(gè)插入數(shù)值。例如，范圍6-9除6和9外還包括數(shù)值7和8且范圍6.0-7.0明確包括數(shù)值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

本申請使用的術(shù)語“約”是指該術(shù)語后的數(shù)值向上或向下偏離10％。例如，當(dāng)提及厚度為約50μm的含有膠原的貼劑時(shí)，包括在45μm和55μm之間的范圍即數(shù)值50μm向上或向下10％。其包括45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、50μm、51μm、52μm、53μm、54μm和55μm。

將理解的是，在本申請方法中描述的操作(或步驟)的順序不限于在權(quán)利要求書或附圖中呈現(xiàn)的次序，除非另有明確說明。

在最可能寬的方面，本申請涉及使用含有膠原的貼劑來修復(fù)軟組織。

本申請使用的術(shù)語“膠原”是指所有形式的膠原，包括已加工或以其它方式修飾的那些膠原。優(yōu)選的膠原被處理以除去免疫原性端肽區(qū)(“無端肽膠原”)，為可溶的且被再造為纖維形式。i型膠原最適于最廣泛的應(yīng)用，包括韌帶組織、肌腱組織、靜脈組織或神經(jīng)組織修復(fù)。然而，與i型膠原組合的其它形式的膠原也可用于實(shí)施本申請且不被本申請排除。

術(shù)語“貼劑”是指一片或一段含有膠原的組織，其通過本申請公開的方法產(chǎn)生且可將其置于和/或粘附于軟組織缺損或軟組織缺損部位以修復(fù)所述組織。貼劑可為任何幾何形狀，但通常為基本上平面的且可在原位符合下方或上方組織的形狀。

含有膠原的貼劑優(yōu)選具有以下性質(zhì)：

a)以有利于組織整合和血管化的方式相互連接的孔；

b)使正常組織最終替換支架的生物可降解性和/或生物可再吸收性；

c)促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖和分化的表面化學(xué)；

d)強(qiáng)度和柔性；和

e)低抗原性。

含有膠原的貼劑通常由在任何哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的包含致密結(jié)締組織的“含有膠原的組織”制備或生產(chǎn)。術(shù)語“含有膠原的組織”是指可由含有膠原的哺乳動(dòng)物體分離的皮膚、肌肉等。術(shù)語“含有膠原的組織”還包括“以合成方式”產(chǎn)生的組織，其中的膠原或含有膠原的物質(zhì)已在體外組裝或制備。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的組織由哺乳動(dòng)物分離，包括但不限于羊、牛、豬或人類。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的組織由人類分離。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的組織為“自體的”即由需要治療的患者的身體分離。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑包含大于80％的i型膠原。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑包含至少85％的i型膠原。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑包含大于90％的i型膠原。

含有膠原的貼劑可通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備；然而，一種優(yōu)選的方法包括以下步驟：

(i)分離含有膠原的組織并使其在乙醇溶液中溫育；

(ii)使來自步驟(i)的含有膠原的組織在包含無機(jī)鹽和陰離子表面活性劑的第一溶液中溫育以使其所含有的非膠原蛋白變性；

(iii)使在步驟(ii)中產(chǎn)生的含有膠原的組織在包含無機(jī)酸的第二溶液中溫育直到所述物質(zhì)中的膠原變性；和

(iv)在同時(shí)進(jìn)行機(jī)械刺激的情況下使在步驟(iii)中產(chǎn)生的含有膠原的組織在包含無機(jī)酸的第三溶液中溫育足以使所述含有膠原的組織中的膠原束能夠?qū)R的時(shí)間；

其中所述機(jī)械刺激包括將張力循環(huán)施加于所述含有膠原的組織。

將認(rèn)識到的是，任何無機(jī)鹽都可用于第一溶液，只要其能夠與路易斯酸形成絡(luò)合物。在一些實(shí)施方案中，無機(jī)鹽選自三甲基氯化銨、四甲基氯化銨、氯化鈉、氯化鋰、高氯酸鹽和三氟甲磺酸鹽。在其它實(shí)施方案中，無機(jī)鹽為氯化鋰(licl)。

盡管多種陰離子表面活性劑可用于第一溶液，但在一些實(shí)施方案中，陰離子表面活性劑選自烷基硫酸鹽、烷基醚硫酸鹽、烷基磺酸鹽和烷基芳基磺酸鹽。特別有用的陰離子表面活性劑包括烷基硫酸鹽例如十二烷基硫酸鈉(sds)。

在一些實(shí)施方案中，第一溶液包含約1％(v/v)sds和約0.2％(v/v)licl。

在一些實(shí)施方案中，第二溶液中的無機(jī)酸包括約0.5％(v/v)hcl，而第三溶液中的無機(jī)酸包括約1％(v/v)hcl。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到的是，所述三個(gè)步驟各自的溫育期將隨以下而變化：(i)含有膠原的組織的類型；(ii)無機(jī)鹽/酸和/或陰離子表面活性劑的類型；(iii)所使用的每種無機(jī)鹽/酸和/或陰離子表面活性劑的強(qiáng)度(濃度)；和(iv)溫育的溫度。在一些實(shí)施方案中，步驟(i)的溫育期為至少8小時(shí)。在其它實(shí)施方案中，步驟(ii)的溫育期小于60分鐘，而在其它實(shí)施方案中，步驟(iii)的溫育期為至少20小時(shí)。

在一些實(shí)施方案中，步驟(ii)的溫育在約4℃進(jìn)行。在其它實(shí)施方案中，步驟(ii)的溫育進(jìn)行至少12小時(shí)。

在一些實(shí)施方案中，第二溶液包含約0.5％(v/v)hcl。

在一些實(shí)施方案中，步驟(iii)的溫育進(jìn)行約30分鐘。在其它實(shí)施方案中，步驟(iii)的溫育在振蕩下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，第三溶液包含約1％(v/v)hcl溶液。

在一些實(shí)施方案中，步驟(iv)的溫育進(jìn)行約12至36小時(shí)，優(yōu)選約24小時(shí)。在其它實(shí)施方案中，步驟(iv)的溫育在振蕩下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，本申請方法還包括在步驟(iii)和步驟(iv)之間的中和步驟，其包括使含有膠原的組織與約0.5％(v/v)naoh一起溫育。

在一些實(shí)施方案中，本申請方法還包括步驟(v)，其包括使來自步驟(iv)的含有膠原的組織與丙酮一起溫育，然后干燥含有膠原的組織。

在一些實(shí)施方案中，本申請方法還包括在步驟(ii)和(iii)之間和/或在步驟(iii)和(iv)之間的以下步驟：使含有膠原的組織與甘油接觸以使脂肪和/或血管可視化并有助于其除去。

可使甘油與含有膠原的組織接觸有助于除去脂肪和/或血管的任何時(shí)長。在一些實(shí)施方案中，接觸時(shí)間為至少10分鐘。

在一些實(shí)施方案中，本申請方法還包括在步驟(ii)和(iii)之間和/或在步驟(iii)和(iv)之間針對含有膠原的組織的洗滌步驟。在步驟(ii)和(iii)之間使用洗滌步驟的目的是為了除去變性蛋白。因此，可使用能夠除去變性蛋白的任何洗滌溶液。在一些實(shí)施方案中，在步驟(ii)和(iii)之間使用的洗滌溶液為丙酮。

用丙酮洗滌后，含有膠原的組織進(jìn)一步用無菌水洗滌。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的組織進(jìn)一步在naoh:nacl溶液中洗滌。若含有膠原的組織用naoh:nacl洗滌，則其然后優(yōu)選用無菌水洗滌。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的組織在步驟(iv)后進(jìn)一步用第一溶液洗滌。

本申請所述方法使用的術(shù)語“同時(shí)進(jìn)行機(jī)械刺激”是指在對含有膠原的組織進(jìn)行化學(xué)加工期間使所述含有膠原的組織拉伸的措施。含有膠原的組織可經(jīng)歷靜態(tài)和/或循環(huán)拉伸。因此，在一些實(shí)施方案中，同時(shí)進(jìn)行機(jī)械刺激可包括：

(i)在預(yù)設(shè)時(shí)段內(nèi)使所述含有膠原的組織拉伸；

(ii)在預(yù)設(shè)時(shí)段內(nèi)使所述含有膠原的組織松弛；和

(iii)將步驟(i)和(ii)重復(fù)n次，其中n為大于或等于1的整數(shù)。

若機(jī)械刺激通過使含有膠原的組織拉伸來進(jìn)行，則優(yōu)選沿其長軸使所述含有膠原的組織拉伸。

在一些實(shí)施方案中，同時(shí)進(jìn)行機(jī)械刺激包括將張力循環(huán)施加于含有膠原的組織，其中張力周期包括約10秒至約20秒的拉伸期及約10秒的松弛期且由此產(chǎn)生的應(yīng)變?yōu)榧s10％且連續(xù)進(jìn)行機(jī)械刺激直到所述含有膠原的組織中的膠原束如本申請所述那樣對齊。

產(chǎn)生后，含有膠原的組織包含具有編織結(jié)構(gòu)的膠原纖維或束。本申請使用的術(shù)語“編織結(jié)構(gòu)”是指包含第一和第二組纖維或束的結(jié)構(gòu)，其中第一組中的纖維或束主要在第一方向上延伸且第二組中的纖維或束主要在第二方向上延伸，其中第一和第二方向彼此不同且第一組中的纖維或束與第二組中的纖維或束交錯(cuò)或以其它方式編織。方向上的不同可為約90°。

通過優(yōu)選方法制備的含有膠原的組織所具有的“最大拉伸負(fù)荷強(qiáng)度”大于20n。在一些實(shí)施方案中，本申請含有膠原的組織所具有的最大拉伸負(fù)荷強(qiáng)度大于25n、40n、60n、80n、100n、120n或140n。

還據(jù)信含有膠原的組織中的編織結(jié)構(gòu)使所述含有膠原的貼劑在最大負(fù)荷時(shí)的延伸得以減小同時(shí)使模量得以增加。

本申請使用的術(shù)語“模量”是指楊氏模量(young’smodulus)且被確定為應(yīng)力與應(yīng)變的比例。這可度量含有膠原的組織和/或貼劑的剛度。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的組織所具有的模量大于100mpa。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的組織所具有的模量大于200mpa、300mpa、400mpa或500mpa。

本申請使用的術(shù)語“在最大負(fù)荷時(shí)的延伸”是指含有膠原的組織在最大拉伸負(fù)荷強(qiáng)度時(shí)與含有膠原的組織在無負(fù)荷的條件下的原始長度相比的延伸。這與最大延伸是不同的，后者更大。

在一些實(shí)施方案中，含有膠原的組織在最大負(fù)荷時(shí)所具有的延伸小于原始長度的85％。

產(chǎn)生含有膠原的組織后，可使其成形為含有膠原的貼劑以供使用。在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑通過使所述貼劑成形來調(diào)整以提供較好方式的原位處理。在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑對應(yīng)于圖3所示的含有膠原的貼劑。

最重要的是，本申請含有膠原的貼劑的厚度必須足以為正在修復(fù)的軟組織提供支撐；然而，又不能過厚以使所述含有膠原的貼劑與所述軟組織粘附的能力受損。因此，在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為25μm至200μm。在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為30μm至180μm。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為35μm至170μm。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為40μm至160μm。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為45μm至150μm。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為50μm至140μm。在其它實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為50μm至100μm。最后在一些實(shí)施方案中，含有膠原的貼劑的厚度為約50μm。

本申請實(shí)施方案大體上涉及含有膠原的貼劑，其特別適于在哺乳動(dòng)物或人類患者中修復(fù)軟組織缺損?；颊叱祟愅膺€可為靈長類、馬類、犬類或貓科動(dòng)物。因此，在使用中將含有膠原的貼劑施用于待治療的患者的軟組織缺損或缺損部位以使其包圍所述缺損。術(shù)語“組織缺損”或“組織缺損部位”是指肌腱、韌帶、靜脈/動(dòng)脈或神經(jīng)管的上皮或組織的破損。組織缺損使組織性能處于亞適水平或使組織處于亞適狀態(tài)。例如，組織缺損可為肌腱或韌帶中部分厚度或全部厚度的撕裂。組織缺損可呈“空隙”構(gòu)造，其被理解為是指三維缺陷例如缺口、腔隙、孔洞或上皮或組織結(jié)構(gòu)完整性的其它實(shí)質(zhì)性破損。在一些實(shí)施方案中，組織缺損使其不能內(nèi)源性或自發(fā)性修復(fù)。組織缺損可為事故、疾病和/或手術(shù)操作所導(dǎo)致的結(jié)果。

術(shù)語“包圍”是指含有膠原的貼劑基本上包封組織缺損部位以在所述貼劑下且在所述組織缺損上形成生物活性腔。術(shù)語“生物活性腔”是指在含有膠原的貼劑和組織缺損表面之間的空間。在該空間內(nèi)，內(nèi)源細(xì)胞或在一些實(shí)施方案中引入的細(xì)胞、藥理學(xué)活性劑等被包含在組織缺損部位中，由此能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織修復(fù)。

本申請使用的術(shù)語“修復(fù)”或其語法等同形式包括修復(fù)哺乳動(dòng)物優(yōu)選人類中的組織缺損?！靶迯?fù)”是指所形成的新組織足以至少部分填充組織缺損部位的空隙或結(jié)構(gòu)不連續(xù)性。然而，修復(fù)不是指或不必然是就使組織缺損恢復(fù)至其缺損前生理學(xué)/結(jié)構(gòu)/機(jī)械狀態(tài)而言100％有效的完全治愈或治療過程。

在一些實(shí)施方案中，將含有膠原的貼劑施用于組織缺損前或?qū)⒑心z原的貼劑施用于組織缺損后，使含有膠原的貼劑和/或組織缺損或缺損部位與致敏劑接觸。致敏劑具有以下作用：由放射線或光線吸收能量且將能量傳遞至含有膠原的貼劑和/或軟組織以使含有膠原的貼劑粘附或“焊接”于所處理的軟組織。

可用于本申請的致敏劑的非窮舉性實(shí)例包括苯乙酮類、二苯甲酮類、萘類、雙乙酰、曙紅、玫瑰紅、芘類、蒽類、吩噻嗪類等。在一些實(shí)施方案中，致敏劑為玫瑰紅(4,5,6,7-四氯-2’,4’,5’,7’-四碘熒光素)。

將含有膠原的貼劑施用于組織缺損后，本領(lǐng)域技術(shù)人員例如整形外科醫(yī)生通過使所述貼劑粘附于所述軟組織缺損而將所述貼劑固定在患者的缺損部位。含有膠原的貼劑與缺損部位的這種粘附提供本申請所述生物活性腔，其促進(jìn)細(xì)胞生長和正在治療的組織的治愈。粘附方式的實(shí)例包括但不限于生物相容性膠水、組織焊接及其組合。

生物相容性膠水可選自但不限于明膠、海藻酸、瓊脂糖、淀粉、纖維蛋白、膠原、層粘連蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖例如硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素和/或硫酸角質(zhì)素、酪蛋白、葡聚糖、焦糖、果膠、角叉菜膠和黃原膠?？捎糜诒旧暾埖纳锵嗳菪阅z水的非限制性實(shí)例為纖維蛋白粘合劑，其由oesterreichischesinstitutfuerhaemoderivateg.m.b.h.,vienna,austria制造并由baxterhealthcarecorporation,glendale,calif.以商品名tisseel^tm銷售?？商鎿Q生物相容性膠水或除生物相容性膠水外還可使用的其它粘附方式的非限制性實(shí)例包括組織焊接，參見例如helmsworth,t.f.等人,lasersurgerymedicine10:576-583,1990。還可使用生物相容性或生物可吸收性材料例如但不限于pla/plg聚合物。

可使含有膠原的貼劑粘附于軟組織缺損的一種方法為通過光化學(xué)組織粘結(jié)(ptb)即光驅(qū)動(dòng)方法學(xué)的一種替換方法，其依賴于化學(xué)能而非熱能來密封組織(chan等人(2005),jsurgres；124:274-279；chan等人(2002)jsurgres；108:77-84；kamegaya等人(2005)laserssurgmed；37:264-270；mulroy等人(2000)investophthalmolvissci；41:3335-3340；proano等人(2004)jcataractrefractsurg；30:2420-2424；proano等人(2004)investophthalmolvissci；45:2177-2181)。ptb使用可見光和光反應(yīng)性染料的組合以在組織表面之間進(jìn)行直接粘結(jié)和緊密密封。不需要任何其它添加劑。染料對光的吸收導(dǎo)致反應(yīng)性中間體的產(chǎn)生，其在所粘合的組織表面上的分子之間引起交聯(lián)反應(yīng)(lambert和kochevar(1997)photochemphotobiol.,66:15-25)。盡管確切的作用機(jī)制是不清楚的，但已證實(shí)可使用光化學(xué)方法使i型膠原發(fā)生化學(xué)交聯(lián)。ptb通過光化學(xué)機(jī)制發(fā)生且通常以比激光焊接低很多的能量進(jìn)行。其不涉及加熱組織且由此可提供激光修復(fù)的所有優(yōu)點(diǎn)同時(shí)避免熱損傷后遺癥。

可用于暴露的放射線的實(shí)例包括遠(yuǎn)紫外線，例如汞燈亮線譜(波長：254nm)、krf準(zhǔn)分子激光(波長：248nm)、arf準(zhǔn)分子激光(波長：193nm)、f2準(zhǔn)分子激光(波長：157nm)和euv(波長：13nm)等；x射線，例如同步加速器放射線；帶電粒子射線，例如電子束等。放射線優(yōu)選為遠(yuǎn)紫外線和帶電粒子射線。更優(yōu)選地，放射線為krf準(zhǔn)分子激光(波長：248nm)、arf準(zhǔn)分子激光(波長：193nm)、f2準(zhǔn)分子激光(波長：157nm)和電子束。

激光用于為含有膠原的貼劑提供均勻照明。激光優(yōu)選是脈沖的以使附近軟組織熱損傷區(qū)域最小化。選擇激光波長以使所述激光被致敏劑吸收。能量使貼劑和相鄰軟組織表面上的薄層升溫，這使所述貼劑粘結(jié)或“焊接”于所述軟組織表面。貼劑作為連接組織的手段。貼劑上的致敏劑薄層使損傷區(qū)域最小化，這是因?yàn)樘幱谫N劑-軟組織界面的該薄層優(yōu)先吸收激光能量且被加熱。因此，致敏劑薄層對于滲透有致敏劑的貼劑是優(yōu)選的。

生物相容性膠水層也可存在于貼劑上以促進(jìn)或加強(qiáng)粘結(jié)，或在暴露于激光后發(fā)生聚合的化學(xué)物質(zhì)可用于形成與軟組織表面的機(jī)械粘結(jié)。除經(jīng)涂敷的貼劑外或?yàn)榱颂鎿Q經(jīng)涂敷的貼劑，也可將致敏劑層或生物相容性膠水層或聚合物層直接施用于軟組織表面，盡管用化學(xué)層對貼劑進(jìn)行涂敷可能是較容易的。

貼劑或軟組織表面通常具有致敏劑層或生物相容性膠水層且在傳遞激光并被貼劑吸收時(shí)使貼劑焊接于軟組織缺損。

必須小心地選擇用于焊接貼劑的激光的脈沖結(jié)構(gòu)以最小化或防止對所焊接的軟組織的損傷。帶有溫度反饋的脈沖激光照射對血管內(nèi)貼劑焊接的作用已使用計(jì)算機(jī)模擬來研究。參見glinsky等人,“computermodelingofendovascularpatchweldingusingtemperaturefeedback”,proceedingsofmedicalapplicationsoflasersiii,vol.2623,pp.349-358(1995)和glinsky等人,“modelingofendovascularpatchweldingusingthecomputerprogramlatis”,proceedingsoflaser-tissueinteractioniv,vol.2391,pp.262-272(1995)。這些研究(通過引用的方式并入本申請)顯示可使用脈沖激光照射來控制損傷區(qū)域。

最佳脈沖長度使將貼劑焊接于軟組織缺損所需要的總體處理時(shí)間最小化同時(shí)保持受損組織的厚度小于100μm。

在本申請各個(gè)實(shí)施方案中，通過使含有膠原的貼劑與軟組織缺損粘附而產(chǎn)生的生物活性腔可包含一種或多種藥理學(xué)活性劑。本申請使用的“藥理學(xué)活性劑”通常是指在引入宿主后具有直接或間接有益治療作用的藥理學(xué)活性劑?？蛇m用于本申請的藥理學(xué)活性劑的代表性實(shí)例包括：

抗高血壓藥，例如肼屈嗪、米諾地爾、卡托普利、依那普利、可樂定、哌唑嗪、異喹胍、二氮嗪、胍乙啶、甲基多巴、利舍平、曲美芬；

鈣通道阻斷劑，例如地爾硫非洛地平、氨氯地平、尼群地平、硝苯地平和維拉帕米；

抗心律失常藥，例如胺碘酮、氟卡尼、丙吡胺、普魯卡因胺、美西律和奎尼??；

抗心絞痛藥，例如甘油三硝酸酯、丁四醇四硝酸酯、戊四醇四硝酸酯、甘露醇六硝酸酯、派克昔林、異山梨醇二硝酸酯和尼可地爾；

β-腎上腺素能阻斷劑，例如阿普洛爾、阿替洛爾、布拉洛爾、卡替洛爾、拉貝洛爾、美托洛爾、納多洛爾、萘肟洛爾、奧普洛爾、吲哚洛爾、普萘洛爾、索他洛爾、噻嗎洛爾和馬來酸噻嗎洛爾；

腎上腺素能興奮劑，例如腎上腺素、麻黃堿、非諾洛爾、異丙腎上腺素、奧西那林、rimeterol、沙丁胺醇、沙美特羅、特布他林、多巴酚丁胺、去氧腎上腺素、苯丙醇胺、偽麻黃堿和多巴胺；

血管擴(kuò)張劑，例如環(huán)扁桃酯、異舒普林、罌粟堿、二嘧啶醇、異山梨醇二硝酸酯、酚妥拉明、煙醇、雙氫麥角堿、煙酸、甘油三硝酸酯、戊四醇四硝酸酯和羥丙茶堿；

抗增殖劑，例如紫杉醇、放線菌素d、西羅莫司、他克莫司、依維莫司和地塞米松；

抗凝血?jiǎng)┖脱ㄈ芙鈩缛A法林、雙香豆素、低分子量肝素例如依諾肝素、鏈激酶及其活性衍生物；

止血?jiǎng)?，例如抑肽酶、氨甲環(huán)酸和魚精蛋白；

鎮(zhèn)痛藥和解熱藥，包括阿片類鎮(zhèn)痛藥例如丁丙諾啡、右嗎拉胺、右丙氧芬、芬太尼、阿芬太尼、舒芬太尼、氫嗎啡酮、美沙酮、嗎啡、羥考酮、阿片全堿、噴他佐辛、哌替啶、苯哌利定、可待因、二氫可待因、乙酰水楊酸(阿司匹林)、對乙酰氨基酚和安替比林；

免疫抑制劑、抗增殖劑和細(xì)胞抑制劑，例如雷帕霉素(西羅莫司)及其類似物(依維莫司和他克莫司)；

非甾體抗炎劑，包括其外消旋混合物或單獨(dú)的對映異構(gòu)體(適用時(shí))，其優(yōu)選可與真皮和/或粘膜滲透促進(jìn)劑組合配制，例如布洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、醋氯芬酸、雙氯芬酸、阿洛普令、萘普生、阿司匹林、二氟尼柳、非諾洛芬、吲哚美辛、甲芬那酸、萘普生、保泰松、吡羅昔康、水楊酰胺、水楊酸、舒林酸、脫氧舒林酸、替諾昔康、曲馬多、酮咯酸、氟芬尼酸、雙水楊酯、水楊酸三乙醇胺、氨基比林、安替比林、羥布宗、阿扎丙宗、辛噴他宗、氟芬那酸、clonixerl、氯尼辛、甲氯芬那酸、氟尼辛、秋水仙堿、秋水仙胺、別嘌醇、羥嘌呤醇、鹽酸芐達(dá)明、二甲法登、吲哚克索、吲四唑、鹽酸米姆本、鹽酸瑞尼托林、四氫甲吲胺、鹽酸苯吲吡林、氟洛芬、異丁芬酸、萘普索、芬布芬、辛可芬、二氟米酮鈉、非那莫、氟替阿嗪、美他扎咪、鹽酸來替米特、鹽酸萘西利定、奧他酰胺、嗎林那宗、新辛可芬、尼莫唑、枸櫞酸普羅沙唑、替昔康、芐叉異喹酮、托美丁和三氟米酯；

抗微生物劑，包括頭孢菌素類，例如頭孢氨芐、頭孢噻吩和頭孢噻吩；

青霉素類，例如阿莫西林、阿莫西林與克拉維酸、氨芐西林、巴氨西林、芐星青霉素、芐青霉素、羧芐西林、氯唑西林、甲氧西林、苯氧乙基青霉素、苯氧甲基青霉素、氟氯西林、美洛西林、哌拉西林、替卡西林和阿洛西林；

四環(huán)素類，例如米諾環(huán)素、金霉素、四環(huán)素、地美環(huán)素、多西環(huán)素、美他環(huán)素和土霉素及其它四環(huán)素類抗生素；

氨基糖苷類，例如阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星和妥布霉素；

抗真菌劑，例如阿莫羅芬、異康唑、克霉唑、益康唑、咪康唑、制霉菌素、特比萘芬、聯(lián)苯芐唑、兩性霉素、灰黃霉素、酮康唑、氟康唑和氟胞嘧啶、水楊酸、非扎硫酮、替克拉酮、托萘酯、三醋汀、巰氧吡啶和巰氧吡啶鈉；

喹諾酮類，例如萘啶酸、西諾沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星和諾氟沙星；

磺胺類，例如酞磺胺噻唑、磺胺多辛、磺胺嘧啶、磺胺甲噻二唑和磺胺甲基異噁唑；

砜類，例如氨苯砜；

其它各種抗生素，例如氯霉素、克林霉素、紅霉素、紅霉素碳酸乙酯、依托紅霉素、葡庚糖酸紅霉素、琥乙紅霉素、乳糖酸紅霉素、羅紅霉素、林可霉素、那他霉素、呋喃妥因、大觀霉素、萬古霉素、氨曲南、粘菌素iv、甲硝唑、替硝唑、夫西地酸、甲氧芐啶和2-硫吡啶n-氧化物、鹵素化合物且具體為碘和碘化合物例如碘-pvp絡(luò)合物和雙碘喹啉、六氯酚、氯己定、氯胺化合物和過氧化苯甲酰。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮以下參數(shù)且參考眾所周知的資料例如physicians’deskreference^tm:pdr--第52版(1998)--medicaleconomics1974后可容易地確定上述一種或多種藥理學(xué)活性劑的有效量，所述參數(shù)為例如所選擇的具體藥理學(xué)活性劑、患者的身形和體重、所預(yù)期的療效、所選擇的藥理學(xué)活性劑的藥代動(dòng)力學(xué)等。

以上出于說明和描述的目的而對本申請優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了描述而非意在是窮舉性的或?qū)⒈旧暾埾抻谒_的精確形式。許多調(diào)整和變化在以上教導(dǎo)的基礎(chǔ)上是可能的。

本申請參考或引用的所有專利、專利申請、臨時(shí)申請和公開文本通過引用的方式完整并入本申請至不與本說明書的明確教導(dǎo)相矛盾的程度，包括所有附圖和表格。

以下是對用于實(shí)施本申請的操作進(jìn)行說明的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被理解成是限制性的。

實(shí)施例1：用于制備膠原膜的方法

小心地分離來自豬內(nèi)部器官襯里的膠原片段并置于包含約70％乙醇的溶液中并在室溫短暫溫育。然后在工作表面上將含有膠原的組織在脂肪側(cè)朝上的情況下拉伸并盡可能多地除去脂肪組織和血管。

為了使所存在的脂肪組織可視化，含有膠原的組織用甘油涂敷約10分鐘。此時(shí)膠原為透明的，但脂肪組織為白色的。在解剖顯微鏡下使用鑷子將白色脂肪組織與膠原分離。

完成后，將含有膠原的組織小心地轉(zhuǎn)移至密封容器中并在包含約1％(v/v)sds和0.2％(v/v)licl的溶液中溫育以使非膠原蛋白變性。溫育在4℃留置過夜。

然后將含有膠原的組織在100％丙酮中小心地洗滌兩次以除去變性的非膠原蛋白。然后將組織在200ml容器中以100rpm離心以溫和地旋轉(zhuǎn)分離來自含有膠原的組織的殘留溶液、非膠原蛋白和核酸。

小心地取出含有膠原的組織并再次在膜steripure^tm水中洗滌3次。

有時(shí)還將含有膠原的組織在包含naoh:nacl的溶液中洗滌，然后將組織以100rpm離心90分鐘。

然后將含有膠原的組織浸入0.5％(v/v)hcl并在振蕩器上放置30分鐘以使膠原變性。發(fā)現(xiàn)hcl濃度和溫育時(shí)間是重要的以避免損傷所得組織的機(jī)械結(jié)構(gòu)。

然后取出含有膠原的組織并再次在steripure^tm水中洗滌3次。

然后含有膠原的組織使用0.5％(v/v)naoh來中和。在該階段可初步測試所得含有膠原的組織的機(jī)械性質(zhì)。

然后使用不銹鋼框架使用機(jī)械力(壓縮和延伸)對含有膠原的組織進(jìn)行處理。含有膠原的組織被拉伸至合適的大小和厚度后，使所述組織在原位即在框架中變性即浸入包含1％(v/v)hcl的溶液。通常，將組織在以100rpm進(jìn)行振蕩的情況下溫育22-25小時(shí)直到膠原纖維束對齊。

然后含有膠原的組織用水洗滌并用1％(v/v)sds和0.2％(v/v)licl的混合物淋洗。

取決于最終用途，含有膠原的組織然后用甘油重新涂敷10分鐘以使任何殘留的脂肪組織可視化。如上所述，在解剖顯微鏡下使用鑷子將剩余的白色脂肪組織與膠原分離。在該階段還除去任何多余的膠原束以控制含有膠原的組織的厚度。

最后含有膠原的組織用丙酮處理并風(fēng)干同時(shí)仍在框架中拉伸以使對齊的膠原束固定。然后將含有膠原的組織拉伸、壓縮和/或卷起以產(chǎn)生平滑表面。然后檢查成品膠原膜組織并使用激光切割機(jī)切割成一定尺寸。

進(jìn)行sem以表征膠原膜與其它類型的膜相比的表面形態(tài)。簡言之，用厚度為5nm的鉑對組織樣品進(jìn)行濺射鍍膜(sem涂敷單元,e1020,hitachisciencesystemsltd.,japan)并在掃描電子顯微鏡(s260,leica,cambridge,england)下以低電壓(20kv)觀察兩側(cè)。

圖1顯示了通過本申請方法產(chǎn)生的膠原膜(本申請將tympacol^tm稱為acs)與其它膜相比的表面形態(tài)。掃描電子顯微鏡顯示了三個(gè)支架的表面形態(tài)(組a-c；×500,d；×200)。tympacol^tm(在圖1中稱為acs)具有兩種不同的表面即特征為壓實(shí)膠原束的平滑表面(組a)和松散膠原纖維的粗糙多孔表面(組b)。紙貼(膜)表面是不平整的且具有少量小孔(組c)。顯示出大量具有不同尺寸的孔(組d)。比例尺：500μm。

圖2顯示了通過上述方法產(chǎn)生的膠原膜的掃描電子顯微鏡(sem)圖像(×100)。

實(shí)施例2：肌腱修復(fù)

使用50只12至20周齡的體重為3-5kg的白化新西蘭白兔(oryctolaguscuniculus)。所有兔子繁殖自保持在universityofwesternaustralia(nedlands,australia)的動(dòng)物房中的遠(yuǎn)系繁殖兔子群。兔子隨意進(jìn)食兔子/豚鼠粒料、干草且隨意飲水。兔子待在寬為1.5m、長為0.75m且高為0.75m及具有格柵地板以預(yù)防足皮炎的籠中。所有手術(shù)操作及籠活動(dòng)均在nationalhealthandmedicalresearchcouncil(nhmrc,canberra,australia)所詳細(xì)說明的嚴(yán)格指導(dǎo)下進(jìn)行。

將50只兔子隨機(jī)分配到兩個(gè)25只組中且通過肌內(nèi)注射氯胺酮(parke-davis,auckland,nz)和賽拉嗪(troylaboratoriesaustralia)來麻醉。在左肩上進(jìn)行縱切且肩袖肌腱的手術(shù)暴露通過由肩峰釋放部分斜方肌和三角肌來完成。切斷肩袖肌腱，由此產(chǎn)生軟組織缺損。然后缺損通過(a)對肌腱切斷端進(jìn)行簡單縫合或(b)本申請所述方法來修復(fù)。簡言之，將0.1％(w/v)玫瑰紅(aldrich,milwaukee,wi)在磷酸鹽緩沖鹽水中的溶液小心地施用于約5mm的切斷肌腱外表面。如圖3所示，將通過實(shí)施例1的方法制備的厚度為50μm的含有膠原的貼劑包裹圍繞肌腱兩端以使肌腱兩端鄰接(接觸)且將缺損包圍。然后將貼劑暴露于來自350mwcompass415連續(xù)波長倍頻nd/yag激光器(coherent,inc.,santaclara,ca,光斑大小為～1cm)的波長為532nm的照射度為～0.5w/cm²的綠光5分鐘。選擇該系統(tǒng)是因?yàn)榧ぐl(fā)波長被玫瑰紅強(qiáng)烈吸收。其它激光參數(shù)可通過離體先導(dǎo)研究確定。肌腱再造后，將傷口封閉在層中并包扎，但肢沒有用夾板固定。

在4周和8周時(shí)將兔子麻醉并通過靜脈內(nèi)注射戊巴比妥來處死。由兩肩(手術(shù)處理或非手術(shù)處理)收集肱骨頭、肩袖肌腱和部分肌肉。在松弛狀態(tài)下用游標(biāo)卡尺測量手術(shù)處理和非手術(shù)處理的肌腱的長度和寬度且用千分尺測量厚度。然后將樣品在4％多聚甲醛中固定。固定后，樣品用10％甲酸脫鈣，脫水，用石蠟包埋，切成5μm切片并用蘇木精、曙紅和阿辛藍(lán)染色。