用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的DNA疫苗組合物，以及使用其激活針對VZV抗原的T細(xì)胞的方法與流程

文檔序號：11440721閱讀：823來源：國知局

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用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的DNA疫苗組合物，以及使用其激活針對VZV抗原的T細(xì)胞的方法與流程

本發(fā)明涉及一種疫苗接種領(lǐng)域的技術(shù)，更特別地，涉及一種用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的疫苗，該疫苗具有優(yōu)異的生產(chǎn)率、穩(wěn)定性和對t細(xì)胞的免疫反應(yīng)性并且適用于多種疾病狀況。

背景技術(shù)：

通常，帶狀皰疹(herpeszoster)是一種皮疹疾病，它發(fā)展為水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zostervirus,vzv)并潛伏在神經(jīng)元神經(jīng)節(jié)(neuronalganglion)中，直到免疫系統(tǒng)變?nèi)酰缓笳T導(dǎo)vzv再活化。當(dāng)帶狀皰疹發(fā)展時，形成大皰性病變，即使帶狀皰疹修復(fù)時，患者仍有帶狀皰疹后神經(jīng)痛的后遺癥。在這種情況下，一旦帶狀皰疹后神經(jīng)痛發(fā)展，就難以完全治愈帶狀皰疹后神經(jīng)痛，因此，患者經(jīng)歷極度的疼痛。vzv的再活化和帶狀皰疹的發(fā)作與t細(xì)胞中細(xì)胞免疫應(yīng)答的減弱有關(guān)。特別地，帶狀皰疹是在老年人或接受免疫抑制治療的人群中經(jīng)常發(fā)生的疾病。

當(dāng)患者的帶狀皰疹發(fā)展時，患者將接受抗病毒藥物的治療。然而，這種治療的目的主要是通過在患者開始出現(xiàn)皮疹后72小時內(nèi)給藥抗病毒藥物來防止皮疹擴散至其它部位，并且降低或減輕帶狀皰疹發(fā)作后的并發(fā)癥。隨著老年人和免疫抑制患者的增加，韓國帶狀皰疹的發(fā)病率迅速提高，但是沒有治療帶狀皰疹的根本性藥物。因此，帶狀皰疹被認(rèn)為是強調(diào)預(yù)防性疫苗的重要性的疾病。

目前市場上的針對帶狀皰疹的預(yù)防性疫苗具有臨床試驗中認(rèn)可的藥用效果，但是，響應(yīng)于預(yù)防性疫苗的給藥，帶狀皰疹的發(fā)作下降率達(dá)到50％。因此，需要開發(fā)一種具有優(yōu)異的藥用效果的針對帶狀皰疹的新型疫苗。此外，由于目前市場上的針對帶狀皰疹的預(yù)防性疫苗是減毒疫苗，因此，這些預(yù)防性疫苗處于矛盾的狀況中，即，不能用于帶狀皰疹發(fā)病率較高的免疫抑制患者。因此，迫切需要開發(fā)一種能夠安全地給藥于免疫抑制患者的針對帶狀皰疹的新型疫苗。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

因此，本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的dna疫苗組合物，該dna疫苗組合物能夠應(yīng)用于患有各種類型的疾病的患者，并且具有顯著改善的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的另一目的是提供一種通過有效地將所述用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的dna疫苗組合物給藥于體內(nèi)來激活對抗vzv抗原的t細(xì)胞的方法。

技術(shù)方案

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的質(zhì)粒dna，該質(zhì)粒dna含有由水痘-帶狀皰疹病毒(vzv)衍生的編碼vzv蛋白的基因的插入位點，其中，所述質(zhì)粒dna通過電穿孔法直接給藥于體內(nèi)，以誘導(dǎo)對抗vzv抗原的t細(xì)胞的免疫活性。

使用電穿孔系統(tǒng)(可以從inoviopharmaceuticalsinc.購得的cellectra)作為用于電穿孔的電穿孔系統(tǒng)。

所述基因可以包括選自編碼ie-62蛋白(seqidno:1)的第一基因、編碼ie-63蛋白(seqidno:2)的第二基因和編碼ge蛋白(seqidno:3)的第三基因中的一種。

具體地，所述質(zhì)?？梢园ㄟx自seqidno:4中所示的質(zhì)粒dna、seqidno:5中所示的質(zhì)粒dna和seqidno:6中所示的質(zhì)粒dna中的一種。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的dna疫苗組合物，包含：至少一種含有由水痘-帶狀皰疹病毒(vzv)衍生的編碼vzv蛋白的基因的插入位點的質(zhì)粒；以及其它藥學(xué)上可接受的成分。所述其它成分可以，例如，包括水(如生理鹽水等)。

所述dna疫苗組合物可以包含多種含有不同的異源基因的插入位點的質(zhì)粒作為構(gòu)成dna疫苗的質(zhì)粒。例如，可以使用含有不同的編碼vzv蛋白的遺傳基因座的多種質(zhì)粒作為所述質(zhì)粒。

可以使用三種質(zhì)粒，如含有編碼ie-62蛋白(seqidno:1)的第一基因的插入位點的第一質(zhì)粒、含有編碼ie-63蛋白(seqidno:2)的第二基因的插入位點的第二質(zhì)粒以及含有編碼ge蛋白(seqidno:3)的第三基因的插入位點的第三質(zhì)粒，作為在所述dna疫苗組合物中包含的質(zhì)粒?？紤]到疾病的類型、質(zhì)粒給藥對象的年齡等，可以對組合物中各種質(zhì)粒的含量進(jìn)行各種調(diào)整。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種激活對抗水痘-帶狀皰疹病毒(vzv)抗原的t細(xì)胞的方法，該方法包括：制備含有由vzv衍生的編碼vzv蛋白的基因的質(zhì)粒；以及使用電穿孔法將所述質(zhì)粒給藥至體內(nèi)。在這種情況下，可以使用大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)大規(guī)模地生產(chǎn)所述質(zhì)粒。

有益效果

由于所述dna疫苗是通過質(zhì)粒的直接給藥而遞送的疫苗，因此，根據(jù)本發(fā)明的用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的dna疫苗不引起由減毒活疫苗引起的安全問題。此外，所述質(zhì)粒可以容易地大規(guī)模生產(chǎn)，并且可以顯著改善所述疫苗在配送過程中的穩(wěn)定性。由于使用電穿孔法將所述dna疫苗給藥于體內(nèi)，與常規(guī)的可注射藥物相比，所述dna疫苗可以表現(xiàn)出顯著的體內(nèi)遞送效率。同時，所述用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的dna疫苗可以用于治療目的和預(yù)防目的，并且可以適用于患有各種疾病的患者和不同年齡的患者。所述用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的dna疫苗具有的優(yōu)點在于可以通過含有不同的質(zhì)?；虻牟迦胛稽c的多種質(zhì)粒的不同組合來設(shè)計個性化疫苗。

附圖說明

圖1是示出根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的疫苗接種方案的圖；

圖2示出了表明根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的實驗組的免疫原性的結(jié)果的圖；

圖3和圖4是示出比較在各個實驗組中蛋白質(zhì)的重疊肽的免疫應(yīng)答的結(jié)果的圖；

圖5至圖7是由各個質(zhì)?；虮磉_(dá)的產(chǎn)物的電泳圖像。

具體實施方式

下文中，將詳細(xì)描述用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的dna疫苗。

根據(jù)本發(fā)明的用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的dna疫苗不是病毒類活疫苗，而是將dna自身給藥于體內(nèi)的dna類疫苗。結(jié)果，以質(zhì)粒形式的dna自身作為疫苗，將其給藥于體內(nèi)以誘導(dǎo)對抗vzv抗原的t細(xì)胞的免疫活性。

dna疫苗編碼由vzv衍生的抗原蛋白，最終起到在體內(nèi)形成抗原蛋白的作用。由vzv衍生的蛋白質(zhì)優(yōu)選鑒于所需要的dna疫苗的特性來選擇。在這種情況下，蛋白質(zhì)可以單獨選擇或者以多種類型組合選擇。

根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案，所述蛋白質(zhì)可以包括蛋白ie-62(seqidno:1)和蛋白ie-63(seqidno:2)以及糖蛋白ge(seqidno:3)，它們均可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，設(shè)計質(zhì)粒使得編碼這種蛋白的基因可以被插入質(zhì)粒中。

給藥質(zhì)粒dna使得質(zhì)粒dna與體內(nèi)的液體混合。為此，本發(fā)明的質(zhì)粒dna可以設(shè)計成使用電穿孔法以較高的效率引入到體內(nèi)。只有當(dāng)使用這種電穿孔法時，體內(nèi)遞送效率可以最大化，從而使治療功效最大化。使用電穿孔法給藥質(zhì)粒dna的身體部位包括肌肉部位等，但是本發(fā)明不特別局限于此。例如，身體部位可以考慮各種因素，如質(zhì)粒dna給藥對象的年齡、疾病的類型、并發(fā)癥等來確定?？梢允褂秒姶┛紫到y(tǒng)(可以從inoviopharmaceuticalsinc.購得的cellectra)作為用于進(jìn)行電穿孔法的電穿孔設(shè)備。

使用常規(guī)的方法將所述基因，例如，分別編碼和表達(dá)ie-62、ie-63和ge蛋白的第一基因、第二基因和第三基因包含在質(zhì)粒中。然而，為了使藥效和給藥效率最大化，可以在本實施例中設(shè)計分別列于seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6中的質(zhì)粒，以使dna疫苗的效率最大化。各個質(zhì)粒可以單獨使用，但是優(yōu)選以兩種以上不同質(zhì)粒的組合包含在dna疫苗中。例如，在本發(fā)明的一個示例性實施方案中，可以考慮含有全部三種質(zhì)粒的dna疫苗。同時，也可以新引入在本實施例中未指定的不同類型的質(zhì)粒。

質(zhì)粒可以通過可注射藥物等給藥至體內(nèi)。在這種情況下，應(yīng)當(dāng)以較高的濃度和較高的純度制備質(zhì)粒以改善遞送效率和免疫應(yīng)答效率。此外，在商業(yè)方面，應(yīng)當(dāng)確保大規(guī)模生產(chǎn)的容易性。根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的質(zhì)粒具有以這種較高的濃度和較高的純度大規(guī)模生產(chǎn)的基礎(chǔ)。

根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的dna疫苗是用于液體的疫苗，即，如上所述的包含至少一種質(zhì)粒dna的可注射藥物。因此，所述dna疫苗包含質(zhì)粒dna和液體成分。此處，液體成分可以是純水。除了水之外，根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的dna疫苗組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的功能性添加劑。在這種情況下，可以以現(xiàn)有技術(shù)中已知的水平引入這種添加劑。

所述dna疫苗組合物可以，例如，如上所述，包含全部三種質(zhì)粒。

下文中，將基于實驗的具體內(nèi)容來描述根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的質(zhì)粒dna的功效。

[實驗1]免疫原性的評價

篩選可用于dna疫苗的vzv基因候選物

從vzv基因組的67個編碼蛋白質(zhì)的基因中篩選可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的蛋白ie-62和蛋白ie-63以及糖蛋白ge的基因。將vzv基因組的類型總共分為5個進(jìn)化枝，進(jìn)化枝之間的ie-62、ie-63和ge的氨基酸序列沒有顯著差異。使用上述ie-62、ie-63和ge基因的序列構(gòu)建質(zhì)粒。蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seqidno:1至3中所示，構(gòu)建的質(zhì)粒的dna序列如seqidno:4至6中所示。在該實施例中，dna疫苗包含質(zhì)粒和液體成分(即，水)，而不包含其它成分。

小鼠實驗

準(zhǔn)備ie-62、ie-63和ge基因作為用于dna疫苗的候選物質(zhì)，并給藥于c57bl/6小鼠。之后，從小鼠中取出脾細(xì)胞來評價對抗vzv抗原的t細(xì)胞的免疫原性。本實驗共使用5組，每組由5只小鼠組成，如下。

1)neg：接種菌體的小鼠的組(n＝5)

2)ie62：接種ie-62dna疫苗的小鼠的組(n＝5)

3)ie63：接種ie-63dna疫苗的小鼠的組(n＝5)

4)ge：接種gedna疫苗的小鼠的組(n＝5)

5)ie62+ie63+ge：接種ie-62、ie-63和gedna疫苗的混合物的小鼠的組

使用電穿孔系統(tǒng)(可以從inoviopharmaceuticalsinc.購得的cellectra)以2周的間隔進(jìn)行三次疫苗接種。在這種情況下，每次疫苗接種的dna的量為30μg/鼠，對于混合組，每種dna接種30μg(總量為90μg)。疫苗接種12天之后，取出脾細(xì)胞來進(jìn)行免疫測定。疫苗接種方案如圖1中所示。圖1是示出根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的疫苗接種方案的圖。

用于實驗的抗原的制備

為了系統(tǒng)地測量對由候選基因編碼的蛋白質(zhì)的整個免疫應(yīng)答，設(shè)計并制備一系列的重疊肽(olp)。將各個重疊肽設(shè)計為由15個氨基酸組成，其中10個氨基酸與它的相鄰的肽重疊。此外，將重疊肽設(shè)計為含有ie-62、ie-63和ge蛋白的全長氨基酸序列。結(jié)果，制備261個ie-62重疊肽、54個ie-63重疊肽和124個ge重疊肽。將37或38個連續(xù)的ie-62重疊肽混合以制備總共7種肽混合物，然后使用。將27個連續(xù)的ie-63重疊肽混合以制備總共2種肽混合物，然后使用。將40或41個連續(xù)的ie-63重疊肽混合以制備總共3種肽混合物，然后使用。使用5％的dmso作為陰性對照，使用豆蔻酸佛波醇乙酸酯(phorbolmyristateacetate)(pma)和離子霉素的混合物作為陽性對照。通過混合重疊肽而制備的肽混合物列于下面的表1中。

[表1]

使用在mrc-5細(xì)胞感染vzv之后制備的溶解產(chǎn)物(lysate)作為抗原，使用mrc-5細(xì)胞溶解產(chǎn)物作為對應(yīng)于溶解產(chǎn)物的陰性抗原。

ifn-γelispot測定方案

以1×10⁶個細(xì)胞/孔播種脾細(xì)胞，來進(jìn)行elispot測定。當(dāng)用重疊肽的混合物刺激脾細(xì)胞時，給予重疊肽，使得各個重疊肽的濃度達(dá)到每孔為1μg/ml，并且，當(dāng)用溶解產(chǎn)物抗原刺激脾細(xì)胞時，給予溶解產(chǎn)物抗原，使得溶解產(chǎn)物抗原的濃度達(dá)到每孔為50μg/ml。在這種情況下，重復(fù)該實驗三次。如下計算通過用重疊肽抗原刺激而得到的測定結(jié)果：(olp池-特定斑點形成細(xì)胞(sfc)的平均值)-(5％的dmso-特定sfc的平均值)。如下計算通過用溶解產(chǎn)物抗原刺激而得到的測定結(jié)果：(vzv-特定sfc的平均值)-(mrc-5-特定sfc的平均值)。每個孔的sfc的最大值計算為500。

免疫原性的實驗結(jié)果

對各個疫苗的抗原評價的結(jié)果表明，在用作陰性對照的neg處理組中，重疊肽的刺激沒有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答?？梢燥@示出，在ie-62、ie-63和gedna疫苗分別單獨給藥的ie-62、ie-63和ge處理組中，相對于相應(yīng)的蛋白質(zhì)的重疊肽，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答?？梢燥@示出，在ie-62、ie-63和gedna疫苗全部給藥的ie62+ie63+ge處理組中，相對于這三種蛋白質(zhì)的重疊肽，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。當(dāng)給藥候選物質(zhì)的dna疫苗時，相對于候選物質(zhì)的特異性重疊肽，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。圖2示出了表明根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的實驗組的免疫原性的結(jié)果的圖。

圖3和圖4是示出比較各個實驗組中蛋白質(zhì)的重疊肽的免疫應(yīng)答的結(jié)果的圖。參照圖3，比較在給藥單一dna疫苗的組和給藥三種dna疫苗的混合物的組中的相應(yīng)蛋白質(zhì)的重疊肽的免疫應(yīng)答。結(jié)果，可以顯示出，與給藥單一dna疫苗時相比，給藥三種dna疫苗的混合物時，對ie-62的免疫應(yīng)答降低43.3％，對ie-63的免疫應(yīng)答沒有差異，對ge的免疫應(yīng)答下降9.6％。

抗原選擇的有效性

參照圖4，在各個實驗組中用溶解產(chǎn)物抗原刺激脾細(xì)胞。結(jié)果可以證實，在neg處理組中沒有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，但是在給藥候選物質(zhì)的dna疫苗的組中誘導(dǎo)強烈的免疫應(yīng)答。從這些結(jié)果可以看出，在感染vzv的細(xì)胞中表達(dá)諸如ie-62、ie-63、ge等的蛋白質(zhì)，并且在本實驗中，當(dāng)誘導(dǎo)選擇作為候選物質(zhì)的ie-62、ie-63和ge的免疫應(yīng)答時，在感染vzv的細(xì)胞中發(fā)生免疫應(yīng)答。

實驗評價

在實驗動物模型中，評價并分析使用編碼ie-62、ie-63和ge蛋白的基因制備的dna疫苗。結(jié)果顯示，當(dāng)單獨或組合給藥dna疫苗時，t細(xì)胞表現(xiàn)出足夠的免疫原性。通過vzv溶解產(chǎn)物抗原的刺激來分析t細(xì)胞的免疫原性。結(jié)果認(rèn)為，選擇ie-62、ie-63和ge作為疫苗的候選物質(zhì)是合理的。

[實驗2]體外蛋白質(zhì)表達(dá)的評價

表達(dá)的確認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)

-轉(zhuǎn)染(transfection)：rd細(xì)胞(1×10⁶個細(xì)胞/t75燒瓶)，30μg的pdna，lipofectamine2000，轉(zhuǎn)染24小時后進(jìn)行細(xì)胞收集

*rd細(xì)胞：人橫紋肌肉瘤

-細(xì)胞溶解：2×10⁶個細(xì)胞/90μl的ripa緩沖液與蛋白酶抑制劑混合物

-sdspage：lds樣品緩沖液與還原劑(dtt)，30μl的負(fù)載(19.5μl的溶解產(chǎn)物)，4至12％的bis-tris凝膠，在165v下運行mes緩沖液35分鐘

-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移：nc膜，在20v下干印跡(dryblotting)1分鐘→在23v下干印跡4分鐘→在25v下干印跡2分鐘

-蛋白質(zhì)檢測：1)阻斷1小時，2)抗體反應(yīng)(1:100)一個半小時(ha-探針hrp(santacruz，目錄號：sc-805hrp)，羊抗-vzvie62(santacruz，目錄號：sc-17525)，驢抗羊igghrp(santacruz，目錄號：sc-2020))，3)以及hrp顯色底物(invitrogen，目錄號：wp20004))

表達(dá)的確認(rèn)的評價

圖5至圖7是由各個質(zhì)?；虮磉_(dá)的產(chǎn)物的電泳圖像。

參照圖5，使用lipofectamine2000將編碼ie-62基因的質(zhì)粒引入到衍生自人橫紋肌肉瘤的rd細(xì)胞中。24小時之后，將細(xì)胞溶解以提取蛋白質(zhì)，然后使用用于檢測表達(dá)的抗原的抗體，使蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。使用抗vzvie62(santacruz，目錄號：sc-2020)檢測編碼ie-62基因的質(zhì)粒的表達(dá)的蛋白質(zhì)，并使用hrp顯色底物(invitrogen，目錄號：wp20004)顯現(xiàn)。結(jié)果顯示，由編碼ie-62基因的質(zhì)粒表達(dá)的插入基因的產(chǎn)物尺寸與插入基因的預(yù)測分子量相同，表明引入到rd細(xì)胞中的基因的產(chǎn)物為vzv的ie-62抗原蛋白。

參照圖6，使用lipofectamine2000將編碼ie-63基因的質(zhì)粒引入到衍生自人橫紋肌肉瘤的rd細(xì)胞中。24小時之后，將細(xì)胞溶解以提取蛋白質(zhì)，然后使用用于檢測表達(dá)的抗原的抗體，使蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。使用ha-探針hrp(santacruz，目錄號：sc-805hrp)檢測編碼ie-63基因的質(zhì)粒的表達(dá)的蛋白質(zhì)，并使用hrp顯色底物(invitrogen，目錄號：wp20004)顯現(xiàn)。結(jié)果顯示，由編碼ie-63基因的質(zhì)粒表達(dá)的插入基因的產(chǎn)物尺寸與插入基因的預(yù)測分子量相同，表明引入到rd細(xì)胞中的基因的產(chǎn)物為vzv的ie-63抗原蛋白。

參照圖7，使用lipofectamine2000將編碼ge基因的質(zhì)粒引入到衍生自人橫紋肌肉瘤的rd細(xì)胞中。24小時之后，將細(xì)胞溶解以提取蛋白質(zhì)，然后使用用于檢測表達(dá)的抗原的抗體，使蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。使用ha-探針hrp(santacruz，目錄號：sc-805hrp)檢測編碼ge基因的質(zhì)粒的表達(dá)的蛋白質(zhì)，并使用hrp顯色底物(invitrogen，目錄號：wp20004)顯現(xiàn)。結(jié)果顯示，由編碼ge基因的質(zhì)粒表達(dá)的插入基因的產(chǎn)物尺寸與插入基因的預(yù)測分子量相同，表明引入到rd細(xì)胞中的基因的產(chǎn)物為vzv的ge抗原蛋白。

<110>錦玟生命科學(xué)

<120>用于預(yù)防和治療帶狀皰疹的dna疫苗組合物，以及使用其激活針對vzv抗原的t細(xì)胞的方法

<130>kp14-001

<160>6

<170>kopatentin2.0

<210>1

<211>1328

<212>prt

<213>水痘-帶狀皰疹病毒

<400>1

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151015

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