本文提供了用于通過向?qū)ο蟮哪X部施用組合物，而改善所述對(duì)象中的記憶或認(rèn)知功能的方法，其中所述組合物包含：i)化合物，其增加malat-1長非編碼rna的表達(dá)，ii)malat-1長編碼rna核酸序列，或iii)至少一種源自malat-1的pirna核酸序列。本文還提供了針對(duì)其調(diào)節(jié)malat-1長非編碼rna在腦細(xì)胞中的表達(dá)的能力而篩選候選化合物的方法。在某些實(shí)施方案中，還將如此鑒別出的增加表達(dá)的調(diào)節(jié)因子施用到實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的腦部以測定此類調(diào)節(jié)因子對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的影響。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)功能和病理學(xué)以及所導(dǎo)致的性質(zhì)和表型(例如，行為、記憶、疾病等)是動(dòng)物(例如，人類)生物學(xué)、健康和幸福的至關(guān)重要的方面。然而，對(duì)其基礎(chǔ)的分子和細(xì)胞生物學(xué)知之甚少。有鑒于此，缺乏用于在分子水平并以特定方式改變這些性質(zhì)和表型的藥物或研究工具。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本文提供了用于通過向?qū)ο蟮哪X部施用組合物，而改善所述對(duì)象中的記憶或認(rèn)知功能的方法，其中所述組合物包含：i)化合物，其增加malat-1長非編碼rna的表達(dá)，ii)malat-1長編碼rna核酸序列，或iii)至少一種源自malat-1的pirna核酸序列(例如，seqidno:5-22或與seqidno:5-22具有90-99%序列同一性的序列中的一種或多種)。本文還提供了針對(duì)其調(diào)節(jié)malat-1長非編碼rna在腦細(xì)胞中的表達(dá)的能力而篩選候選化合物的方法。在某些實(shí)施方案中，還將如此鑒別出的增加表達(dá)的調(diào)節(jié)因子施用到實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的腦部以測定此類調(diào)節(jié)因子對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的影響。在一些實(shí)施方案中，本文提供了用于改善對(duì)象中的記憶或認(rèn)知功能的方法，包括：向所述對(duì)象(例如，人類對(duì)象)施用治療有效劑量的組合物，所述組合物增加轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1(malat-1)長非編碼rna在所述對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中的表達(dá)，其中所述施用顱內(nèi)進(jìn)行或其中所述施用在直接向所述對(duì)象腦部供血的血管中進(jìn)行；其中所述組合物包含以下中的至少一種：i)化合物(例如，通過本文所述的篩選方法鑒別的)，其增加malat-1長非編碼rna在細(xì)胞中的表達(dá)，ii)第一核酸序列，其包含malat-1長編碼rna，或第一表達(dá)載體，其編碼所述第一核酸序列；或iii)第二核酸序列，其編碼至少一種源自malat-1的pirna序列(例如，seqidno:5-22中的一種或多種)，或第二表達(dá)載體，其編碼所述第二核酸序列；并且其中所述記憶或認(rèn)知功能的至少一項(xiàng)屬性得到改善。在某些實(shí)施方案中，所述對(duì)象患有其中以陳述性記憶減退為癥狀的疾病。在其它實(shí)施方案中，所述分子是kcl或dna甲基轉(zhuǎn)移酶(dnmt)抑制劑。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述dnmt抑制劑包括rg108。在另外的實(shí)施方案中，所述第一和/或第二表達(dá)載體包括：腺相關(guān)病毒(aav)、腺病毒、單純皰疹病毒、慢病毒或dna質(zhì)粒。在另外的實(shí)施方案中，所述組合物經(jīng)由顱內(nèi)接入裝置通過顱內(nèi)遞送而向所述對(duì)象施用。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括步驟：在所述對(duì)象的腦部之外植入泵，其中所述泵與所述顱內(nèi)接入裝置的近端相連。在具體的實(shí)施方案中，所述顱內(nèi)接入裝置包括顱內(nèi)導(dǎo)管。在其它實(shí)施方案中，所述第一和/或第二核酸分子包含化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾改善以下中的一項(xiàng)或多項(xiàng)或全部：核酸酶穩(wěn)定性、觸發(fā)先天免疫應(yīng)答的可能性降低、降低脫靶效應(yīng)的發(fā)生率、以及相對(duì)于非修飾核酸的改善的藥效學(xué)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述至少一種化學(xué)修飾選自：硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、4'-硫代-核糖、鎖核酸、2'-o-(2'-甲氧基乙基)、2'-o-甲基、2'-氟代、2'-脫氧-2'-氟代-b-d-阿拉伯糖核酸、嗎啉代核酸類似物和肽核酸類似物。在一些實(shí)施方案中，所述第一和/或第二核酸序列連接至納米顆?；蛭挥谄鋬?nèi)部，所述納米顆粒經(jīng)配置以用于穿過血腦屏障。在某些實(shí)施方案中，所述納米顆粒包括脂質(zhì)體。在另外的實(shí)施方案中，所述組合物被遞送至邁納特(meynert)基底核、大腦皮層或海馬體。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象患有阿爾茨海默病和/或年齡相關(guān)的記憶減退。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述對(duì)象患有記憶障礙。在另外的實(shí)施方案中，所述記憶障礙選自：毒物暴露、腦損傷、年齡相關(guān)的記憶障礙、輕度認(rèn)知障礙、癲癇、精神發(fā)育遲緩和由于疾病導(dǎo)致的癡呆。在其它實(shí)施方案中，所述導(dǎo)致癡呆的疾病選自：帕金森病、阿爾茨海默病、aids、頭部創(chuàng)傷、亨廷頓病、匹克氏病、克雅氏病、心臟手術(shù)后(疾病)、唐氏綜合征、前交通動(dòng)脈綜合征和腦卒中癥狀。在具體的實(shí)施方案中，所述對(duì)象具有期望增強(qiáng)的正常的記憶功能。在一些實(shí)施方案中，所述施用在直接向所述對(duì)象腦部供血的血管中進(jìn)行。本公開提供了用于篩選和鑒別化合物的方法，所述化合物調(diào)節(jié)malat-1長非編碼rna在腦細(xì)胞中的表達(dá)，所述方法包括：a)使腦細(xì)胞與候選試劑接觸，并且b)檢測所述malat-1長非編碼rna(例如，seqidno:1的全部或一部分)和/或源自malat-1的pirna(例如，seqidno:5-22中的一種或多種)的表達(dá)水平，其中所述表達(dá)水平的提高或降低表明所述候選試劑是malat-1長非編碼rna在腦細(xì)胞中的調(diào)節(jié)因子。在某些實(shí)施方案中，所述鑒別出的調(diào)節(jié)因子提高malat-1rna的表達(dá)水平，并且所述方法還包括：將所述鑒別出的malat-1長非編碼rna的調(diào)節(jié)因子施用至實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的腦部，并且測定所述調(diào)節(jié)因子對(duì)所述實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的記憶或?qū)W習(xí)的影響。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)因子被鑒別為提高所述動(dòng)物的記憶和/或?qū)W習(xí)。在具體的實(shí)施方案中，所述腦細(xì)胞是神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了用于治療對(duì)象中酒精成癮(alcoholism)的方法，包括：向所述對(duì)象施用治療有效劑量的組合物，所述組合物包含malat-1反義物(例如，seqidno:2-4，或與seqidno:2-4具有90-99%同一性的序列)，其中所述施用顱內(nèi)進(jìn)行或其中所述施用在直接向該對(duì)象腦部供血的血管中進(jìn)行；并且其中所述對(duì)象中的酒精成癮的至少一項(xiàng)屬性得到改善。附圖說明圖1顯示了實(shí)施例1中所用的威脅識(shí)別行為測定的示意圖。圖2顯示了經(jīng)受條件化恐懼訓(xùn)練(fearconditioningtraining)的小鼠，當(dāng)被重新引入到訓(xùn)練環(huán)境中時(shí)，表現(xiàn)出增加的靜止不動(dòng)(freezing)。圖3顯示了小鼠訓(xùn)練(環(huán)境+電擊)后，malat1在2小時(shí)的表達(dá)相比對(duì)照(僅環(huán)境本身或未接受過實(shí)驗(yàn))有顯著提高，與基于行為的學(xué)習(xí)中的作用相一致。圖4顯示了輸注malat1反義寡核苷酸(aso)導(dǎo)致在訓(xùn)練后24小時(shí)，條件化恐懼模型中的靜止不動(dòng)減少，這表明小鼠在沒有malat1的情況下沒有那樣有效地鞏固記憶。圖5顯示了即刻早期基因(ieg)的基因表達(dá)在用malat1aso處理的小鼠與對(duì)照小鼠之間不存在顯著改變。在此圖中，m=經(jīng)malat1aso處理的，而p=pbs對(duì)照。圖6顯示了在經(jīng)malat1aso處理的小鼠中，小rna的豐度有顯著增加。圖7顯示了相比對(duì)照，經(jīng)malat1aso處理的小鼠中的dna甲基化增加。定義如本文所用，術(shù)語“宿主”、“對(duì)象”和“患者”是指任何動(dòng)物，包括但不限于所研究、分析、測試、診斷或治療的人和非人動(dòng)物(例如，狗、貓、牛、馬、綿羊、禽類、魚、甲殼動(dòng)物等)。除非另外指明，如本文所用，術(shù)語“宿主”、“對(duì)象”和“患者”可互換使用。如本文所用，術(shù)語“有效量”是指足以實(shí)現(xiàn)有益或期望結(jié)果的組合物(例如，合成的源自malat-1的pirna)的量。有效量可以在一次或多次施用、應(yīng)用或劑量中施用，并且并非旨在被限制于特定的制劑或施用途徑。如本文所用，術(shù)語“施用(administration)”和“施用(administering)”是指將藥品、前藥或其它試劑，或治療性治療(例如，本發(fā)明的組合物)給予對(duì)象(例如，對(duì)象或體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織和器官)的行為。對(duì)人體的示例性施用途徑可以是：經(jīng)由腦或脊髓的蛛網(wǎng)膜下方的空間(鞘內(nèi))、眼睛(眼部)、嘴(口腔)、皮膚(局部或透皮)、鼻(鼻腔)、肺(吸入)、口腔粘膜(頰面)、耳、直腸、陰道，通過注射(例如，靜脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)、腹腔內(nèi)等)等。如本文所用，術(shù)語“共施用(co-administration)”和“共施用(co-administering)”是指向?qū)ο笫┯弥辽賰煞N試劑(例如，多種合成的源自malat-1的pirna，或pirna或抗pirna分子以及另一種治療劑)或療法。在一些實(shí)施方案中，兩種或更多種試劑或療法的共施用是同時(shí)發(fā)生的。在其它實(shí)施方案中，第一試劑/療法先于第二試劑/療法施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，所用的各種試劑或療法的制劑和/或施用途徑可有所差別。適用于共施用的劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)試劑或療法被共施用時(shí)，試劑或療法各自以低于適于其單獨(dú)施用的劑量施用。因此，共施用在如下的實(shí)施方案中是特別期望的，其中試劑或療法的共施用降低潛在有害(例如，有毒的)試劑的必需劑量，和/或，當(dāng)共施用兩種或更多種試劑導(dǎo)致對(duì)象對(duì)經(jīng)由與其它試劑共施用的試劑之一的有益效果敏感化時(shí)。如本文所用，術(shù)語“治療”或語法上的等同形式涵蓋對(duì)疾病(例如，神經(jīng)退行性疾病)或病況的癥狀的改善和/或逆轉(zhuǎn)。當(dāng)用于本發(fā)明的篩選方法中時(shí)，造成與疾病相關(guān)的任何參數(shù)的改善的化合物，可由此被鑒別為治療性化合物。術(shù)語“治療”是指治療性治療和預(yù)防性或防預(yù)性措施二者。例如，可受益于使用本發(fā)明的組合物和方法的治療的那些人包括已經(jīng)患有疾病和/或障礙(例如，神經(jīng)退行性疾病)的那些，以及其中要預(yù)防(例如，使用預(yù)防性治療)疾病和/或障礙的那些。術(shù)語“化合物”是指可以用于治療或預(yù)防疾病、病癥、病或身體功能障礙的任何化學(xué)物質(zhì)、藥物、藥品等?；衔锇ㄒ阎蜐撛诘闹委熜曰衔锒摺？梢酝ㄟ^使用篩選方法篩選來確定化合物是治療性的?！耙阎闹委熜曰衔铩笔侵敢呀?jīng)顯示(例如，通過動(dòng)物試驗(yàn)或?qū)θ梭w施用的先前經(jīng)驗(yàn))在此類治療中有效的治療性化合物。換言之，已知的治療性化合物不限于在疾病(例如，神經(jīng)退行性疾病)治療中有效的化合物。如本文所用，術(shù)語“藥物組合物”是指活性劑(例如，源自malat-1的pirna)與載體(惰性或活性)的組合，使得所述組合物特別適合于體外、體內(nèi)或離體的診斷或治療用途。如本文所用，術(shù)語“核酸分子”是指任何含有核酸的分子，包括但不限于：dna或rna(例如，源自malat-1的pirna)。該術(shù)語涵蓋包含dna和rna的任何已知堿基類似物的序列，所述類似物包括但不限于：4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-n6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、n6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基q核苷(queosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、氧丁核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、假尿嘧啶、q核苷、2-硫代胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。如本文所用，術(shù)語“基因表達(dá)”和“表達(dá)”是指以下的過程：通過基因的“轉(zhuǎn)錄”(即，經(jīng)由rna聚合酶的酶促作用)，將基因中編碼的遺傳信息轉(zhuǎn)換成rna(例如，mrna、rrna、trna或snrna)，并對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的基因，通過mrna的“翻譯”轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)?？梢栽诖诉^程中的多個(gè)階段調(diào)控基因表達(dá)?！吧险{(diào)”或“活化”是指增加和/或提高基因表達(dá)產(chǎn)物(例如，rna或蛋白質(zhì))的生產(chǎn)的調(diào)控，而“下調(diào)”或“抑制”是指減少生產(chǎn)的調(diào)控。當(dāng)術(shù)語“分離的”用于核酸相關(guān)時(shí)，如在“分離的寡核苷酸”或“分離的多核苷酸”中，是指從在其天然來源中，通常與之結(jié)合的至少一種組分或污染物中鑒別并分離出的核酸序列。分離的核酸以不同于其在天然所見的形式或設(shè)定存在。相比之下，非分離的核酸是處于其天然存在的狀態(tài)的核酸如dna和rna。例如，給定dna序列(例如，基因)見于宿主細(xì)胞染色體上相鄰基因的附近；rna序列，如編碼特定蛋白質(zhì)的特定的mrna序列，與編碼大量蛋白質(zhì)的許多其它mrna一起作為混合物而見于細(xì)胞中。然而，編碼給定蛋白質(zhì)的分離的核酸包括，譬如，在通常表達(dá)該給定蛋白質(zhì)的細(xì)胞中的此核酸，其中該核酸位于不同于天然細(xì)胞的染色體位置，或其側(cè)接不同于天然所見的核酸序列。分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以單鏈或雙鏈形式存在。當(dāng)術(shù)語“合成的”用于核酸分子(例如，pirna)相關(guān)時(shí)，是指由人直接(例如，在實(shí)驗(yàn)室中)或間接(例如，通過在細(xì)胞中表達(dá)實(shí)驗(yàn)室中制得的構(gòu)建體)制得的非天然分子。發(fā)明詳述本文提供了用于通過向?qū)ο蟮哪X部施用組合物，而改善所述對(duì)象中的記憶或認(rèn)知功能的方法，其中所述組合物包含：i)化合物，其增加malat-1長非編碼rna的表達(dá)，ii)malat-1長編碼rna核酸序列，或iii)至少一種源自malat-1的pirna核酸序列。本文還提供了針對(duì)其調(diào)節(jié)malat-1長非編碼rna在腦細(xì)胞中的表達(dá)的能力而篩選候選化合物的方法。在某些實(shí)施方案中，還將如此鑒別出的增加表達(dá)的調(diào)節(jié)因子施用到實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的腦部以測定此類調(diào)節(jié)因子對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的影響。malat-l是非編碼rna，其已經(jīng)表明是肺癌中轉(zhuǎn)移的調(diào)控因子(cancerres.2013年2月1日;73(3):1180-9,通過引用并入本文)，其在酒精成癮者的腦中上調(diào)(kryger,等人,alchol,46,629-634,2012,通過引用并入本文)并且提高肺腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性(tano等人,febsletters,584:4575-4580,2010,通過引用并入本文)。在研發(fā)本公開的實(shí)施方案過程中所進(jìn)行的工作表明，malat1rna在小鼠腦部的海馬體中作為小rna高度表達(dá)，所述小rna通過對(duì)來自小鼠海馬體細(xì)胞的培養(yǎng)物的rna進(jìn)行深度序列分析而鑒別出。在用kci(針對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的模擬學(xué)習(xí)事件)和rg108(dnmt抑制劑)處理后，表達(dá)增加，并且該效果是加成性的，使用kci和rg108二者處理時(shí)觀察到最高的表達(dá)水平。這與malat-l參與學(xué)習(xí)和記憶形成相符。當(dāng)在存在或不存在rg108的情況下，用kci刺激小鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)物時(shí)，誘導(dǎo)了malat-l表達(dá)。令人印象深刻的是，腦部cal區(qū)中的malat-l表達(dá)在條件化恐懼/學(xué)習(xí)范式之后被誘導(dǎo)。此數(shù)據(jù)表明，malat-l明顯參與學(xué)習(xí)和記憶過程。在一些實(shí)施方案中，本文提供了合成的源自malat-1的pirna分子(例如，seqidno:5-22或與seqidno:5-22具有90-99%序列同一性的序列)。在一些實(shí)施方案中，所述pirna分子包含化學(xué)修飾以改善核酸酶穩(wěn)定性、降低觸發(fā)先天免疫應(yīng)答的可能性、降低脫靶效應(yīng)的發(fā)生率、以及/或者相對(duì)于非修飾分子改善藥效學(xué)，以便提高效力和特異性。在一些實(shí)施方案中，所述分子被加載到納米顆粒上，以提供穩(wěn)定效應(yīng)(例如，免于核酸酶降解的保護(hù))。這些效應(yīng)對(duì)于旨在治療腦部的核酸而言特別重要，其中遞送困難限制了可到達(dá)靶細(xì)胞的活性核酸藥物的量。可用于該技術(shù)的一些實(shí)施方案中的合成的pirna分子中的示例性核苷酸化學(xué)修飾(例如，對(duì)糖類的修飾)包括以下：硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、4'-硫代-核糖、鎖核酸、2'-o-(2'-甲氧基乙基)、2'-o-甲基、2'-氟代、2'-脫氧-2'-氟代-b-d-阿拉伯糖核酸、嗎啉代核酸類似物和肽核酸類似物?？刹捎糜糜诜戳x寡核苷酸的另外修飾(參見，例如，美國專利公布號(hào)2012/0202874和2012/0149755，通過引用以其全文并入本文)。本文所述的核酸序列(例如，合成的源自malat-1的pirna分子或malat-1反義寡核苷酸)的遞送可通過任何期望的方法完成。在一些實(shí)施方案中，將分子通過鞘內(nèi)、顱內(nèi)或在直接通向腦部的血管中遞送。在一些實(shí)施方案中，采用可植入的、電池供電的藥物輸注泵的美敦力(medtronic)輸液系統(tǒng)被用于將分子遞送至紋狀體(dickinson等人，neuro.oncol.12:928-940(2010)；sah和aronin,j.clin.invest.121:500-507(2011))。在一些實(shí)施方案中，使用鼻內(nèi)遞送。在一些實(shí)施方案中，通過納米顆粒遞送核酸。例如，可使用包含由殼聚糖包被的氧化鐵核的顆粒(參見，例如，veiseh等人，adv.drugdeliv.rev.,8:582(2011))。殼聚糖是能夠穿過血腦屏障的轉(zhuǎn)胞吞分子。在一些實(shí)施方案中，所述顆粒與細(xì)胞穿透肽結(jié)合以利于將核酸遞送到細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)源性納米顆粒(例如，高密度脂蛋白)被用于遞送分子穿過血腦屏障。在一些實(shí)施方案中，化合物和寡核苷酸被直接遞送/施用至腦部，例如，通過鞘內(nèi)注射(例如，在人中)、icv(例如，在小鼠、大鼠和人中)、側(cè)腦室內(nèi)注射(進(jìn)入腦部的腦室系統(tǒng)的注射類型)、或通過直接注射入待調(diào)查的特定腦區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，通過引入合成的寡核苷酸(例如，類似于pirna或微rna)上調(diào)malat1表達(dá)，所述合成的寡核苷酸改變malat1啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，因而增加轉(zhuǎn)錄。在其它實(shí)施方案中，由于malat1是長非編碼rna，并且它們已經(jīng)顯示對(duì)于基因表達(dá)具有類似增強(qiáng)子的功能，所以使用增強(qiáng)子以提高malat1的實(shí)際表達(dá)(?rom等人，cell.2010年10月1日;143(1):46-58.;通過引用以其全文并入本文)。在某些實(shí)施方案中，使用鋅指重組酶融合蛋白的基因療法被用于位點(diǎn)特異性地將malat1的啟動(dòng)子與具有組成型或更高水平表達(dá)的啟動(dòng)子交換。在一些實(shí)施方案中，例如，使用tet啟動(dòng)子，并在靶細(xì)胞中重組后，通過向?qū)ο筇峁┧沫h(huán)素而啟動(dòng)該基因。此方法的一個(gè)示例性替代方案是將malat1基因引入到具有所需表達(dá)水平的天然啟動(dòng)子之后。在一些實(shí)施方案中，malat1的負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)被減少和/或抑制，從而增加malat1的表達(dá)。類似地，在某些實(shí)施方案中，通過抑制降解途徑而減少malat1的降解。在開發(fā)本文所述的實(shí)施方案的過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，用kcl刺激細(xì)胞(其模擬學(xué)習(xí)事件)增加malat1的表達(dá)。因此，在一些實(shí)施方案中，用強(qiáng)效學(xué)習(xí)事件刺激malat1表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，將已顯示提高學(xué)習(xí)的深度腦部刺激(例如，通過植入電極或通過外部經(jīng)顱直流電刺激)用于刺激malat1的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，施用(例如，外周注射)裝載有malat1rna的外來體，其攜帶外部標(biāo)志物，所述標(biāo)志物將外來體引導(dǎo)至期望的腦區(qū)(或任何器官)。在其中組合物被遞送穿過血腦屏障的某些實(shí)施方案中，所述組合物包含，例如，如例如美國專利號(hào)6,372,250(pardridge)中所述的脂質(zhì)體，以及藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體為受體特異性脂質(zhì)體，其中所述受體特異性脂質(zhì)體包括：具有外表面和內(nèi)腔室的脂質(zhì)體；位于所述脂質(zhì)體的內(nèi)腔室中的人工腺相關(guān)病毒(aav)載體；一個(gè)或多個(gè)血腦屏障和腦細(xì)胞膜靶向劑；以及一個(gè)或多個(gè)綴合劑(例如，聚乙二醇(peg)鏈)，其中各靶向劑均經(jīng)由所述綴合劑中的至少一個(gè)而被連接至所述脂質(zhì)體的外表面。在脂質(zhì)體內(nèi)腔室中包括人工腺相關(guān)病毒(aav)載體的受體特異性脂質(zhì)體可以通過美國專利號(hào)6,372,250(pardridge)中所述的一般方法制備，不同之處在于，使用人工腺相關(guān)病毒(aav)載體取代質(zhì)粒dna。本公開提供了用于篩選和鑒別化合物的方法，所述化合物調(diào)節(jié)malat-1長非編碼rna在腦細(xì)胞中的表達(dá)，所述方法包括：a)使腦細(xì)胞與候選試劑接觸，和b)檢測所述malat-1長非編碼rna和/或源自malat-1的pirna的表達(dá)水平，其中所述表達(dá)水平的提高或降低表明所述候選試劑是malat-1長非編碼rna在腦細(xì)胞中的調(diào)節(jié)因子。在某些實(shí)施方案中，所述鑒別出的調(diào)節(jié)因子提高malat-1rna的表達(dá)水平，并且所述方法還包括：將所述鑒別出的malat-1長非編碼rna的調(diào)節(jié)因子施用至實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的腦部，并且測定所述調(diào)節(jié)因子對(duì)該實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的記憶或?qū)W習(xí)的影響。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)因子被鑒別為提高所述動(dòng)物的記憶和/或?qū)W習(xí)。在具體的實(shí)施方案中，所述腦細(xì)胞是神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。本公開的候選試劑(即，測試化合物)可以，例如，使用本領(lǐng)域已知的組合文庫方法中眾多方法中的任一種獲得，包括：生物文庫；類肽(peptoid)文庫(具有肽的功能性，但具有新的非肽骨架的分子的文庫，所述分子具有酶降解抗性，但依然保持生物活性；參見，例如，zuckennann等人，j.med.chem.37:2678-85(1994))；空間可尋址平行固相或溶液相文庫；需要去卷積的合成文庫方法；‘一珠一化合物’的文庫方法；以及使用親和層析選擇的合成文庫方法。一般優(yōu)選生物文庫和類肽文庫方法與肽文庫一起使用，而其它四種方法適用于化合物的肽、非肽低聚物或小分子文庫(lam(1997)anticancerdrugdes.12:145)。用于合成分子文庫的方法的實(shí)例可見于本領(lǐng)域，例如，在以下中：dewitt等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6909(1993)；erb等人，proc.nad.acad.sci.usa91:11422(1994);zuckermann等人，j.med.chem.37:2678(1994)；cho等人，science261:1303(1993)；carrell等人，angew.chem.int.ed.engl.33.2059(1994)；carell等人，angew.chem.int.ed.engl.33:2061(1994)；以及gallop等人，j.med.chem.37:1233(1994)。化合物文庫可存在于溶液中(例如，houghten,biotechniques13:412-421(1992))，或在珠(lam,nature354:82-84(1991))、芯片(fodor,nature364:555-556(1993))、細(xì)菌或孢子(美國專利號(hào)5,223,409;通過引用并入本文)、質(zhì)粒(cull等人，proc.nad.acad.sci.usa89:18651869(1992))上，或在噬菌體上(scott和smith,science249:386-390(1990)；devlinscience249:404-406(1990)；cwirla等人，proc.nati.acad.sci.87:6378-6382(1990)；felici,j.mol.biol.222:301(1991))。用于篩選malat1靶向化合物的方法可通過基于細(xì)胞的測定或無細(xì)胞測定進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于無細(xì)胞測定，將全長malat1rna連同piwi蛋白、合成的pirna以及攜帶待調(diào)查序列的質(zhì)粒dna一起提供。在溫育后，通過直接測序測定質(zhì)粒dna上的甲基化水平，或者如果使用了表達(dá)構(gòu)建體，則通過與相關(guān)的rna聚合酶一起溫育并監(jiān)測rna轉(zhuǎn)錄水平，以測定來自啟動(dòng)子的體外表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于基于細(xì)胞的測定，使用來自皮質(zhì)或海馬體的原代細(xì)胞，或轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元細(xì)胞系，來鑒別對(duì)于學(xué)習(xí)和記憶重要的區(qū)域。根據(jù)需要，使用來自適當(dāng)組織的其它細(xì)胞系來研究表現(xiàn)和效果。細(xì)胞鋪板并生長至接近匯合。然后，用合成的寡核苷酸(oligos)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一段時(shí)間后(例如，2小時(shí)-2周)，收獲細(xì)胞，提取rna和dna。將rna用于，例如，rna測序?qū)嶒?yàn)以鑒別基因表達(dá)以及小rna生產(chǎn)中的變化。dna被用于以甲基化dna-測序鑒別dna甲基化中的變化(例如，現(xiàn)有技術(shù)是：用亞硫酸氫鹽化學(xué)轉(zhuǎn)化dna，然后在illuminahiseq2500上進(jìn)行單核苷酸測序)?？蛇x地，使用直接鑒別特定堿基的甲基化的pacificbiosciencesdna測序技術(shù)或類似技術(shù)，來直接鑒別dna甲基化。實(shí)施例實(shí)施例1：malat-1參與對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)控本實(shí)施例描述了將非編碼rnamalat-1鑒別并表征為參與對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)控。將約9-12周齡的雄性c57bl/6j小鼠(jacksonlaboratories)用于實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物在抵達(dá)后成對(duì)居住并隨意飲食。在納入實(shí)驗(yàn)前，給動(dòng)物至少一周時(shí)間適應(yīng)環(huán)境。所有方案均遵守國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南，并且得到阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)的批準(zhǔn)。在威脅識(shí)別學(xué)習(xí)前，所有動(dòng)物均經(jīng)過4天的管理。將小鼠置于訓(xùn)練室中并給2分鐘以探索新環(huán)境。2分鐘后，小鼠接受以1分鐘間隔施用的3次足底電擊(0.7ma,2秒)，并在移出訓(xùn)練室前允許另外的一分鐘用于探索。在訓(xùn)練后1小時(shí)，通過快速斷頭將動(dòng)物安樂死。在快速斷頭后立刻以及在海馬體、皮質(zhì)和小腦的大體解剖過程中，將腦部浸沒在富氧的(95%/5%o2/co2)冰冷切削液(125mmnacl、3mmkcl、1.25mmnah2po4、25mmnahco3、0.5mmcacl2、7mmmgcl2、10mm葡萄糖、0.6mm抗壞血酸鹽)中。靜止不動(dòng)百分比是對(duì)動(dòng)物對(duì)于其在特定環(huán)境中所接受的經(jīng)歷(輕度足底電擊)的記憶程度的測量。將未接受過實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物置于新“環(huán)境”中并經(jīng)歷一系列3次的足底電擊(1s,0.5ma)，電擊之間間隔2m。24小時(shí)后，使動(dòng)物回到此環(huán)境中并測量其保持靜止不動(dòng)的時(shí)間量。在這種情況下，相比僅環(huán)境，環(huán)境加上電擊造成靜止不動(dòng)顯著增加。在圖1示出了威脅識(shí)別行為測定的示意圖。使年輕雄性c57b6小鼠經(jīng)受標(biāo)準(zhǔn)恐懼識(shí)別訓(xùn)練方案。這包括將小鼠置于新環(huán)境中2m，然后以2分鐘的間隔進(jìn)行3次足底電擊(12,0.5ma)。對(duì)照小鼠也被置于該新環(huán)境中，但不接受足底電擊。然后，使所有的小鼠回到其飼養(yǎng)籠中，待上24小時(shí)。然后，將小鼠再次置于所述新環(huán)境中，并測量靜止不動(dòng)百分比。靜止不動(dòng)是相比于僅經(jīng)歷環(huán)境處理的動(dòng)物，動(dòng)物對(duì)于誘導(dǎo)恐懼的經(jīng)歷(足底電擊)的記憶程度的測量。如圖2中所示，經(jīng)受條件化恐懼訓(xùn)練的小鼠，當(dāng)被重新引入到訓(xùn)練環(huán)境中時(shí)，表現(xiàn)出增加的靜止不動(dòng)。值得注意的是，短語“威脅識(shí)別行為訓(xùn)練”的使用等同于“條件化恐懼訓(xùn)練”?！皸l件化恐懼”是在科學(xué)文獻(xiàn)中最常使用的術(shù)語，而“威脅識(shí)別”則是用在軍事背景中。在另外的工作中，使動(dòng)物經(jīng)受如上所述相同的訓(xùn)練方案，不同的是，在訓(xùn)練后的不同時(shí)間點(diǎn)(30m、2h和24h)處死動(dòng)物。使用富氧的切削液(高mg2+并且低ca2+以防止興奮性毒性)，將海馬體解剖。隨后，從海馬體中提取rna(使用qiagenmirneasy試劑盒)。將rna的等分試樣用于內(nèi)部qpcr以驗(yàn)證malat-1表達(dá)。圖3顯示在訓(xùn)練(環(huán)境+電擊)后，malat1在2小時(shí)的表達(dá)相比對(duì)照(僅環(huán)境或未接受過實(shí)驗(yàn))有顯著提高，與基于行為的學(xué)習(xí)中的作用相一致。訓(xùn)練后24小時(shí)，malat1表達(dá)回到對(duì)照的水平。這些結(jié)果共同顯示，基于活動(dòng)的學(xué)習(xí)事件導(dǎo)致malat1的時(shí)間依賴性增加，與學(xué)習(xí)和記憶鞏固中的作用相一致。在進(jìn)一步的工作中，進(jìn)行了用于反義寡核苷酸(aso)遞送的立體定位手術(shù)。將小鼠用異氟烷麻醉并固定在kopf立體定位裝置上。使用以下坐標(biāo)：(ap-0.2;ml-1.0;dv-2.4)，以1ul/min的速率將aso(300ug，以60ug/ul)遞送到icv中，并允許恢復(fù)2周。malat1aso#1(seqidno:2)通過側(cè)腦室內(nèi)推(icvb)注(300ug、180ug或pbs對(duì)照)進(jìn)行注射。在2周的術(shù)后恢復(fù)后，使動(dòng)物經(jīng)受如上所述的條件化恐懼訓(xùn)練，并在24小時(shí)后測試恐懼反應(yīng)。如圖4中所示，malat1aso的輸注導(dǎo)致在訓(xùn)練后24小時(shí)，條件化恐懼模型中靜止不動(dòng)減少，這表明小鼠在沒有malat1的情況下沒有那樣有效地鞏固記憶。小鼠在沒有malat1的情況下也沒有習(xí)得電擊，這一事實(shí)與訓(xùn)練后2小時(shí)malat1表達(dá)增加相符。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)重復(fù)三次(在圖中以批次標(biāo)記)；僅示出了批次一、二以及合并的結(jié)果。此結(jié)果非常顯著，因?yàn)閙alat1喪失顯示了對(duì)學(xué)習(xí)的明顯影響。還存在劑量反應(yīng)，其中300ug導(dǎo)致強(qiáng)于180ug劑量的反應(yīng)。malat1轉(zhuǎn)錄物的分子敲低(molecularknockdown)(qpcr)在圖4的右下圖(300ug劑量)中得到確認(rèn)。在另外的工作中，監(jiān)測了使用malat1aso處理的小鼠中的即刻早期基因(ieg)的表達(dá)。malat1aso#1(seqidno:2)通過側(cè)腦室內(nèi)推(icvb)注(300ug對(duì)比pbs對(duì)照)進(jìn)行注射。在2周的術(shù)后恢復(fù)后，使動(dòng)物經(jīng)受如上所述的條件化恐懼訓(xùn)練。訓(xùn)練后一小時(shí)，處死動(dòng)物，取出海馬體，提取rna并用于經(jīng)qpcr的基因表達(dá)的定量。rna提取和qrt-pcr如下進(jìn)行。使用mirneasymini試劑盒(qiagen)，按照制造商的準(zhǔn)則，提取總rna，并進(jìn)行額外的無rnasednase(qiagen)處理步驟，并洗脫在104ul無rnase的水中。對(duì)于體內(nèi)研究而言，處理右側(cè)海馬體。對(duì)于體外研究而言，將純化的rna穿過12孔平板的三個(gè)孔匯集，以提高測序所需rna的產(chǎn)量。使用nanodrop200c(thermoscientific)，以分光光度法測定rna濃度。然后，通過使用iscriptcdna合成試劑盒(bio-rad)中的寡聚-(dt)和隨機(jī)六聚體引物，將300ng的rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna。使用cfx96touch實(shí)時(shí)pcr檢測系統(tǒng)(bio-rad)，用ssoadvanceduniversalsybrgreensupermix(bio-rad)和500nm跨內(nèi)含子的引物(表1)，或taqmanfastadvancedmastermix和taqman基因表達(dá)測定(lifetechnologies)(表2)，進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄酶pcr(qrt-pcr)。表1：所使用的引物?；蛘x引物(5’->3’)反義引物(5’->3’)hprtggagtcctgttgatgttgccagta(seqidno:23)gggacgcagcaactgacatttcta(seqidno:24)fosaatggtgaagaccgtgtcagga(seqidno:25)ttgatctgtctccgcttggagtgt(seqidno:26)arcacgatctggcttcctcattctgct(seqidno:27)aggttccctcagcatctctgcttt(seqidno:28)egr1agcgccttcaatcctcaag(seqidno:29)tttggctgggataactcgtc(seqidno:30)表2：所使用的taqman基因表達(dá)測定。基因產(chǎn)物大小目錄號(hào)hprt65bpmm00446968_m1malat-1124bpmm03958568_s1使用以下循環(huán)條件一式三份進(jìn)行pcr擴(kuò)增：95℃30秒，然后95℃10秒和60℃30秒的40個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熔融分析以驗(yàn)證產(chǎn)物特異性(sybr)，或者是50℃2分鐘，然后是95℃20秒，然后95℃3秒和60℃30秒的40個(gè)循環(huán)(taqman)。樣品間的差異基因表達(dá)通過比較ct(δδct)方法測定，使用次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hprt)作為內(nèi)部對(duì)照。已經(jīng)顯示即刻早期基因(ieg)的表達(dá)在學(xué)習(xí)事件后增加。本實(shí)施例就其在用malat1aso處理的小鼠中的表達(dá)，監(jiān)測了典型iegarc、btg2、dusp1、egr1、egr2、fos、fosb、gadd45g、ler2、junb、npas4、nr4a1和nr4a2的表達(dá)。如圖5中所示，發(fā)現(xiàn)這些ieg的基因表達(dá)在用malat1aso處理的小鼠與對(duì)照小鼠之間不存在顯著改變。因此，在經(jīng)malat1aso處理的小鼠中觀察到的學(xué)習(xí)減少并非由于ieg基因的表達(dá)改變所造成。這些結(jié)果表明，malat1通過尚未在文獻(xiàn)中描述的新機(jī)制起到提高學(xué)習(xí)的作用。在進(jìn)一步的工作中，在經(jīng)malat1反義寡核苷酸(aso)處理的小鼠中檢查了小rna的表達(dá)水平。在表3中提供了來自malat1(seqidno:1)的示例性aso(seqidno:2-4)。表3：示例性反義寡核苷酸分離了來自經(jīng)malat1aso處理的小鼠以及對(duì)照小鼠的rna，并對(duì)其進(jìn)行rna-測序和小rna測序。針對(duì)銜接子污染和低質(zhì)量序列調(diào)整配對(duì)末端mrna讀出序列。然后，用tophat2，將這些與小鼠基因組grcm38.p2比對(duì)，使用經(jīng)注釋的轉(zhuǎn)錄物組以指導(dǎo)已知剪接位點(diǎn)間的比對(duì)。然后，用cufflinks處理這些比對(duì)，以檢測表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。用cuffmerge，將全部所得gtf文件和參考注釋匯集在一起，以構(gòu)建共有轉(zhuǎn)錄物組件，并計(jì)算其豐度。小rna樣品得到1x67bp讀取項(xiàng)，針對(duì)銜接子序列和質(zhì)量進(jìn)行調(diào)整，并棄去短于15bp的經(jīng)調(diào)整的讀出序列。使用bowtie2，以默認(rèn)參數(shù)，將經(jīng)調(diào)整的讀出序列與參照基因組比對(duì)。使用ncrna基因組注釋以鑒別已知的小rna，如mirna、trna、snorna等。在剩余的讀出序列上進(jìn)行新的小rna基因座的檢測。mirna檢測使用mirdeep2進(jìn)行，其使用熱力學(xué)以鑒別穩(wěn)定的mirna發(fā)夾結(jié)構(gòu)。其它小rna和pirna簇(例如，seqidno:5-22)的從頭檢測通過內(nèi)部腳本進(jìn)行，所述腳本首先通過計(jì)算在相同區(qū)域中偶然得到所觀察到的讀出序列分布的可能性而鑒別轉(zhuǎn)錄物。新的和已知基因座一起形成轉(zhuǎn)錄物組件，計(jì)算其豐度，并鑒別出差異表達(dá)的基因座，這使用具有無長度校正標(biāo)志的cufflinks完成。如圖6中所示，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)malat1aso處理的小鼠中，小rna的豐度有顯著增加。另外，相比對(duì)照小鼠，與所表達(dá)蛋白的編碼基因座具有序列互補(bǔ)性的許多小rna在malat1aso小鼠中表現(xiàn)出擴(kuò)增。這些結(jié)果與malat1通過誘導(dǎo)小rna(其可以在小rna的同源編碼基因座起到調(diào)控作用)或通過序列特異性dna甲基化而影響學(xué)習(xí)和記憶鞏固相符。在進(jìn)一步的工作中，檢查了經(jīng)malat1aso處理的小鼠中的dna甲基化水平。malat1aso#1(seqidno:2)通過側(cè)腦室內(nèi)推(icvb)注(300ug對(duì)比pbs對(duì)照)進(jìn)行注射。2周后，取出海馬體，并用qigendna純化試劑盒純化dna。然后，使用來自epicentre的epi-gnome試劑盒(epignome?methyl-seq試劑盒)，對(duì)dna進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。用illumina測序，通過合成技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化的dna進(jìn)行測序。針對(duì)銜接子污染調(diào)整讀出序列，連接，并最終針對(duì)低質(zhì)量堿基進(jìn)行調(diào)整。使用bismark以默認(rèn)設(shè)定進(jìn)行甲基化調(diào)用，其中使讀出序列與轉(zhuǎn)化形式的基因組比對(duì)，并通過鑒別錯(cuò)配來推斷讀出序列中甲基化的堿基。然后，從所調(diào)用的讀出序列中提取甲基化調(diào)用，以生成基因組的單bp分辨率甲基化圖譜。通過計(jì)算與λ對(duì)照序列比對(duì)的讀出序列中甲基化堿基的數(shù)量，來估計(jì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化誤差率。此誤差率被用作最大似然估計(jì)(mle)模型中的參數(shù)，該模型測定具有序列覆蓋的基因組中各個(gè)胞嘧啶處的甲基化比率。將所有生物復(fù)制品的數(shù)據(jù)匯集，假設(shè)具有隨機(jī)采樣的正態(tài)分布，測定各位點(diǎn)處的群體甲基化比率。使用配對(duì)t檢驗(yàn)以鑒別差異甲基化基因，其中各條件之間平均甲基化比率的差異在統(tǒng)計(jì)上不同于零。在基因體和側(cè)翼區(qū)上計(jì)算甲基化概況，使用1kb滑動(dòng)窗口以使數(shù)據(jù)足夠平滑用于作圖。如圖7中所示，發(fā)現(xiàn)相比對(duì)照，經(jīng)malat1aso處理的小鼠中的dna甲基化增加。相對(duì)于對(duì)照(p)，malat1aso小鼠(m)中差異甲基化基因的3'端在chg和chh背景中具有增加的甲基化(p=4.686e-09)。這些結(jié)果表明，malat1在學(xué)習(xí)過程中的主要作用是在特定基因的基因座增加小rna并且減少dna甲基化。小rna豐度和dna甲基化的變化負(fù)責(zé)在條件化恐懼中編碼學(xué)習(xí)和記憶事件。malat1可在通過小rna指令序列特異性dna甲基化調(diào)控記憶的表觀編碼中起到直接作用。本申請(qǐng)中提及的所有出版物和專利均通過引用并入本文。本發(fā)明所述的方法和組合物的各種修改形式和變型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，并且不脫離本發(fā)明的范圍和精神。盡管已經(jīng)結(jié)合特定優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)厥芟抻诖祟愄囟▽?shí)施方案。事實(shí)上，所述用于實(shí)施本發(fā)明的模式的對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的各種修改形式均旨在落入以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。序列表<110>艾比斯生物科學(xué)公司michael,toddp.motley,stanleyt.<120>非編碼rnamalat-1是調(diào)控學(xué)習(xí)和記憶的靶標(biāo)<130>isis-33961/us-1/pro<160>30<170>patentinversion3.5<210>1<211>6982<212>dna<213>小鼠(musmusculus)<400>1aggcattcaggcagcgagagcagagcagcgtagagcagcacagctgagctcgtgaggcag60gagactcagcccgaggaaatcgcagataagtttttaattaaaaagattgagcagtaaaaa120gaattagaactctaaacttaagctaatagagtagcttatcgaaatattacttagtcttaa180taatctaagaagatcttaagagataacatgaaggcttatttaaacagtttgaaaaaggaa240atgaggagaaaagtatttgtactgtataatggaggctgaccagagcagtttaggagattg300taaagggaggttttgtgaagttctaaaaggttctagtttgaaggtcggccttgtagatta360aaacgaaggttacctaaatagaatctaagtggcatttaaaacagtaaagttgtagagaat420agtttgaaaatgaggtgtagttttaaaagattgagaaaagtaggttaagttgacggccgt480tataaaaatccttcgactggcgcatgtacgtttgaaggcatgagttggaaacagggaaga540tggaagtgttaggctagccgggcgatggtggcgcacgcctttaatcctagcacttgggag600gcagaggcaggcggatttctgagttcgaggccagcctggtctacagagtgagttccagga660cagccagggctacacagagaaaccctgtcttgaaaaaacaaaaaggttaggctagtattt720ggagaaagaagattagaaaatggaagtgaaagacgaagaagacatacaggaaggtgaaga780aaaagctgttagagaagataggaaaatagaagacaaagcatctttagaagacagaaaagg840tacttaaaggcacaggtagtaggaagccgaagaatagaagatagaaagaagcaagataga900aaaacaaaatggaagttaagacaactttggatgccagcattcaagataggcaaagaagat960aagattgaggccaaaaggttggataagatataaagtcagaaggaaattatctttaaagcc1020ataagttcaaatttctgatggagcgagcagtttagaagagtctttagacagccacataca1080agattgaagctagcaatcaaagctactaggactgaagtaaaaagttaaggcagaatgcct1140ttgaagagttagaagaatattaaaagccttaacttgtagcttaattttgcttgatgacaa1200aaggacttttgataacagtttcaagattgtcagcattttgcattggacttgagctgaggt1260gcttttaaaatcctaacgactagcattggcagctgacccaggtctacacagaagtgcatt1320cagtgaactaggaagacaggagcggcagacaggagtcccgaagccagtttggtgaagcta1380ggaaggactgaggagccagcagcagcagtgcatggtgaagatagcccaggaaagagtgcg1440gttcggtggaggaagctaggaagaaggagccatacggatgtggtggtgaagctgggaaag1500ggttccaggatggtggagcgagagcgagttggtgatgaagctagctggcggcttggcttg1560tcaactgcgcggaggaggcgagcaggcattgtggagaggatagatagcggctcctagacc1620agcatgccagtgtgcaagaaaggctgcagggagagcatgcggtgcggtaacattccttga1680ggtcggcaacatggtggtggttttctgtaacttggatggtaacttgtttactttgtctta1740atagttatgggggagttgtaggcttctgtgtaaagagatatatctggggctgtatgtagg1800cctttgcgggtgttgtaggtttttctttttcagggttatgtcctcttgcatcttgtcaga1860agcttttgagggctgactgccaaggcccagaaagaagaatggtagatggcaagttgtctt1920taaccgctcagaggggaatgaatggtagagccagcacaacctcccagttttgtaagacgt1980tgtagtttgaacagatgacctaccacaagcctcactcctgtgtaggggaggtaattgggc2040aaagtgcttttgggggaatgggggcaaaatatattttgagttcttttccccttaggtctg2100tctagaatcctaaaggcagatgactcaagggaaccagaaaaaaggaaatccactctcagg2160ataagcagagctcgccaggtttacagtttgtaggaagtagaggatggatgctagctttca2220cactgagtgtggaggagctggccatggcggaattgctggtagtttactctttccccctcc2280cttaatgagatttgtaaaatcctaaacacttttacttgaaatatttgggagtggtcttaa2340cagggaggagtgggtgggggaaacgttttttttctaagattttccacagatgctatagtt2400gtgttgacacactgggttagagaaggcgtgtactgctatgctgttggcacgacaccttca2460gggactggagctgccttttgtccttggaagagttttcccagttgccgctgaagtcagcac2520agtgcggctttggttcacagtcacctcaggagaacctcaggagcttggctaggccagagg2580ttgaagttaagttttacagcaccgtgatttaaaatatttcattaaaggggaggggtaaaa2640cttagttggctgtggccttgtgtttgggtgggtgggggtgttaggtaattgtttagttta2700tgatttcagataatcataccagagaacttaaatatttggaaaaacaggaaatctcagctt2760tcaagttggcaagtaactcccaatccagtttttgcttcttttttcctttttctttttttg2820aggcgggcagctaaggaaggttggttcctctgccggtccctcgaaagcgtagggcttggg2880ggttggtctggtccactgggatgatgtgatgctacagtggggactcttctgaagctgttg2940gatgaatatagattgtagtgtgtggttctcttttgaaatttttttcaggtgacttaatgt3000atcttaataactactataggaacaaaggaagtggctttaatgaccctgaaggaatttctt3060ctggtgatagcttttatattatcaagtaagagatactatctcagttttgtataagcaagt3120ctttttcctagtgtaggagaaatgattttccttgtgactaaacaagatgtaaaggtatgc3180tttttttcttcttgtgcattgtatacttgtgtttatttgtaacttataatttaagaatta3240tgataattcagcctgaatgtcttttagagggtgggcttttgttgatgagggaggggaaac3300ctttttttttctgtagacctttttcagataacaccatctgagtcataaccagcctggcag3360tgtgatgacgtagatgcagagggagcagctccttggtgaatgagtgataagtaaaggcag3420aaaaaataatgtcatgtctccatggggaatgagcatgagccagagattgttcctactgat3480gaaaagctgcatatgcaaaaatttaagcaaatgaaagcaaccagtataaagttatggcaa3540tacctttaaaagttatggcttatctaccaagctttatccacaaaagtaaagaattgatga3600aaaacagtgaagatcaaatgttcatctcaaaactgcttttacaaaagcagaatagaaatg3660aagtgaaaatgctgcattaagcctggagtaaaaagaagctgagcttgttgagatgagtgg3720gatcgagcggctgcgaggcggtgcagtgtgccaatgtttcgtttgcctcagacaggtttc3780tcttcataagcagaagagttgcttcattccatctcggagcaggaaacagcagactgctgt3840tgacagataagtgtaacttggatctgcagtattgcatgttagggatagataagtgccttt3900tttctctttttccaaaaagacctgtagagctgttgaatgtttgcagctggcccctcttag3960gcagttcagaattttgagtagttttcccatccagcctcttaaaaattcctaagccttgca4020ccgatgggctttcatgatgggatagctaataggcttttgcatcgtaaacttcaacacaaa4080agcctacatgattaatgcctactttaattacattgcttacaagattaaggaatctttatc4140ttgaagaccccatgaaagggatcattatgtgctgaaaattagatgttcatattgctaaaa4200tttaaatgtgctccaatgtacttgtgcttaaaatcattaaattatacaaattaataaaat4260acttcactagagaatgtatgtatttagaaggctgtctccttatttaaataaagtcttgtt4320tgttgtctgtagttagtgtgggcaattttggggggatgttcttctctaatcttttcagaa4380acttgacttcgaacactta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