相關(guān)申請(qǐng)交叉參考本申請(qǐng)要求于2014年8月29日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/044,100和于2015年4月24日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/150,596的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，其兩者出于所有目的，通過(guò)引用以其整體結(jié)合。發(fā)明背景甲狀腺素運(yùn)載蛋白(ttr)是主要在肝臟中產(chǎn)生的四聚體蛋白質(zhì)。ttr基因中的突變使蛋白質(zhì)四聚體不穩(wěn)定，導(dǎo)致單體的錯(cuò)誤折疊和聚集成ttr淀粉樣蛋白原纖維(attr)。組織沉積導(dǎo)致全身性attr淀粉樣變性(科蒂紐(coutinho)等人，對(duì)i型淀粉樣蛋白神經(jīng)病變的40年經(jīng)驗(yàn)，復(fù)查483例(fortyyearsofexperiencewithtypeiamyloidneuropathy.reviewof483cases)。在如下中：格列納(glenner)等人，淀粉樣蛋白和淀粉樣變性(amyloidandamyloidosis)，阿姆斯特丹(amsterdam)：摘要媒體(excerptamedia)，1980，第88-93頁(yè)；霍(hou)等人，甲狀腺素運(yùn)載蛋白和家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病，最近在理解神經(jīng)變性的分子機(jī)制方面的最新進(jìn)展(transthyretinandfamilialamyloidoticpolyneuropathy.recentprogressinunderstandingthemolecularmechanismofneurodegeneration)，歐洲聯(lián)合生化學(xué)會(huì)雜志(febsj)2007，274:1637-1650；韋斯特馬克(westermark)等人，老年性全身性淀粉樣變性中的原纖維來(lái)源于正常的甲狀腺素運(yùn)載蛋白(fibrilinsenilesystemicamyloidosisisderivedfromnormaltransthyretin)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(procnatlacadsciusa)，1990，87:2843-2845)。超過(guò)100例報(bào)告的ttr突變表現(xiàn)出一系列疾病癥狀。ttr淀粉樣變性以多種形式表現(xiàn)。當(dāng)周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)更顯著地受影響時(shí)，該疾病被稱為家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變(fap)。當(dāng)心臟主要受累但神經(jīng)系統(tǒng)則不受累時(shí)，該疾病被稱為家族性淀粉樣心肌病(fac)。第三種主要類型的ttr淀粉樣變性被稱為柔腦膜/cns(中樞神經(jīng)系統(tǒng))淀粉樣變性。與家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病變(familialamyloidpolyneuropathy，fap)和attr相關(guān)性心肌病相關(guān)的最常見(jiàn)的突變分別是val30met(科埃略(coelho)等人，用于甲狀腺素運(yùn)載蛋白家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病變的氯苯唑酸：一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(tafamidisfortransthyretinfamilialamyloidpolyneuropathy:arandomized，controlledtrial)，神經(jīng)學(xué)(neurology)，2012，79:785-792)以及val122ile(康納斯(connors)等人，非洲裔美國(guó)人的心臟淀粉樣變性：甲狀腺素運(yùn)載蛋白v122i淀粉樣變性和免疫球蛋白輕鏈淀粉樣變性的臨床和實(shí)驗(yàn)室特征的比較(cardiacamyloidosisinafricanamericans:comparisonofclinicalandlaboratoryfeaturesoftransthyretinv122iamyloidosisandimmunoglobulinlightchainamyloidosis)，美國(guó)心臟雜志(amheartj)，2009，158:607-614)。fap的當(dāng)前治療選項(xiàng)關(guān)注于穩(wěn)定或降低循環(huán)成淀粉樣蛋白的量。原位肝移植降低突變ttr水平(霍姆格倫(holmgren)等人，在兩個(gè)瑞典的家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變(fap-met30)患者中肝移植的生化效應(yīng)(biochemicaleffectoflivertransplantationintwoswedishpatientswithfamilialamyloidoticpolyneuropathy(fap-met30))。臨床遺傳學(xué)(clingenet)1991，40:242-246)，其中在具有早期fap的患者中報(bào)道了存活改善，盡管野生型ttr的沉積可能持續(xù)(矢崎(yazaki)等人，肝移植后進(jìn)展的野生型甲狀腺素運(yùn)載蛋白沉積優(yōu)先發(fā)生在fap患者的心肌中(progressivewild-typetransthyretindepositionafterlivertransplantationpreferentiallyoccursintomyocardiuminfappatients)，美國(guó)移植雜志(amjtransplant)，2007，7:235-242；亞當(dāng)斯(adams)等人，家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病的快速進(jìn)展：多國(guó)自然史研究(rapidprogressionoffamilialamyloidpolyneuropathy:amultinationalnaturalhistorystudy)，神經(jīng)學(xué)(neurology)，2015年8月25日；85(8)675-82；山下(yamashita)等人，肝移植后患有家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病的患者的長(zhǎng)期存活(long-termsurvivalafterlivertransplantationinpatientswithfamilialamyloidpolyneuropathy)，神經(jīng)學(xué)(neurology)，2012，78:637-643；岡本(okamoto)等人，家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病的肝移植：對(duì)瑞典患者存活的影響(livertransplantationforfamilialamyloidoticpolyneuropathy:impactonswedishpatients’survival)，肝移植(livertranspl)，2009，15:1229-1235；斯坦歐(stangou)等人,繼發(fā)于家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病肝移植后的進(jìn)行性心臟淀粉樣變性：對(duì)淀粉樣蛋白原纖維形成的影響(progressivecardiacamyloidosisfollowinglivertransplantationforfamilialamyloidpolyneuropathy:implicationsforamyloidfibrillogenesis)，移植(transplantation)，1998，66:229-233；福斯(fosby)等人，在北歐國(guó)家的肝移植—從北歐肝移植登記處治療和移植后分析的意圖(livertransplantationinthenordiccountries-anintentiontotreatandpost-transplantanalysisfromthenordiclivertransplantregistry)，1982-2013，斯堪的納維亞胃腸病學(xué)雜志(scandjgastroenterol)，2015年6月；50(6):797-808，移植(transplantation)，正在出版)。氯苯唑酸和二氟尼柳穩(wěn)定循環(huán)ttr四聚體，其可以減緩疾病進(jìn)展的速率(伯克(berk)等人，重復(fù)利用二氟尼柳用于家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)?。阂豁?xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)(repurposingdiflunisalforfamilialamyloidpolyneuropathy:arandomizedclinicaltrial)，美國(guó)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)雜志(jama)，2013，310:2658-2667；科赫爾(coelho)等人，2012；科赫爾(coelho)等人，用于治療甲狀腺素運(yùn)載蛋白家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病的氯苯唑酸的長(zhǎng)期效應(yīng)(long-termeffectsoftafamidisforthetreatmentoftransthyretinfamilialamyloidpolyneuropathy)，神經(jīng)病學(xué)雜志(jneurol)，2013，260:2802-2814；洛澤龍(lozeron)等人，對(duì)met30甲狀腺素運(yùn)載蛋白家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病晚期發(fā)病中氯苯唑酸的失能和安全性的影響(effectondisabilityandsafetyoftafamidisinlateonsetofmet30transthyretinfamilialamyloidpolyneuropathy)，歐洲神經(jīng)病學(xué)雜志(eurjneurol)，2013，20:1539-1545)。然而，在大部分患者中，治療中癥狀繼續(xù)惡化，突出了對(duì)fap的新的、改善疾病的治療選項(xiàng)的需要。關(guān)于dsrna靶向ttr的描述可以在例如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)杙ct/us2009/061381(wo2010/048228)和國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)杙ct/us2010/055311(wo2011/056883)中找到。概述本文描述了通過(guò)給予有效量的甲狀腺素運(yùn)載蛋白(ttr)抑制組合物來(lái)減少或阻止人類受試者的神經(jīng)病變損傷評(píng)分(nis)或改良的nis(mnis+7)增加的方法，其中該有效量將人類受試者的血清中ttr蛋白的濃度降低至低于50μg/ml或降低至少80％。本文還描述了通過(guò)向具有增加的nis或家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變(familialamyloidoticpolyneuropathy，fap)的受試者給予ttr抑制組合物并確定具有增加的nis或fap的受試者中ttr蛋白水平來(lái)調(diào)節(jié)用于治療增加的nis或fap的ttr抑制組合物的劑量的方法。在一些實(shí)施例中，如果ttr蛋白水平大于50μg/ml，則隨后向受試者給予的ttr抑制組合物的量增加，并且如果ttr蛋白水平小于50μg/ml，則隨后向受試者給予的ttr抑制組合物的量減少。本文還描述了ttr抑制sirna的配制形式。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1是表示δnis或δmnis+7的進(jìn)展與ttr濃度之間的關(guān)系的圖。圖2是表示δnis或δmnis+7的進(jìn)展與ttr濃度之間的關(guān)系的圖。詳細(xì)說(shuō)明如下文更加詳細(xì)地描述，本文披露了通過(guò)給予有效量的甲狀腺素運(yùn)載蛋白(ttr)抑制組合物來(lái)減少或阻止人類受試者的神經(jīng)病變損傷評(píng)分(nis)或改良的nis(mnis+7)增加的方法，這樣使得該有效量將血清中ttr蛋白的濃度降低至低于50μg/ml或降低至少80％。在一個(gè)實(shí)施例中，ttr抑制組合物是帕提斯然(patisiran)。帕提斯然是對(duì)ttr特異的小干擾核糖核酸(sirna)，并且配制在用于靜脈內(nèi)(iv)給藥的嗜肝脂質(zhì)納米粒(lnp)中。ttr抑制組合物本文所述的方法包括給予ttr抑制組合物。ttr抑制組合物可以是降低人類受試者血清中ttr蛋白濃度的任何化合物。實(shí)例包括但不限于rnai，例如sirna。sirna的實(shí)例包括靶向ttr基因的sirna，例如帕提斯然(在下文更加詳細(xì)地描述)和瑞維斯然(revusiran)。實(shí)例還包括反義rna。靶向ttr基因的反義rna的實(shí)例可以在美國(guó)專利號(hào)8,697,860中找到。ttr抑制組合物抑制ttr基因的表達(dá)。如本文中所使用，“甲狀腺素運(yùn)載蛋白”(“ttr”)是指細(xì)胞中的基因。ttr也稱為attr、hst2651、palb、前白蛋白、tbpa和甲狀腺素運(yùn)載蛋白(前白蛋白、淀粉樣變性i型)。人類ttrmrna轉(zhuǎn)錄物的序列可以在nm_000371中找到。小鼠ttrmrna的序列可以在nm_013697.2中找到，并且大鼠ttrmrna的序列可以在nm_012681.1中找到。術(shù)語(yǔ)“沉默”、“抑制其表達(dá)”、“下調(diào)……的表達(dá)”、“抑制……的表達(dá)”等，只要它們涉及ttr基因，本文是指至少部分抑制ttr基因的表達(dá)，表現(xiàn)為與一個(gè)第二細(xì)胞或一組第二細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)相比，可以從ttr基因轉(zhuǎn)錄的一個(gè)第一細(xì)胞或一組第一細(xì)胞中分離的mrna的量降低，該第一細(xì)胞或一組第一細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)過(guò)處理使得ttr基因的表達(dá)被抑制，該第二細(xì)胞或一組第二細(xì)胞與該第一細(xì)胞或一組第一細(xì)胞基本上相同，但是未經(jīng)過(guò)如此的處理。抑制程度通常按照以下來(lái)表示可替代地，抑制程度能按照與ttr基因表達(dá)功能性相聯(lián)系的一個(gè)參數(shù)的減少而給出，例如由細(xì)胞分泌的ttr基因編碼的蛋白的量，或展現(xiàn)某種表型(例如細(xì)胞凋亡)的細(xì)胞數(shù)量。原則上，ttr基因沉默可以在(組成型地或通過(guò)基因組工程)表達(dá)該靶標(biāo)的任何細(xì)胞中并且通過(guò)任何合適的測(cè)定來(lái)確定。然而，當(dāng)需要參考來(lái)確定給定的dsrna是否在一定程度上抑制ttr基因的表達(dá)并且因此被本發(fā)明所涵蓋時(shí)，在以下實(shí)例中提供的這些測(cè)定將作為此類參考。rnai在一些實(shí)施例中，本文所述的方法使用ttr抑制組合物用于抑制ttr基因的表達(dá)，該ttr抑制組合物是rnai，例如sirna，例如dsrna。在一個(gè)實(shí)施例中，sirna是靶向ttr基因的dsrna。dsrna包括具有互補(bǔ)區(qū)域的反義鏈，該互補(bǔ)區(qū)域與在ttr基因表達(dá)中形成的mrna的至少一部分互補(bǔ)，并且該互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，通常為19-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。本發(fā)明的dsrna可以進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)單鏈核苷酸懸突。ttr抑制sirna描述于國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)杙ct/us2009/061381(wo2010/048228)和國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)杙ct/us2010/055311(wo2011/056883)中，兩者通過(guò)引用以其整體結(jié)合在此。在一個(gè)實(shí)施例中，ttr抑制組合物是帕提斯然，在下文進(jìn)行了更加詳細(xì)地描述。在另一個(gè)實(shí)施例中，ttr抑制組合物是瑞維斯然，一種對(duì)與三價(jià)galnac碳水化合物簇軛合的ttr特異的sirna。瑞維斯然的完整描述可以在國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杙ct/us2012/065691和美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)us20140315835中找到，其內(nèi)容通過(guò)引用以其整體結(jié)合在此。dsrna包括充分雜交互補(bǔ)以形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的兩條rna鏈。dsrna(反義鏈)的一條鏈包括：與靶序列基本上互補(bǔ)并且通常完全互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，該靶序列源自在ttr基因表達(dá)期間形成的mrna的序列，另一條鏈(有義鏈)包括與反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，使得當(dāng)在合適的條件下組合時(shí)，兩條鏈雜交并形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“反義鏈”是指dsrna鏈，其包括一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域基本上與靶序列互補(bǔ)。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)區(qū)域”是指該反義鏈上基本上與一個(gè)序列(例如如本文所定義的靶序列)互補(bǔ)的區(qū)域。在互補(bǔ)區(qū)域不與靶序列完全互補(bǔ)的情況下，錯(cuò)配在末端區(qū)域是最可容忍的，并且如果出現(xiàn)錯(cuò)配，它們通常在一個(gè)或多個(gè)末端區(qū)域中，例如5’和/或3’末端的6個(gè)、5個(gè)、4個(gè)、3個(gè)、或2個(gè)核苷酸之內(nèi)。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“有義鏈”是指含有與反義鏈區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域的dsrna鏈。通常，雙鏈體結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度在15和80之間、或15和60之間或15和30之間、或在25和30之間、或在18和25之間、或在19和24之間、或在19和21之間、或?yàn)?9、20或21個(gè)堿基對(duì)。在一個(gè)實(shí)施例中，雙鏈體的長(zhǎng)度為19個(gè)堿基對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施例中，雙鏈體的長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)。dsrna的每條鏈的長(zhǎng)度通常在15和80、或15和60、或15和30之間、或在18和25之間、或?yàn)?8、19、20、21、22、23、24或25個(gè)核苷酸。在其他實(shí)施例中，每條鏈的長(zhǎng)度為25-30個(gè)核苷酸。雙鏈體的每條鏈可以是相同的長(zhǎng)度或不同的長(zhǎng)度。當(dāng)組合使用兩種不同的sirna時(shí)，每種sirna的每條鏈的長(zhǎng)度可以相同或可以不同。dsrna可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的一個(gè)或多個(gè)單鏈懸突。在一個(gè)實(shí)施例中，dsrna的至少一個(gè)末端具有1至4個(gè)、通常1或2個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸懸突。在另一個(gè)實(shí)施例中，dsrna的反義鏈在3’末端和5’末端各自具有超出有義鏈的1-10個(gè)核苷酸懸突。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，dsrna的有義鏈在3’末端和5’末端各自具有超出反義鏈的1-10個(gè)核苷酸懸突。如本文所使用，并且除非另外指明，當(dāng)用來(lái)描述與第二核苷酸序列相關(guān)的第一核苷酸序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指包含該第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含該第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交并且形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的能力，如技術(shù)人員將理解的。此類條件可以例如是嚴(yán)格條件，其中嚴(yán)格條件可以包括：400mmnacl、40mmpipesph6.4、1mmedta，50℃或70℃持續(xù)12-16小時(shí)，隨后洗滌?？梢詰?yīng)用其他條件，例如可以在有機(jī)體中遇到的生理學(xué)相關(guān)條件。技術(shù)人員將能夠根據(jù)雜交核苷酸的最終應(yīng)用，確定最適宜于測(cè)試兩個(gè)序列的互補(bǔ)性的條件集合。這包括：包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的整個(gè)長(zhǎng)度上堿基配對(duì)。此類序列本文可以稱作相對(duì)于彼此“完全互補(bǔ)”。然而，本文中，在第一序列被稱作相對(duì)于第二序列“基本上互補(bǔ)”的情況下，這兩個(gè)序列可以是完全互補(bǔ)的，或者它們可以在雜交時(shí)形成一個(gè)或多個(gè)，但是通常不多于4個(gè)、3個(gè)或2個(gè)錯(cuò)配堿基配對(duì)，同時(shí)保留了在與它們的最終應(yīng)用最相關(guān)的條件下雜交的能力。然而，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸被設(shè)計(jì)成在雜交時(shí)形成一個(gè)或多個(gè)單鏈懸突時(shí)，此類懸突不應(yīng)該被認(rèn)為是關(guān)于互補(bǔ)性確定的錯(cuò)配。例如，出于本文描述的目的，以下這樣一種dsrna也可以稱作“完全互補(bǔ)”：該dsrna包括一個(gè)長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸的寡核苷酸以及另一個(gè)長(zhǎng)度為23個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其中該更長(zhǎng)的寡核苷酸包括一個(gè)與該更短的寡核苷酸完全互補(bǔ)的21個(gè)核苷酸序列。如本文所使用，就滿足以上相對(duì)于它們雜交的能力而言的要求來(lái)說(shuō)，“互補(bǔ)”序列還可以包括或完全形成自非沃森-克里克堿基對(duì)和/或從非天然的以及經(jīng)修飾的核苷酸形成的堿基對(duì)。此類非沃森-克里克堿基對(duì)包括但不限于g:u搖擺堿基配對(duì)或hoogstein堿基配對(duì)。本文的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”、“完全互補(bǔ)”和“基本上互補(bǔ)”可以相對(duì)于在dsrna的有義鏈與反義鏈之間、或dsrna的反義鏈與靶標(biāo)序列之間的堿基配對(duì)使用，如將從其使用的上下文中理解的。如本文所使用，與信使rna(mrna)的“至少部分基本上互補(bǔ)”的多核苷酸是指與感興趣的mrna(例如，編碼ttr的mrna)的一個(gè)連續(xù)部分(包括5'utr、開(kāi)放閱讀框(orf)或3'utr)基本互補(bǔ)的多核苷酸。舉例來(lái)說(shuō)，如果多核苷酸與編碼ttr的mrna的非中斷部分基本上互補(bǔ)，那么該序列與ttrmrna的至少一部分互補(bǔ)。dsrna可以通過(guò)如在下文進(jìn)一步討論的、本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行合成，例如通過(guò)使用自動(dòng)化的dna合成儀，例如從例如生物研究公司(biosearch)、應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，inc)可商購(gòu)的合成儀。修飾的dsrna在一些實(shí)施例中，在本文所述的方法中使用的dsrna被化學(xué)修飾以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。本發(fā)明中表征的核酸可以通過(guò)本領(lǐng)域已建立好的方法合成和/或修飾，如在“核酸化學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南(currentprotocolsinnucleicacidchemistry)”，畢克奇(beaucage,s.l.)等人(編輯)，約翰威利父子出版公司(johnwiley&sons,inc.)，美國(guó)紐約州紐約市(newyork,ny,usa)中描述的那些方法，該文獻(xiàn)因此通過(guò)引用結(jié)合在此。在本發(fā)明中有用的dsrna化合物的具體實(shí)例包括含有修飾骨架或無(wú)天然核苷間鍵合的dsrna。如本說(shuō)明書(shū)中所定義的，具有修飾骨架的dsrna包括：在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。出于本說(shuō)明書(shū)的目的并且如有時(shí)本領(lǐng)域中所提及的，在其核苷間骨架中不具有磷原子的修飾dsrna也可以被認(rèn)為是寡核苷。修飾的dsrna骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯、磷酰胺酯，包括3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'鍵的硼烷磷酸酯、這些酯的2'-5'連接的類似物、和具有反轉(zhuǎn)極性的那些酯，其中相鄰對(duì)的核苷單位為3'-5'至5'-3'連接或2'-5'至5'-2'連接。還包括不同鹽、混合鹽以及游離酸形式。教授制備以上含磷鍵的代表性美國(guó)專利包括但不限于：美國(guó)專利號(hào)3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050，其每一個(gè)通過(guò)引用在此結(jié)合。其中不包含磷原子的修飾的dsrna骨架具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷酸間鍵合、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷酸間鍵合或者一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷酸間鍵合形成的骨架。這些包括具有以下結(jié)構(gòu)的那些：?jiǎn)徇I合(從核苷的糖部分中部分地形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙?；羌埽粊喖谆柞Ｒ阴；土虼柞Ｒ阴；羌?；含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲亞氨基和亞甲肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合n、o、s和ch2組分部分的其他骨架。教授制備以上寡核苷的代表性美國(guó)專利包括但不限于：美國(guó)專利號(hào)5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，其每一個(gè)通過(guò)引用在此結(jié)合。在其他合適的dsrna模擬物中，將核苷酸單位的糖和核苷間鍵合即骨架替換為新穎的基團(tuán)。保持堿基單元以與適當(dāng)?shù)暮怂岚袠?biāo)化合物雜交。一種這樣的低聚化合物，已經(jīng)顯示具有優(yōu)異雜交特性的dsrna模擬物，被稱為肽核酸(pna)。在pna化合物中，dsrna的糖骨架被含有酰胺的骨架替換，具體是氨基乙基甘氨酸骨架。這些核堿基得以保持并且直接或間接地結(jié)合至該骨架的酰胺部分的氮雜氮原子上。教授制備pna化合物的代表性美國(guó)專利包括但不限于：美國(guó)專利號(hào)5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其每一個(gè)通過(guò)引用在此結(jié)合。對(duì)pna化合物的進(jìn)一步教授內(nèi)容可以在尼爾森(nielsen)等人，科學(xué)(science)，1991，254，1497-1500中找到。本發(fā)明的其他實(shí)施例是：具有硫代磷酸酯骨架的dsrna和具有雜原子骨架的寡核苷，并且尤其是上文所引用的美國(guó)專利號(hào)5,489,677的--ch2--nh--ch2--、--ch2--n(ch3)--o--ch2--[稱作亞甲基(甲基亞氨基)或mmi骨架]、--ch2--o--n(ch3)--ch2--、--ch2--n(ch3)--n(ch3)--ch2--、和--n(ch3)--ch2--ch2--[其中天然磷酸二酯骨架表示為--o--p--o--ch2--]，以及上文所引用的美國(guó)專利號(hào)5,602,240的酰胺骨架。還優(yōu)選的是具有上文所引用的美國(guó)專利號(hào)5,034,506的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的dsrna。修飾的dsrna還可以含有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)取代的糖部分。優(yōu)選的dsrna在2'位置處包含以下各項(xiàng)之一：oh；f；o-、s-、或n-烷基；o-、s-、或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中該烷基、烯基以及炔基可以是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1至c10烷基或c2至c10烯基和炔基。特別優(yōu)選的是：o[(ch2)no]mch3、o(ch2)noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2、和o(ch2)non[(ch2)nch3)]2，其中n和m是從1至約10。其他優(yōu)選的dsrna在2'位置處包含以下各項(xiàng)之一：c1至c10低級(jí)烷基、經(jīng)取代的低級(jí)烷基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、經(jīng)取代的甲硅烷基、rna切割基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、嵌入劑、用于改善dsrna的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)或用于改善dsrna的藥效特性的基團(tuán)以及具有類似特性的其他取代基。優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-o--ch2ch2och3，也稱為2'-o-(2-甲氧基乙基)或2'-moe)(馬丁(martin)等人，瑞士化學(xué)學(xué)報(bào)(helv.chim.acta)，1995，78，486-504)，即，烷氧基-烷氧基基團(tuán)。進(jìn)一步優(yōu)選的修飾包括2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基團(tuán)，如在本文以下實(shí)例中所描述的也稱作2'-dmaoe，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領(lǐng)域中也稱作2’-o-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-dmaeoe)，即2'-o--ch2--o--ch2--n(ch2)2，也如在本文以下實(shí)例中所描述的。其他優(yōu)選的修飾包括2’-甲氧基(2’-och3)、2’-氨基丙氧基(2’-och2ch2ch2nh2)以及2’-氟代(2’-f)。也可以在dsrna上的其他位置處作出相似的修飾，尤其在3'末端核苷酸上或在2'-5'連接的dsrna中糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。dsrnas還可以具有糖模擬物，例如代替戊呋喃糖基糖的環(huán)丁基部分。教授制備此類修飾的糖結(jié)構(gòu)的代表性美國(guó)專利包括但不限于：美國(guó)專利號(hào)4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，這些專利中的某些與本申請(qǐng)被共同擁有人，并且其每一個(gè)通過(guò)引用以其整體在此結(jié)合。dsrna還可以包括核堿基(在本領(lǐng)域中通常簡(jiǎn)稱為“堿基”)修飾物或取代物。如本文所使用，“非修飾”或“天然”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(a)和鳥(niǎo)嘌呤(g)、以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。經(jīng)修飾的核堿基包括其他合成和天然的核堿基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)；5-羥基甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤；5-鹵代、尤其5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥(niǎo)嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤和8-氮雜腺嘌呤；7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和7-脫氮腺嘌呤；以及3-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。另外的核堿基包括披露于美國(guó)專利號(hào)3,687,808中的那些；披露于聚合物科學(xué)與工程的簡(jiǎn)明百科全書(shū)(theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering)，第858-859頁(yè)，克奧赤威茲(kroschwitz,j.l,)編輯，約翰威利父子公司(johnwiley&sons)，1990中的那些；由英格力士(englisch)等人，應(yīng)用化學(xué)(angewandtechemie)，國(guó)際版，1991，30，613披露的那些；以及由桑格威(sanghvi,ys.)第15章，dsrna研究與應(yīng)用(dsrnaresearchandapplications)，第289-302頁(yè)，克魯克(crooke,s.t.)和黎布魯(lebleu,b.,)，編輯，crc出版社，1993披露的那些。這些核堿基中的某些對(duì)于提高在本發(fā)明中出現(xiàn)的低聚化合物的結(jié)合親和力特別有用。這些堿基包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及n-2、n-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經(jīng)顯示5-甲基胞嘧啶取代使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加0.6℃-1.2℃(桑格威(sanghvi,y.s.)、克魯克(crooke,s.t)和黎布魯(lebleu,b.)，編輯，dsrna研究與應(yīng)用(dsrnaresearchandapplications)，crc出版社，波卡拉頓(bocaraton)，1993，第276-278頁(yè))并且是示例性堿基取代，甚至更具體地當(dāng)與2’-o-甲氧基乙基糖修飾組合時(shí)。教授制備上述經(jīng)修飾的核堿基以及其他經(jīng)修飾的核堿基中的某些的代表性美國(guó)專利包括但不限于上述的美國(guó)專利號(hào)3,687,808，連同美國(guó)專利號(hào)4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；和5,681,941，其每一個(gè)通過(guò)引用結(jié)合在此，以及美國(guó)專利號(hào)5,750,692，也通過(guò)引用結(jié)合在此。帕提斯然在一個(gè)實(shí)施例中，ttr抑制組合物是帕提斯然。帕提斯然是對(duì)ttr特異的小干擾核糖核酸(sirna)，并且是配制在用于靜脈內(nèi)(iv)給藥的嗜肝脂質(zhì)納米粒(lnp)中(阿基尼克(akinca)，松巴赫(zumbuehla)等人，用于遞送rnai治療劑的脂質(zhì)樣材料的組合文庫(kù)(acombinatoriallibraryoflipid-likematerialsfordeliveryofrnaitherapeutics)，自然生物技術(shù)(natbiotechnol)，2008；26(5):561-569)。該ttrsirna具有在ttr基因的3'utr區(qū)域內(nèi)的靶區(qū)域，以確保和證實(shí)與wtttr以及所有報(bào)道的ttr突變的同源性。在lnp介導(dǎo)的向肝臟的遞送后，帕提斯然靶向用于降解的ttrmrna，導(dǎo)致經(jīng)由rnai機(jī)制來(lái)有效并且持續(xù)的減少突變體和wtttr蛋白。ttrsirna(也稱為aln-18328)由具有以下序列的有義鏈和反義鏈組成；小寫(xiě)字母表示核苷酸的2'-o-甲基形式：制造方法由通過(guò)常規(guī)的固相寡核苷酸合成來(lái)合成雙鏈體的兩個(gè)單鏈寡核苷酸組成。純化后，將兩個(gè)寡核苷酸退火成雙鏈體。帕提斯然藥物產(chǎn)品是ttrsirnaaln-18328與等滲磷酸鹽緩沖鹽水中的脂質(zhì)賦形劑(dlin-mc3-dma、dspc、膽固醇和peg2000-c-dmg)的無(wú)菌配制品。帕提斯然配制品示于下表1中：表1：帕提斯然藥物產(chǎn)品的組成在一些實(shí)施例中，帕提斯然藥物產(chǎn)品提供在容器(例如玻璃小瓶)中，其中每個(gè)小瓶具有以下量：表2：每個(gè)小瓶包括的帕提斯然藥物產(chǎn)品的組成用于注射的帕提斯然溶液含有2mg/ml的ttrsirna藥品。將帕提斯然藥物產(chǎn)品包裝在充填容積為5.5ml的10ml玻璃小瓶中。容器封閉系統(tǒng)由美國(guó)藥典/歐洲藥典(unitedstatespharmacopeia/europeanpharmacopoeia，usp/ep)i型硼硅酸鹽玻璃小瓶、特氟隆(teflon)為面的丁基橡膠塞和鋁封蓋組成。四聚體穩(wěn)定劑在一些實(shí)施例中，本文所述的方法包括四聚體穩(wěn)定劑與另一種ttr抑制組合物的共同給予。四聚體穩(wěn)定劑是結(jié)合ttr蛋白并且用于穩(wěn)定ttr四聚體的化合物。使ttr四聚體不穩(wěn)定的突變導(dǎo)致錯(cuò)配和聚集的ttr。四聚體穩(wěn)定劑的實(shí)例包括：氯苯唑酸和二氟尼柳。氯苯唑酸和二氟尼柳兩者都可以減緩疾病進(jìn)展的速率(伯克(berk)等人，重復(fù)利用二氟尼柳用于家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)?。阂豁?xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)(repurposingdiflunisalforfamilialamyloidpolyneuropathy:arandomizedclinicaltrial)，美國(guó)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)雜志(jama)，2013，310:2658-2667；科赫爾(coelho)等人，2012；科赫爾(coelho)等人，用于治療甲狀腺素運(yùn)載蛋白家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病的氯苯唑酸的長(zhǎng)期效應(yīng)(long-termeffectsoftafamidisforthetreatmentoftransthyretinfamilialamyloidpolyneuropathy)，神經(jīng)病學(xué)雜志(jneurol)，2013，260:2802-2814；洛澤龍(lozeron)等人，對(duì)met30甲狀腺素運(yùn)載蛋白家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病晚期發(fā)病中氯苯唑酸的失能和安全性的影響(effectondisabilityandsafetyoftafamidisinlateonsetofmet30transthyretinfamilialamyloidpolyneuropathy)，歐洲神經(jīng)病學(xué)雜志(eurjneurol)，2013，20:1539-1545)。受試者和診斷本文披露了用于減少或阻止人類受試者的神經(jīng)病變損傷評(píng)分(nis)或改良的nis(mnis+7)增加的方法，其中該人類受試者具有ttr相關(guān)失調(diào)。在一些實(shí)施例中，ttr相關(guān)失調(diào)是由甲狀腺素運(yùn)載蛋白(ttr)基因中的突變引起的疾病之一。在一個(gè)實(shí)施例中，該疾病是ttr淀粉樣變性，其以多種形式表現(xiàn)，例如家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病變(fap)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性(attr)和癥狀性多發(fā)性神經(jīng)病變。當(dāng)周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)更顯著地受影響時(shí)，該疾病被稱為fap。當(dāng)心臟主要受累但神經(jīng)系統(tǒng)則不受累時(shí)，該疾病被稱為家族性淀粉樣心肌病(fac)。第三種主要類型的ttr淀粉樣變性被稱為柔腦膜/cns(中樞神經(jīng)系統(tǒng))淀粉樣變性。attr影響自主神經(jīng)系統(tǒng)。在一些實(shí)施例中，具有ttr相關(guān)失調(diào)的人類受試者具有突變的ttr基因。超過(guò)100例報(bào)告的ttr突變表現(xiàn)出一系列疾病癥狀。與fap和attr相關(guān)的心肌病相關(guān)聯(lián)的最常見(jiàn)的突變分別是val30met和val122ile。ttr突變引起蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，并加速ttr淀粉樣形成的過(guò)程，并且ttr突變是臨床上顯著ttr淀粉樣變性(也稱為attr(淀粉樣變性-甲狀腺素運(yùn)載蛋白型))發(fā)展的最重要的風(fēng)險(xiǎn)因素。已知超過(guò)85種成淀粉樣ttr變體會(huì)引起全身性家族性淀粉樣變性。在一些實(shí)施例中，如果人類受試者是具有活組織檢查證實(shí)的attr淀粉樣變性和輕度至中度神經(jīng)病變的成年人(≥18歲)，則選擇該人類受試者接受任何形式的ttr淀粉樣變性的治療。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，人類受試者還具有以下各項(xiàng)中的一種或多種：卡諾夫斯庫(kù)機(jī)能狀態(tài)量表評(píng)分(karnofskyperformancestatus，kps)≥60％；體重指數(shù)(bmi)為17-33kg/m2；適當(dāng)?shù)母文I功能(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ast)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)≤2.5×正常上限(uln)、總膽紅素在正常限度內(nèi)、白蛋白>3g/dl、和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率(inr)≤1.2；血清肌酸酐≤1.5uln)；以及乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒為血清陰性。在另一個(gè)實(shí)施例中，如果人類受試者有下列情況，則將該人類受試者排除在治療之外：接受過(guò)肝移植；在治療期間計(jì)劃進(jìn)行手術(shù)；hiv陽(yáng)性；在30天內(nèi)已經(jīng)接受了除氯苯唑酸或二氟尼柳以外的研究藥物；紐約心臟協(xié)會(huì)心力衰竭分類>2；懷孕或哺乳；已知或懷疑有全身性細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)或真菌感染；具有不穩(wěn)定的心絞痛、不受控制的臨床顯著心律失常；或先前對(duì)脂質(zhì)體產(chǎn)物具有嚴(yán)重反應(yīng)或已知對(duì)寡核苷酸過(guò)敏。神經(jīng)病變損傷評(píng)分(nis)本文披露的方法通過(guò)給予甲狀腺素運(yùn)載蛋白(ttr)抑制組合物來(lái)減少或阻止人類受試者中神經(jīng)病變損傷評(píng)分(nis)的增加。nis是指測(cè)量虛弱、感覺(jué)和反射，尤其是關(guān)于周?chē)窠?jīng)病變的評(píng)分系統(tǒng)。nis分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)組的肌肉虛弱(1是25％虛弱、2是50％虛弱、3是75％虛弱、3.25是克服重力的運(yùn)動(dòng)、3.5是重力消除的運(yùn)動(dòng)、3.75是沒(méi)有運(yùn)動(dòng)下肌肉顫動(dòng)、并且4是癱瘓)，標(biāo)準(zhǔn)組的肌肉拉伸反射(0是正常、1是減少、2是不存在)，以及觸摸壓力、振動(dòng)、關(guān)節(jié)位置和運(yùn)動(dòng)和針刺(全部在食指和拇趾上進(jìn)行分級(jí)：0是正常，1是減少，2是不存在)。針對(duì)年齡、性別和身體健康校正評(píng)價(jià)。在一個(gè)實(shí)施例中，用于降低nis分?jǐn)?shù)的方法導(dǎo)致nis降低至少10％。在其他實(shí)施例中，該方法分?jǐn)?shù)導(dǎo)致nis降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或至少50％。在其他實(shí)施例中，該方法阻止nis分?jǐn)?shù)增加，例如，該方法導(dǎo)致nis分?jǐn)?shù)增加0％。用于確定人類受試者的nis的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可以從以下參考文獻(xiàn)中找到：戴克(dyck,pj)等人，使用羅切斯特糖尿病神經(jīng)病研究組群中的綜合分?jǐn)?shù)來(lái)縱向評(píng)估糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病變(longitudinalassessmentofdiabeticpolyneuropathyusingacompositescoreintherochesterdiabeticneuropathystudycohort)，神經(jīng)學(xué)(neurology)，1997.49(1):pg.229-239)。戴克(dyck,pj)，多發(fā)性神經(jīng)病的檢測(cè)、表征和分期：在糖尿病患者中評(píng)估(detection,characterization,andstagingofpolyneuropathy:assessedindiabetics)，肌肉神經(jīng)(musclenerve)，1988年1月，11(1):21-32。改良的神經(jīng)病變損傷評(píng)分(mnis+7)在一些實(shí)施例中，本文披露的方法通過(guò)給予甲狀腺素運(yùn)載蛋白(ttr)抑制組合物來(lái)減少或阻止人類受試者中改良的神經(jīng)病變損傷評(píng)分(mnis+7)的增加。如普通技術(shù)人員所熟知的，mnis+7是指與小和大神經(jīng)纖維功能的電生理測(cè)量(ncs和qst)以及自主功能測(cè)量(體位性血壓)結(jié)合的基于臨床檢查的神經(jīng)損傷評(píng)估(nis)。該mnis+7分?jǐn)?shù)是nis+7分?jǐn)?shù)的改良(其代表nis加7個(gè)測(cè)試)。nis+7分析虛弱和肌肉拉伸反射。七個(gè)測(cè)試中的五個(gè)包括神經(jīng)傳導(dǎo)的屬性。這些屬性是腓神經(jīng)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位振幅、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)遠(yuǎn)端潛伏期(mndl)、脛骨mndl和腓腸感覺(jué)神經(jīng)動(dòng)作電位振幅。這些值針對(duì)年齡、性別、身高和體重的變量進(jìn)行校正。七個(gè)測(cè)試中的剩余兩個(gè)包括振動(dòng)檢測(cè)閾值和伴隨深呼吸的心率下降。該mnis+7分?jǐn)?shù)改良了nis+7，以考慮使用智能軀體特定區(qū)定量感覺(jué)測(cè)試(smartsomatotopicquantitativesensationtesting)，新自主神經(jīng)評(píng)估和使用尺骨、腓骨和脛神經(jīng)振幅的復(fù)合肌肉動(dòng)作電位，以及尺骨和腓腸神經(jīng)的感覺(jué)神經(jīng)動(dòng)作電位(蘇安巴碩(suanprasert,n)等人，ttrfap組群的回顧性研究以改良nis+7用于治療試驗(yàn)(retrospectivestudyofattrfapcohorttomodifynis+7fortherapeutictrials)，神經(jīng)科學(xué)雜志(j.neurol)，2014，344(1-2):pg.121-128)。在一個(gè)實(shí)施例中，用于降低mnis+7分?jǐn)?shù)的方法導(dǎo)致mnis+7降低至少10％。在其他實(shí)施例中，該方法分?jǐn)?shù)導(dǎo)致mnis+7分?jǐn)?shù)降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或至少50％。在其他實(shí)施例中，該方法阻止mnis+7分?jǐn)?shù)增加，例如，該方法導(dǎo)致mnis+7分?jǐn)?shù)增加0％。血清ttr蛋白濃度本文所述的方法包括向人類受試者給予有效量的甲狀腺素運(yùn)載蛋白(ttr)抑制組合物，其中該有效量將人類受試者血清中的ttr蛋白的濃度降低至低于50μg/ml或降低至少80％。血清ttr蛋白濃度可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法直接確定，例如基于抗體的測(cè)定，例如elisa?？商娲?，可以通過(guò)測(cè)量ttrmrna的量來(lái)確定血清ttr蛋白濃度。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，通過(guò)測(cè)量替代物(例如維生素a或視黃醇結(jié)合蛋白(rbp))的濃度來(lái)確定血清ttr蛋白濃度。在一個(gè)實(shí)施例中，使用如在下面實(shí)例中所述的elisa測(cè)定來(lái)確定血清ttr蛋白濃度。在一些實(shí)施例中，血清ttr蛋白的濃度降低至低于50μg/ml、或低于40μg/ml、25μg/ml或10μg/ml。在一些實(shí)施例中，血清ttr蛋白的濃度降低了80％、或降低了81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％或95％。aucauc是指向患者給予一個(gè)劑量的藥物(如ttr抑制組合物)后，血流的血漿中組合物(如ttr)濃度隨時(shí)間的曲線下面積。其受組合物從患者血漿中的吸收速率和去除速率的影響。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可以通過(guò)計(jì)算給予藥物后血漿組合物濃度的積分來(lái)確定auc。在另一個(gè)方面，可以使用以下化學(xué)式預(yù)測(cè)auc：預(yù)測(cè)的auc＝(dxf)/cl其中d是劑量濃度，f是生物利用度的量度，并且cl是預(yù)測(cè)的清除率。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是預(yù)測(cè)的auc的值具有±3至4倍范圍內(nèi)的誤差。在一些實(shí)施例中，用于確定auc的數(shù)據(jù)通過(guò)在給予藥物之后在不同時(shí)間間隔從患者采集血液樣品而獲得。在一個(gè)方面，在給予ttr抑制組合物之后，患者血漿中的平均auc在約9000至約18000的范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解的是，由于代謝和/或可能與其他治療劑的相互作用的可變性，ttr的血漿濃度可能在受試者之間有顯著變化。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，ttr的血漿濃度可以隨受試者而變化。同樣地，諸如最大血漿濃度(cmax)或達(dá)到最大血漿濃度的時(shí)間(tmax)或從時(shí)間零到最后可測(cè)量濃度(auclast)時(shí)間的曲線下面積或血漿濃度時(shí)間曲線下總面積(auc)的值都可以隨受試者而變化。由于這種可變性，構(gòu)成化合物(例如ttr抑制組合物)的“治療有效量”所需的量可以隨受試者而變化。藥物組合物本文所述的方法包括給予ttr抑制組合物，例如靶向ttr基因的sirna，例如帕提斯然。在一些實(shí)施例中，ttr抑制組合物是藥物組合物。如本文所使用，“藥物組合物”包含ttr抑制組合物和藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指用于給予治療劑的載體。此類載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇、及其組合。該術(shù)語(yǔ)特別地排除細(xì)胞培養(yǎng)基。對(duì)于口服給予的藥物，藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣、以及乳糖，而玉米淀粉和海藻酸是合適的崩解劑。結(jié)合劑可以包括淀粉和明膠，而潤(rùn)滑劑(如果存在的話)將通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。如果希望的話，可以將片劑用一種材料(例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)進(jìn)行包衣，以延遲在胃腸道中的吸收。取決于希望局部還是系統(tǒng)性治療以及取決于有待治療的區(qū)域，可以將本發(fā)明的藥物組合物按許多方式給予。給予可以是局部的；肺的，例如通過(guò)吸入或吹入粉劑或氣溶膠，包括通過(guò)噴霧器；氣管內(nèi)的；鼻內(nèi)的；表皮的和經(jīng)皮的；口服的或腸胃外的。腸胃外給予包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)(例如，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)、鞘內(nèi)或腦室內(nèi))給予。組合物可以按這樣的方式遞送以靶向特定組織，例如肝臟(如肝臟的肝細(xì)胞)。藥物組合物可以通過(guò)直接注射到腦中來(lái)遞送。注射可以通過(guò)立體定位注射到腦的特定區(qū)域(例如黑質(zhì)、皮質(zhì)、海馬體、紋狀體或蒼白球)，或dsrna可以遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個(gè)區(qū)域(例如進(jìn)入多個(gè)腦區(qū)域、和/或進(jìn)入脊髓)。dsrna還可以遞送到腦的彌漫區(qū)(例如，彌漫遞送到腦的皮層)。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向ttr的dsrna可以經(jīng)由插管或其他遞送裝置遞送，該遞送裝置有一端被植入組織，例如腦(例如大腦的黑質(zhì)、皮質(zhì)、海馬體、紋狀體、胼胝體或蒼白球)?？梢詫⒉骞苓B接到dsrna組合物的貯液器。流動(dòng)或遞送可以通過(guò)泵介導(dǎo)，例如滲透泵或微型泵(例如阿爾澤特(alzet)泵)(杜瑞科公司(durect)，丘珀蒂諾市(cupertino)，加利福尼亞州(ca))。在一個(gè)實(shí)施例中，將泵和貯液器植入遠(yuǎn)離組織的區(qū)域(例如腹部)，并且通過(guò)從泵或貯液器通向釋放部位的導(dǎo)管來(lái)實(shí)現(xiàn)遞送。將dsrna組合物輸注到腦中可以在幾小時(shí)內(nèi)或持續(xù)幾天，例如，持續(xù)1天、2天、3天、5天或7天或更長(zhǎng)時(shí)間。用于遞送至腦的裝置描述于例如美國(guó)專利號(hào)6,093,180和5,814,014中。劑量和時(shí)間本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，某些因素可以影響有效治療受試者所需的劑量和時(shí)間，這些因素包括(但不限于)疾病或失調(diào)的嚴(yán)重性、先前的治療、該受試者的總體健康和/或年齡、以及其他存在的疾病。此外，用治療有效量的組合物治療受試者可以包括單一治療或者一系列治療。如本文的其他地方所描述，使用常規(guī)方法或基于使用適當(dāng)動(dòng)物模型的體內(nèi)測(cè)試，可以評(píng)估由本發(fā)明涵蓋的ttr抑制組合物的有效劑量和體內(nèi)半衰期。通常，ttr抑制組合物的藥物組合物的合適劑量將處于0.01毫克至200.0毫克/受體千克體重/日的范圍內(nèi)，通常處于1mg至50mg/千克體重/日的范圍內(nèi)。例如、ttr抑制組合物可以是sirna，并且能以0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.628mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg每單個(gè)劑量進(jìn)行給予。在另一個(gè)實(shí)施例中，該劑量在0.15mg/kg和0.3mg/kg之間。例如，ttr抑制組合物能以0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg或0.3mg/kg的劑量給予。在一個(gè)實(shí)施例中，ttr抑制組合物以0.3mg/kg的劑量給予。。藥物組合物(例如帕提斯然)可以每天給予一次，或每5天、10天、15天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天給予一次或兩次。例如使用經(jīng)幾天的時(shí)間提供持續(xù)的ttr抑制組合物釋放的常規(guī)持續(xù)釋放配制品，可以將劑量單位復(fù)配用于在幾天內(nèi)遞送。持續(xù)釋放配制品是本領(lǐng)域中熟知的并且對(duì)于在特定位點(diǎn)遞送藥劑是特別有用的，由此可以與本發(fā)明的藥劑一起使用。在一個(gè)實(shí)施例中，該ttr抑制組合物是帕提斯然，且劑量為0.3mg/kg，并且其中該劑量每21天給予一次。在另一個(gè)實(shí)施例中，有效量為0.3mg/kg，并且有效量經(jīng)由70分鐘輸注(以1ml/min持續(xù)15分鐘，接著以3ml/min持續(xù)55分鐘)，每21天給予一次。在另一個(gè)實(shí)施例中，有效量為0.3mg/kg，并且有效量經(jīng)由60分鐘輸注(3.3ml/min)或經(jīng)由70分鐘輸注(以1.1ml/min持續(xù)15分鐘，接著以3.3ml/min持續(xù)55分鐘)，每21-28天給予兩個(gè)劑量?？梢酝ㄟ^(guò)以下方式調(diào)節(jié)ttr抑制組合物的劑量用于治療增加的nis或fap：給予ttr抑制組合物并確定受試者的ttr蛋白水平。如果ttr蛋白水平大于50μg/ml，則隨后向受試者給予的ttr抑制組合物的量增加，并且如果ttr蛋白水平低于50μg/ml，則隨后向受試者給予的ttr抑制組合物的量減少。ttr抑制組合物可以與其他已知的、有效治療由靶基因表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程的藥劑組合來(lái)進(jìn)行給予。在一個(gè)實(shí)施例中，帕提斯然與四聚體穩(wěn)定劑(例如如氯苯唑酸或二氟尼柳)一起給予。在任何情況下，基于使用本領(lǐng)域已知或本文描述的標(biāo)準(zhǔn)功效測(cè)量所觀察到的結(jié)果，給藥醫(yī)師可以調(diào)整帕提斯然和/或四聚體穩(wěn)定劑給予的量和時(shí)間。實(shí)例下面是用于實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施例的實(shí)例。所提供的實(shí)例僅用于說(shuō)明性目的，并非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。就使用的數(shù)字(例如量、溫度等)而言，已努力確保其精確度，但仍應(yīng)一定允許有一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)踐將使用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、重組dna技術(shù)和藥理學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已充分解釋。參見(jiàn)例如：克賴頓(t.e.creighton)，蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)和分子特性(proteins:structuresandmolecularproperties)(弗里曼與康帕尼公司(w.h.freemanandcompany)，1993)；萊寧(a.l.lehninger)，生物化學(xué)(biochemistry)(價(jià)值出版商公司(worthpublishers,inc.)最新版)；桑布魯克(sambrook)等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(molecularcloning:alaboratorymanual)(1989年第2版)；酶學(xué)方法(methodsinenzymology)(科威克(s.colowick)和卡普蘭(n.kaplan)編輯，學(xué)術(shù)出版公司(academicpress,inc.))；雷明頓的制藥科學(xué)(remington'spharmaceuticalsciences)，第18版，(賓夕法尼亞州伊斯頓市麥克出版公司(easton,pennsylvania:mackpublishingcompany)，1990)；卡蕾(carey)和松德貝里(sundberg)，高等有機(jī)化學(xué)(advancedorganicchemistry)第3版(普萊納姆出版社(plenumpress))，卷a和卷b(1992)。實(shí)例1：帕提斯然治療ttr淀粉樣變性的安全性和功效在臨床i期試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)帕提斯然在28天的時(shí)間內(nèi)降低了患者的ttr水平。該研究的結(jié)果發(fā)表在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)(科埃略(coelho)等人，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(nengljmed)，2013；369：819-29)中。該出版物出于所有目的通過(guò)引用結(jié)合。研究設(shè)計(jì)和結(jié)果的總結(jié)提供如下。該試驗(yàn)是多中心的、隨機(jī)的、單盲的、安慰劑對(duì)照的和有劑量范圍的試驗(yàn)，用來(lái)評(píng)價(jià)單個(gè)劑量的帕提斯然在ttr淀粉樣變性患者或健康成人中的安全性和功效。對(duì)于年齡在18-45歲之間的男性和女性，如果他們是健康的(根據(jù)病史、體格檢查和12導(dǎo)聯(lián)心電圖確定)，bmi為18.0-31.5，具有適當(dāng)?shù)母喂δ芎脱?xì)胞計(jì)數(shù)，并且沒(méi)有分娩可能性，則有資格參加該試驗(yàn)。參與者系列(每個(gè)系列四個(gè)參與者)被隨機(jī)分配為以3:1的比例接受0.01-0.5mg/kg劑量的帕提斯然或安慰劑(生理鹽水)。分別在15分鐘和60分鐘的時(shí)間內(nèi)靜脈內(nèi)給予帕提斯然。在試驗(yàn)中，患者在輸注前一天晚上和當(dāng)天接受類似的前藥以降低輸注相關(guān)反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。這些藥物包括：地塞米松、醋氨酚、苯海拉明或西替利嗪和雷尼替丁。使用驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)對(duì)總ttr(查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(charlesriverlaboratories)，馬薩諸塞州威爾明頓(wilmingtonma))，通過(guò)血清ttr水平反映測(cè)定帕提斯然藥效學(xué)活性。將每個(gè)患者的ttr、視黃醇結(jié)合蛋白和維生素a的基線水平定義為在給予帕提斯然之前的四次測(cè)量的平均值。從藥物給予開(kāi)始到第28天監(jiān)測(cè)不良事件。安全監(jiān)測(cè)還包括血液學(xué)評(píng)價(jià)、血液化學(xué)分析和甲狀腺功能測(cè)試。憑借經(jīng)驗(yàn)證的基于elisa的雜交測(cè)定來(lái)評(píng)估帕提斯然中包含的ttrsirna的血漿藥物代謝動(dòng)力學(xué)。對(duì)于sirna的檢測(cè)和定量，使用atto-探針-hplc測(cè)定(定量下限，每毫升1.0ng)(坦德姆實(shí)驗(yàn)室(tandemlaboratories)，猶他州鹽湖城(saltlakecityut))。使用溫諾林(winnonlin)(法賽特公司(pharsight)，新澤西州普林斯頓(princetonnj))來(lái)確定藥物代謝動(dòng)力學(xué)估算值。與基線水平相比，測(cè)量到ttr、維生素a和視黃醇結(jié)合蛋白的敲低。(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果在兩個(gè)最低劑量的帕提斯然中沒(méi)有觀察到ttr水平(與安慰劑相比)的顯著變化。然而，在接受0.15-0.5mg/kg劑量的所有參與者中觀察到實(shí)質(zhì)的ttr敲低(數(shù)據(jù)未顯示)。與直到第28天使用安慰劑(p<0.001)相比，ttr敲低在所有三個(gè)劑量水平上都是快速、有效和持久的，并且具有高度顯著的變化。鑒于在0.15和0.3mg/kg下觀察到的強(qiáng)烈響應(yīng)和在0.5mg/kg下響應(yīng)的適度增加性改善，僅一個(gè)參與者接受了0.5mg/kg的劑量。特別是在至少0.3mg/kg的劑量下，在響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)中參與者之間幾乎沒(méi)有變異性(數(shù)據(jù)未顯示)，其中在第3天超過(guò)50％降低，在大約第10天達(dá)到最低值水平，并且在第28天持續(xù)抑制超過(guò)50％，以及在第70天發(fā)生完全恢復(fù)。接受0.15mg/kg、0.3mg/kg和0.5mg/kg的參與者的ttr敲低的最大值分別為85.7％、87.6％和93.8％。在0.15mg/kg和0.3mg/kg劑量的平均最低值分別為82.3％(95％置信區(qū)間(ci)，67.7-90.3)和86.8％(95％ci，83.8-89.3)；當(dāng)作為絕對(duì)ttr水平或ttr敲低百分比分析時(shí)，這些最低值在參與者之間顯示出很小的變異性，并且與安慰劑相比高度顯著(p<0.001)(數(shù)據(jù)未顯示)。敲低程度似乎確定抑制的持續(xù)時(shí)間，對(duì)于接受0.15mg/kg和0.3mg/kg的參與者在第28天分別平均減少56.6％(95％ci，11.6-78.7)和67.1％(95％ci，45.5-80.1)，并且對(duì)于接受0.5mg/kg的單個(gè)患者在第28天減少76.8％。在0.3mg/kg的劑量下，在人類中觀察到的ttr敲低與在相同劑量水平下在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中觀察到的ttr敲低實(shí)際上相同(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)帕提斯然的這些ttr減少與視黃醇結(jié)合蛋白和維生素a水平的變化相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。使用帕提斯然沒(méi)有導(dǎo)致血液學(xué)、肝臟或腎臟測(cè)量或甲狀腺功能的任何顯著變化，并且由于不良事件，沒(méi)有藥物相關(guān)的嚴(yán)重不良事件或任何研究藥物中止(數(shù)據(jù)未顯示)。帕提斯然的血漿藥物代謝動(dòng)力學(xué)曲線顯示：在測(cè)試的劑量范圍內(nèi)，ttrsirna直到最后一天的血漿峰濃度和曲線下面積的值以與劑量近似成比例的方式增加(數(shù)據(jù)未顯示)。帕提斯然的特異性為了進(jìn)一步證明帕提斯然作用的特異性，還在aln-pcs的1期試驗(yàn)中在一組健康志愿者中測(cè)量ttr，該aln-pcs含有靶向pcsk9(膽固醇降低的靶標(biāo))的sirna，該sirna配制于用于帕提斯然的相同類型的脂質(zhì)納米顆粒中。單劑量的0.4mg/kgaln-pcs(所謂的對(duì)照sirna)對(duì)ttr沒(méi)有作用(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明帕提斯然對(duì)ttr的作用是由于sirna的特異性靶向而不是脂質(zhì)納米顆粒配制品的非特異性作用。使用從接受0.3mg/kg劑量的參與者獲得的血液樣品上的5'race(互補(bǔ)dna末端的快速擴(kuò)增)試驗(yàn)獲得支持帕提斯然的藥效學(xué)作用的特異性和作用機(jī)制的另外的證據(jù)，以便檢測(cè)在循環(huán)細(xì)胞外rna中的預(yù)測(cè)的ttrmrna切割產(chǎn)物。為了收集血液樣品，在以1200xg離心凝固的血液樣品(取自給藥前和給藥后24小時(shí)的受試者)20分鐘之后收集血清。將血清在1200xg下第二次離心10分鐘以除去漂浮的細(xì)胞材料，然后冷凍。將解凍的血清與氯化鋰(最終濃度1m)混合，并且在4℃下孵育1小時(shí)。將樣品以120,000xg在4℃下旋轉(zhuǎn)2小時(shí)以沉淀rna，并且通過(guò)試劑盒(trizol)提取(生命技術(shù)公司(lifetechnologies)，美國(guó)紐約州格蘭德艾蘭市(grandisland，newyork，usa))和異丙醇沉降來(lái)從沉淀中分離總rna。為了檢測(cè)ttrsirna介導(dǎo)的切割產(chǎn)物，使用基因瑞思(generacer)試劑盒(生命技術(shù)公司(lifetechnologies))將分離的rna用于連接介導(dǎo)的racepcr。將rna連接到基因瑞思銜接子上，并且使用ttr特異性反向引物(5'-aatcaagttaaagtggaatgaaaagtgcctttcacag-3')(seqidno:3)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后使用與銜接子互補(bǔ)的基因瑞思gr5'正向引物和ttr特異性反向引物(5'-gcctttcacaggaatgttttattgtctctg-3')(seqidno:4)進(jìn)行2輪pcr。使用gr5'巢式引物和ttr特異性反向巢式引物(5'-ctctgcctggacttctaacatagcatatgaggtg-3')(seqidno:5)進(jìn)行巢式pcr。使用topo-平端(blunt)載體(生命技術(shù)公司(lifetechnologies))克隆pcr產(chǎn)物。使用m13正向和反向引物通過(guò)菌落pcr擴(kuò)增克隆的插入片段。在馬克羅根(macrogen)測(cè)序設(shè)備中用t7啟動(dòng)子引物對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序。使用軟件(clc工作臺(tái)(workbench))將來(lái)自96個(gè)克隆的序列與人ttr進(jìn)行比對(duì)。在給藥前的樣品和藥物給予后24小時(shí)獲得的樣品中都檢測(cè)到ttrmrna。與rnai機(jī)制一致，在所有三個(gè)參與者中，預(yù)測(cè)的mrna切割產(chǎn)物在給藥前的樣品中不存在，并且在給藥后樣品中存在(數(shù)據(jù)未顯示)。用于定量人血清中野生型和突變型ttr的lc/ms/ms測(cè)定是合格的，并且由坦德姆實(shí)驗(yàn)室(tandemlabs)進(jìn)行。在通過(guò)lc/ms/ms分析之前，使用胰凝乳蛋白酶消化血清樣品，然后通過(guò)蛋白質(zhì)沉淀提取進(jìn)行處理。根據(jù)它們獨(dú)特的具體質(zhì)/荷比轉(zhuǎn)換，監(jiān)測(cè)代表野生型ttr的胰凝乳蛋白酶肽ttrw-1和代表突變體v30m的v30m-1。使用采用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的肽(ttrw-1-d8和v30m-1-d8)獲得的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，來(lái)用于計(jì)算人血清樣品中的內(nèi)源肽片段(ttrw-1和v30m-1)。使用1/x2加權(quán)最小二乘回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)物的峰面積比(即ttrw-1-d8比內(nèi)標(biāo)ttrw-l1-d16以及v30m-1-d8比v30m-l1-d16)被用來(lái)產(chǎn)生線性校準(zhǔn)曲線。合格的lc/ms/ms方法實(shí)現(xiàn)了5ng/ml的下限定量(lloq)，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為從5至2500ng/ml。實(shí)例2：多劑量研究帕提斯然(patisiran)治療對(duì)家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病的安全性和功效在該臨床ii期試驗(yàn)中，向患有ttr介導(dǎo)的fap的患者給予多劑量的帕提斯然，以便評(píng)價(jià)在這些患者中帕提斯然的多次遞增靜脈內(nèi)劑量的安全性、耐受性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。這些數(shù)據(jù)在2013年11月舉行的家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變國(guó)際研討會(huì)(isfap)上提出。合格的患者是成人(≥18歲)，具有活組織檢查證實(shí)的attr淀粉樣變性和輕度至中度神經(jīng)病變；卡諾夫斯庫(kù)機(jī)能狀態(tài)量表評(píng)分(karnofskyperformancestatus，kps)≥60％；體重指數(shù)(bmi)為17-33kg/m2；適當(dāng)?shù)母文I功能(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ast)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)≤2.5×正常上限(uln)、總膽紅素在正常限度內(nèi)、白蛋白>3g/dl、且國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率(inr)≤1.2；血清肌酸酐≤1.5uln)；以及乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒為血清陰性。如果患者有下列情況，則將該患者排除：接受過(guò)肝移植；在研究期間計(jì)劃進(jìn)行手術(shù)；hiv陽(yáng)性；在30天內(nèi)已經(jīng)接受了除氯苯唑酸或二氟尼柳以外的研究藥物；紐約心臟協(xié)會(huì)心力衰竭分類>2；懷孕或哺乳；已知或懷疑有全身性細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)或真菌感染；具有不穩(wěn)定的心絞痛、不受控制的臨床顯著心律失常；或先前對(duì)脂質(zhì)體產(chǎn)物具有嚴(yán)重反應(yīng)或已知對(duì)寡核苷酸過(guò)敏。這是一項(xiàng)在患有fap患者中的帕提斯然的多中心、國(guó)際化、開(kāi)放標(biāo)簽、多劑量遞增ii期研究。3名患者的組群接受了兩個(gè)劑量的帕提斯然，其中每一個(gè)劑量都是靜脈內(nèi)(iv)輸注給予。組群1-3每四周(q4w)分別接受兩個(gè)劑量的帕提斯然0.01mg/kg、0.05mg/kg和0.15mg/kg；組群4和5都接受兩個(gè)劑量的帕提斯然0.3mg/kgq4w。組群6-9中的所有患者每三周(q3w)接受0.3mg/kg的兩個(gè)劑量的帕提斯然給予。所有患者在每次帕提斯然輸注之前接受前藥以降低輸注相關(guān)反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，該前藥由地塞米松、對(duì)撲熱息痛(醋氨酚)、h2阻滯劑(例如雷尼替丁或法莫替丁)和h1阻滯劑(例如西替利嗪、羥嗪或非索非那定)組成。使用微劑量方案(1.1ml/min持續(xù)15分鐘，接著剩余劑量為3.3ml/min)，以3.3ml/min經(jīng)60分鐘或經(jīng)70分鐘iv給予帕提斯然。使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)評(píng)估所有患者的總ttr蛋白的血清水平。另外，使用專有質(zhì)譜方法(查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(charlesriverlaboratories)，加拿大魁北克省(quebec，canada))，在患有val30met突變的患者的血清中單獨(dú)并且明確地測(cè)量野生型和突變型ttr蛋白。在篩選時(shí)和在隨訪的第0天、第1天、第2天、第7天、第10天、第14天、第21天、第22天、第23天(僅q3w)；第28天、第29天(僅q4w)；第30天(僅q4w)；第31天(僅q3w)；第35天、第38天(僅q4w)及第42天、第49天、第56天、第112天及第208天收集血清樣品?；谠诘?天和在以下時(shí)間點(diǎn)收集的血液樣品，為ttrsirna創(chuàng)建血漿濃度-時(shí)間曲線：給藥前(在計(jì)劃給藥開(kāi)始的1小時(shí)內(nèi))，在輸注結(jié)束時(shí)(eoi)，在輸注后5、10和30分鐘以及在1、2、4、6、24、48、168、336、504(第21天，僅q3w方案)和672(第28天，僅q4w方案)小時(shí)。在q4w方案的第84天和第180天以及在q3w方案的第35天、第91天和第187天收集另外的樣品。對(duì)于組群3-9，也分析了在eoi的第0天和輸注后2小時(shí)的血液樣品中游離和封裝的ttrsirna。使用驗(yàn)證的atto-探針高效液相色譜(hplc)測(cè)定(美國(guó)猶他州鹽湖城坦德姆實(shí)驗(yàn)室(tandemlaboratories，saltlakecity，utah，usa))分析血清ttrsirna。使用驗(yàn)證的軟件程序溫諾林使用非區(qū)劃和/或區(qū)劃評(píng)價(jià)ttrsirna血漿濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行pk分析以便確定pk參數(shù)估計(jì)。分析尿樣品中排泄的ttrsirna的水平，并且在給藥后測(cè)量腎清除率(clr)。在對(duì)總ttr特異的相同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)hplc和濁度測(cè)定法分別測(cè)量維生素a和視黃醇結(jié)合蛋白(rbp)的血清水平(百奧明專業(yè)醫(yī)學(xué)病理學(xué)(biominsspecializedmedicalpathology)，法國(guó)里昂市(lyon，france))。對(duì)于pp群體計(jì)算從基線的ttr敲低的平均值和方差，其中基線定義為所有給藥前值的平均值。將方差分析(anova)和協(xié)方差分析(ancova)用于分析pd數(shù)據(jù)(相對(duì)于基線的自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的ttr)，其中(劑量水平之間的)單獨(dú)成對(duì)比較使用圖基(tukey)事后檢驗(yàn)法。最低ttr水平定義為在每個(gè)劑量給予(第一劑量、第二劑量時(shí)期：q4w組和q3w組分別為第1-28、29-56天和第1-21、22-42天)后在28天的時(shí)期期間(q3w組的21天期間)每個(gè)患者的最低水平。經(jīng)由線性回歸探索ttr和rbp或維生素a之間相對(duì)于基線的關(guān)系以及野生型和v30mttr水平之間的關(guān)系。使用能力模型分析評(píng)估了帕提斯然組分在pk參數(shù)中的劑量比例性。使用監(jiān)管活動(dòng)醫(yī)學(xué)詞典(meddra)編碼系統(tǒng)(版本15.0)對(duì)ae進(jìn)行編碼，并且為ae、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)、生命體征數(shù)據(jù)和ecg區(qū)間數(shù)據(jù)提供描述性統(tǒng)計(jì)。使用版本9.3或更高版本的sas軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。功效和藥效學(xué)：平均(sd)基線血清ttr蛋白水平在以下劑量組群中相似：對(duì)于0.01、0.05、0.15、0.3mg/kgq4w劑量組和0.3mg/kgq3w劑量組分別為272.9(98.86)、226.5(12.67)、276.1(7.65)、242.6(38.30)和235.5(44.45)μg/ml。與0.01mg/kg劑量組群相比，在0.3mg/kg的q4w和q3w組群中在帕提斯然的第一和第二劑量后觀察到ttr顯著降低(在ancova后的事后檢驗(yàn)，p<0.001)(數(shù)據(jù)未顯示)。在具有val30met突變的患者中，觀察到野生型和突變型ttr具有非常相似的敲低程度(數(shù)據(jù)未顯示)。血清ttr敲低的水平與rbp(r2＝0.89，p<10-15)和維生素a(r2＝0.90，p<10-15)的循環(huán)水平的降低高度相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。盡管與未采取穩(wěn)定劑治療的患者相比，服用氯苯唑酸和二氟尼柳的患者具有顯著增加的血清ttr基線水平(通過(guò)anova，p<0.001)(數(shù)據(jù)未顯示)，帕提斯然給予導(dǎo)致這兩個(gè)患者組中類似程度的ttr敲低(數(shù)據(jù)未顯示)。藥物代謝動(dòng)力學(xué)：在eoi后，帕提斯然ttrsirna組分的平均濃度降低(數(shù)據(jù)未顯示)，并且在第21/28天第二次給藥后沒(méi)有sirna積累。每個(gè)劑量后ttrsirna的包封與未包封濃度的測(cè)量表明循環(huán)lnp配制品的穩(wěn)定性。對(duì)于第一和第二劑量?jī)烧撸瑥牧愕阶詈罂蓽y(cè)量時(shí)間點(diǎn)(auc0-last)的最大血漿濃度(cmax)和血漿濃度-時(shí)間曲線下面積的平均值，在測(cè)試的劑量范圍內(nèi)以與劑量成比例的方式增加。劑量1和劑量2之后的cmax和auc0-last具有可比性而沒(méi)有積累。在第0天和第21/28天，帕提斯然的中值終末半衰期為39-59小時(shí)(在劑量>0.01mg/kg時(shí))，并且當(dāng)比較每個(gè)劑量組群的劑量1和劑量2時(shí)其相對(duì)不變。這些ii期數(shù)據(jù)表明：用帕提斯然治療患有fap的患者導(dǎo)致強(qiáng)健的、劑量依賴性的和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的血清ttr蛋白水平的敲低。使用兩個(gè)連續(xù)劑量的帕提斯然(每3-4周給藥0.3mg/kg)達(dá)到了ttr平均持續(xù)降低>80％，并且在q3w組中達(dá)到96％的最大敲低。這些敲低率與在單次遞增劑量、安慰劑對(duì)照的1期帕提斯然研究中觀察到的速率一致(科爾賀(coelho)等人，2013a)。來(lái)自其他系統(tǒng)性淀粉樣變性疾病的證據(jù)表明，致病蛋白質(zhì)減少至僅僅50％可以導(dǎo)致臨床疾病改善或穩(wěn)定(拉赫曼(lachmann)等人，2003；拉赫曼(lachmann)等人，2007)。使用帕提斯然的ttr敲低的程度不受服用氯苯唑酸和二氟尼柳的患者的影響，表明這些ttr穩(wěn)定劑藥物不干擾帕提斯然的藥理學(xué)活性。在具有val30met突變的患者中，帕提斯然抑制了突變型和野生型ttr兩者的產(chǎn)生；后者在患有晚發(fā)性fap患者肝移植后保持成淀粉樣蛋白(矢崎(yazaki)等人，2003；列尼克(liepnieks)等人，2010)。實(shí)例3：通過(guò)給予帕提斯然減少如通過(guò)nis和mnis+7測(cè)量的神經(jīng)損傷使用實(shí)例2中所述的方案，對(duì)fap患者已經(jīng)并且正在進(jìn)行開(kāi)放標(biāo)記延伸研究。給予帕提斯然導(dǎo)致nis和mnis+7兩者的降低。先前在2期試驗(yàn)中給藥的fap患者有資格進(jìn)行2期ole研究。已經(jīng)并且正在進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)2年的給藥，每3周給予0.30mg/kg，其中每6個(gè)月評(píng)估臨床終點(diǎn)。研究目標(biāo)包括：對(duì)神經(jīng)損傷(mnis+7和nis)、生活質(zhì)量、mbmi、失能、運(yùn)動(dòng)、握力、自主癥狀、皮膚活組織檢查的神經(jīng)纖維密度、心臟受累(心臟亞組)和血清ttr水平的影響?；颊呷丝诮y(tǒng)計(jì)學(xué)如下所示?；€特征包括以下：特征n平均值(范圍)mnis+7a(最大損傷：304)2752.9(2.0-122.5)nis(最大損傷：244)2734.8(4.0-93.4)如下表所示，給予帕提斯然導(dǎo)致血清ttr水平降低。帕提斯然達(dá)到大約80％的持續(xù)血清ttr降低，在劑量之間進(jìn)一步達(dá)到88％的最低值。天數(shù)n平均％敲低12521.432546.872571.1172477.8842678.11682780.51822787.72312582.42342487.02382488.12482586.027322+80.73572281.33711887.1462379.2如下表所示，給予帕提斯然導(dǎo)致如在6個(gè)月和12個(gè)月測(cè)量的mnis+7的變化。如下表所示，給予帕提斯然導(dǎo)致在6個(gè)月和12個(gè)月的nis的變化。如圖1和圖2所示，經(jīng)由線性回歸來(lái)探索δnis或δmnis+7的進(jìn)展與ttr濃度之間的關(guān)系。ttr和平均給藥前低谷期[ttr]與在6個(gè)月的mnis+7的變化相關(guān)。在0、6和12個(gè)月測(cè)量nis和mnis+7。δnis或δmnis+7從0至6個(gè)月和從0至12個(gè)月被用作響應(yīng)變量。預(yù)測(cè)變量包括ttr濃度的兩種不同測(cè)量：ttr蛋白質(zhì)濃度曲線下面積(“auc”)，以及在第84和168天(用于0-6個(gè)月的比較)和第84、168、273和357天(用于0-12個(gè)月的比較)相對(duì)于基線的平均敲低百分比。對(duì)于兩種ttr測(cè)量，“基線”定義為所有給藥前值的平均值。使用原始ttr濃度(μg/ml)和梯形法，從基線值(在第0天插入)開(kāi)始并且延伸至第182天(用于0-6個(gè)月的比較)或第357天(用于0-12個(gè)月的比較)來(lái)計(jì)算ttrauc。在每個(gè)安排的時(shí)間點(diǎn)計(jì)算相對(duì)于基線的敲低百分比。進(jìn)行了線性回歸分析，并且報(bào)告了與零假設(shè)(在預(yù)測(cè)變量和響應(yīng)變量之間不存在關(guān)聯(lián))相關(guān)聯(lián)的p值。在具有相似基線nis的患者群體中，在12個(gè)月時(shí)mnis+7和nis的平均變化分別為-2.5和0.4分，與來(lái)自先前fap研究的在12個(gè)月估計(jì)的mnis+7和nis的快速增加(例如，10-18分的增加)相比是有利的。帕提斯然對(duì)神經(jīng)病變損傷評(píng)分進(jìn)展的有利影響與ttr降低的程度相關(guān)。這表明，通過(guò)帕提斯然對(duì)血清ttr負(fù)荷的降低給fap患者帶來(lái)臨床益處。盡管已經(jīng)參考優(yōu)選實(shí)施例和各種替代實(shí)施例具體示出和描述了本發(fā)明，但是相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，可以在形式和細(xì)節(jié)上進(jìn)行各種改變而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。出于所有目的，在本說(shuō)明書(shū)的正文中引用的所有參考文獻(xiàn)、發(fā)布的專利和專利申請(qǐng)通過(guò)引用以其整體特此結(jié)合。當(dāng)前第1頁(yè)12