本發(fā)明涉及半胱胺及其衍生物在治療和/或預防由酵母菌和/或霉菌引起的感染中的用途。

發(fā)明背景

在一般群體和具有絕大多數(shù)由曲霉菌屬(Aspergillus species)和念珠菌屬(Candida species)引起的感染的免疫抑制患者中，侵襲性真菌感染的頻率在過去二十年中持續(xù)提高(Pasqualotto，A.C.和Denning，D.W.(2005)Diagnosis of Invasive Fungal Infections–Current Limitations of Classical and New Diagnostic Methods.Euro Oncol Rev)。這些感染具有高死亡率，并且對醫(yī)療保健系統(tǒng)造成沉重負擔。仍然迫切需要更有效的和更安全的用來治療和預防由酵母菌和霉菌(包括例如念珠菌屬(Candida spp.)或曲霉菌屬(Aspergillus spp.))引起的感染的治療劑。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于治療或預防由酵母菌和/或霉菌引起的感染的半胱胺或其衍生物(或包含半胱胺和/或其衍生物的組合物)。

本發(fā)明是基于以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：半胱胺和/或其衍生物在治療或預防酵母菌和霉菌感染，合適地為真菌感染，如曲霉菌和/或念珠菌感染中具有特別的用途。

合適地，感染可以是真菌感染或由真菌感染引起的疾病，例如念珠菌感染和/或曲霉菌感染。合適地，感染可以由酵母菌和/或霉菌引起。合適地，感染可以是由以下中的一種或多種引起的感染：念珠菌屬(例如白色念珠菌(C.albicans))，表皮癬菌屬(Epidermophyton spp.)，外瓶柄霉菌屬(Exophiala spp.)，小孢霉屬(Microsporum spp.)，發(fā)癬菌屬(Trichophyton spp.)(例如紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)和趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale))，癬屬(Tinea spp.)，曲霉菌屬(Aspergillus spp.)，芽生菌屬(Blastomyces spp.)，芽生裂殖菌屬(Blastoschizomyces spp.)，球孢子菌屬(Coccidioides spp.)，隱球菌屬(Cryptococcus spp.)(例如新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，組織胞漿菌屬(Histoplasma spp.)，副球孢子菌屬(Paracoccidiomyces spp.)，孢子絲菌屬(Sporotrix spp.)，犁頭霉屬(Absidia spp.)，支孢霉屬(Cladophialophora spp.)，產(chǎn)色芽生菌屬(Fonsecaea spp.)，瓶霉菌屬(Phialophora spp.)，Lacazia屬，爪甲白癬菌屬(Arthrographis spp.)，支頂孢菌屬(Acremonium spp.)，馬都拉放線菌屬(Actinomadura spp.)，鱗質霉屬(Apophysomyces spp.)，伊蒙菌屬(Emmonsia spp.)，團擔子菌屬(Basidiobolus spp.)，白僵菌屬(Beauveria spp.)，金孢子菌屬(Chrysosporium spp.)，耳霉屬(Conidiobolus spp.)，小克銀漢霉屬(Cunninghamella spp.)，鐮刀菌屬(Fusarium spp.)，地霉屬(Geotrichum spp.)，粘束孢屬(Graphium spp.)，小球腔菌屬(Leptosphaeria spp.)，馬拉塞霉菌屬(Malassezia spp.)(例如糠秕馬拉塞霉菌(Malassezia furfur))，毛霉菌屬(Mucor spp.)，新龜甲屬(Neotestudina spp.)，諾卡爾菌屬(Nocardia spp.)，諾卡爾土壤菌屬(Nocardiopsis spp.)，擬青霉屬(Paecilomyces spp.)，莖點霉屬(Phoma spp.)，毛孢子菌屬(Piedraia spp.)，肺孢子蟲屬(Pneumocystis spp.)，偽霉樣真菌屬(Pseudallescheria spp.)，核菌屬(Pyrenochaeta spp)，根毛霉屬(Rhizomucor spp.)，根霉屬(Rhizopus spp.)，紅酵母屬(Rhodotorula spp.)，酵母菌屬(Saccharomyces spp.)，足放線病菌屬(Scedosporium spp.)，帚霉屬(Scopulariopsis spp.)，擲孢酵母屬(Sporobolomyces spp.)，共頭霉屬(Syncephalastrum spp.)，木霉屬(Trichoderma spp.)，毛孢子菌屬(Trichosporon spp.)，單格孢屬(Ulocladium spp.)，黑粉菌屬(Ustilago spp.)，輪枝孢菌屬(Verticillium spp.)，萬吉拉菌屬(Wangiella spp.)。

合適地，感染可由念珠菌屬(例如白色念珠菌)引起。

合適地，感染可以由曲霉屬(例如煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus))引起。

合適地，感染可以由外瓶柄霉菌屬(例如皮炎外瓶霉(Exophiala dermatitidis))引起。

合適地，感染可以由隱球菌屬引起。

另一方面，本發(fā)明提供了半胱胺或其衍生物或包含半胱胺和/或其衍生物的藥物組合物，其用于預防或治療以下中的任意一種或多種：念珠菌病(包括OPC)，囊胞性纖維癥，曲霉菌病(包括支氣管肺曲霉菌病，慢性肺曲霉菌病和曲霉病)，足癬；蛙糞霉病(basidiodiabolomycosis)；芽生菌??；球孢子菌病，隱球菌病(cryptoccocis)，慢性阻塞性肺疾病(COPD)；基底腦膜炎(basal meningitis)；皮膚真菌??；甲真菌病(onchomycosis)；皮霉癬菌病(dermatophytids)；毛內癬菌病(endothrix)；毛外癬菌病(exothrix)；真菌性腦膜炎，真菌血癥，肺氣腫(heaves)；組織胞漿菌病，霉菌病，肉芽霉病(myrinogmycosis)，副球孢子菌病(paracoccidioidomycosis)，青霉病，毛孢子菌病(piedra)，肺孢子菌肺炎(pneumocytosis pneumonia)，孢子絲菌病(sporptrichosis)，癬，zeospora和接合菌病。COPD包括肺部疾病，肺部疾病包括慢性支氣管炎，肺氣腫和慢性阻塞性氣道疾病。

合適地，該組合物可以是包含藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。

合適地，該組合物可以進一步包含抗生素或抗真菌劑。合適地，抗生素可以選自：妥布霉素、粘菌素、慶大霉素或環(huán)丙沙星。合適地，抗生素可以是妥布霉素?？拐婢鷦┛梢允欠颠?、伊曲康唑、卡泊芬凈和兩性霉素B中的一種或多種。

優(yōu)選地，組合物還包含抗真菌劑。優(yōu)選地，所述組合物還用于治療由外瓶柄霉菌屬引起的感染。

合適地，半胱胺可以與修飾肽組合使用。

如本文所用，術語“修飾肽”是指包含3至50個α，D和/或L氨基酸的肽，其中所述氨基酸主要是精氨酸，并且其中所述肽任選地還包含選自以下中的一種或多種的修飾：

1)組氨酸標簽的摻入；

2)脂質化；和

3)聚乙二醇化。

合適地，組氨酸標簽可以包含至少兩個組氨酸殘基。

在另外的或可選的方面中，本發(fā)明的任選的修飾肽可以是脂質化的肽，使得脂肪酸結合(conjugate)到肽。

合適地，脂肪酸可以是C₂至C₂₀脂肪酸。優(yōu)選地，脂肪酸可以是C₃至C₁₄。

在另一個另外的或可選的方面中，本發(fā)明的任選的修飾肽可以是聚乙二醇化的。

合適地，本發(fā)明的組合物還可以包含含有3-500個氨基酸的肽，其中氨基酸主要是精氨酸。

另一方面，本發(fā)明提供了治療或預防受試者的由酵母菌或霉菌引起的感染的方法，該方法包括給予藥學有效量的包含半胱胺或其衍生物的組合物。

合適地，感染可以由以下中的一種或多種引起：念珠菌屬(例如白色念珠菌)，曲霉菌屬(Aspergillus spp.)，表皮癬菌屬(Epidermophyton spp.)，外瓶柄霉菌屬(Exophiala spp.)，小孢霉屬(Microsporum spp.)，發(fā)癬菌屬(Trichophyton spp.)(例如紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)和趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale))，癬屬(Tinea spp.)，芽生菌屬(Blastomyces spp.)，芽生裂殖菌屬(Blastoschizomyces spp.)，球孢子菌屬(Coccidioides spp.)，隱球菌屬(Cryptococcus spp.)(例如新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，組織胞漿菌屬(Histoplasma spp.)，副球孢子菌屬(Paracoccidiomyces spp.)，孢子絲菌屬(Sporotrix spp.)，犁頭霉屬(Absidia spp.)，支孢霉屬(Cladophialophora spp.)，產(chǎn)色芽生菌屬(Fonsecaea spp.)，瓶霉菌屬(Phialophora spp.)，Lacazia屬，爪甲白癬菌屬(Arthrographis spp.)，支頂孢菌屬(Acremonium spp.)，馬都拉放線菌屬(Actinomadura spp.)，鱗質霉屬(Apophysomyces spp.)，伊蒙菌屬(Emmonsia spp.)，團擔子菌屬(Basidiobolus spp.)，白僵菌屬(Beauveria spp.)，金孢子菌屬(Chrysosporium spp.)，耳霉屬(Conidiobolus spp.)，小克銀漢霉屬(Cunninghamella spp.)，鐮刀菌屬(Fusarium spp.)，地霉屬(Geotrichum spp.)，粘束孢屬(Graphium spp.)，小球腔菌屬(Leptosphaeria spp.)，馬拉塞霉菌屬(Malassezia spp.)(例如糠秕馬拉塞霉菌(Malassezia furfur))，毛霉菌屬(Mucor spp.)，新龜甲屬(Neotestudina spp.)，諾卡爾菌屬(Nocardia spp.)，諾卡爾土壤菌屬(Nocardiopsis spp.)，擬青霉屬(Paecilomyces spp.)，莖點霉屬(Phoma spp.)，毛孢子菌屬(Piedraia spp.)，肺孢子蟲屬(Pneumocystis spp.)，偽霉樣真菌屬(Pseudallescheria spp.)，核菌屬(Pyrenochaeta spp)，根毛霉屬(Rhizomucor spp.)，根霉屬(Rhizopus spp.)，紅酵母屬(Rhodotorula spp.)，酵母菌屬(Saccharomyces spp.)，足放線病菌屬(Scedosporium spp.)，帚霉屬(Scopulariopsis spp.)，擲孢酵母屬(Sporobolomyces spp.)，共頭霉屬(Syncephalastrum spp.)，木霉屬(Trichoderma spp.)，毛孢子菌屬(Trichosporon spp.)，單格孢屬(Ulocladium spp.)，黑粉菌屬(Ustilago spp.)，輪枝孢菌屬(Verticillium spp.)，萬吉拉菌屬(Wangiella spp.)。

合適地，感染可由念珠菌屬或曲霉屬引起。

合適地，感染可以由外瓶柄霉菌屬引起。

另一方面，本發(fā)明提供了預防或治療患者的以下中的任意一種或多種的方法：念珠菌病(包括OPC)，囊胞性纖維癥，曲霉菌病(包括支氣管肺曲霉菌病，慢性肺曲霉菌病和曲霉病)，足癬；蛙糞霉病(basidiodiabolomycosis)；芽生菌病；球孢子菌病，COPD，隱球菌??；基底腦膜炎(basal meningitis)；皮膚真菌??；甲真菌病(onchomycosis)；皮霉癬菌病(dermatophytids)；毛內癬菌病(endothrix)；毛外癬菌病(exothrix)；真菌性腦膜炎，真菌血癥，肺氣腫(heaves)；組織胞漿菌病，霉菌病，肉芽霉病(myrinogmycosis)，副球孢子菌病(paracoccidioidomycosis)，青霉病，毛孢子菌病(piedra)，肺孢子菌肺炎(pneumocytosis pneumonia)，孢子絲菌病(sporptrichosis)，癬，zeospora和接合菌病，該方法包括給予患者包含藥學有效量的半胱胺或其衍生物的組合物。

合適地，本發(fā)明的組合物可以是包含藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。

合適地，本發(fā)明的組合物可以包含抗生素，如選自以下中的一種或多種：妥布霉素、粘菌素、慶大霉素或環(huán)丙沙星。

合適地，組合物可以包含含有3至50個α，D和/或L氨基酸的肽，其中所述氨基酸主要是精氨酸，并且其中所述肽任選地還包含選自以下中的一種或多種的修飾：

1)組氨酸標簽的摻入；

2)脂質化；和

3)聚乙二醇化。

合適地，組合物可以包含含有3-500個氨基酸的肽，其中所述氨基酸主要是精氨酸。

詳述

本發(fā)明提供用于治療或預防由酵母菌和/或霉菌引起的感染的半胱胺或其衍生物(或包含半胱胺和/或其衍生物的組合物)。

術語“包含半胱胺和/或其衍生物的組合物”包括將半胱胺和/或其衍生物任選地與其它未限定的成分組合使用。使用的術語“組合物包含”可以任選地被“基本上由...組成”或“由...組成”代替。

半胱胺衍生物的實例包括：2-甲硫基乙胺(肉桂酸酯)，2-甲硫基乙基脲，N-(2-甲硫基乙基)對乙酰胺基苯甲酰胺，2-氨基乙硫醇，N-(2-甲硫基乙基)對乙酰胺基苯磺酰胺，N-(2-丙硫基乙基)-對甲氧基苯甲酰胺，N-(丁硫基乙基)煙酰胺，N-(2-十二烷基硫基乙基)對丁氧基苯甲酰胺，N-(2-甲硫基乙基)對甲苯磺酰胺，N-(2-異丙基硫基乙基)丙酰胺，N-(2-辛基硫基乙基)乙酰胺，N-(2-丁硫基乙基)甲烷磺酰胺，N-(2-異戊基硫基乙基)丁烷，雙1,4(2-乙酰胺基乙硫基)，2,3-丁二醇，2-十六烷基硫基乙胺鹽酸鹽，2-烯丙基硫基乙胺蘋果酸鹽，9-十八烯2-基硫基乙胺鹽酸鹽，2-十二烷基硫基乙胺鹽酸鹽，2-異戊基硫基乙胺扁桃酸鹽，2-十八烷基硫基乙胺水楊酸鹽，2-β-羥乙基硫基乙基脲，2-β-羥乙基硫基乙胺鹽酸鹽，2-(2,3-二羥基丙硫基)乙胺對甲苯磺酸鹽，2-(2-羥基丙硫基)乙胺草酸鹽，N-(2-甲硫基乙基)苯基乙酰胺，2-(2,2-二甲氧基乙硫基)乙胺鹽酸鹽，2-(2,2-二甲氧基乙硫基)乙胺十一碳烯酸鹽，2-(2,2-二乙氧基乙硫基)乙胺十一碳烯酸鹽，2-(2,2-二乙氧基乙硫基)乙胺乙酸鹽，2-十一碳烯基硫基乙胺，2-β-脲基乙硫基乙胺鹽酸鹽，2-β-乙酰胺基乙硫基乙胺托品酸鹽，2,2'-硫基二乙胺富馬酸鹽，2,2'-硫基二乙脲，3-β-氨基乙硫基丙胺鹽酸鹽，S-β-脲基乙基硫基氨基甲酸酯，2-乙氧基羰基硫基乙胺鹽酸鹽，2-二甲氨基羰基硫基乙胺硫酸鹽，2-丁氧基羰基甲硫基乙基脲，2-乙氧基羰基甲硫基乙胺鹽酸鹽，6-β-氨基乙硫基己酸甲酯鹽酸鹽(6-.beta.-aminoethylthio hexanoate of methyl hydrochloride)，5-β-氨基乙硫基戊酸，2-苯硫基乙胺磷酸二氫鹽，2-對叔丁基苯硫基乙胺三氯乙酸鹽，2-對甲氧基苯硫基乙胺二酒石酸鹽，2-甲苯基硫基乙胺氫溴酸鹽，2-(1-聯(lián)苯硫基)乙胺鹽酸鹽，2-N-五氯苯硫基乙基乙酰胺，2-芐硫基乙胺蘋果酸鹽，2-芐硫基乙胺煙酸鹽，2-芐硫基2-甲基丙胺鹽酸鹽，2-芐硫基丙胺乳酸鹽，N-(2-芐硫基乙基)煙酰胺鹽酸鹽，N-(2-芐硫基乙基)10-十一烯酰胺，N-(2-芐硫基乙基)十六酰胺，S-β-氨乙基巰基丁酸，N-(2-芐硫基乙基)甲酰胺，N-(2-芐硫基乙基)苯基乙酰胺，N-[2-(2,6-二甲基苯基)乙基]己酰胺，2-鄰氨基苯硫基乙胺琥珀酸鹽，N-(2-芐硫基乙基)谷氨酰胺，S-β-氨基乙基巰基乙酸，(3-S-β-氨基乙基)巰基丙酸，(3-S-γ-氨基丙基)巰基乙酸，S(2-對甲氧基苯甲酰胺基乙基)巰基2-(2-萘基甲硫基)乙胺鹽酸鹽，2-(2-萘基甲硫基)乙胺二琥珀酸鹽，(2-噻吩甲基)2-硫基乙胺氫溴酸鹽，2-N-乙?；?2-噻吩甲基硫基-乙胺，2-鄰氯芐硫基乙胺鹽酸鹽，2-對氯芐硫基乙胺乙醇酸鹽，2-鄰氟芐硫基乙胺鹽酸鹽，2-糠基硫基乙胺鹽酸鹽，2-四氫糠基硫基乙胺對氨基苯甲酸鹽，2-β-苯乙基硫基乙胺谷氨酸鹽，2-二苯基甲硫基乙胺鹽酸鹽，2-三苯基甲硫基乙胺鹽酸鹽半水合物，2-(2-吡啶基乙硫基)乙胺鹽酸鹽，2-(2-對甲苯磺酰胺基乙硫基)吡啶N-氧化物，2-β-氨基乙硫基甲基吡啶N-氧化物二鹽酸鹽，2-β-氨基乙硫基吡啶N-氧化物鹽酸鹽，2,4-二氯-2-芐硫基乙胺天冬氨酸鹽，N-[2-(3,4-二氯芐硫基)乙基]丁酰胺，N-[2-(2,6-二氯芐硫基)乙基]十二酰胺，N-[2-(3,5-二氯芐硫基)乙基]三氟乙酰胺鹽酸鹽，2-對乙氧基芐硫基乙胺鹽酸鹽，N-[2-間氟芐硫基乙基]氯乙酰胺，2-對溴芐硫基乙胺琥珀酸鹽，2-(3,4-二甲氧基芐硫基)乙胺蘋果酸鹽，2-(3,4-亞甲二氧基芐硫基)乙胺鹽酸鹽，2-(2,4-二氯十六烷基硫基)乙胺，2(3,4,5-三甲氧基芐硫基)乙胺氫化肉桂酸鹽(2(3,4,5-trimethoxy benzylthio)ethylamine hydrocinnamate)，2-對甲氧基芐硫基乙胺水楊酸鹽，2-鄰甲基芐硫基乙胺苯基乙酸鹽，N-[2-對二甲基氨基芐硫基乙基]甲烷磺酰胺，2-對苯氧基芐硫基乙胺鹽酸鹽，2-β-氨基乙硫基吡啶鹽酸鹽，2-芐硫基乙胺檸檬酸鹽，N-[2-芐硫基乙基]2,4-二羥基3,3-二甲基丁酰胺，N-(2-芐硫基乙基)6,8-二羥基7,7-二甲基5-氧代-4-氮雜辛酰胺，N-[2-(2-吡啶硫基)乙基]丙酰胺，2-(2-吡啶基甲硫基)乙胺二鹽酸鹽，2-芐硫基乙胺泛酸鹽，S-(β-乙酰氨基乙基)巰基乙酸β-嗎啉代乙酯(S-(.beta.-acetamidoethyl)mercaptoacetate of beta.-morpholinoethyl)，S-(β-苯基乙酰胺基乙基)巰基乙酸N'-甲基2-哌嗪基乙酯，S-(β-脲基乙基)巰基乙酸β吡咯烷基乙酯，S-(β-三氟乙酰胺基乙基)-β-巰基丙酸β-二甲氨基乙酯，2-對硝基芐硫基乙胺巴豆酸鹽，2-β-嗎啉代羰基乙硫基乙胺鹽酸鹽，N,N-二(羥乙基)S-(β-芐酰氨基-乙基)巰基乙酰胺(N,N-di(hydroxyethyl)S-(.beta.-benzamido-ethyl)mercapto-acetamido)，N[2-N'-甲基哌嗪基羰基硫基乙基]乙酰胺，2-(1-萘基硫基)乙胺鹽酸鹽，N-(3-β-脲基乙硫基丙基)琥珀酰胺酸，3-烯丙基硫基丙胺，3-(2,2'-二甲氧基乙硫基)丙胺，3-(2,2'-二甲氧基乙硫基)丙胺硫酸鹽，S-β-氨基乙基巰基乙酸，S-β-氨基乙基巰基乙酸的鹽酸鹽，N-(2-芐硫基乙基)乙酰胺，N-(2-芐硫基乙基)丙酰胺，N-(2-芐硫基乙基)丁酰胺，N-(2-芐硫基乙基)甲磺酰胺，N-(2-芐硫基乙基)丁磺酰胺，N-(2-芐硫基乙基)甲磺酰胺，N-(2-芐硫基乙基)乙磺酰胺，N-(2-芐硫基乙基-丙磺酰胺，N-(2-芐硫基乙基)丁磺酰胺，S-(2-對乙酰胺基苯磺胺基乙基)巰基乙酸，S-(2-對乙酰胺基苯甲酰胺基乙基)巰基乙酸，N-(2-噻吩甲基硫基乙基)乙酰胺，2-芐硫基丙胺，2-芐硫基2-甲基丙胺，2-(2-對甲苯磺酰胺基乙硫基)吡啶N-氧化物，S-(2-對丁氧基芐酰胺基乙基)巰基乙酸，2-叔丁基硫基乙胺鹽酸鹽，2-甲氧基羰基甲硫基乙胺鹽酸鹽，2-乙氧羰基甲硫基乙胺鹽酸鹽，2-丙氧基羰基甲基硫基乙胺鹽酸鹽，2-丁氧基羰基甲硫基乙胺鹽酸鹽，2,2'-硫基二乙胺二鹽酸鹽，3-(2-氨基乙硫基)丙氨酸鹽酸鹽，2-芐硫基乙基銨二酸磷酸鹽(2-benzylthio ethylammonium diacid phosphate)，2-甲硫基乙胺，N-(甲硫基乙基)對乙酰胺基芐酰胺，N-(2-甲硫基乙基)煙酰胺，N-(2-甲硫基乙基)芐酰胺，N-(2-甲硫基乙基)對丁氧芐酰胺，N-(2-甲硫乙基)丁酰胺，N-(2-甲硫基乙基)丙酰胺，N-(2-甲硫基乙基)乙酰胺，N-(2-甲硫基乙基)丁磺酰胺，N-(2-辛硫基乙基)甲磺酰胺，2-十六烷基硫基乙胺鹽酸鹽，2-(2-羥基乙硫基)乙胺鹽酸鹽，2-甲硫基乙胺苯乙酸鹽和2-甲硫基乙胺十一碳烯酸鹽。

任選的修飾肽

本發(fā)明的組合物還可以包含含有3至50個D和/或L氨基酸的修飾肽，其中所述氨基酸主要是精氨酸，并且其中所述肽包含選自以下中的一種或多種的修飾：

1)組氨酸標簽的摻入；

2)脂質化；和

3)聚乙二醇化。

組氨酸標簽的摻入

一方面，當使用修飾肽時，優(yōu)選在N末端或C末端包含組氨酸標簽。有利地，組氨酸的存在可以增強肽對真菌感染如念珠菌的有效性。考慮到當與不存在組氨酸標簽的相當?shù)碾南啾容^時，陽離子電荷在這樣的pH范圍內可以不被顯著地改變，這是極其意外的。

合適地，組氨酸標簽可以包含至少兩個組氨酸殘基。優(yōu)選地，組氨酸殘基的數(shù)目可以高達10個。例如，組氨酸標簽可以由1至10個，優(yōu)選2至6個組氨酸殘基組成。在一個實施方案中，組氨酸標簽可以由兩個組氨酸殘基組成。

有利地，組氨酸標簽的存在對于治療口腔真菌感染，諸如口咽念珠菌病可以是特別有用的。

口腔在疾病狀態(tài)下具有5.5至7的pH，而當不進食時，健康口腔的正常口pH為約7。然而，pH影響AMP的電荷。此外，分泌的唾液也含有有助于肽分解的蛋白酶。

本發(fā)明人已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，經(jīng)修飾以包含組氨酸標簽的本發(fā)明的肽特別適合克服與口服給藥相關的pH和蛋白酶難題。

因此，包含組氨酸標簽的修飾肽可以包含在適于口服給藥的藥物制劑中。

適當?shù)?，用于本發(fā)明的藥物組合物中的肽，本發(fā)明的治療或預防方法和本發(fā)明的第二醫(yī)療用途可以在給藥途徑或預期給藥途徑是口服給藥時包含組氨酸標簽。

優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物的pH在pH 5.5至6.5的范圍內。

脂質化

一方面，當用于本發(fā)明的組合物中時，修飾肽是脂質化的。例如，脂質可以與包含3至50個D和/或L氨基酸的肽結合，其中所述氨基酸主要是精氨酸。

本發(fā)明已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，肽的脂質化可有利地拓寬肽針對微生物的活性譜(spectrum of activity)和/或增強肽針對某些微生物感染的活性。

合適地，本發(fā)明的脂質化肽可用于治療或預防酵母菌和霉菌感染(優(yōu)選例如念珠菌和/或曲霉菌感染，優(yōu)選曲霉菌感染)。已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，所要求保護的肽的脂質化可賦予這些脂質化的肽有效的活性。

因此，本發(fā)明的修飾肽可以包含可以在C末端、N末端的脂質，或側面連接(flank)氨基酸殘基的脂質。

合適地，本發(fā)明的肽可以包含C₃至C₂₀脂肪酸，優(yōu)選C₄至C₁₄脂肪酸，優(yōu)選C₈至C₁₄脂肪酸，優(yōu)選C₁₂脂肪酸。

合適地，本發(fā)明的修飾肽可以包含3至50個氨基酸和C₃至C₂₀脂肪酸，優(yōu)選C₄至C₁₄脂肪酸，優(yōu)選C₈至C₁₄脂肪酸，優(yōu)選C₁₂脂肪酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的修飾肽可以包含6至50個氨基酸和C₃至C₂₀脂肪酸，優(yōu)選C₄至C₁₄脂肪酸，優(yōu)選C₈至C₁₄脂肪酸，優(yōu)選C₁₂脂肪酸。

一方面，脂肪酸可以在任一側側面連接氨基酸殘基。已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，脂肪酸的側面連接可導致溶血活性的降低。

另一方面，脂肪酸可以位于肽的末端上。已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，就較低的MIC而言，這可以增加肽的抗微生物效果。

在一個優(yōu)選的實施方案中，脂肪酸是C₁₂脂肪酸。有利地，該長度的脂肪酸表現(xiàn)出良好的抗微生物效果并且另外具有低的細胞毒性和溶血活性。

聚乙二醇化的肽

一方面，本發(fā)明的修飾肽是聚乙二醇化的肽。

有利地，這樣的聚乙二醇化的肽具有增強的穩(wěn)定性，同時仍提供抗微生物效果。

合適地，PEG組分的尺寸可以為約300Da至約40KDa。

氨基酸殘基

如果用于本發(fā)明的組合物中，則該肽可以包含3至50個(優(yōu)選連續(xù)的)氨基酸。

合適地，肽可以包含至少3或至少4或至少5或至少6或至少7或至少8或至少9或至少10或至少12或至少15或至少20或至少25或至少30或至少35或至少40或至少45個氨基酸。

合適地，肽可以包含少于50或少于45或少于40或少于35或少于30或少于25或少于0或少于15個的氨基酸。

一方面，在上述范圍內涉及的氨基酸殘基數(shù)目不包含組氨酸標簽殘基。因此，一方面，當確定修飾肽中氨基酸的編號時，在肽的任一端的組氨酸殘基不被計數(shù)(discount)。另一方面，包括組成組氨酸標簽的那些氨基酸殘基的所有氨基酸殘基被計數(shù)。

在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，所述肽包含3至20個(優(yōu)選連續(xù)的)氨基酸，例如3至16個氨基酸。進一步優(yōu)選地，肽包含5至14個氨基酸。在一些方面，肽可以包含12個(優(yōu)選連續(xù)的)氨基酸。

正如技術人員所知的，主要根據(jù)氨基酸側鏈的化學和物理性質，可以將氨基酸分為不同的類別。例如，一些氨基酸通常被認為是親水性或極性氨基酸，而其它的則被認為是疏水性或非極性氨基酸。疏水性氨基酸可以選自由甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸以及蘇氨酸組成的疏水氨基酸組；陽離子氨基酸可以選自由鳥氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸組成的組。本發(fā)明使用的術語“疏水性”和“陽離子的”可以是指疏水性大于或等于-1.10和/或如Fauchere和Pliska Eur.J.Med Chem.10:39，1983所描述的方法，凈電荷大于或等于0的氨基酸。疏水性或非極性氨基酸也可以指具有在生理pH下不帶電荷的非極性側鏈的氨基酸，并且該側鏈通常與水溶液不相容。氨基酸可以是天然的或合成的。

合適地，精氨酸殘基是肽中的主要氨基酸。合適地，至少50％的氨基酸殘基是精氨酸殘基，優(yōu)選肽中至少60％或至少70％或至少80％的氨基酸是精氨酸。優(yōu)選地，至少90％是精氨酸殘基。在一些實施方案中，肽中的所有氨基酸是精氨酸殘基(任選地除組氨酸標簽外)。

合適地，肽可以包含除精氨酸以外的、非優(yōu)勢量的氨基酸。例如，可以使用組氨酸、鳥氨酸和賴氨酸。

合適地，3至50個(優(yōu)選連續(xù)的)D和/或L氨基酸由精氨酸或精氨酸和賴氨酸殘基的組合組成，除了對精氨酸或賴氨酸以外的氨基酸殘基的0、1或2個取代以外。優(yōu)選地，這種取代(如果存在)是對選自組氨酸、鳥氨酸和賴氨酸的另一種陽離子氨基酸的取代。優(yōu)選地，對賴氨酸進行取代。

合適地，所述肽可以被0、1、2、3、4、5、6、7或8個取代基取代，條件是精氨酸占肽的至少60％，優(yōu)選至少75％。

優(yōu)選地，氨基酸是L-氨基酸。

在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，肽中至少90％，例如至少95％，諸如97-99％或甚至100％的氨基酸是L-氨基酸。

本發(fā)明也包括上述氨基酸的已知異構體(結構異構體、立體異構體、構象和構型異構體)，肽模擬物(peptidomimetics)以及結構類似物，以及天然修飾的(例如翻譯后修飾)或化學修飾的、包括但不限于磷酸化、糖基化、磺酰化和/或羥基化的那些。

一般來說，本發(fā)明的肽不包括以下氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或絲氨酸，但是即使這些氨基酸存在，本發(fā)明的某些肽仍可以具有生物活性。

肽的一個或多個殘基可以被交換成另一個，以改變、增強或保留肽的生物活性。這樣的變體可以具有例如至少約10％的相應的非變體肽的生物活性。經(jīng)常使用保守性氨基酸，即上述具有相似的化學和物理性質的氨基酸的替換。因此，例如保守性氨基酸替換可以包括賴氨酸交換精氨酸、鳥氨酸或組氨酸；或者精氨酸交換賴氨酸或異亮氨酸，鳥氨酸交換組氨酸；或者一種疏水性氨基酸交換另一種。在進行替換后，篩選變體的生物學活性。

肽

在通常的術語中，本發(fā)明使用的術語“肽”是指通過肽鍵連接起來的多個氨基酸殘基。該術語可以與多肽和蛋白質互換使用，并且意義相同。

術語“修飾肽”是指包含3至50個氨基酸殘基，主要是精氨酸的肽，肽還包含：組氨酸標簽；和/或脂肪酸和/或聚乙二醇化的肽。合適地，本發(fā)明的修飾肽可以是線性肽。

優(yōu)選地，本發(fā)明的修飾肽可以由以下組成：

1)主要是精氨酸的3至50個氨基酸殘基和組氨酸標簽；

2)主要是精氨酸的3至50個氨基酸殘基和一個或多個脂肪酸；

3)主要是精氨酸的3至50個氨基酸殘基，組氨酸標簽和一種或多種脂肪酸；

4)主要是精氨酸的3至50個氨基酸殘基的聚乙二醇化的肽和組氨酸標簽；

5)主要是精氨酸的3至50個氨基酸殘基的聚乙二醇化的肽和一種或多種脂肪酸；或

6)主要是精氨酸的3至50個氨基酸殘基的聚乙二醇化的肽、組氨酸標簽和一種或多種脂肪酸。

肽通?？梢允呛铣傻碾摹ｋ目梢允欠蛛x的、純化的肽或者其變體，這些可以是體外合成的，例如通過固相肽合成方法、通過酶催化的肽合成或者借助重組DNA技術。

為了鑒定對哺乳動物細胞具有很小或者沒有不希望的毒性的活性肽，可以制備單一的肽或肽文庫(libraries of peptides)，并且可以篩選單一的肽或來自這些肽文庫的肽的抗微生物活性和毒性，包括但并不限于抗真菌、抗細菌、抗病毒、抗原生動物、抗寄生蟲活性以及毒性。

本發(fā)明的肽可以以不同形式存在，如游離酸、游離堿、酯和其它前藥、鹽或互變異構體，例如，并且本發(fā)明包括了化合物所有的變體形式。

因此，本發(fā)明包括了本發(fā)明的肽或肽變體的鹽或前藥。

給藥

本發(fā)明的組合物可以以藥學上可接受的鹽的形式給藥。本發(fā)明的藥學上可接受的鹽可以通過常規(guī)化學方法由母體肽合成，該母體肽包含堿性或酸性部分。一般來說，這些鹽是通過在水或在有機溶劑、或兩者的混合物中，游離酸或堿形式的肽與化學計量的適合的堿或酸反應來制備的；通常，非水介質如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈是優(yōu)選的。適合的鹽類的列表見于Remington's Pharmaceutical Sciences，17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,US,1985,p.1418，在此通過引用將其公開內容并入；還參見Stahl等編的“Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use”,Verlag Helvetica Chimica Acta和Wiley-VCH,2002。

因此，本發(fā)明包括了本發(fā)明的組合物的藥學上可接受的鹽，其中通過制備母體化合物的酸或堿的鹽對其進行修飾，所述鹽例如常規(guī)的無毒鹽或者由無機或有機酸或堿形成的季銨鹽。這樣的酸加成鹽的例子包括醋酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖庚酸鹽(glucoheptanoate)、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽(palmoate)、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽以及十一酸鹽。堿性鹽包括銨鹽，堿金屬鹽如鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽如鈣鹽和鎂鹽，含有機堿的鹽如雙環(huán)己胺鹽、N-甲基-D-谷氨酰胺，以及含氨基酸如精氨酸、賴氨酸的鹽，等等。此外，含氮的堿性基團可以被以下試劑季銨化，低級鹵代烷烴，如氯甲烷、氯乙烷、氯丙烷、氯丁烷、溴甲烷、溴乙烷、溴丙烷、溴丁烷、碘甲烷、碘乙烷、碘丙烷和碘丁烷；二烷基硫酸鹽，如二甲基硫酸鹽、二乙基硫酸鹽、二丁基硫酸鹽和二戊基硫酸鹽；長鏈鹵化物，如氯代癸烷、溴代癸烷、碘代癸烷、月桂基氯、月桂基溴、月桂基碘、肉豆蔻基氯、肉豆蔻基溴、肉豆蔻基碘、硬脂基氯、硬脂基溴和硬脂基碘；鹵代芳香烷，如溴代苯甲烷和溴代苯乙烷以及其它。

本發(fā)明的肽或肽的變體的羧酸鹽可以按照常規(guī)方式制備，即通過肽與一當量或多當量的希望的堿接觸，例如金屬氫氧化物堿，如氫氧化鈉；金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽，如碳酸鈉或碳酸氫鈉；或者胺類堿，如三乙胺、三乙醇胺等。

本發(fā)明包括用于所述肽的藥物活性形式的前藥，例如其中一個或多個官能團被保護或衍生化，但其在體內可以轉化為官能團，如可以在體內被轉化為游離酸的羧酸酯的情形，或可以轉化為游離氨基的被保護的胺的情形。本發(fā)明使用的術語“前藥”特指在體內被迅速轉化為母體結構的結構，例如在血液中水解。

本發(fā)明的另一方面提供了包含藥學有效量的半胱胺和/或其衍生物的藥物組合物。當使用修飾肽時，其可以形成組合物的部分或可以分別給藥。

組合物也可以包括藥學上可接受的載體、賦形劑和稀釋劑。本發(fā)明使用的短語“藥學上可接受的”是指在合理的醫(yī)學判斷范圍內，適合用于與人類的組織接觸，或者視情況可以是與動物的組織接觸，而沒有過量毒性、刺激和過敏反應、或其它問題或并發(fā)癥，并且與合理效益/風險比相稱的那些化合物、材料、組合物和/或劑型。

在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選用途中，真菌病原體是念珠菌屬或曲霉屬。例如，真菌病原體可以是白色念珠菌或煙曲霉菌。

真菌感染可以是全身性、局部、皮下、皮膚或粘膜感染。優(yōu)選地，真菌感染可以是全身性或粘膜感染。

本發(fā)明的組合物是對多種病原酵母菌和霉菌均有效的抗真菌劑。然而，本發(fā)明的組合物也可以用于其它病征的治療，包括但不限于與粘膜感染有關的病征，例如囊性纖維化，胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)(如腎臟感染或膀胱炎)或呼吸系統(tǒng)的感染。

在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可用于治療呼吸性/肺部疾病癥狀，特別是囊性纖維化或COPD的癥狀。

術語“治療”涉及本發(fā)明所述的肽在使經(jīng)受(感染性)疾病痛苦的患者受益方面的作用，包括改善患者的癥狀或延緩疾病發(fā)展。

另一方面，本發(fā)明提供了治療或預防受試者的微生物感染的方法，其包括給予所述受試者治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的組合物。

在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，微生物感染為真菌感染。在本發(fā)明的方法中，肽優(yōu)選口服給藥。

本發(fā)明所述的肽、組合物或方法可以治療哺乳動物、鳥類和其它動物。這些哺乳動物和鳥類包括人，狗，貓和家畜，如馬、牛、綿羊、山羊，雞和火雞等。此外，本發(fā)明的肽、組合物或方法也可以治療植物。

當受試者為動物時，本發(fā)明的方法可以施用于具有指(趾)甲樣特征部位，包括但不限于蹄、爪和腳。

為了獲得理想的效果，組合物及其變體或組合可以以單劑量或分劑量給藥，例如至少約0.01mg/kg至約500-750mg/kg，至少約0.01mg/kg至約300-500mg/kg，至少約0.1mg/kg至約100-300mg/kg或者至少約1mg/kg至約50-100mg/kg體重，或者至少約1mg/kg至20mg/kg體重，盡管其它劑量也可以提供有益的效果。給藥劑量將隨著各種因素而變化，包括但不限于所選擇的肽及其臨床效果、疾病、體重、身體狀況、健康狀況、哺乳動物的年齡、要實現(xiàn)的是治療還是預防，以及肽是否經(jīng)過化學修飾。

根據(jù)本發(fā)明，治療劑的給藥可以是單劑量、多劑量、連續(xù)的或間歇的方式，這取決于例如接受者的生理狀況，給藥的目的是治療還是預防，以及專業(yè)技術人員已知的其它因素。本發(fā)明的肽的給藥可以是在預定的時間期間基本上連續(xù)的，或者可以是以一系列間隔的劑量的形式。局部和全身給藥都考慮在內。

為了制備組合物，合成半胱胺和/或其衍生物或以其它方式獲得半胱胺和/或其衍生物，必要的話或根據(jù)期望純化，然后經(jīng)凍干和穩(wěn)定化。然后可以調節(jié)組合物至適當?shù)臐舛?，并且任選地與其它試劑組合。單位劑量中包含的特定肽的絕對重量可以有很大的變化。例如，可以給予約0.01mg至約2g或約0.01mg至約500mg的至少一種本發(fā)明的肽，或特異性針對特定細胞類別的多種肽。供選擇地，單位劑量可以從約0.01g至約50g，從約0.01g至約35g，從約0.1g至約25g，從約0.5g至約12g，從約0.5g至約8g，從約0.5g至約4g或者從約0.5g至約2g變化。

因此，一種或多種包含本發(fā)明的治療性組合物的適宜的單位劑型可以通過多種途徑給藥，包括口服，腸胃外(包括皮下、靜脈內、肌內和腹膜內)，直腸，皮膚，透皮，胸內，肺內，鼻內(呼吸的)途徑。治療性肽也可以配制成脂質制劑或用于緩釋(例如使用微囊化，參見WO 94/07529和美國專利No.4,962,091)。如果適合，劑型可以方便地以離散的單位劑型呈現(xiàn)，并且可以通過藥學領域熟知的任何方法來制備。這些方法可以包括以下步驟：治療劑與液體載體、固體基質、半固體載體，細分散的固體載體或其組合混合，以及隨后如果需要，將產(chǎn)品加入所需的輸送系統(tǒng)或成型進入所需的輸送系統(tǒng)。

當本發(fā)明的治療性組合物被制成用于口服給藥時，它們通常與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合以形成藥物制劑或單位劑型。為了口服給藥，肽可以以呈現(xiàn)為粉末、顆粒形式、溶液、懸浮液、乳液，或者處在天然的或合成的聚合物或樹脂中用于從口香糖攝入活性成分?；钚猿煞忠部梢猿尸F(xiàn)為丸劑、藥糖劑或糊劑。本發(fā)明的口服給藥的治療性組合物也可以被配制成緩釋的，例如半胱胺可以被包衣、微囊化或者以其他方式置于緩釋輸送的裝置中。在這樣的制劑中，活性成分總量占制劑重量的0.1％-99.9％。

包含本發(fā)明的治療性組合物的藥物制劑可以使用熟知且容易獲得的成分通過本領域已知的方法制備。例如，肽可以與常用的賦形劑、稀釋劑或載體一起配制并形成片劑、膠囊、溶液、懸浮液、粉末和氣霧劑等。適于這些制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的例子包括緩沖劑以及填充劑和膨脹劑，如淀粉、纖維素、蔗糖、甘露醇以及含硅的衍生物。也可以包括粘合劑，如羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙甲基纖維素以及其它纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮?？梢园ǖ谋駝┤绺视停澜鈩┤缣妓徕}和碳酸氫鈉。還可以包括用于延遲溶出的試劑，如石蠟。也可以包括再吸收促進劑(Resorption accelerators)，如季銨化合物?？梢园ū砻婊钚詣琏L蠟醇、甘油單硬脂酸酯?？梢约尤胛捷d體如高嶺土和膨潤土。還可以包括潤滑劑如滑石、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂，以及固體聚乙二醇。也可以加入防腐劑。本發(fā)明的組合物也可以包含增稠劑，如纖維素和/或纖維素衍生物。它們也可以包含樹膠如黃原膠、瓜爾膠或卡波(carbo)膠或阿拉伯膠，或供選擇的聚乙二醇、有機皂土和蒙脫土等。

例如，包含本發(fā)明的組合物的片劑或囊片(caplets)可以包括緩沖劑，如碳酸鈣、氧化鎂和碳酸鎂。適宜的緩沖劑還包括醋酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽和磷酸鹽等。囊片和片劑也可以包括非活性成分，如纖維素、預膠化淀粉、二氧化硅、羥丙甲基纖維素、硬脂酸鎂，微晶纖維素、淀粉、滑石、二氧化鈦、苯甲酸、檸檬酸、玉米淀粉、礦物油、聚丙二醇、磷酸鈉、硬脂酸鋅等。包含至少一種本發(fā)明的肽的硬或軟明膠膠囊可以包含非活性成分如明膠、微晶纖維素、十二烷基硫酸鈉、淀粉、滑石和二氧化鈦等，以及液體載體如聚乙二醇(PEG)和植物油。此外，設計了包含一種或多種本發(fā)明的肽的腸衣囊片或片劑以防止在胃內崩解，并且在十二指腸內更加中性到堿性的環(huán)境下溶解。

本發(fā)明的治療性組合物也可以被配制成酏劑或溶液以便于口服給藥，或者配制成適于腸胃外給藥的溶液，例如通過肌內、皮下、腹膜內或靜脈內的途徑。本發(fā)明的藥物制劑也可以采用水溶液或無水溶液或分散體的形式，或者供選擇的乳劑、懸浮劑或軟膏的形式。

因此，治療性組合物可以配制成用于腸胃外給藥(例如，通過注射，例如團注或連續(xù)輸注)，并且可以以單位劑量的形式存在于安瓿、預填充的注射器、小體積輸注容器或多劑量容器中。活性成分可以在油性或水性載體中形成懸浮液、溶液或乳液，并且可以包含調節(jié)劑(formulatory agent)，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。供選擇地，活性成分可以是粉末形式，其是通過無菌固體的無菌分離，或由用適合的載體，例如使用前無菌無熱原的水構成的溶液經(jīng)凍干而獲得的。

這些制劑可以包含本領域熟知的藥學上可接受的載體(carriers)、載體(vehicles)和佐劑。例如，能夠使用一種或多種從生理學的觀點來看可接受的有機溶劑來制備溶液，除水之外，所述有機溶劑選自例如丙酮，醋酸，乙醇，異丙醇，二甲基亞砜，乙二醇醚如以名稱為“Dowanol”銷售的產(chǎn)品，聚二醇和聚乙二醇，短鏈酸的C₁-C₄烷基酯，乳酸乙酯或乳酸異丙酯，脂肪酸甘油三酯如以名稱為“Miglyol”出售的產(chǎn)品，肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl mytrisate)，動物油，礦物油和植物油以及聚硅氧烷的溶劑。

包含本發(fā)明的肽的溶劑或稀釋劑可以包括酸性溶液，二甲基亞砜，N-(2-巰基丙酰)甘氨酸，2-正壬基-l,3-二氧戊環(huán)和乙醇。優(yōu)選地，溶劑/稀釋劑是酸性溶劑，例如醋酸、檸檬酸、硼酸、乳酸、丙酸、磷酸、苯甲酸、丁酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、琥珀酸或酒石酸。

還考慮了包括一種或多種本發(fā)明的肽以及一種或多種其它抗微生物劑或抗真菌劑的組合產(chǎn)品，所述其它抗微生物劑或抗真菌劑例如多烯，如兩性霉素B、兩性霉素B脂質復合物(ABCD)、兩性霉素B脂質體(L-ABM)以及制霉菌素脂質體；唑和三唑，如伏立康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、泊沙康唑(pozaconazole)等；葡聚糖合成酶抑制劑，如卡泊芬凈，米卡芬凈(FK463)和V-棘白菌素(LY303366)；灰黃霉素；烯丙基胺，如特比萘芬；氟胞嘧啶或其它抗真菌劑，包括本發(fā)明描述的那些。此外，考慮肽可以與局部抗真菌劑組合起來，局部抗真菌劑如環(huán)吡酮胺，鹵普羅近，托萘酯，十一烯酸酯(鹽)，局部用制霉菌素(nysatin)，阿莫羅芬，布替萘芬，萘替芬，特比萘芬以及其它局部藥劑。

此外，組合物可以配制成持續(xù)釋放劑型等。制劑的組成可以使得其能夠在一段時間內，例如在腸道或呼吸道的特定部分中釋放活性肽。包衣，包膜和保護性基質可以由例如聚合物質，如聚乳酸-羥乙酸酯，脂質體，微乳，微粒，納米顆?；蛳炛瞥?。這些包衣、包膜和保護性基質用于包覆留置裝置，例如支架、導管、腹膜透析管、排液裝置(draining devices)等。

對于局部給藥，如本領域已知的那樣，可以將活性藥物配制成用于直接應用于靶區(qū)域。主要為局部應用而配制的形式采用例如乳膏，乳液，凝膠，粉末，分散體，微乳，調節(jié)得更稠或更稀的洗劑，浸漬的墊，軟膏或棒，氣霧劑(例如噴霧或泡沫)，皂，洗滌劑，皂類洗劑或皂塊的形式。用于該目的的其它常規(guī)形式包括傷口敷料，涂層繃帶(coated bandages)，或其它聚合物覆蓋物，軟膏，乳膏，洗劑，糊劑，凝膠，噴霧劑和氣霧劑。因此，可以通過貼劑和繃帶輸送本發(fā)明的治療性肽以用于皮膚給藥。供選擇地，也可以將組合物配制成粘性聚合物，如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/醋酸乙烯酯共聚物的一部分。為了長期應用，可能希望使用帶微孔的和/或透氣的襯底層壓物，這樣可以使皮膚的水合作用和浸漬最小。襯底層可以是能夠提供所需的保護和支持功能的任何厚度。適宜的厚度一般為約10微米至約200微米。

局部給藥可以是指(趾)甲涂層或漆的形式。例如，抗真菌的肽可以配制成溶液以用于局部給藥，其包含乙酸乙酯(NF)，異丙醇(USP)以及聚[甲基乙烯基醚/馬來酸]單丁酯的異丙醇溶液。

局部給藥的藥物制劑可以包含例如生理上可接受的緩沖鹽溶液，該溶液包含約0.001mg/ml至100mg/ml，例如0.1mg/ml至10mg/ml的一種或多種特異性針對將被治療的適應癥或疾病的本發(fā)明的肽。

例如，在加入適宜的增稠劑和/或膠凝劑的情況下，可以用水性或油性基質(base)配制軟膏和乳膏。洗劑可以用水性或油性基質配制，并且通常還含有一種或多種乳化劑，穩(wěn)定劑，分散劑，懸浮劑，增稠劑或著色劑?；钚噪囊部梢酝ㄟ^電離子導入來輸送，例如美國專利第4,140,122、4,383,529或4,051,842號中所公開的方法。局部制劑中存在的本發(fā)明的治療劑的重量百分比要取決于多種因素，但通常會為制劑總重量的0.01％至95％，并且典型的是0.1-85％重量。

滴劑，如滴眼劑或滴鼻劑，可以采用水性或非水性基質中的一種或多種治療性肽來配制，該基質中還包含一種或多種分散劑，增溶劑或懸浮劑。液體噴霧劑可以被泵送，或者是從加壓包裝便利地輸送。滴劑可以通過簡單的眼用帶蓋滴管瓶(eye dropper-capped bottle)，通過適于輸送液體內容物液滴的塑料瓶，或者通過特定形狀封閉容器來輸送。

治療性肽可以被進一步配制成用于口腔和咽喉局部給藥。例如，活性成分可以配制成進一步含有調味基質，通常是蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠的錠劑(lozenge)；包含惰性基質如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中的組合物的錠劑(pastille)；以及包含適宜液體載體中的本發(fā)明的組合物的漱口水。供選擇地，活性成分可以配制為膜帶(film strip)或頰含片，其可以是或不是可溶解的。

用于本發(fā)明的藥物制劑的載體和/或稀釋劑的具體非限制性例子包括水和生理上可接受的緩沖鹽溶液，如pH 7.0-8.0的磷酸鹽緩沖鹽溶液。

本發(fā)明的組合物也可以給藥至呼吸道。為了吸入或吹入給藥，組合物可以采用干粉形式，例如治療劑與適宜的粉狀基質如乳糖或淀粉的粉狀混合物。當以氣霧劑或吸入的形式給藥時，本發(fā)明的治療性肽也可以以水溶液給藥。因此，其它的氣霧劑藥物制劑可以包含例如生理上可接受的緩沖鹽溶液，該溶液包含約0.001mg/ml至100mg/ml，例如0.1至100mg/ml，如0.5-50mg/ml、0.5-20mg/ml、0.5-10mg/ml、0.5-5mg/ml或1-5mg/ml的一種或多種特異性針對將被治療的適應癥或疾病的本發(fā)明的肽。

抗生素/抗真菌劑

本發(fā)明的組合物還可以包含抗生素。術語“抗生素”用于指代可來自細菌來源的抗菌劑?？股貏┛梢允菤⒕?或抑菌的。

通常，抗生素劑屬于由氨基糖苷、安莎霉素、碳頭孢烯、碳青霉烯、頭孢菌素(包括第一，第二，第三，第四和第五代頭孢菌素)、林可酰胺、大環(huán)內酯、單環(huán)β-內酰胺、硝基呋喃、喹諾酮、青霉素(penicillin)、磺酰胺、多肽和四環(huán)素組成的組。供選擇地或另外地，抗生素劑可有效抗分枝桿菌。

根據(jù)一個實施方案，抗生素劑可以是氨基糖苷，如阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素或巴龍霉素。

根據(jù)一個實施方案，抗生素劑可以是諸如格爾德霉素和除莠霉素。

供選擇地，抗生素劑可以是碳頭孢烯如氯碳頭孢。

根據(jù)另一個實施方案，抗生素劑是碳青霉烯，如厄他培南、多利培南、亞胺培南/西司他丁或美洛培南。

供選擇地，抗生素劑可以是頭孢菌素(第一代)如頭孢羥氨芐、頭孢唑啉、頭孢氨芐、頭孢噻吩(Cefalotin)或先鋒霉素(Cefalothin)，或供選擇地，頭孢菌素(第二代)如頭孢克洛、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢丙烯或頭孢呋辛。供選擇地，抗生素劑可以是頭孢菌素(第三代)，如頭孢克肟、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢布烯、頭孢唑肟和頭孢曲松，或頭孢菌素(第四代)如頭孢吡肟和頭孢吡普。

抗生素劑可以是林可酰胺如克林霉素和阿奇霉素，或大環(huán)內酯如阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素和壯觀霉素。

供選擇地，抗生素劑可以是單環(huán)β-內酰胺如氨曲南，或硝基呋喃如呋喃唑酮或硝基呋喃妥因。

抗生素劑可以是青霉素，如阿莫西林、氨芐青霉素、阿洛西林、羧芐青霉素、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G或V、哌拉西林、替莫西林和替卡西林。

抗生素劑可以是磺酰胺，如磺胺米隆，磺酰胺柯衣定(Sulfonamidochrysoidine)、磺乙酰胺、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶銀鹽、磺胺甲噻二唑、磺胺甲噁唑、磺亞胺(Sulfanilimide)、柳氮磺胺吡啶、磺胺異噁唑、甲氧芐氨嘧啶和甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲噁唑(復方新諾明(Co-trimoxazole))(TMP-SMX)。

抗生素劑可以是喹諾酮，如環(huán)丙沙星、依諾沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星和替馬沙星。

根據(jù)一個實施方案，抗生素劑可以是多肽，如桿菌肽、粘菌素和多粘菌素B。

供選擇地，抗生素劑可以是四環(huán)素，如地美環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素和氧四環(huán)素。

供選擇地或另外地，抗生素劑可有效抗分枝桿菌。特別地，抗生素劑可以是氯法齊明、氯苯吩嗪、氨苯砜、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福噴丁或鏈霉素。

通常，抗生素劑在治療或預防由革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌如大腸桿菌(Escherichia coli)和克雷伯氏菌(Klebsiella)，特別是綠濃桿菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的感染中具有活性。

在本發(fā)明的產(chǎn)品中，半胱胺和/或其衍生物與抗生素的比例可以為1:10至10:1；通常為至少2:1，例如至少3:1或4:1。供選擇地，本發(fā)明的產(chǎn)品中抗生素劑與第二試劑的比例可以為1:100至1:2000，例如1:500至1:1000。根據(jù)一個實施方案，抗生素劑與第二試劑的比例為約1:1。優(yōu)選地，第一抗生素劑是非肽抗生素，并且第二試劑是半胱胺，且產(chǎn)物以2:1至高達4:1的比例包含這些組分。根據(jù)另一個實施方案，該比例可以為約1:1。

抗真菌劑可選自氟康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈和兩性霉素B，例如氟康唑、伊曲康唑和卡泊芬凈中的一種或多種。

活性劑可以同時、順序或分開給藥。活性劑可以作為組合包裝提供。組合包裝可以包含本發(fā)明的產(chǎn)品以及用于同時、分開或順序給予每種活性劑的說明書。對于順序給藥，活性劑可以以任何順序給藥。

貫穿本申請的說明書和權利要求書，詞語“包括(comprise)”和“包含(contain)”以及這些詞語的變體，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”意思是“包括但不限于”，并且不想要(和不)排除其它部分、添加劑、組分、整數(shù)或步驟。

貫穿本申請的說明書和權利要求書，單數(shù)包含了復數(shù)，除非上下文另有要求。特別地，當使用不定冠詞時，說明應被理解為考慮了復數(shù)以及單數(shù)，除非上下文另有要求。

與本發(fā)明的特定方面、實施方案或實施例一起描述的特征、整數(shù)、特性、化合物、化學部分(chemical moieties)或基團將被理解為可適用于本發(fā)明描述的任何其它方面、實施方案或實施例，除非與之不相容。

附圖

圖1顯示了24小時后半胱胺(Lynovex，NM001)對白色念珠菌73/025的作用。

圖2顯示了48小時后半胱胺(Lynovex，NM001)對白色念珠菌73/025的作用。

圖3A-B顯示了半胱胺(NM001)對四種煙曲霉菌株(圖3A中的AF20，AF22和NCPF2939以及圖3B中的AF2002/0066)的作用。

圖4A-D顯示從4個患有囊性纖維化的患者的痰分離的曲霉菌生長的培養(yǎng)皿。

圖5A-B顯示了用半胱胺(Lynovex)、妥布霉素或其組合治療4小時(圖5A)和24小時(圖5B)的10名囊性纖維化患者的痰的微生物負載。

實施例

以下實施例解釋本發(fā)明。

實施例1

半胱胺(Lynovex)(NM001)對陰道分離的白色念珠菌的最小抑制濃度試驗。

目的：

實驗的目的是確定Lynovex(NM001)對外陰陰道分離的白色念珠菌73/025的MIC。制備含有2x最終濃度的Lynovex(NM001)的連續(xù)倍增稀釋液(a serial doubling dilution)的板。然后根據(jù)CLSI M27-A3方案，以2×RPMI-1640制備培養(yǎng)物，并且在板中以等體積(equal volumes)混合，得到1×RPMI-1640、下述化合物濃度和白色念珠菌的CLSI標準接種物。將這些在35℃下孵育，并在24小時和48小時處在BioTek讀板儀(BioTek plate reader)上讀數(shù)。

用于抗真菌測試的化合物

Lynovex(NM001)

方法：

培養(yǎng)物制備

1.白色念珠菌培養(yǎng)物在30℃下生長過夜

2.從培養(yǎng)箱移出培養(yǎng)物。向過夜培養(yǎng)物加入2ml無菌dH₂O，并從瓊脂表面清洗細胞。將細胞置于新的小管(bijou tube)中。

3.進行連續(xù)倍增稀釋，并且相對于相同體積的MacFarland標準品進行測量。

a.將100μl培養(yǎng)物加入微量滴定板(microtitre plate)的孔A1。

b.將100μl無菌dH₂O加入到孔A2-A11。

c.將100μl培養(yǎng)物加入微量滴定板的孔A2，充分混合，得到1/2稀釋液(1in 2dilution)。

d.從A2取出100μl，并添加到板上的A3，并充分混合，得到1/4稀釋液(1in 4dilution)。

e.這樣繼續(xù)到A11，其中100μl被移出并丟棄。

f.孔A12含有100μl 0.5MacFarland標準品，其已被充分混合。

g.在BioTek上在OD₅₃₀處讀板。

h.所需細胞濃度將是等同于(equivalent to)0.5MacFarland標準品的濃度。

4.用無菌dH₂O將細胞稀釋至0.5MacFarland標準品(可能需要例如1/16稀釋)的當量。

5.然后以1/50將培養(yǎng)物進一步稀釋到水中(其為100μl培養(yǎng)物+4900μl無菌水)。

6.然后以1/20將培養(yǎng)物進一步稀釋為2×RPMI-1640(其為1ml培養(yǎng)物+19ml 2×RPMI-1640)。

板制備

1.板上的最高最終濃度將在方案結尾處的布局中描述。為了能夠加入細胞，其以所述的2×最終濃度制備，例如制備20,000μg/ml，并且因此當加入細胞時，其減半至10,000μg/ml。

2.在無菌小管(bijoux)中制備每種化合物的溶液，得到5ml(5000μl)的最終體積。

3.通過向孔加入100μl最高濃度的化合物制備孔A1-A3、A4-A6、A7-A9和A10-A12(除了克霉唑板，其中化合物僅進入A1-3和A7-9)。

4.所有其他孔含有50μl無菌dH₂O。

5.從A1-A3到B1-B3進行連續(xù)倍增稀釋，其中從A1-A3移出50μl，并置于B1-B3中并充分混合。然后從B1-B3取50μl，并置于C1-C3中，并充分混合。從C1-C3取50μl，并添加至D1-D3，并充分混合。這樣重復直到F1-F3。在F1-F3處，移出50μl并棄去。G1-G3和H1-H3僅含有水，并且將是未處理和未接種的對照。

6.對于列A4-A6、A7-A9和A10-A12中的孔重復相同的過程。參見頁面底部的板布局。

用念珠菌接種板

1.向板上除了將僅含有水和2×RPMI-1640的孔H1-H12(底行)以外的所有孔加入50μl制備的念珠菌培養(yǎng)物，得到未接種的對照。

2.在BioTek中在OD₅₃₀處讀板。

3.然后將板放在塑料盒中，該塑料盒包含含水的培養(yǎng)皿或濕紙巾的床。將盒密封并置于35℃下。盤中或紙巾上存在的水提供了相對高濕度的環(huán)境。

4.在24小時和48小時處讀板，繪制MIC圖。

板布局

Lynovex板

結果

可以看出，半胱胺抑制白色念珠菌的生長。

實施例2

Lynovex(半胱胺)(NM001)對煙曲霉的最小抑制濃度試驗。

目的：

實驗的目的是確定Lynovex(NM001)對各種煙曲霉菌株的MIC。以2x最終濃度制備含有Lynovex(NM001)的連續(xù)倍增稀釋液的微量滴定板。然后根據(jù)CLSI M38-A2方案以2×RPMI-1640制備培養(yǎng)物，并在板中以等體積混合，得到1×RPMI-1640、下述化合物濃度和煙曲霉的CLSI標準接種物。將這些在37℃下孵育，并在24小時和48小時處在BioTek讀板儀上讀數(shù)。

用于抗真菌測試的化合物

Lynovex(NM001)

方法：

培養(yǎng)物制備

1.煙曲霉菌培養(yǎng)物2002/0066、AF20、AF22和NCPF2939在37℃下在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面上生長>72小時，以能夠產(chǎn)生最佳孢子)。

2.從培養(yǎng)箱移出培養(yǎng)物，將1ml無菌的0.85％鹽水加入斜面上的培養(yǎng)物，以從瓊脂表面清洗培養(yǎng)物。將孢子收集在新管中。

3.進行孢子的連續(xù)倍增稀釋，并在530nm的光密度下測量。然后如CLSI文件M38A中所規(guī)定的，將細胞密度調節(jié)至OD 530nm為0.09至0.13。

4.然后以1/50將孢子進一步稀釋到2×RPMI-1640。

5.然后以等體積將稀釋的孢子加入微量滴定板中的Lynovex(將50μl細胞加入到微量滴定板中的50μl Lynovex)。

板制備

1.制備10mg/ml的Lynovex的儲備溶液。該方案結尾處的板布局是在加入孢子之后板中的最終濃度，因此必須以2x最終濃度制備板，以實現(xiàn)在加入細胞時的稀釋。因此，在板中制備的Lynovex是10mg/ml(10,000μg/ml)，并且在添加細胞之后板中的最終濃度是5mg/ml(5,000μg/ml)。

2.將100μl 10mg/ml的Lynovex加入孔A1-A3和A7-A9。

3.所有其他孔含有50μl無菌dH₂O。

4.從A1-A3到B1-B3進行連續(xù)倍增稀釋，其中從A1-A3移出50μl，并置于B1-B3并充分混合。然后從B1-B3取50μl，并置于C1-C3中，充分混合。從C1-C3取50μl，并添加至D1-D3，并且充分混合。這樣重復直到H1-H3。在H1-H3處，移出50μl并加入到A4-6，并將稀釋液轉至F4-6。G4-6和H4-6僅含有水，并且將是未處理和未接種的對照。

5.對板的另一半中的孔重復相同的過程，其中將Lynovex加入到A7-9，并進行稀釋至H7-9，然后從A10-12繼續(xù)。

用煙曲霉菌接種板

1.向板上除了將僅含有水和2×RPMI-1640的孔H4-6和H10-H12之外的所有孔加入50μl制備的煙曲霉菌孢子，得到未接種的對照。

2.G4-6和G10-12是接種的對照并且具有孢子，但沒有Lynovex。

3.在BioTek中在OD₅₃₀處讀板。

4.然后將板放在塑料盒中，該塑料盒包含含水的培養(yǎng)皿或濕紙巾的床。將盒密封并置于37℃。盤中或紙巾上存在的水提供了相對高濕度的環(huán)境。

5.在24小時和48小時處讀板，繪制MIC圖。

板布局

添加孢子后的最終Lynovex板。

實施例3

從CF患者獲得新產(chǎn)生的痰樣品，并將該樣品暴露于單劑量的1mg/ml半胱胺和妥布霉素(10-100μg/ml)，然后鋪板(plate out)并孵育4小時和24小時，然后與來自未處理的痰樣品的微生物菌落形成單位相比，評價所得的微生物菌落形成單位的數(shù)目。結果示于圖5中。

實施例4

伊曲康唑、氟康唑和卡泊芬凈對臨床分離的皮炎外瓶霉的最小抑制濃度試驗。

目的：

該實驗的目的是確定伊曲康唑、氟康唑和卡泊芬凈對臨床分離的皮炎外瓶霉CA01的MIC。兩種念珠菌屬菌株(克魯斯念珠菌(C.krusei)ATCC6258和近平滑念珠菌(C.parapsilosis)ATCC22019)和甄氏外瓶霉(Exophiala jeanselmei)參考菌株NCPF2377也被測試。這些用作質量控制菌株。制備平底Nunc板，其含有2x最終濃度的抗真菌劑的連續(xù)倍增稀釋液。然后根據(jù)CLSI M38-A2方案以2×RPMI-1640制備培養(yǎng)物，并在板中以等體積混合，得到1×RPMI-1640、下述化合物濃度和CLSI標準接種物。將這些在35℃下孵育，并在BioTek讀板器上在530nm處在24小時和48小時(念珠菌屬)或120小時(外瓶柄霉菌屬)讀數(shù)。

用于抗真菌測試的化合物

伊曲康唑

氟康唑

卡泊芬凈

二甲基亞砜(DMSO；載體對照)

方法：

培養(yǎng)物制備

7.念珠菌培養(yǎng)物在Sabouraud葡萄糖瓊脂斜面上在30℃下生長過夜。

8.外瓶柄霉菌培養(yǎng)物在35℃下在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面上生長6天。

9.從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)物，向過夜培養(yǎng)物加入2ml無菌0.15M NaCl，從瓊脂表面收獲孢子和菌絲懸浮液，并轉移到無菌塑料小管。

a.使外瓶柄霉菌屬培養(yǎng)物靜置長達10分鐘，使菌絲沉降到底部。將孢子的頂層轉移到無菌塑料小管。

10.進行兩倍連續(xù)稀釋，并用分光光度法測量光密度，以得到0.5McFarland標準品。

a.將100μl培養(yǎng)物加入微量滴定板的A1。

b.向孔A2-A12加入100μl無菌0.15M NaCl。

c.將100μl培養(yǎng)物加入微量滴定板的孔A2，通過吸取(pipetting)混合。這產(chǎn)生1/2稀釋液。

d.從A2取出100μl并加至板上的A3，并通過吸取混合(1/4稀釋液)。

e.這樣繼續(xù)到A12，其中100μl被移出并丟棄。

f.對于剩余的3種培養(yǎng)物，在行B-D中重復該連續(xù)稀釋。

g.將0.5McFarland標準品添加到孔E1-E3。

h.在BioTek上在OD₅₃₀處讀板。

i.所需細胞濃度將是等同于0.5McFarland標準品的濃度。

11.在無菌0.15M NaCl中稀釋細胞至0.5McFarland標準品的當量(例如可能需要1/32稀釋液)。

12.然后以1/50將培養(yǎng)物進一步稀釋到2×RPMI-1640(100μl培養(yǎng)物+4900μl 2×RPMI-1640)。

板制備

7.板上的最高最終濃度將如方案結尾處的布局中所描述的。為了能夠加入細胞，其以2×所述的最終濃度制備，例如制備2000μg/ml的氟康唑，并且因此當將加入細胞時，其減半至1000μg/ml。

8.在無菌塑料小管中制備每種測試化合物的溶液，得到5ml的最終體積。

9.通過向孔加入200μl最高濃度的化合物來制備孔A1-A3和A7-A9。

10.所有其他孔含有100μl無菌dH₂O。

11.從A1-A3到B1-B3進行連續(xù)稀釋，其中從A1-A3取出100μl，并置于B1-B3中，通過吸移充分混合。然后從B1-B3取100μl，并置于C1-C3中，并充分混合。從C1-C3取100μl，并添加到D1-D3，并且充分混合。這樣重復直到H1-H3。在H1-H3處，100μl被移出并添加到A4-A6。將連續(xù)稀釋以相同的方式沿著板進行，至孔G4-G6，其中移出最終的100μl并棄去。H4-H6僅含有水，并且將是未處理的對照。

12.對于列A7-A9和A10-A12中的孔重復相同的過程。參見頁面底部的板布局。

用念珠菌屬/外瓶柄霉菌屬接種板

5.向板上除了將僅含有水和2×RPMI-1640的孔H10-H12(底行)之外的所有孔加入100μl制備的培養(yǎng)物，得到未接種的對照。

6.在BioTek中在OD_530nm處讀板。

7.然后將板放置在包含含水的培養(yǎng)皿的塑料盒中。將盒密封并在35℃(外瓶柄霉菌屬)或30℃(念珠菌屬)下孵育。盤中或紙巾上存在的水提供了相對高濕度的環(huán)境。

8.在24小時和48小時后讀取念珠菌屬板的OD530，而在96小時和120小時后讀取生長較慢的外瓶柄霉菌屬的板。

9.使用Gen5軟件轉化原始BioTek數(shù)據(jù)，并使用GraphPad Prism 4軟件對其進行圖形顯示，并確定MIC。

板布局

與Lynovex(NM001)組合使用的抗真菌藥物對皮炎外瓶霉CA01的抗真菌活性。

目的：

本實驗的目的是確定Lynovex(NM001)對皮炎外瓶霉CA01的抗真菌易感性的作用。根據(jù)關于肉湯微量稀釋棋盤法(broth microdilution chequerboard method)的CLSI規(guī)范制備微量滴定板。這些板含有與抗真菌藥物：氟康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈和兩性霉素B的連續(xù)倍增稀釋液組合的Lynovex(NM001)的連續(xù)倍增稀釋液。首先以4x最終濃度制備Lynovex(NM001)和抗真菌劑，在它們組合后將其稀釋至2x最終濃度。然后以2×RPMI-1640制備培養(yǎng)物，并在板中等體積混合，得到1×RPMI-1640和1×濃度的下述化合物。將這些在35℃下孵育，并在BioTek讀板器上在72小時、96小時、120小時和144小時處讀數(shù)。

用于抗真菌試驗的化合物

與氟康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈和兩性霉素B組合的Lynovex(NM001)。

方法：

培養(yǎng)物制備

6.三個獨立的皮炎外瓶霉CA01培養(yǎng)物在35℃下在PDA斜面上生長6天。

7.從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)物。將2ml無菌0.15M NaCl加入到過夜的培養(yǎng)物，并從瓊脂表面收獲細胞。將細胞置于新的小管中。

8.使培養(yǎng)物靜置長達10分鐘，使任何菌絲沉降到底部。將分生孢子的頂層移至新的小管中。丟棄菌絲。

9.對每個培養(yǎng)物進行兩倍連續(xù)稀釋，并用分光光度法測量光密度，以得到0.5McFarland標準品。

a.將100μl培養(yǎng)物加入微量滴定板的F1。

b.將100μl無菌0.15M NaCl加入到孔F2-F12。

c.將100μl培養(yǎng)物加入微量滴定板的孔F2并通過吸取混合。這產(chǎn)生1/2稀釋液。

d.從F2取出100μl并添加至板上的F3，并通過吸取混合。(1/4稀釋液)。

e.這樣繼續(xù)到F12，其中100μl被移出并丟棄。

f.對于剩余的2種培養(yǎng)物，在行G-H中重復該連續(xù)稀釋。

g.在BioTek上在OD₅₃₀處讀板。

h.所需細胞濃度將是等同于0.5McFarland標準品的濃度，或OD₅₃₀為0.12-0.15。

10.在無菌0.15M NaCl中將細胞稀釋至0.5McFarland標準品的當量(例如，可能需要1/128稀釋)。

11.然后以1/50將培養(yǎng)物進一步稀釋到2×RPMI-1640(1.1ml培養(yǎng)物+53.9ml 2×RPMI-1640)。

板制備

該制備步驟分兩部分進行。首先，沿著并跨微量滴定板將Lynovex(NM001)和抗真菌劑分別連續(xù)稀釋。然后在接種前將等體積的Lynovex和抗真菌劑在新的微量滴定板中合并。

步驟1：抗真菌板的制備

6.以4x所需濃度制備Lynovex和抗真菌劑的儲備溶液。該方案結尾的板布局是將Lynovex和抗真菌劑組合并添加接種物之后的板中的最終濃度。例如，Lynovex最初以10mg/ml制備，并且在添加細胞后的板中的最終濃度為2.5mg/ml。

7.將300μl 10mg/ml的Lynovex加入行A中的每個孔。

8.所有其他孔含有150μl無菌dH₂O。

9.從A到B進行連續(xù)倍增稀釋，其中從A移出150μl，并置于B中并充分混合。然后從B取150μl，并置于C中，并充分混合。這樣重復直到行G，其中最后的150μl被棄去。行H僅含有水，并且當組合時將僅是抗真菌劑以及未處理和未接種的對照。

10.對于其他4種抗真菌劑重復相同的過程，跨板，即列1至2進行稀釋。在列10中的最終稀釋液處，棄去最終的150μl。列11和12僅含有水，并且當組合時將僅為Lynovex以及未處理和未接種的對照。

步驟2：測試板(Challenge Plate)制備

1.將50μl來自A1的Lynovex稀釋液與來自A1的50μl抗真菌劑稀釋液合并到新的微量滴定板的A1中。

2.重復該步驟，直到所有孔已合并，將Lynovex/抗真菌劑濃度減半至總體積為100μl。

3.孔H11和H12含有100μl無菌dH₂O，并將分別成為未處理和未接種的對照。

用皮炎外瓶霉CA01接種板

6.向板上除孔H12之外的所有孔加入100μl(總體積200μl)制備的皮炎外瓶霉CA01培養(yǎng)物。針對所有組合測試一種培養(yǎng)物，這樣形成針對每種組合的3次重復。

7.H12將僅含有100μl水和100μl 2×RPMI-1640，構成未接種的對照。

8.在BioTek中在OD₅₃₀處讀板。

9.然后將板放置在包含含水的培養(yǎng)皿的塑料盒中，密封并在35℃下孵育。盤中或紙巾上存在的水提供了相對高濕度的環(huán)境。

10.然后在72小時、96小時、120小時和144小時處讀取OD₅₃₀，并使用Microsoft Excel處理原始數(shù)據(jù)。

11.用下式使用MIC₁₀₀72小時數(shù)據(jù)和后面時間點的MIC₅₀得到分數(shù)抑制濃度(FIC)指數(shù)值：

板布局

步驟1布局：

其中χ對于兩性霉素B而言為120μg/ml，對于卡泊芬凈而言為500μg/ml，對于氟康唑而言為8000μg/ml，并且對于伊曲康唑而言為64μg/ml。

步驟2布局：

其中χ對于兩性霉素B而言為30μg/ml，對于卡泊芬凈而言為125μg/ml，對于氟康唑而言為2000μg/ml，并且對于伊曲康唑而言為16μg/ml。

結果

表1：使用CLSI M38-A2*肉湯微稀釋方法，臨床抗真菌劑氟康唑、伊曲康唑和卡泊芬凈對皮炎外瓶霉CA01的體外最小抑制濃度(MIC)。CLSI認可的念珠菌屬QC菌株提供在可接受范圍內的MIC值。

*用于絲狀真菌的肉湯稀釋抗真菌易感性測試的-CLSI(2008)參考方法；批準標準-第二版。(M38-A2)。

表2：與臨床抗真菌劑組合使用的Lynovex(NM001)的肉湯微量稀釋棋盤分析。分開的和組合的Lynovex和抗真菌劑的體外MIC₁₀₀數(shù)據(jù)在35℃下孵育72小時后產(chǎn)生，并分析FICI。確定每種組合的FICI值并給出平均值，其中<0.5；協(xié)同，0.5-1；加和的，>1；無差別(indifference)。(Burkhart等人2002)

表3：與臨床抗真菌劑組合使用的Lynovex(NM001)的肉湯微量稀釋棋盤分析。分開的和組合的Lynovex和抗真菌劑的體外MIC₅₀數(shù)據(jù)在35℃下孵育96小時后產(chǎn)生，并分析FICI。確定每種組合的FICI值并給出平均值，其中<0.5；協(xié)同，0.5-1；加和的，>1；無差別。(Burkhart等人2002)

表4：與臨床抗真菌劑組合使用的Lynovex(NM001)的肉湯微量稀釋棋盤分析。分開的和組合的Lynovex和抗真菌劑的體外MIC₅₀數(shù)據(jù)在35℃下孵育120小時后產(chǎn)生，并分析FICI。確定每種組合的FICI值并給出平均值，其中<0.5；協(xié)同，0.5-1；加和的，>1；無差別。(Burkhart等人2002)

表5：與臨床抗真菌劑組合使用的Lynovex(NM001)的肉湯微量稀釋棋盤分析。分開的和組合的Lynovex和抗真菌劑的體外MIC50數(shù)據(jù)在35℃下孵育144小時后產(chǎn)生，并分析FICI。確定每種組合的FICI值并給出平均值，其中<0.5；協(xié)同，0.5-1；加和的，>1；無差別。(Burkhart等人2002)