一種用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉、制備方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉、制備方法及其用途，其中酵母菌干粉包括表達(dá)MCH的酵母菌，其制備方法為以已克隆的黃鱔MCH基因?yàn)槟０?通過PCR獲得MCH基因,將其載體pHIL-D2進(jìn)行體外重組,構(gòu)建質(zhì)粒；通過電轉(zhuǎn)化將MCH基因整合到酵母GS115的染色體上,用PCR方法篩選、表達(dá)，從而獲得表達(dá)MCH的酵母菌；將上述酵母菌擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)后經(jīng)誘導(dǎo)、分離以及干燥得到酵母菌干粉，將酵母菌干粉添加到黃鱔飼料中進(jìn)行喂食用來促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)。本發(fā)明提供的酵母菌干粉加入到黃鱔飼料中進(jìn)行黃鱔養(yǎng)殖，能使黃鱔增重率達(dá)到30%，飼料添加酵母工程菌具有明顯地促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的作用。
【專利說明】—種用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉、制備方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于漁業(yè)科學(xué)應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]黃鱔(Monopterus a I bus),俗稱鱔魚,屬于硬骨魚綱、合觸目、合觸科、黃鱔屬，廣泛存在于亞洲地區(qū)，中國(guó)僅產(chǎn)I種。其體型細(xì)，形狀似蛇或鰻，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高。目前已在中國(guó)中南部開展大面積的養(yǎng)殖，中國(guó)目前的養(yǎng)殖總產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到36萬噸，由于其生長(zhǎng)快，成活率高以及對(duì)網(wǎng)箱養(yǎng)殖條件的適應(yīng)性好，它被當(dāng)作中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的首選品種之一。鱔魚肉質(zhì)細(xì)嫩，鮮美可口，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有滋補(bǔ)強(qiáng)身和藥用功能，是人們喜愛的滋補(bǔ)水產(chǎn)品，深受中國(guó)消費(fèi)者的青睞。為了繁榮市場(chǎng)，豐富人民生活，發(fā)展池塘養(yǎng)殖已變得日益迫切，對(duì)黃鱔的生物學(xué)特性，生長(zhǎng)變化規(guī)律等方面的研究已成為重要的課題。近年來其水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展很快。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中高效餌料的研制是增產(chǎn)增收的基本途徑。如何捉高餌料轉(zhuǎn)化率，縮短養(yǎng)殖周期，降低生產(chǎn)成本，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖品的產(chǎn)量和質(zhì)量被越來越多的科研工作者和養(yǎng)殖戶所關(guān)注。
[0003]黑色素濃集激素(MCH)是一種由19個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)肽，最先于鮭魚腦垂體腺內(nèi)分離得到，它通過使黑色素細(xì)胞中的黑色素濃集來調(diào)節(jié)硬骨魚類的皮膚顏色，因此而得名。MCH在許多生理過程中起作用，包括調(diào)節(jié)硬骨魚類皮膚的顏色；調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸；調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的水和電解質(zhì)出入；刺激大鼠神經(jīng)垂體分泌催產(chǎn)素；調(diào)節(jié)感覺過程等。而目前研究的重點(diǎn)是MCH在調(diào)節(jié)進(jìn)食行為和能量代謝方面的作用。最近一系列研究發(fā)現(xiàn)MCH在調(diào)節(jié)體重方面具有重要的作用:(I)過表達(dá)MCH的轉(zhuǎn)基因小鼠抵抗胰島素且患有肥胖癥；(2 )在大鼠腦室內(nèi)注射MCH導(dǎo)致進(jìn)食過多引發(fā)肥胖；(3 )基因工程肥胖鼠和禁食小鼠相比下丘腦中的MCH mRNA水平增高；(4)缺乏MCH的小鼠食量減少，代謝率增高，導(dǎo)致體重減輕和脂肪含量下降。這一切都表明MCH具有促進(jìn)食欲，促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。
[0004]目前國(guó)內(nèi)外成功率高、效益好的方式多采取網(wǎng)箱高密度投餌養(yǎng)鱔，為了獲得較快的黃鱔生長(zhǎng)速度從而提高經(jīng)濟(jì)效益，漁民主要采用高蛋白飼料進(jìn)行投喂，一般均采用魚糜、蚯蚓、魚粉等進(jìn)行飼喂，由于世界魚粉市場(chǎng)供需不平衡，魚粉價(jià)格不斷上揚(yáng)，使養(yǎng)殖成本上升，同時(shí)蚯蚓及魚糜的養(yǎng)殖成本也逐年上升，從而嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。此外隨著養(yǎng)殖規(guī)模和強(qiáng)度的不斷擴(kuò)大，未食的殘餌以及養(yǎng)殖體的排泄物等對(duì)養(yǎng)殖水體及周圍水環(huán)境的影響越來越突出，結(jié)果導(dǎo)致魚病增加，養(yǎng)殖水體富營(yíng)養(yǎng)化，最終使得黃鱔生長(zhǎng)停滯，養(yǎng)殖不能繼續(xù)。因此尋找一條減少魚粉等蛋白性飼料的使用并能促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的配合飼料成為亟待解決的問題。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)中的不足而提供一種用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的飼料及其制備和實(shí)施方法。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的:
一種用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉，包括表達(dá)MCH的酵母菌。
[0008]所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉，其中表達(dá)MCH的酵母菌的制備方法可以為以已克隆的黃鱔MCH基因?yàn)槟０?，通過PCR方法獲得MCH基因，將MCH基因與含甲醇酵母的醇氧化酶AOX基因啟動(dòng)子的載體pHIL-D2進(jìn)行體外重組，構(gòu)建pHIL_MCH酵母整合型質(zhì)粒；通過電轉(zhuǎn)化將MCH基因整合到酵母GS115的染色體上，用PCR方法篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并用點(diǎn)雜交篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)AOX啟動(dòng)子，而使rMCH得以表達(dá)，從而獲得表達(dá)MCH的酵母菌。
[0009]一種以上所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行制備:
(1)工程菌的培養(yǎng):表達(dá)MCH的將酵母菌接種于YPD平板培養(yǎng)基中，搖床30°C條件下培養(yǎng)，挑菌電泳觀察有MCH表達(dá)的單菌落菌種于已預(yù)先滅菌裝有YPD培養(yǎng)基的試管中，30°C搖振培養(yǎng)；
(2)工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng):用預(yù)先滅菌，裝有無機(jī)鹽培養(yǎng)基的容器，加入上述工程菌培養(yǎng)液，30°C搖振培養(yǎng)，培養(yǎng)完畢后分裝并保存于_70°C冰箱中備用；
(3)工程菌中試:取保存于_70°C冰箱中的工程菌，接種于YPD培養(yǎng)基中，30°C搖振培養(yǎng)，培養(yǎng)完畢后移至已預(yù)先滅菌的接料瓶中，泵入裝有無機(jī)鹽培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，其中無機(jī)鹽培養(yǎng)基預(yù)先滅 菌并將溫度恢復(fù)至30°C，當(dāng)酵母生長(zhǎng)至0D600為30-45時(shí)，每天加入體積分?jǐn)?shù)為發(fā)酵液量0.5%-1%的甲醇誘導(dǎo)4-5天，收集菌液，采用低溫超聲波法進(jìn)行降解酵母細(xì)胞壁，于4°C冰柜中沉淀，去上清液，沉淀物置于冷凍干燥機(jī)中干燥，即得用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉。
[0010]所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉的制備方法，步驟(1)中搖振培養(yǎng)轉(zhuǎn)速可以為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間可以為24_30h。
[0011]所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉的制備方法，步驟(2)中搖振培養(yǎng)轉(zhuǎn)速可以為170r/min，培養(yǎng)時(shí)間可以為6_8天。
[0012]所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉的制備方法，步驟(3)中搖振培養(yǎng)轉(zhuǎn)速可以為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間可以為2天。
[0013]所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉的制備方法，步驟(3)中發(fā)酵條件可以為pH 5.5,溫度 30°C。
[0014]一種用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌飼料，其中飼料中含有以上所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉。
[0015]一種以上所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌飼料實(shí)施的促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的方法，包括如下步驟:
(1)黃鱔的人工養(yǎng)殖:采取網(wǎng)箱養(yǎng)殖的方式對(duì)黃鱔進(jìn)行人工養(yǎng)殖；
(2)第一年黃鱔的人工馴化:于每年6-11月，選擇規(guī)格相同的黃鱔在網(wǎng)箱里進(jìn)行人工養(yǎng)殖，網(wǎng)箱里移植水花生，在黃鱔配合飼料里添加1%的酵母粉；
(3)黃鱔越冬:當(dāng)年11月份至第二年4月份，黃鱔繼續(xù)養(yǎng)殖在網(wǎng)箱里，同時(shí)停止投喂；
(4)第二年黃鱔增重:第二年5月份開始，黃鱔繼續(xù)養(yǎng)殖在網(wǎng)箱里，并開始重新投喂，每天投放黃鱔配合飼料，飼料中含1%酵母菌干粉，一直飼喂到上市前I周，停喂酵母菌。
[0016]按照本發(fā)明提供的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌飼料以及實(shí)施的促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的方法獲得的黃鱔具有如下特點(diǎn):
1.利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)出rMCH重組酵母菌，可以直接摻入飼料中喂養(yǎng)，免除從工程菌中提純r(jià)MCH的復(fù)雜操作，同時(shí)酵母菌本身也是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。此外實(shí)驗(yàn)表明MCH小肽可通過黃鱔腸道吸收并發(fā)揮作用。
[0017]2.本發(fā)明采用的重組菌具有增強(qiáng)食欲、促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，網(wǎng)箱養(yǎng)殖試驗(yàn)表明具有明顯的促生長(zhǎng)效應(yīng)，是應(yīng)用外源性MCH促進(jìn)魚類生長(zhǎng)安全可行的一條途徑
本發(fā)明在研究中成功的在酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功的表達(dá)了黃鱔MCH激素，動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)以表達(dá)MCH的酵母細(xì)胞拌喂黃鱔可以提高黃鱔生長(zhǎng)速度，體重增加達(dá)29.8%以上。
[0018]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1
1.rMCH酵母菌干粉制備:
(I)工程菌的構(gòu)建和培養(yǎng):
根據(jù)GeneBank中MCH基因的同源序列合成MCH DNA序列，序列見SEQ ID N0.1,并在序列兩端加上&OR I和Not I酶切位點(diǎn)，將人工合成的DNA和pHIL_D2質(zhì)粒分別用I和Not I雙酶切后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn) 化。通過菌落PCR、酶切篩選鑒定陽性克隆子，命名為pHIL-MCH。
[0019]將獲得的重組載體pHIL-MCH質(zhì)粒用Sal I酶切，回收片段后電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，畢赤酵母感受態(tài)準(zhǔn)備、電擊轉(zhuǎn)化均參照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)，將獲得的轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)種到麗和MD平板，并設(shè)陽性對(duì)照GS115 β-gal (His+Mut+)和陰性對(duì)照GS115Albumin (His+ Muts)，在MM平板和MD平板均能正常生長(zhǎng)的菌落為陽性菌落，隨機(jī)挑選30個(gè)陽性菌落接種5 mL BMGY中，30 °C劇烈振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，加3 mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30 °C繼續(xù)培養(yǎng)48 h。篩選出酶活性較高的菌株，命名為GS115-pHIL-MCH。通過對(duì)上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。
[0020]將上述表達(dá)MCH的酵母菌接種于YPD平板培養(yǎng)基中，搖床30°C條件下培養(yǎng)，挑菌于已預(yù)先滅菌裝有5 mL YPD培養(yǎng)基的試管中，30°C搖振(200r/ min)培養(yǎng)24_30h。工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng):用1000 mL的三角瓶，每瓶裝有200 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，預(yù)先滅菌，每瓶加入5 mL上述工程菌培養(yǎng)液，30°C搖振(170r/ min)培養(yǎng)6_8d，以10 mL/管分裝并保存于-70°C冰箱中備用。
[0021](2)工程菌中試:發(fā)酵試驗(yàn)及發(fā)酵產(chǎn)物的預(yù)處理:取保存于_70°C冰箱中的工程菌IOmL,接種于200mL YH)培養(yǎng)基，30°C搖振(200r/min)培養(yǎng)2d ;移至已預(yù)先滅菌的接料瓶中，泵入體積為30L的發(fā)酵罐中(裝有20 L無機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基預(yù)先滅菌并將溫度恢復(fù)至30°C)進(jìn)行發(fā)酵(pH為5.5，溫度為30V，rpm_p02的關(guān)系由電腦操作系統(tǒng)控制)。當(dāng)酵母生長(zhǎng)至0D600為30-45時(shí)，每天加入甲醇0.5%_1%誘導(dǎo)4_5d，收集菌液，采用低溫超聲波法進(jìn)行適當(dāng)?shù)亟到饨湍讣?xì)胞壁，于4°C冰柜中沉淀，去上清液，沉淀物裝于帆布袋中置于冷凍干燥機(jī)中干燥，得rMCH酵母菌干粉。
[0022]將以上制得的rMCH酵母菌干粉加入到黃鱔配合飼料中，其中加入方式為在黃鱔配合飼料中添加1%的酵母菌干粉，混合均勻即得到用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的飼料。
[0023]2.用以上制備的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的飼料進(jìn)行飼喂實(shí)驗(yàn):2012-2013年姜堰市一黃鱔養(yǎng)殖基地進(jìn)行本發(fā)明的飼喂實(shí)驗(yàn)，按以下步驟進(jìn)行:
(1)2012年4月將黃鱔養(yǎng)殖網(wǎng)箱架設(shè)在池塘內(nèi)，網(wǎng)箱規(guī)格為長(zhǎng)3米、寬2米、高1.5米，為30目聚乙烯無結(jié)網(wǎng)片加工而成。共設(shè)120個(gè)網(wǎng)箱。池塘水溫為20-28°C，水中溶氧大于6mg/L, pH 值 7.5-8。
[0024](2)2012年4月中下旬進(jìn)行水體消毒、放苗前15天設(shè)置水花生作為黃鱔的棲息巢，水花生的種植面積為網(wǎng)箱的2/3左右，以模擬黃鱔的自然適宜生態(tài)條件。
[0025](3)2012年5_6月份挑選健康、體表無傷、規(guī)格一致的黃鱔移入到網(wǎng)箱里養(yǎng)殖。放養(yǎng)密度為1.5kg/m2,每個(gè)網(wǎng)箱放養(yǎng)9-10kg。每個(gè)網(wǎng)箱放養(yǎng)10尾泥鰍，以避免黃鱔互相纏繞。
[0026](4)制備重組MCH酵母菌按1%的比例(重量比)拌在黃鱔飼料中。
[0027](5)在黃鱔移入網(wǎng)箱三天后開始投喂黃鱔配合飼料，進(jìn)行開口馴化。待黃鱔習(xí)慣人工飼料1-2周開始飼喂含重組酵母菌的黃鱔配合飼料。
[0028](6)黃鱔配合飼料中酵母菌的比例為0.5%，以后可逐漸加至1%。每天傍晚5點(diǎn)左右投喂，黃鱔配合飼料的蛋白水平控制在38%以內(nèi)，投喂量按體重的4-8%進(jìn)行投喂，第二天清晨有少量殘餌即為飽食。未吃的殘餌應(yīng)及時(shí)清理掉，以免腐敗污染水質(zhì)。
[0029](7)黃鱔越冬:當(dāng)年10月份開始到第二年4月份，黃鱔繼續(xù)養(yǎng)殖在網(wǎng)箱里，但減少投喂，直到停止。
[0030](8)從2013年5月溫度回升開始，黃鱔繼續(xù)養(yǎng)殖在原網(wǎng)箱內(nèi)，并重新開始投喂重組酵母菌。投喂的飼料為鰱魚和粉碎的蚯蚓加1%的酵母菌打碎制成食糜，黃鱔配合飼料的蛋白水平控制在38%以內(nèi)。每天傍晚4點(diǎn)左右投喂在固定的地點(diǎn)。
[0031](9)黃鱔養(yǎng)殖的日常管理:整個(gè)養(yǎng)殖期間，每天投喂新鮮的飼料，第二天早晨及時(shí)收集并妥善處理未吃完的殘餌，防止污染水質(zhì)，每天兩次巡塘，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題，保持良好的水質(zhì)和生態(tài)環(huán)境，每周用戊二醛進(jìn)行消毒，按40mg/m3水體均勻潑灑。
[0032]有益效果:應(yīng)用本發(fā)明后，經(jīng)稱重對(duì)比，喂以重組菌的實(shí)驗(yàn)組對(duì)比正常試驗(yàn)組增重達(dá)30.2%以上。
[0033]實(shí)施例3
用實(shí)施例2中制備的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的飼料進(jìn)行飼喂實(shí)驗(yàn)，2011-2012年泰興市一黃鱔養(yǎng)殖基地進(jìn)行本發(fā)明的重組菌飼喂實(shí)驗(yàn)，按以下步驟進(jìn)行:
(1)2011年3月選擇合適的池塘架設(shè)黃鱔養(yǎng)殖網(wǎng)箱，網(wǎng)箱規(guī)格為長(zhǎng)4米、寬3米、高1.5米，為30目聚乙烯無結(jié)網(wǎng)片加工而成。共設(shè)40個(gè)網(wǎng)箱。池塘水溫為20-28°C，水中溶氧大于 6mg/L，pH 值 7.5-8。
[0034](2) 2011年4月份開始以聚維酮碘水體消毒、網(wǎng)箱內(nèi)放置水花生作為黃鱔的棲息巢，水花生的種植面積為網(wǎng)箱的60%左右為宜，模擬黃鱔的自然適宜生態(tài)條件。
[0035](3)2011年6-7月份挑選健康、體表無傷、規(guī)格一致的黃鱔移入到網(wǎng)箱里養(yǎng)殖。放養(yǎng)密度為1.5kg/m2,每個(gè)網(wǎng)箱放養(yǎng)15kg。每個(gè)網(wǎng)箱放養(yǎng)15尾泥鰍，以避免黃鱔互相纏繞。
[0036](4)制備重組菌，按1%的比例(重量比)拌在黃鱔飼料中。
[0037](5)在黃鱔移入網(wǎng)箱三天后開始投喂蚯蚓，進(jìn)行開口馴化。待黃鱔習(xí)慣人工飼料1-2周開始飼喂含重組菌的配 合飼料。
[0038](6)配合飼料中重組菌的比例為0.5%，以后可逐漸加至1%。每日下午5點(diǎn)左右投喂，配合飼料的蛋白水平控制在38%以內(nèi)，投喂量按體重的4-8%進(jìn)行投喂，第二天清晨有少量殘餌即為飽食。及時(shí)清理掉未吃的殘餌，避免殘餌腐敗污染水質(zhì)。
[0039](7)黃鱔越冬:當(dāng)年10月份開始到第二年4月份，黃鱔繼續(xù)養(yǎng)殖在網(wǎng)箱里，但減少投喂，直到停止。
[0040](8)從2010年5月溫度回升開始，黃鱔繼續(xù)養(yǎng)殖在原網(wǎng)箱內(nèi)，并重新開始投喂重組菌。投喂的飼料為鰱魚和粉碎的蚯蚓加1%的重組菌打碎制成食糜，配合飼料的蛋白水平控制在38%以內(nèi)。每日下午5點(diǎn)左右投喂在固定的地點(diǎn)。在對(duì)黃鱔進(jìn)行稱重前2天，停喂重組菌。
[0041](9)黃鱔養(yǎng)殖的日常管理:整個(gè)養(yǎng)殖期間，每天投喂新鮮的飼料，第二天早晨及時(shí)收集并妥善處理未吃完的殘餌，防止污染水質(zhì)，每天兩次巡塘，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題，保持良好的水質(zhì)和生態(tài)環(huán)境，每周用戊二醛進(jìn)行消毒，按40mg/m3水體均勻潑灑。
[0042]有益效果:應(yīng)用本發(fā)明后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組稱重比較后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，增重效果明顯，達(dá)29.8%以上，表明重組蛋白具有生物活性，黃鱔MCH重組蛋白可通過口服被黃鱔腸 道吸收，并產(chǎn)生了明顯的促生長(zhǎng)效應(yīng)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉，其特征在于，包括表達(dá)MCH的酵母菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉，其特征在于，表達(dá)MCH的酵母菌的制備方法為以已克隆的黃鱔MCH基因?yàn)槟０澹ㄟ^PCR方法獲得MCH基因，將MCH基因與含甲醇酵母的醇氧化酶AOX基因啟動(dòng)子的載體pHIL-D2進(jìn)行體外重組，構(gòu)建pHIL-MCH酵母整合型質(zhì)粒；通過電轉(zhuǎn)化將MCH基因整合到酵母GS115的染色體上，用PCR方法篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并用點(diǎn)雜交篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)AOX啟動(dòng)子，而使rMCH得以表達(dá)，從而獲得表達(dá)MCH的酵母菌。
3.—種權(quán)利要求1所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行制備: (1)工程菌的培養(yǎng):表達(dá)MCH的將酵母菌接種于YPD平板培養(yǎng)基中，搖床30°C條件下培養(yǎng)，挑菌電泳觀察有MCH表達(dá)的單菌落菌種于已預(yù)先滅菌裝有YPD培養(yǎng)基的試管中，30°C搖振培養(yǎng)； (2)工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng):用預(yù)先滅菌，裝有無機(jī)鹽培養(yǎng)基的容器，加入上述工程菌培養(yǎng)液，30°C搖振培養(yǎng)，培養(yǎng)完畢后分裝并保存于_70°C冰箱中備用； (3)工程菌中試:取保存于_70°C冰箱中的工程菌，接種于YPD培養(yǎng)基中，30°C搖振培養(yǎng)，培養(yǎng)完畢后移至已預(yù)先滅菌的接料瓶中，泵入裝有無機(jī)鹽培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，其中無機(jī)鹽培養(yǎng)基預(yù)先滅菌并將溫度恢復(fù)至30°C，當(dāng)酵母生長(zhǎng)至0D600為30-45時(shí)，每天加入體積分?jǐn)?shù)為發(fā)酵液量0.5%-1%的甲醇誘導(dǎo)4-5天，收集菌液，采用低溫超聲波法進(jìn)行降解酵母細(xì)胞壁，于4°C冰柜中沉淀，去上清液，沉淀物置于冷凍干燥機(jī)中干燥，即得用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉的制備方法，其特征在于，步驟(1)中搖振培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為24_30h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉的制備方法，其特征在于，步驟(2)中搖振培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為170r/min，培養(yǎng)時(shí)間為6_8天。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉的制備方法，其特征在于，步驟(3)中搖振培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為2天。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉的制備方法，其特征在于，步驟(3)中發(fā)酵條件為pH 5.5，溫度30°C。
8.權(quán)利要求1所述的用于促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)的酵母菌干粉用于制備黃鱔飼料的用途。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103992960SQ201410221002
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】丁煒東, 邴旭文, 曹麗萍, 曹哲明 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心