本發(fā)明主要涉及治療學和藥物化學的領域，且更具體地涉及一些脾酪氨酸激酶(Syk)抑制劑與一些長春花生物堿的組合在治療癌癥中的用途，所述癌癥包括例如，白血病、淋巴瘤和實體細胞腫瘤。

背景技術：

當下正在研究多種咪唑并吡嗪化合物以用于抑制脾酪氨酸激酶(Syk)的活性。Syk是非受體酪氨酸激酶，其在多種類型的細胞中的免疫受體-和整合素-介導的信號傳導中起著關鍵作用，所述細胞類型包括B細胞、巨噬細胞、單核細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、T細胞、自然殺傷細胞、血小板和破骨細胞。

據(jù)報道，Syk在經(jīng)B細胞受體的信號傳導中起著重要作用，其已知為B細胞中的重要的生存信號。因此，抑制Syk活性可用于治療一些類型的惡性血液病。這種惡性血液病的實例包括癌癥，例如B細胞淋巴瘤和白血病。而且，存在關于一些實體癌(腫瘤)細胞系中Syk表達的報告。這些實體癌腫瘤的實例包括胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和結(jié)腸直腸癌、卵巢癌和肝細胞癌。此外，抑制Syk活性被認為可用于治療其他疾病和病癥，包括炎性疾病(例如，類風濕性關節(jié)炎)、過敏性疾病和自身免疫性疾病。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制Syk活性的一種這樣的化合物或其藥學上可接受的鹽，其用式I表示:

該式的化合物具有化學名6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-嗎啉代苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺。該化合物及其合成已被描述于美國專利號8,450,321和8,455,493中，將其全部引入本文作為參考，特別在于制備該化合物的方法。參見例如，美國專利號8,450,321的實施例1和2。

長春花生物堿為20世紀50年代發(fā)現(xiàn)的衍生自長春花(Madagascar periwinkle)植物的藥物的亞組，且具有多種用途，包括治療糖尿病、高血壓和癌癥。對這些適應癥正在使用或正開發(fā)約10(十)種長春花生物堿，包括用于臨床腫瘤用途的4種主要的長春花生物堿：長春堿、長春瑞濱、長春新堿和長春地辛。這些主要長春花生物堿中的每一種都已報告引起了嚴重副作用，最顯著為神經(jīng)病。更常見的長春花生物堿之一為長春新堿(VCR)，也被稱為醛基長春堿(leurocristine)，且以安可平為名銷售。如同其它長春花生物堿，長春新堿作為有絲分裂抑制劑可用于癌癥化療且常用于非霍奇金病的標準護理方案CHOP(環(huán)磷酰胺、羥基柔紅霉素(也稱為多柔比星)、安可平(長春新堿)和潑尼松)，或用于B-細胞淋巴瘤的R-CHOP(CHOP與(也稱為利妥昔單抗)的組合)。然而，長春新堿也與另一種長春花生物堿一樣具有多種嚴重的副作用，最嚴重的副作用為化療-誘導的周圍神經(jīng)病，其為進行性、持久的，通常不可逆的神經(jīng)病。該神經(jīng)病可如此嚴重，以至于導致長春新堿使用的減少或甚至停止。

所需要的是在有此治療需要的受試者中治療對抑制Syk有響應的疾病的方法，包括在可被認為有患該疾病風險、標準治療難以治愈和/或標準治療后復發(fā)的受試者中進行治療，其中僅使用Syk抑制劑的治療方案不抑制細胞活性，尤其是對于可對繼發(fā)于治療方案的神經(jīng)病敏感的受試者，其中該治療方案包含標準給藥水平的長春新堿或長春花生物堿。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了在有此需要的受試者中治療癌癥的方法，其包括向所述受試者給藥治療有效量的式I化合物或其藥學上可接受的鹽，其與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合：

在一些實施方案中，所述受試者為患有對Syk活性有響應的癌癥的人。在另一實施方案中，所述受試者為具有表達Syk的實體癌腫瘤的人。在一些實施方案中，所述受試者為具有17p缺失、TP53突變、NOTCH1、SF3B1突變、11q缺失或其任意組合的人。在一個實施方案中，所述受試者為具有17p缺失、TP53突變或其組合的人。在另一實施方案中，所述受試者為具有NOTCH1、SF3B1突變、11q缺失，或其任意組合的人。

在一些實施方案中，所述長春花生物堿選自長春新堿、長春堿、長春地辛、長春瑞濱、desoxyvincaminol、vincaminol、長春布寧、長春蔓晶和長春內(nèi)日定及其藥學上可接受的鹽。在一些實施方案中，至少一種長春花生物堿選自長春新堿、長春堿、長春地辛、長春瑞濱、desoxyvincaminol、vincaminol、長春布寧、長春蔓晶和長春內(nèi)日定及其藥學上可接受的鹽。在一些實施方案中，所述長春花生物堿選自長春新堿、長春堿、長春地辛和長春瑞濱及其藥學上可接受的鹽。在其它實施方案中，所述長春花生物堿選自長春新堿和長春堿及其藥學上可接受的鹽。在一個實施方案中，所述長春花生物堿為長春新堿及其藥學上可接受的鹽。在另一實施方案中，所述長春花生物堿為長春堿及其藥學上可接受的鹽。

本文還提供在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括向受試者給藥治療有效量的式I的化合物或其藥學上可接受的鹽；和治療有效量的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽。

本文還提供在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括向受試者給藥治療有效量的式I的化合物或其藥學上可接受的鹽，和治療有效量的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽，其中：所述受試者為沒有正在經(jīng)歷任何其它抗癌治療的人；且所述受試者(i)為至少一種抗癌治療難以治愈的，或(ii)處于用至少一種抗癌治療進行治療后的復發(fā)中，或其組合。

本文還提供附圖和實施例，闡述了式I的化合物或其藥學上可接受的鹽和治療有效量的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合，相比單一治療或作為唯一藥劑給藥的單獨的式I化合物或長春花生物堿，該組合在一些癌癥以及其各自細胞系中的治療作用具有出人意料的改善。

在一些實施方案中，所述受試者沒有正在經(jīng)歷任何使用一種或多種PI3K抑制劑的其它抗癌治療。在一些實施方案中，該PI3K抑制劑可包括化合物A、B和C，它們的結(jié)構(gòu)在以下提供：

化合物A具有化學名(S)-2-(1-((9H-嘌呤-6-基)氨基)丙基)-5-氟-3-苯基喹唑啉-4(3H)-酮，化合物B命名為(S)-2-(1-((9H-嘌呤-6-基)氨基)乙基)-5-氟-3-苯基喹唑啉-4(3H)-酮，且化合物C為(S)-2-(1-((9H-嘌呤-6-基)氨基)乙基)-3-(2,6-二氟苯基)喹唑啉-4(3H)-酮。

在一些實施方案中，所述受試者為至少一種抗癌治療難以治愈的。在其它實施方案中，所述受試者處于用至少一種抗癌治療進行治療后的復發(fā)中。

在一些實施方案中，約100mg至800mg的式I的化合物或其藥學上可接受的鹽被給藥于受試者，每天兩次。在其它實施方案中，約200mg至400mg的式I的化合物或其藥學上可接受的鹽被給藥于受試者，每天兩次。在一個實施方案中，約400mg的式I的化合物或其藥學上可接受的鹽被給藥于受試者，每天兩次。

在一個變型中，所述受試者為具有17p缺失、TP53突變或其組合的人；且約100mg至800mg的式I的化合物或其藥學上可接受的鹽被給藥于受試者，每天兩次。在另一個變體中，所述受試者為具有17p缺失、TP53突變或其組合的人；且約200mg至400mg的式I的化合物或其藥學上可接受的鹽被給藥于受試者，每天兩次。在另一個變體中，所述受試者為具有17p缺失、TP53突變或其組合的人；且約400mg的式I的化合物或其藥學上可接受的鹽被給藥于受試者，每天兩次。

在其它實施方案中，所述長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽，以臨床批準的或亞臨床批準的量給藥于受試者，每周一次。在一些實施方案中，所述長春花生物堿的量以亞臨床批準的量給藥于受試者，每周一次。在其它實施方案中，所述長春花生物堿為長春新堿，且長春新堿或其藥學上可接受的鹽的量，以0.1mg-M²至1.5mg-M²的劑量給藥。在其它實施方案中，所述長春花生物堿以0.25mg-M²至1.0mg-M²的劑量給藥于受試者，每周一次，且所述長春花生物堿選自長春新堿和長春堿。在其它實施方案中，所述長春花生物堿以0.1mg-M²至0.2mg-M²的劑量給藥于受試者，每天一次，且所述長春花生物堿選自長春新堿和長春堿。

在一些實施方案中，式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽在長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽之前給藥。在其它實施方案中，長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽，在式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽之前給藥。

在一個實施方案中，式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽以及和長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽同時給藥，其中所述長春花生物堿通過靜脈注射給藥且式I的化合物通過片劑給藥。在一些實施方案中，式I的化合物和至少一種長春花生物堿或它們的藥學上可接受的鹽，每天獨立給藥兩次。在其它實施方案中，式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽，和長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽，每天給藥一次。在其它實施方案中，式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽，和長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽，一周給藥一次。在一個實施方案中，式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽每天給藥兩次，且長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽一周給藥一次。在一個實施方案中，式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽每天給藥一次，且長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽一周給藥一次。

在一些實施方案中，所述癌癥為惡性血液病。在一些實施方案中，所述癌癥為白血病。在一個實施方案中，所述白血病為慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。在一些實施方案中，所述癌癥為淋巴瘤。在一個實施方案中，所述淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一個變型中，所述NHL為彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、淋巴漿細胞性淋巴瘤(LPL)、和/或邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)。因此，應理解在一個方面所述受試者為患有惡性血液病，如白血病或淋巴瘤的人。

在某些實施方案中，所述癌癥選自急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、慢性骨髓性白血病(CML)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、低侵襲性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)、難治性iNHL、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(WM)、T-細胞淋巴瘤、B-細胞淋巴瘤、彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、淋巴漿細胞性淋巴瘤(LPL)、和邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)。

在一些實施方案中，所述癌癥為實體瘤癌癥(或?qū)嶓w癌腫瘤)。在一些實施方案中所述癌癥為實體瘤且表達脾酪氨酸激酶(Syk)活性。在其它實施方案中，所述實體瘤癌癥選自胰腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、乳癌、食管癌、腺癌和肝細胞癌。

附圖簡述

圖1描繪式I的化合物的化學結(jié)構(gòu)。

圖2詳述了式I的化合物和長春新堿的組合相比于單獨的長春新堿在十七(17)種惡性B-細胞系(代表4種血液癌癥類型：DLBCL、MM、FL和MCL)中的抑制作用。(圖2(a)–2(q))

圖3總結(jié)了式I的化合物和長春新堿的組合相對以下組合的效果：A)式I的化合物和考布他汀A4；B)式I的化合物和秋水仙堿；C)式I的化合物和多柔比星；以及D)式I的化合物和紫杉醇。

圖4描繪且總結(jié)了當化合物共同給藥時，圖1化合物和兩種長春花生物堿(分別為長春新堿和長春堿)之一的組合，在DLBCL細胞系DHL-10中的抑制作用。

圖5總結(jié)了式I的化合物和長春新堿的組合在表達Syk的惡性結(jié)腸細胞系MiaPaca(圖5a)、和不表達Syk的惡性結(jié)腸細胞系HepG2(圖5b)中對細胞活力的抑制。

圖6描繪了在MiaPaca和HepG2惡性結(jié)腸細胞系中Syk表達水平。

圖7總結(jié)了在源自肺、胰腺和結(jié)腸的惡性細胞系中Syk的表達水平。

發(fā)明詳述

以下說明闡述了示例性的組合物和方法。但是，應認識到，這種描述不旨在限制本發(fā)明的范圍，而是作為示例性實施方案的說明。

本發(fā)明提供了在有此需要的具體受試者(例如，人)群體中治療癌癥的方法，其包括向這種受試者給藥治療有效量的式I化合物或藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合：

本文還提供附圖和實施例，闡述了式I的化合物或其藥學上可接受的鹽，和治療有效量的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合，相比單一治療或作為唯一藥劑給藥的單獨的式I化合物或長春花生物堿，該組合在一些癌癥以及其各自細胞系中的治療作用具有出人意料的改善。

所述式I化合物也可用其化合物名稱表示：6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-嗎啉代苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺。所提供的化合物名稱是使用ChemBioDrawUltra 12.0命名的，且本領域技術人員理解，所述化合物結(jié)構(gòu)可使用其他公認的命名系統(tǒng)和符號(包括CAS和IUPAC)進行命名或鑒定。用于合成所述式I化合物的方法在之前已描述于，例如，美國專利號8,450,321中。

本發(fā)明給出的任意化學式或結(jié)構(gòu)，包括所述式I化合物及其藥學上可接受的鹽，也旨在表示該化合物的未標記形式以及同位素標記形式或其鹽。同位素標記的化合物或其鹽具有本發(fā)明給出的化學式所描繪的結(jié)構(gòu)，除了一個或多個原子被具有選定的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子所替代?？蓳饺氡景l(fā)明化合物的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如，但不限于²H(氘，D)、³H(氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸F、³¹P、³²P、³⁵S、³⁶Cl和¹²⁵I。本發(fā)明的各種同位素標記的化合物或其鹽，例如引入放射性同位素(例如³H、¹³C和¹⁴C)的那些均被包括在內(nèi)。這種同位素標記的化合物或其鹽可用于代謝研究、反應動力學研究、檢測或成像技術，例如正電子發(fā)射斷層掃描(PET)或單光子發(fā)射計算機斷層掃描(SPECT)，包括藥物或底物組織分布測定或用于受試者(例如人)的放射性治療。

本發(fā)明還包括所述式I化合物及其藥學上可接受的鹽，其中碳原子所連接的1至n個氫被氘代替，其中n為該分子中的氫數(shù)。這種化合物可表現(xiàn)出增加的代謝抗性，并因此當給藥至哺乳動物時，有效提高所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的半衰期。參見，例如，F(xiàn)oster，“Deuterium Isotope Effectsin Studies of Drug Metabolism”,Trends Pharmacol.Sci.5(12):524-527(1984)。這種化合物通過本領域熟知的方式合成，例如通過采用其中一或多個氫已被氘代替的起始原料。

氘標記的或取代的本發(fā)明治療性化合物可具有改善的DMPK(藥物代謝和藥代動力學)性質(zhì)，其涉及分布、代謝和排泄(ADME)。由于更高的代謝穩(wěn)定性，被較重的同位素(例如氘)取代可提供一定的治療優(yōu)勢，例如增加的體內(nèi)半衰期、減少的劑量需求和/或治療指數(shù)的改善。¹⁸F標記的化合物可用于PET或SPECT研究。同位素標記的本發(fā)明化合物及其前藥通?？赏ㄟ^實施下述方案或?qū)嵤├爸苽渲泄_的操作制備，其用易得的同位素標記試劑取代非同位素標記試劑。應理解，在上下文中，氘被認為是所述式I化合物及其藥學上可接受的鹽的取代基。

這種較重的同位素(尤其是氘)的濃度可用同位素富集因子來定義。在本發(fā)明化合物中，沒有具體用特定同位素指示的任何原子意指該原子的任何穩(wěn)定的同位素。除非另外提及，當一個位置被具體指定為“H”或“氫”時，則該位置應理解為具有其天然豐度同位素組成的氫。因此，在本發(fā)明的化合物或其鹽中，被具體指示為氘(D)的任何原子意指氘。

長春花生物堿及其藥學上可接受的鹽衍生自長春花植物，且已用于治療糖尿病、高血壓和多種癌癥。長春花生物堿的實例包括長春新堿、長春堿、長春地辛、長春瑞濱、desoxyvincaminol、vincaminol、長春布寧、長春蔓晶和長春內(nèi)日定。通常，在臨床使用中有4種主要長春花生物堿：長春堿、長春瑞濱、長春新堿和長春地辛。所有長春花生物堿靜脈內(nèi)(IV)給藥。

本發(fā)明的長春花生物堿及其藥學上可接受的鹽為細胞毒性的–它們終止細胞分裂且引起細胞死亡。在細胞分裂過程中，長春花生物堿分子結(jié)合至蛋白質(zhì)(稱為微管蛋白)的構(gòu)建單元以抑制其形成。微管蛋白通常在細胞中起作用以產(chǎn)生微管。這些微管向細胞提供它們分裂和復制所需的結(jié)構(gòu)和柔性。沒有微管，細胞就不能分裂。與Syk抑制劑形成對照(其抑制脾酪氨酸激酶)，長春花生物堿的機理為占據(jù)微管蛋白的構(gòu)建結(jié)構(gòu)，從而理論上防止微管形成，因此干擾癌細胞分裂的能力。

本發(fā)明的長春花生物堿之一長春堿抑制血管發(fā)生或新血管從先前已存在的血管生長的過程。血管發(fā)生為腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤的關鍵步驟。長春堿通常用于治療霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、乳癌和生殖細胞腫瘤。長春堿的副作用包括：對白細胞的毒性、惡心、嘔吐、便秘、呼吸困難、胸部或腫瘤疼痛、氣喘和發(fā)燒。長春堿也偶爾與抗利尿激素分泌和心絞痛相關。

本發(fā)明的另一長春花生物堿為長春瑞濱，其作用與長春堿類似。長春瑞濱已在患有乳癌的患者中顯示顯著的抗腫瘤活性和對骨肉瘤(骨腫瘤細胞)的抗增殖作用。長春瑞濱治療可導致副作用，包括對感染、擦傷或出血降低的抗性，貧血，便秘，腹瀉，惡心，手和腳麻木或麻刺感，疲勞(也稱為周圍神經(jīng)病)，和注射位點的炎癥。不常見的副作用包括脫發(fā)和過敏反應。

本發(fā)明的長春花生物堿另一實例或?qū)嵤┓桨笧殚L春新堿或其藥學上可接受的鹽。長春新堿對微管蛋白二聚體(二聚體為僅為兩個嵌段長度的蛋白質(zhì)的構(gòu)建塊)具有高親和力且可迅速附著和再附著在不同位點，因此理論上防止二聚體重新組裝(構(gòu)建)成細管的能力，從而使微管蛋白不穩(wěn)定且抑制微管形成。長春新堿經(jīng)FDA批準以治療急性白血病、橫紋肌肉瘤、成神經(jīng)細胞瘤、魏爾姆瘤、霍奇金病和其它淋巴瘤。長春新堿最常見的副作用為：周圍神經(jīng)病、抑制骨髓活性、便秘、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、惡心、和嘔吐，其中神經(jīng)病為最常見和嚴重的副作用。因此，報告了一些用長春新堿治療腫瘤的受試者必須停止長春新堿的治療。

第四常見的長春花生物堿為長春地辛或其藥學上可接受的鹽。長春地辛的血清半衰期僅為24小時，但與長春堿的作用(預期作用和副作用)類似。在治療黑素瘤、治療肺癌和(與其它藥物組合)治療子宮癌時，長春地辛通常以3毫克/平方米體表面給藥。長春地辛的其它副作用包括：貧血、血細胞毒性、疲勞、皮膚麻刺感或刺痛感覺，和皮膚毒性。

藥學上可接受的鹽

在本文所述方法的一些實施方案中，將所述式I化合物的藥學上可接受的鹽給藥至所述受試者(例如，人)。

如本文所用“藥學上可接受的”是指不是生物學不希望或其他方面不希望的物質(zhì)，例如，可將該物質(zhì)摻入給藥至患者的藥物組合物中而不會產(chǎn)生任何顯著不希望的生物學效應，也不會與該組合物中所含的任何其他成分以有害方式相互作用。藥學上可接受的載劑(例如，載體、佐劑和/或其他賦形劑)已優(yōu)選地符合毒理學和成品試驗的所需標準和/或已被包括在美國食品和藥品管理局制定的非活性成分指南中。

“藥學上可接受的鹽”包括，例如，無機酸的鹽和有機酸的鹽。鹽的實例可包括鹽酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、亞磺酸鹽、硝酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、2-羥乙基磺酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽和烷酸鹽(例如乙酸鹽、HOOC-(CH₂)_n-COOH，其中n為0-4)。此外，如果以酸加成鹽形式獲得本文所述化合物，則該游離堿可通過將所述酸鹽的溶液堿化獲得。相反地，如果所述產(chǎn)物是游離堿，則加成鹽(特別是藥學上可接受的加成鹽)可通過將所述游離堿溶于合適的有機溶劑中并用酸處理該溶液進行制備，其根據(jù)由堿化合物制備酸加成鹽的常規(guī)操作。本領域技術人員將理解可用于制備無毒藥學上可接受的加成鹽的各種合成方法。

術語“有效量”、“藥物有效量”和“治療有效量”是指可能有效引起所需生物或醫(yī)療響應的量，包括當給藥化合物至受試者以治療疾病時足以實現(xiàn)該疾病的治療的量。所述有效量將根據(jù)化合物、待治療受試者的疾病及其嚴重性和年齡、體重等而改變。該有效量可包括一定范圍的量。藥物有效量包括當與其它藥物組合時有效的藥物的量。

在本發(fā)明一些實施方案中，式I的化合物的藥學上可接受的鹽為二甲磺酸鹽。在本發(fā)明一些實施方案中，長春花生物堿的藥學上可接受的鹽為硫酸鹽。在本發(fā)明一些實施方案中，式I的化合物的藥學上可接受的鹽為二甲磺酸鹽且長春花生物堿的藥學上可接受的鹽為硫酸鹽。在本發(fā)明一個實施方案中，式I的化合物的藥學上可接受的鹽為二甲磺酸鹽且所述長春花生物堿為長春新堿，其中所述藥學上可接受的鹽為硫酸長春新堿。

藥物組合物

在本文所述方法的一些實施方案中，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，存在于藥物組合物中，所述藥物組合物包含所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，和至少一種藥學上可接受的載劑。藥學上可接受的載劑可包括藥學上可接受的載體、輔料和/或其他賦形劑，并且其他成分也可被視為藥學上可接受的，只要它們與該制劑的其他成分相容且對其接受者無害。

本文所述的式I化合物的藥物組合物可使用任意常規(guī)方法制備，例如，混合、溶解、制粒、制錠、研磨、乳化、包封、包埋、熔紡、噴霧干燥或凍干工藝。最佳藥物制劑可由本領域技術人員根據(jù)給藥途徑和所需劑量進行確定。這種制劑可影響所施用的藥物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除率。根據(jù)所治療的病癥，可配制這些藥物組合物并全身給藥或局部給藥。

術語“載體”是指稀釋劑、崩解劑、沉淀抑制劑、表面活性劑、助流劑、粘合劑、潤滑劑以及與所述化合物一起施用的其他賦形劑和載劑。載體在本文以及在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中進行一般性描述。載體的實例包括，但不限于，單硬脂酸鋁、硬脂酸鋁、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、交聚維酮、異硬脂酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、羥乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥甲基纖維素、羥基二十八烷醇羥基硬脂酸酯、羥丙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、乳糖一水合物、硬脂酸鎂、甘露醇、微晶纖維素、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆407、聚維酮、二氧化硅、膠體二氧化硅、硅酮、硅酮粘合劑4102和硅酮乳液。但是，應理解，該藥物組合物中所選定的載體以及這種載體在所述組合物中的量可根據(jù)制劑的方法而變化(例如，干法制粒制劑、固體分散制劑)。

術語“稀釋劑”通常是指在遞送前用于稀釋感興趣的化合物的物質(zhì)。稀釋劑也可用于穩(wěn)定化合物。稀釋劑的實例可包括淀粉、糖、二糖、蔗糖、乳糖、多糖、纖維素、纖維素醚、羥丙基纖維素、糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、微晶纖維素、碳酸鈣或碳酸鈉、乳糖、乳糖一水合物、磷酸二鈣、纖維素、可壓縮糖、無水磷酸氫鈣、甘露醇、微晶纖維素和磷酸鈣。

術語“崩解劑”通常是指這樣一種物質(zhì)，其一旦加至固體制劑，則在給藥后促進該固體制劑的分裂或崩解并使得活性成分盡可能有效地釋放以允許其快速溶出。崩解劑的實例可包括玉米淀粉、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲纖維素鈉、交聚維酮、微晶纖維素、改性的玉米淀粉、羧甲基淀粉鈉、聚維酮、預膠化淀粉和海藻酸。

術語“沉淀抑制劑”通常是指防止或抑制所述活性劑從過飽和溶液中沉淀的物質(zhì)。沉淀抑制劑的一個實例包括羥丙基甲基纖維素(HPMC)。

術語“表面活性劑”通常是指降低液體和固體之間的表面張力的物質(zhì)，其可提高所述活性劑的潤濕性或提高所述活性劑的溶解度。表面活性劑的實例包括泊洛沙姆和月桂基硫酸鈉。

術語“助流劑”通常是指用于片劑和膠囊制劑中以提高壓片過程中的流動性并產(chǎn)生抗結(jié)塊作用的物質(zhì)。助流劑的實例可包括膠體二氧化硅、滑石、煙霧硅膠、淀粉、淀粉衍生物和膨潤土。

術語“粘合劑”通常是指任意藥學上可接受的膜(film)，其可用于將所述活性成分和載體的惰性成分粘合在一起以維持粘合和分離的部分。粘合劑的實例可包括羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚維酮、共聚維酮和乙基纖維素。

術語“潤滑劑”通常是指加至粉末共混物中以防止在壓片或包封過程中被壓實的粉塊粘到設備上的物質(zhì)。潤滑劑可幫助所述片劑從模具中排出并可提高粉末流動。潤滑劑的實例可包括硬脂酸鎂、硬脂酸、二氧化硅、脂肪、硬脂酸鈣、聚乙二醇、硬脂酰富馬酸鈉或滑石；和增溶劑，例如脂肪酸，包括月桂酸、油酸和C₈/C₁₀脂肪酸。

治療方法

本發(fā)明提供了使用式I化合物或其藥學上可接受的鹽，在治療或預防的方面上選擇性或特異性地抑制Syk活性，并與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，在治療或預防的方面上選擇性或特異性地抑制微管蛋白或微管形成的方法。該方法包括以足以抑制Syk活性和/或抑制微管蛋白或微管形成的量，向有此需要的受試者(例如，人)給藥式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物，且與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合。所述方法可用于治療患有或易患病癥的受試者(例如，人)，所述病癥的癥狀或病狀是由Syk的表達或活性所介導的。

“治療”是為了獲得有益或所需結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方法。有益或所需的臨床結(jié)果可包括以下中的一種或多種：

(i)減少由該疾病產(chǎn)生的一種多種癥狀；

(ii)降低該疾病的嚴重程度和/或穩(wěn)定該疾病(例如，延遲該疾病的惡化)；

(iii)延遲該疾病的擴散(例如，轉(zhuǎn)移)；

(iv)延遲或減緩該疾病的復發(fā)和/或該疾病的進展；

(v)改善該疾病狀態(tài)和/或提供該疾病的緩解(無論是部分緩解或整體緩解)和/或減少治療該疾病所需的一種或多種其他藥物的量；

(vi)提高生存質(zhì)量；和/或

(vii)延長生存期。

“延遲”疾病或病癥的發(fā)展是指推遲、阻礙、減緩、延緩、穩(wěn)定和/或擱延所述疾病或病癥的發(fā)展。該延遲可為不同的時間長度，其取決于所述疾病或病癥的病史，和/或所治療的受試者?！把舆t”疾病或病癥的發(fā)展的方法是指，相比于未使用該方法，在給定時限內(nèi)降低疾病或病癥發(fā)展的可能性和/或在給定時限內(nèi)降低疾病或病癥的嚴重程度的方法。這種比較通常是基于臨床研究，該研究使用了統(tǒng)計學顯著量的受試者。疾病或病癥的發(fā)展可使用標準方法進行檢測，例如常規(guī)身體檢查、乳房X射線攝影術、成像或活組織檢查。發(fā)展也可指最初檢測不到的疾病或病癥的進展，并包括發(fā)生、復發(fā)和發(fā)作。

在一些實施方案中，可將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合，其被給藥至有面臨所述疾病或病癥的風險或有所述疾病或病癥家族史的受試者(例如，人)。

術語“抑制”表示生物活性或過程的基線活性的降低?！耙种芐yk活性”是指相對于不存在所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽時的Syk活性，由于直接或間接響應于這種化合物或其藥學上可接受的鹽的存在，Syk的活性降低。在一些實施方案中，所述Syk活性的抑制可與同一受試者治療前相比較，或與未接受治療的其他受試者相比較?！耙种莆⒐艿鞍仔纬傻幕钚浴笔侵赶鄬τ诓淮嬖谒鲩L春花生物堿或其藥學上可接受的鹽時的微管蛋白形成的活性，由于直接或間接響應于長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的存在，降低了微管蛋白的形成。在一些實施方案中，微管蛋白形成的抑制可與同一受試者治療前相比較，或與其它未接受該治療的受試者比較。

疾病

在一些實施方案中，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，被用于治療癌癥。在一些實施方案中，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，用于治療惡性血液病。在一些實施方案中，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，抑制造血來源的癌細胞的生長或增殖。在一些實施方案中，所述癌細胞是淋巴來源的，且在一些實施方案中，所述癌細胞與B淋巴細胞或B淋巴細胞祖細胞有關或衍生自B淋巴細胞或B淋巴細胞祖細胞。

適于使用本發(fā)明公開的方法進行治療的惡性血液病包括，但不限于，淋巴瘤(例如，淋巴和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織的惡性腫瘤，例如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴細胞性淋巴瘤)；多發(fā)性骨髓瘤；白血病(例如，淋巴細胞性白血病、慢性髓性(髓細胞性)白血病)。造血來源或其他來源的表達Syk的其他癌細胞也可通過給藥本文所述的多晶型物及其組合物進行治療。

在具體實施方案中，所述惡性血液病為白血病或淋巴瘤。在一些實施方案中，所述惡性血液病為急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、慢性骨髓性白血病(CML)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、低侵襲性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)、難治性iNHL、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(WM)、T-細胞淋巴瘤、B-細胞淋巴瘤、彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、淋巴漿細胞性淋巴瘤(LPL)和邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)。

在一個實施方案中，所述癌癥為T-細胞急性成淋巴細胞性白血病(T-ALL)，或B-細胞急性成淋巴細胞性白血病(B-ALL)。在另一實施方案中，所述癌癥為慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。在另一實施方案中，所述癌癥為非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一個實施方案中，所述NHL為彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、淋巴漿細胞性淋巴瘤(LPL)和邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)。在一個實施方案中，所述癌癥為低侵襲性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)。

在一些實施方案中，式I的化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，用于治療實體瘤癌癥。在一些實施方案中，式I的化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，用于治療一些實體瘤癌癥，如胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸-直腸癌、乳癌、肝細胞癌。在一些實施方案中，式I的化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，用于治療具有Syk活性的表達或其中表達Syk的一些實體瘤癌癥。其它表達Syk的實體瘤癌細胞可通過給藥本文所述的多晶型物和其組合物而治療。

在又一方面，本發(fā)明提供了治療患有Syk-介導的障礙的受試者(例如，人)的方法，其中向所述受試者給藥式I化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物，其與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合。本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)受試者(例如，人)的Syk的方法，其中向所述受試者給藥式I化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物，其與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合。

在本文所述的任意方法中，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，可作為單位劑量(例如以片劑的形式)給藥至所述個體。在本文所述的任一方法中，所述長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽，可通過IV(靜脈內(nèi))遞送而被給藥于個體。

本文所提供的任何治療方法都可用于治療晚期癌癥。本文所提供的任何治療方法都可用于治療局部晚期的癌癥。本文所提供的任何治療方法都可用于治療早期癌癥。本文所提供的任何治療方法都可用于治療緩解期癌癥。在本文提供的任意治療方法的一些實施方案中，所述癌癥已在緩解后復發(fā)。在本文提供的任意治療方法的一些實施方案中，所述癌癥是進行性癌癥。

受試者

所提供的任意治療方法可用于治療已被診斷為或疑似患有癌癥的受試者。“受試者”是指動物，例如哺乳動物(包括人)，其已為或?qū)橹委煛⒂^察或?qū)嶒灥膶ο?。本文所述的方法可用于人的療法?或獸醫(yī)應用。在一些實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在一個實施方案中，所述受試者是人。

在本文提供的任意方法的一些實施方案中，所述受試者是有發(fā)展癌癥風險的人(例如，遺傳上或在其他方面傾向于發(fā)展癌癥的人)和已診斷為或還未診斷為患有癌癥的人。如本文所用，“有風險的”受試者是指有發(fā)展癌癥(例如，惡性血液病或?qū)嶓w瘤癌癥)風險的受試者。所述受試者可已患有可檢測到的疾病或者可未患有可檢測到的疾病，以及在本文所述治療方法之前可能已表現(xiàn)出或可能未表現(xiàn)出可檢測到的疾病。有風險的受試者可具有一種或多種所謂的危險因素，其為與如本文所述的癌癥的發(fā)展相關的可測參數(shù)。具有一種或多種這些危險因素的受試者比沒有這些危險因素的個體具有更高發(fā)展癌癥的概率。

這些危險因素可包括，例如，年齡、性別、種族、飲食、先前病史、先兆疾病(precursor disease)的存在、基因(例如，遺傳)原因和環(huán)境暴露。在一些實施方案中，有患癌癥風險的受試者包括，例如，其親戚已經(jīng)歷這一疾病的受試者，和通過基因或生化標記物分析確定風險的那些?；及┌Y的前史也可以是例如癌癥復發(fā)的危險因素。

本發(fā)明提供了治療受試者(例如，人)的方法，所述受試者有“極高風險”或“高風險”患癌癥(例如，惡性血液病)。這種受試者可通過一些基因缺失和/或突變的存在來鑒定。在一個方面，極高風險的受試者是具有17p缺失、TP53突變，或其組合的人。在一個方面，高風險的受試者是具有NOTCH1、SF3B1突變、11q缺失或其任意組合的人。因此，應理解，本文詳述的治療方法可能，在一些情況下，通過檢測17p缺失、TP53突變、NOTCH1、SF3B1突變、11q缺失或其任意組合中一種或多種的存在與否來選擇具有極高患癌癥風險或具有高患癌癥風險的受試者。

本發(fā)明還提供了治療受試者(例如，人)的方法，所述受試者表現(xiàn)出一種或多種與癌癥(例如，惡性血液病或?qū)嶓w瘤癌癥)相關的癥狀。在一些實施方案中，所述受試者是早期癌癥。在其他實施方案中，所述受試者是晚期癌癥。

本發(fā)明還提供了治療受試者(例如，人)的方法，所述受試者正進行一種或多種用于治療癌癥(例如，惡性血液病或?qū)嶓w瘤癌癥)的標準療法，例如化療、放療、免疫療法和/或手術。因此，在一些上述實施方案中，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，在施用化療、放療、免疫療法和/或手術之前、之中或之后進行給藥。

在一些實施方案中，所述受試者可為人，其為(i)至少一種抗癌療法難以治愈的，或(ii)在用至少一種抗癌療法治療后復發(fā)的，或(i)和(ii)兩者。在一些實施方案中，所述受試者是至少兩種、至少三種或至少四種抗癌療法(包括，例如，標準或?qū)嶒炐缘幕?難以治愈的。

在一些實施方案中，所述受試者是至少一種、至少兩種、至少三種或至少四種抗癌療法(包括，例如，標準或?qū)嶒炐曰?難以治愈的，所述抗癌療法選自氟達拉濱、利妥昔單抗、奧比妥珠單抗(obinutuzumab)、烷化劑、阿侖單抗和其他化療治療，例如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松)；R-CHOP(利妥昔單抗-CHOP)；hyperCVAD(超分割環(huán)磷酰胺(hyperfractionated cyclophosphamide)、長春新堿、多柔比星、地塞米松、甲氨蝶呤、阿糖胞苷)；R-hyperCVAD(利妥昔單抗-hyperCVAD)；FCM(氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、米托蒽醌)；R-FCM(利妥昔單抗、氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、米托蒽醌)；硼替佐米和利妥昔單抗；坦西莫司和利妥昔單抗；坦西莫司和碘-131托西莫單抗和CHOP；CVP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松)；R-CVP(利妥昔單抗-CVP)；ICE(異環(huán)磷酰胺、卡鉑、依托泊苷)；R-ICE(利妥昔單抗-ICE)；FCR(氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、利妥昔單抗)；FR(氟達拉濱、利妥昔單抗)；和D.T.PACE(地塞米松、沙立度胺、順鉑、環(huán)磷酰胺、依托泊苷)。

其他化療治療(包括標準或?qū)嶒炐缘幕?的實例如下所述。此外，一些淋巴瘤的治療在Cheson,B.D.,Leonard,J.P.,“Monoclonal Antibody Therapy for B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma”The New England Journal of Medicine 2008,359(6),第613-626頁；和Wierda,W.G.,“Current and Investigational Therapies for Patients with CLL”Hematology 2006,第285-294頁中討論。美國的淋巴瘤發(fā)病模式在Morton,L.M等人，“Lymphoma Incidence Patterns by WHO Subtype in the United States,1992-2001”Blood 2006,107(1),第265-276頁中進行概述。

例如，非霍奇金淋巴瘤(NHL)(尤其是B細胞來源的)的治療包括使用單克隆抗體、標準化療方法(例如，CHOP、CVP、FCM、MCP等)、放射性免疫療法及其組合，特別是抗體療法與化療的結(jié)合。用于非霍奇金淋巴瘤/B細胞癌癥的非綴合單克隆抗體的實例包括利妥昔單抗、阿侖單抗、人或人源化的抗-CD20抗體、魯昔單抗、抗-TRAIL、貝伐單抗、加利昔單抗(galiximab)、依帕珠單抗、SGN-40和抗-CD74。用于治療非霍奇金淋巴瘤/B細胞癌癥的實驗性抗體藥物的實例包括奧法木單抗(ofatumumab)、ha20、PRO131921、阿侖單抗、加利昔單抗、SGN-40、CHIR-12.12、依帕珠單抗、魯昔單抗、阿泊珠單抗、米拉珠單抗(milatuzumab)和貝伐單抗。用于非霍奇金淋巴瘤/B細胞癌癥的化療的標準方案的實例包括CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松)、FCM(氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、米托蒽醌)、CVP(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松)、MCP(米托蒽醌、苯丁酸氮芥和潑尼松龍)、R-CHOP(利妥昔單抗加CHOP)、R-FCM(利妥昔單抗加FCM)、R-CVP(利妥昔單抗加CVP)和R-MCP(R-MCP)。用于非霍奇金淋巴瘤/B細胞癌癥的放射性免疫療法的實例包括釔-90-標記的替伊莫單抗和碘-131-標記的托西莫單抗。

在另一實例中，套細胞淋巴瘤(MCL)的治療性治療包括組合的化學療法，例如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松)、hyperCVAD(超分割環(huán)磷酰胺、長春新堿、多柔比星、地塞米松、甲氨蝶呤、阿糖胞苷)和FCM(氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、米托蒽醌)。此外，這些方案可補充有單克隆抗體利妥昔單抗(Rituxan)以形成組合療法R-CHOP、hyperCVAD-R和R-FCM。其他方法包括將任意上述療法與干細胞移植或用ICE(異環(huán)磷酰胺、卡鉑和依托泊苷)的治療相結(jié)合。治療套細胞淋巴瘤的其他方法包括免疫療法，例如使用單克隆抗體，如利妥昔單抗(Rituxan)。利妥昔單抗可用于治療低侵襲性B細胞癌癥，包括邊緣區(qū)淋巴瘤、WM、CLL和小淋巴細胞性淋巴瘤。利妥昔單抗和化療劑的組合是特別有效的。改進的方法是放射性免疫療法，其中將單克隆抗體與放射性同位素顆粒組合(例如碘-131托西莫單抗和釔-90替伊莫單抗。在另一實例中，用于與CHOP進行連續(xù)治療。另一免疫療法實例包括使用癌癥疫苗，其是基于個體患者腫瘤的基因構(gòu)成。淋巴瘤疫苗的實例是GTOP-99治療套細胞淋巴瘤的其他方法包括自體干細胞移植加上高劑量化療，或者套細胞淋巴瘤的治療包括給藥蛋白酶體抑制劑，例如(硼替佐米或PS-341)，或血管生成抑制劑，例如沙立度胺，尤其是與Rituxan組合。另一治療方法是施用引起B(yǎng)cl-2蛋白降解并提高癌細胞對化療的敏感性的藥物，例如與其他化療劑組合的奧利默森(Genasense)。另一治療方法包括施用mTOR抑制劑，其可導致細胞生長的抑制和甚至細胞死亡；非限制性實例是坦西莫司(CCI-779)，和坦西莫司與或其他化療劑組合。

治療MCL的其他新近的療法已被公開(Nature Reviews；Jares，P.2007)。這種實例包括夫拉平度(Flavopiridol)、PD0332991、R-roscovitine(Selicilib，CYC202)、苯乙烯基砜、Obatoclax(GX15-070)、TRAIL、抗-TRAIL DR4和DR5抗體、坦西莫司(CCl-779)、依維莫司(RAD001)、BMS-345541、姜黃素、伏立諾他(SAHA)、沙立度胺、來那度胺(lenalidomide，CC-5013)和格爾德霉素(17-AAG)。

用于治療沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥(WM)的其他治療劑的實例包括哌立福辛、硼替佐米利妥昔單抗、枸櫞酸西地那非CC-5103、沙立度胺、依帕珠單抗(hLL2-抗-CD22人源化抗體)、辛伐他汀、enzastaurin、Campath-1H、地塞米松、DT PACE、奧利默森、抗瘤酮A10、抗瘤酮AS2-1、阿侖單抗、β-阿理新(beta alethine)、環(huán)磷酰胺、鹽酸多柔比星、潑尼松、硫酸長春新堿、氟達拉濱、非格司亭、美法侖、重組干擾素-α、卡莫司汀、順鉑、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、依托泊苷、美法侖、多拉司他汀10、銦In 111單克隆抗體MN-14、釔Y 90人源化依帕珠單抗、抗-胸腺細胞球蛋白、白消安、環(huán)孢菌素、甲氨蝶呤、麥考酚酸嗎乙酯、治療性的同種異體淋巴細胞、釔Y 90替伊莫單抗、西羅莫司、他克莫司、卡鉑、噻替派、紫杉醇、阿地白介素、重組干擾素-α、紫杉醇、異環(huán)磷酰胺、美司鈉、重組白介素-12、重組白介素-11、Bcl-2家族蛋白抑制劑ABT-263、地尼白介素(denileukin diftitox)、坦螺旋霉素(Tanespimycin)、依維莫司、聚乙二醇化的非格司亭、伏立諾他、alvocidib、重組的flt3配體、重組的人血小板生成素、淋巴因子激活的殺傷細胞、氨磷汀三水合物、氨基喜樹堿、鹽酸依立替康、乙酸卡泊芬凈、氯法拉濱、阿法依伯汀、奈拉濱、噴司他丁、沙莫司亭、雙酒石酸長春瑞濱、WT-1類似物肽疫苗、WT1 126-134肽疫苗、芬維A胺、伊沙匹隆(Ixabepilone)、奧沙利鉑、單克隆抗體CD19、單克隆抗體CD20、ω-3脂肪酸、鹽酸米托蒽醌、醋酸奧曲肽、托西莫單抗和碘I-131托西莫單抗、莫特沙芬釓(motexafin gadolinium)、三氧化二砷、替吡法尼(tipifarnib)、自體人腫瘤衍生的HSPPC-96、維妥珠單抗(veltuzumab)、苔蘚抑素1和聚乙二醇化的脂質(zhì)體鹽酸多柔比星，及其任意組合。

用于治療WM的治療過程的實例包括外周血干細胞移植、自體造血干細胞移植、自體骨髓移植、抗體療法、生物療法、酶抑制劑療法、全身輻射、輸注干細胞、干細胞支持的骨髓消融、體外處理的外周血干細胞移植、臍帶血移植、免疫酶技術、藥理學研究、低-LET鈷-60γ射線療法、博來霉素、常規(guī)手術、放療和非清髓性同種異體造血干細胞移植。

用于治療彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)藥物療法(Blood 2005Abramson，J.)的其他治療劑的實例包括環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松、抗-CD20單克隆抗體、依托泊苷、博來霉素、針對沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥列出的許多藥劑及其任意組合，例如ICE和R-ICE。

用于治療慢性淋巴細胞性白血病(CLL)(Spectrum，2006，F(xiàn)ernandes，D.)的其他治療劑的實例包括苯丁酸氮芥(Leukeran)、環(huán)磷酰胺(Cyloxan、Endoxan、Endoxana、Cyclostin)、氟達拉濱(Fludara)、噴司他丁(Nipent)、克拉屈濱(Leustarin)、多柔比星(Adriblastine)、長春新堿(安可平)、潑尼松、潑尼松龍、阿侖單抗(Campath，MabCampath)、針對沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥列出的許多藥劑以及化療和化學免疫療法的組合，包括常規(guī)組合方案：CVP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松)；R-CVP(利妥昔單抗-CVP)；ICE(異環(huán)磷酰胺、卡鉑、依托泊苷)；R-ICE(利妥昔單抗-ICE)；FCR(氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、利妥昔單抗)；和FR(氟達拉濱、利妥昔單抗)。

在又一方面，本發(fā)明提供了使受試者(例如，人)致敏的方法，所述受試者為(i)至少一種化療治療難以治愈的，或(ii)處于用化療進行治療后的復發(fā)中，或為(i)和(ii)二者，其中所述方法包括向所述受試者給藥式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物，其與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合。致敏的受試者是對治療有響應的受試者，所述治療涉及向受試者或尚未發(fā)展對這種治療抵抗的受試者給藥所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合。在本發(fā)明一個實施方案中，致敏的受試者是對治療有響應的受試者，所述治療涉及向受試者或尚未發(fā)展對這種治療抵抗的受試者給藥所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽。

單一療法和組合療法

單一療法

在一個方面，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合，以單一療法(即唯一治療方案)給藥至受試者(例如，人)。本發(fā)明提供了治療方法，其中給藥至受試者(例如，人)的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合，是給藥至所述受試者的唯一的抗癌治療方案。本發(fā)明提供了治療方法，其中將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合，給藥至受試者(例如，人)，其中所述受試者不接受任何其他抗癌治療。在一個變型中，所述受試者沒有正在經(jīng)歷任何使用一種或多種PI3K抑制劑的其它抗癌治療。在一些實施方案中，這種PI3K抑制劑可包括化合物A、B和C，其結(jié)構(gòu)如下所提供。

在一個變型中，所述受試者不接受任何使用化合物A或其藥學上可接受的鹽的其他抗癌治療。在另一變型中，所述受試者不接受任何使用化合物B或其藥學上可接受的鹽的其他抗癌治療。在又一變型中，所述受試者不接受任何使用化合物C或其藥學上可接受的鹽的其他抗癌治療。

在一些實施方案中，其中所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，作為單一治療方案給藥至所述受試者，所述受試者可為人，其為(i)至少一種化療治療難以治愈的，或(ii)在用至少一種抗癌療法治療后復發(fā)，或(i)和(ii)二者。在一些實施方案中，所述受試者為至少兩種、至少三種或至少四種抗癌療法(包括，例如，標準或?qū)嶒炐缘幕?難以治愈的。例如，在一些實施方案中，所述受試者可為人，其為(i)使用抗-CD20抗體、烷化劑(例如，苯達莫司汀)、嘌呤類似物(例如，氟達拉濱)、蒽環(huán)類抗生素或其任意組合的療法難以治愈的；(ii)在用抗-CD20抗體、烷化劑(例如，苯達莫司汀)、嘌呤類似物(例如，氟達拉濱)、蒽環(huán)類抗生素或其任意組合治療后復發(fā)的，或(i)和(ii)二者。

如上所述，至少一種抗癌療法難以治愈的和/或在用至少一種抗癌療法治療后復發(fā)的人受試者可以已經(jīng)接受了一種或多種先前療法。在一些實施方案中，這種受試者在使用本文所述的方法之前(例如，在給藥作為單一療法的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽之前)已經(jīng)接受了一種、兩種、三種或四種，或至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種，或一至十種、一至九種、一至八種、一至七種、一至六種、一至五種或一至四種抗癌療法。

應理解，當用所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，作為本文所述的單一治療方案治療受試者(例如人)時，所述受試者也可進行一種或多種非抗癌療法的其他療法。

在一些實施方案中，提供了在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括向受試者給藥治療有效量的式I的化合物或藥學上可接受的鹽，和治療有效量的長春花生物堿或藥學上可接受的鹽，其中：所述長春花生物堿選自長春新堿、長春地辛、長春瑞濱和長春堿，且所述受試者為人，其(i)為至少一種抗癌治療難以治愈的，或(ii)處于用至少一種抗癌治療進行治療后的復發(fā)中，或為其組合。在一些其它實施方案中，提供了在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括向受試者給藥治療有效量的式I的化合物或藥學上可接受的鹽，和治療有效量的長春花生物堿或藥學上可接受的鹽，其中所述長春花生物堿選自長春新堿、長春地辛、長春瑞濱和長春堿，且其中進一步所述受試者為沒有正在經(jīng)歷任何其它抗癌治療的人；且所述受試者(i)為至少一種抗癌治療難以治愈的，或(ii)處于用至少一種抗癌治療進行治療后的復發(fā)中，或為其組合。

在一些實施方案中，提供了在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括向受試者給藥治療有效量的式I的化合物或藥學上可接受的鹽，和治療有效量的長春花生物堿或藥學上可接受的鹽，其中：所述長春花生物堿選自長春新堿和長春堿，且所述受試者為人，其(i)為至少一種抗癌治療難以治愈的，或(ii)處于用至少一種抗癌治療進行治療后的復發(fā)中，或為其組合。在一些其它實施方案中，提供了在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括向受試者給藥治療有效量的式I的化合物或藥學上可接受的鹽，和治療有效量的長春花生物堿或藥學上可接受的鹽，其中所述長春花生物堿選自長春新堿和長春堿，且其中進一步所述受試者為沒有正在經(jīng)歷任何其它抗癌治療的人；且所述受試者(i)為至少一種抗癌治療難以治愈的，或(ii)處于用至少一種抗癌治療進行治療后的復發(fā)中，或為其組合。

在一個實施方案中，提供了在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括向受試者給藥治療有效量的式I的化合物或藥學上可接受的鹽，和治療有效量的長春花生物堿或藥學上可接受的鹽，其中：所述長春花生物堿為長春新堿，且所述受試者為人，其(i)為至少一種抗癌治療難以治愈的，或(ii)處于用至少一種抗癌治療進行治療后的復發(fā)中，或為其組合。在一個其它實施方案，提供了在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括向受試者給藥治療有效量的式I的化合物或藥學上可接受的鹽，和治療有效量的長春花生物堿或藥學上可接受的鹽，其中所述長春花生物堿為長春新堿，且其中進一步所述受試者為沒有正在經(jīng)歷任何其它抗癌治療的人；且所述受試者(i)為至少一種抗癌治療難以治愈的，或(ii)處于用至少一種抗癌治療進行治療后的復發(fā)中，或為其組合。

在一個實施方案中，提供了在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括向受試者給藥治療有效量的式I的化合物或藥學上可接受的鹽，和治療有效量的長春花生物堿或藥學上可接受的鹽，其中：所述長春花生物堿為長春堿，且所述受試者為人，其(i)為至少一種抗癌治療難以治愈的，或(ii)處于用至少一種抗癌治療進行治療后的復發(fā)中，或為其組合。在一個其它實施方案中，提供了在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括向受試者給藥治療有效量的式I的化合物或藥學上可接受的鹽，和治療有效量的長春花生物堿或藥學上可接受的鹽，其中所述長春花生物堿為長春堿，且其中進一步所述受試者為沒有正在經(jīng)歷任何其它抗癌治療的人；且所述受試者(i)為至少一種抗癌治療難以治愈的，或(ii)處于用至少一種抗癌治療進行治療后的復發(fā)中，或為其組合。

在其它實施方案中(其中式I的化合物或其藥學上可接受的鹽，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合作為單一治療方案給藥于受試者)，該受試者可具有17p缺失、TP53突變、NOTCH1、SF3B1突變、11q缺失，或其任意組合。在一個實施方案中(其中式I的化合物或其藥學上可接受的鹽與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合，作為單一治療方案給藥于受試者)，該受試者具有17p缺失、TP53突變或其組合。在另一實施方案中(其中式I的化合物或其藥學上可接受的鹽與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合，作為單一治療方案給藥于受試者)，該受試者具有NOTCH1、SF3B1突變、11q缺失，或其任意組合。

其它組合療法

本發(fā)明還提供了治療方法，其中將給藥至受試者(例如，人)的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合，與一種或多種額外的療法(包括一種或多種上述抗癌療法)進一步組合給予受試者(例如，人)。因此，在一些實施方案中，用于治療有此需要的受試者(例如，人)的癌癥的方法包括向所述受試者給藥治療有效量的式I化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物，其與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，可與用于治療所述癌癥的一種或多種額外的療法一起使用。所述一種或多種額外的療法可包括給藥一種或多種治療劑。

在一些實施方案中，所述一種或多種額外的療法涉及使用磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑，包括例如，化合物A、B和C，或這些化合物的藥學上可接受的鹽。

在上述方法的其他實施方案中(其中涉及使用所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，再與一種或多種額外的療法組合)，所述一種或多種額外的療法是除了使用化合物A、B和C或這些化合物的藥學上可接受的鹽的療法之外的療法。在上述方法的一個實施方案中(其中涉及使用所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，再與一種或多種額外的療法組合)，所述一種或多種額外的療法是除了使用化合物A或其藥學上可接受的鹽的療法之外的療法。在上述方法的其他實施方案中(其中涉及使用所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，再與一種或多種額外的療法組合)，所述一種或多種額外的療法是除了使用化合物B或其藥學上可接受的鹽的療法之外的療法。還在上述方法的其他實施方案中(其中涉及使用所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，再與一種或多種額外的療法組合)，所述一種或多種額外的療法是除了使用化合物C或其藥學上可接受的鹽的療法之外的療法。

在其他實施方案中，所述一種或多種額外的治療劑可為賴氨酰氧化酶樣2(LOXL2)抑制劑和結(jié)合LOXL2的物質(zhì)，包括例如，具有針對人LOXL2的免疫球蛋白IgG4同種型的人源化單克隆抗體(mAb)。

在其他實施方案中，所述一種或多種額外的治療劑可為抗炎劑。使用所述一種或多種額外的治療劑的治療可在用本文所述藥物組合物的治療之前、同時或之后進行。在一些實施方案中，將本文所述藥物組合物與另一治療劑在單一劑型中組合，然后將其在本發(fā)明的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽之前、同時或之后給藥?？捎糜谂c至少一種本文所述的化學實體的組合中的合適的抗腫瘤治療劑包括，但不限于，化療劑，例如絲裂霉素C、卡鉑、紫杉酚、順鉑、紫杉醇、依托泊苷、多柔比星或包含至少一種上述化療劑的組合。放射治療的抗癌劑也可單獨使用或與化療劑組合使用。

所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，可用作化學致敏劑，并因此，當與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合時，可用于與其他化學治療藥物(尤其是，誘導細胞凋亡的藥物)組合。

本發(fā)明還提供了用于提高癌細胞對化療的敏感性的方法，其包括向進行化療的受試者(例如，人)給藥化療劑以及式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物，其與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合，其量足以提高癌細胞對所述化療劑的敏感性?？膳c本文所述化學實體組合使用的其他化學治療藥物的實例包括拓撲異構(gòu)酶I抑制劑(喜樹堿或托泊替康)、拓撲異構(gòu)酶II抑制劑(例如道諾霉素和依托泊苷)、烷化劑(例如環(huán)磷酰胺、美法侖和BCNU)、針對微管蛋白的藥劑(例如紫杉酚和長春堿，或其它長春花生物堿)和生物制劑(例如抗體，例如抗CD20抗體、IDEC8、免疫毒素和細胞因子)。在用于提高癌細胞對化療敏感性的方法的一個實施方案中，所述化療劑是除了化合物A或其藥學上可接受的鹽之外的化療劑。在用于提高癌細胞對化療敏感性的方法的另一實施方案中，所述化療劑是除了化合物B或其藥學上可接受的鹽之外的化療劑。還在用于提高癌細胞對化療敏感性的方法的另一實施方案中，所述化療劑是除了化合物C或其藥學上可接受的鹽之外的化療劑。

在一些實施方案中，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物，與(利妥昔單抗)或通過選擇性耗竭CD20+B細胞起作用的其他藥劑組合使用。

本發(fā)明包括的是治療方法，其中將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物，與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的組合，與抗炎劑組合給藥?？寡讋┌ǖ幌抻贜SAID、非特異性和COX-2特異性環(huán)氧合酶抑制劑、金化合物、皮質(zhì)類固醇、甲氨蝶呤、腫瘤壞死因子受體(TNF)受體拮抗劑、免疫抑制劑和甲氨蝶呤。NSAID的實例包括，但不限于布洛芬、氟比洛芬、萘普生和萘普生鈉、雙氯芬酸、雙氯芬酸鈉和米索前列醇的組合、舒林酸、奧沙普秦、二氟尼柳、吡羅昔康、吲哚美辛、依托度酸、非諾洛芬鈣、酮洛芬、萘丁美酮鈉、柳氮磺吡啶、托美丁鈉和羥氯喹。NSAID的實例還包括COX-2特異性抑制劑(即，抑制COX-2的化合物，其IC50最高是抑制COX-1的IC50的1/50)，例如塞來考昔、伐地考昔、蘆米考昔、艾托考昔和/或羅非考昔。

在其他實施方案中，所述抗炎劑是水楊酸鹽/酯。水楊酸鹽/酯包括但不限于乙酰水楊酸或阿司匹林、水楊酸鈉和水楊酸膽堿和水楊酸鎂。所述抗炎劑還可為皮質(zhì)類固醇。例如，所述皮質(zhì)類固醇可選自可的松、地塞米松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍、潑尼松龍磷酸鈉和潑尼松。在一些實施方案中，所述抗炎劑是金化合物，例如硫代蘋果酸金鈉或金諾芬。在一些實施方案中，所述抗炎劑是代謝抑制劑，例如二氫葉酸還原酶抑制劑，例如甲氨蝶呤，或二氫乳清酸脫氫酶抑制劑，例如來氟米特。

在一些實施方案中，使用以下組合，其中至少一種抗炎化合物是抗-C5單克隆抗體(例如艾庫組單抗(eculizumab)或培克珠單抗(pexelizumab))、TNF拮抗劑(例如依那西普)或英利昔單抗(其為抗-TNFα單克隆抗體)。

在一些實施方案中，使用以下組合，其中至少一種治療劑是免疫抑制劑化合物，例如甲氨蝶呤、來氟米特、環(huán)孢菌素、他克莫司、硫唑嘌呤或麥考酚酸嗎乙酯。

應理解，可使用上述額外治療劑的任意組合，如同各種和每種組合被單獨列出一樣。例如，在一些實施方案中，所述額外的治療劑包括PI3K抑制劑和LOXL2抑制劑，如simtuzumab。

給藥方案和給藥方式

在本文提供的方法中，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物以治療有效量給藥以實現(xiàn)其預期目的。如本文所用，“治療有效量”當涉及式I的化合物時，是足以調(diào)節(jié)Syk表達或活性的量，并從而治療患有適應癥的受試者(例如，人)，或改善或減輕該適應癥的已有癥狀。例如，式I的化合物或其藥學上可接受的鹽的治療有效量可為足以降低疾病或病癥的癥狀的量，所述疾病或病癥響應于抑制Syk活性。

在本文提供的方法中，式I的化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物，以治療有效量給藥以實現(xiàn)其預期目的。如本文所述，“治療有效量”當涉及長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽時，為足以抑制微管蛋白生長或形成、或抑制或減少微管形成、或干擾紡錘體形成的量，從而治療患有適應癥的受試者(例如人)，或改善或減輕該適應癥的已有癥狀。例如，長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的治療有效量可為足以減少疾病或病癥的癥狀的量，所述疾病或病癥響應于抑制微管蛋白活性和/或形成。

治療有效量的確定是在本領域技術人員能力范圍內(nèi)的，尤其在參考了本文提供的詳細公開內(nèi)容后。在一些實施方案中，治療有效量的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，可(i)減少癌細胞數(shù)目；(ii)減小腫瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、延緩、減緩、并優(yōu)選停止癌細胞浸潤周圍器官；(iv)抑制(例如，在一定程度上減緩并優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)延遲腫瘤的發(fā)生和/或復發(fā)；和/或(vii)在一定程度上減輕一種或多種與所述癌癥有關的癥狀。在各種實施方案中，所述量足以改善、緩和、減輕和/或延遲一種或多種癌癥癥狀。

所述治療有效量可根據(jù)所述受試者、所治療的疾病或病癥、所述受試者的體重和年齡、所述疾病或病癥的嚴重性和給藥方式而變化，其可由本領域技術人員容易地確定。

在本文提供的方法中，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽與長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽組合的給藥方案可根據(jù)例如適應癥、給藥途徑和該病癥的嚴重性而變化。根據(jù)給藥途徑，可根據(jù)體重、體表面積或器官大小計算合適的劑量。最終給藥方案是由主治醫(yī)師根據(jù)良好的醫(yī)療實踐進行確定，其中考慮了改變藥物作用的各種因素，例如，所述化合物的特定活性、疾病狀態(tài)的特性和嚴重性、患者的響應、患者的年齡、狀況、體重、性別和飲食，以及任何感染的嚴重性?？梢员豢紤]的其他因素包括給藥時間和頻率、藥物組合、反應敏感度和對療法的耐受性/響應。本領域技術人員可常規(guī)地對適于使用本文所述任意制劑的治療的劑量進行進一步細化，而無需過度實驗，尤其參考了所公開的劑量信息和測定法以及在人臨床試驗中所觀察到的藥代動力學數(shù)據(jù)后。適當?shù)膭┝靠赏ㄟ^使用已經(jīng)建立的用于確定體液或其他樣品中該藥物的濃度以及劑量響應數(shù)據(jù)的測試法來確定。

所選定的制劑和給藥途徑可根據(jù)個體受試者、在所述受試者中待治療的病癥的性質(zhì)和通常主治醫(yī)師的判斷進行制定。例如，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的治療指數(shù)，可通過以下增強：修飾或衍生所述化合物以用于靶向遞送至表達標記物的癌細胞，所述標記物鑒別該細胞。例如，所述化合物可連接至抗體，所述抗體識別針對癌細胞的選擇性或特異性標記物，以使所述化合物到達所述細胞的附近以在局部發(fā)揮其作用，如前文所述。參見例如，Pietersz等人，Immunol.Rev.，129:57(1992)；Trail等人，Science，261:212(1993)；和Rowlinson-Busza等人，Curr.Opin.Oncol.，4:1142(1992)。類似分析可適用于本發(fā)明的用長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的治療和本文的方法。

給藥方案

治療有效量的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，可以以單一劑量或多劑量提供以實現(xiàn)所需的治療終點。如本文所用，“劑量”是指受試者(例如，人)每次服用的活性成分(例如，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽)的總量。

用于人受試者的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的示例性劑量可為約0.01mg至約1800mg，或約0.01mg至約1500mg，或約10mg至約1500mg，或約10mg至約1300mg，或約10mg至約1000mg，或約10mg至約800mg，或約10mg至約600mg，或約10mg至約300mg，或約10mg至約200mg，或約10mg至約100mg，或約100mg至約800mg，或約100mg至約600mg，或約100mg至約300mg，或約100mg至約200mg，或約200mg至約350mg，或約250mg至約300mg，或約200mg至約400mg，或約400mg至約600mg，或約400mg至約800mg，或約600mg至約800mg，或約800mg至約1200mg，或約1200mg至約1600mg，或約50mg至約200mg，或約25mg，約50mg，約75mg，約100mg，約125mg，或約150mg，或約175mg，約200mg，約250mg，約300mg，約350mg，約400mg，約450mg，約500mg，約550mg，約600mg，約650mg，約700mg，或約750mg，或約800mg，或約850mg，或約900mg，或約950mg，或約1000mg，或約1100mg，或約1200mg，或約1300mg，或約1400mg，或約1500mg，或約1600mg，或約1800mg。在一個實施方案中，在本文提供的方法中給藥于受試者的式I的化合物或其藥學上可接受的鹽的劑量為約400mg。在一個實施方案中，在本文提供的方法中給藥于受試者的式I的化合物或其藥學上可接受的鹽的劑量為約800mg。

在其他實施方案中，所提供的方法包括通過給藥一定劑量的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽來連續(xù)治療受試者(例如，人)，其中該劑量實現(xiàn)了臨床療效，或通過遞增至可維持療效的水平來降低劑量。在具體實施方案中，所提供的方法包括向所述受試者(例如，人)給藥所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的初始每日劑量(100mg至1000mg)，并給藥后續(xù)每日劑量的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，持續(xù)至少6天，其中各后續(xù)每日劑量以50mg至400mg增加。因此，還應理解，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的劑量可通過遞增來增加，直至達到臨床療效。可使用約25mg、約50mg、約100mg、或約125mg、或約150mg、或約200mg、或約250mg、或約300mg的遞增量來增加該劑量。該劑量可每日增加一次、每隔一日增加一次、每周增加兩次、增加三次、增加四次、增加五次或增加六次，或每周增加一次。

給藥頻率將取決于所施用化合物的藥代動力學參數(shù)、給藥途徑和所治療的具體疾病。劑量和給藥頻率也可取決于藥代動力學和藥效學，以及毒性和治療有效性數(shù)據(jù)。例如，關于所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的藥代動力學和藥效學信息，可通過臨床前的體外和體內(nèi)研究收集，之后在人的臨床試驗過程中證實。因此，對于用于本文提供的方法中的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，治療有效量可由生物化學和/或基于細胞的測試進行初始評估。然后，可在動物模型中調(diào)配劑量以實現(xiàn)所需的調(diào)節(jié)Syk表達或活性的循環(huán)濃度范圍。由于進行了人研究，將獲得關于各疾病和病癥合適的劑量水平和治療持續(xù)時間的進一步信息。

所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的毒性和療效可在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏型ㄟ^標準藥學操作(例如，測定LD₅₀(致死50％群體的劑量)和ED₅₀(有效治療50％群體的劑量))確定。毒性和療效之間的劑量比率是“治療指數(shù)”，其通常表示為比率LD₅₀/ED₅₀。呈現(xiàn)大的治療指數(shù)(即，毒性劑量遠高于有效劑量)的化合物是優(yōu)選的。獲自這種細胞培養(yǎng)測試和額外的動物研究的數(shù)據(jù)可用于配制人用劑量范圍。這種化合物的劑量優(yōu)選處于包括ED₅₀的循環(huán)濃度范圍內(nèi)，且具有很小毒性或沒有毒性。

所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽可在進食條件下給藥。術語進食條件或其類似用語是指，在給藥所述化合物或其藥物組合物之前或同時，攝入或攝取了固體或液體形式的食物，或任意合適形式的卡路里。例如，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，可在攝入卡路里(例如，一餐)的數(shù)分鐘或數(shù)小時內(nèi)給藥至所述受試者(例如，人)。在一些實施方案中，所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，可在攝入卡路里的5-10分鐘、約30分鐘、或約60分鐘內(nèi)給藥至所述受試者(例如，人)。

本發(fā)明的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的治療有效量，可以單劑量或多劑量提供以實現(xiàn)所需治療終點。如本文所述，“劑量”是指被受試者(例如，人)每次服用的活性成分(例如，長春新堿或長春堿或其藥學上可接受的鹽)的總量。

用于人受試者的本發(fā)明的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的示例性劑量，可為約0.01mg-M²至約3.0mg-M²，這取決于長春花生物堿的特性，或為約0.01mg-M²至約2.5mg-M²，或約0.01mg-M²至約2.0mg-M²，或約0.01mg-M²至約1.9mg-M²，或約0.01mg-M²至約1.8mg-M²，或約0.01mg-M²至約1.7mg-M²，或約0.01mg-M²至約1.6mg-M²，或約0.01mg-M²至約1.5mg-M²，或約0.01mg-M²至約1.4mg-M²，或約0.01mg-M²至約1.3mg-M²，或約0.01mg-M²至約1.2mg-M²，或約0.01mg-M²至約1.1mg-M²，或約0.01mg-M²至約1.0mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.9mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.8mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.7mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.6mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.5mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.45mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.4mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.35mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.33mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.3mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.25mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.2mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.15mg-M²，或約0.01mg-M²至約0.01mg-M²，或約0.1mg-M²至約1.8mg-M²，或約0.15mg-M²至約1.7mg-M²，或約0.2mg-M²至約1.6mg-M²，或約0.25mg-M²至約1.5mg-M²，或約0.3mg-M²至約1.4mg-M²，或約0.33mg-M²至約1.3mg-M²，或約0.35mg-M²至約1.2mg-M²，或約0.4mg-M²至約1.1mg-M²，或約0.45mg-M²至約1.0mg-M²，或約0.5mg-M²至約0.9mg-M²，或約0.6mg-M²至約0.8mg-M²。在一個實施方案中，在本文提供的方法中給藥于受試者的本發(fā)明的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的劑量，為約1.5mg-M²。在一個實施方案中，在本文提供的方法中給藥于受試者的本發(fā)明的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的劑量，為約1.0mg-M²。在一個實施方案中，在本文提供的方法中給藥于受試者的本發(fā)明的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽的劑量，為約0.5mg-M²。

在其它實施方案中，提供的方法包括通過給藥一定劑量的本發(fā)明的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽繼續(xù)治療該受試者(例如，人)，其中在該劑量實現(xiàn)臨床療效，或通過遞增至可維持療效的水平來降低劑量。給藥頻率將取決于施用的化合物的藥代動力學參數(shù)、給藥途徑和治療的具體疾病。給藥的劑量和頻率也可取決于藥代動力學和藥效學、以及毒性和治療功效數(shù)據(jù)。

給藥方式

式I的化合物的藥物組合物可以單劑量或多劑量，通過具有相似用途的藥劑的任何可接受的給藥方式進行給藥，例如在被引入作為參考的那些專利和專利申請中所描述的，包括直腸、口腔、鼻內(nèi)和經(jīng)皮途徑，通過動脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、胃腸外、肌內(nèi)、皮下、口服、局部、作為吸入劑、或經(jīng)由浸漬或涂覆裝置(例如支架)或插入動脈的圓柱形聚合物而給藥。

一種給藥模式是胃腸外給藥，特別是通過注射。其中可通過注射給藥引入的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的形式包括：水性或油性混懸液或乳液，其含芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏劑、甘露醇、右旋糖，或無菌水溶液和類似的藥物載劑。在鹽水中的水溶液也可常規(guī)地用于注射。也可以采用乙醇、甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等(及其合適的混合物)、環(huán)糊精衍生物和植物油?？衫缤ㄟ^使用包衣(例如卵磷脂)、通過維持在分散情況下所需的顆粒尺寸和通過使用表面活性劑來維持合適的流動性。防止微生物的作用可通過各種抗菌劑和抗真菌劑實現(xiàn)，例如，對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。

無菌可注射溶液通過以下制備：將所需量的本發(fā)明化合物摻入含有上文所列舉的各種其他成分(根據(jù)需要)的合適的溶劑中，然后過濾滅菌。通常，分散液通過以下制備：將各種滅菌的活性成分摻入無菌載劑中，含有基本分散介質(zhì)和如上文所列舉的那些所需的其他成分。對于用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術，其從之前無菌過濾的溶液中得到所述活性成分以及任何額外的所需成分的粉末。在一些實施方案中，對于胃腸外給藥，制備無菌可注射溶液，其含有治療有效量(例如，0.1至1000mg)的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽。但是，將理解，所述化合物實際給藥的量通常將由醫(yī)生根據(jù)有關情況來確定，包括所治療的病癥、所選定的給藥途徑、所給藥的實際化合物及其相關活性、個體患者的年齡、體重和響應、所述患者癥狀的嚴重性等。

口服給藥是給藥所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的另一途徑。給藥可經(jīng)由膠囊或腸溶包衣片劑等進行。在制備含有所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物時，通常將所述活性成分用賦形劑稀釋和/或包封在載體中，所述載體可為膠囊、囊袋劑(sachet)、紙或其他容器的形式。當所述賦形劑用作稀釋劑時，其可為固體、半固體或液體材料(如上述)的形式，其充當所述活性成分的載劑、載體或介質(zhì)。因此，所述組合物可為片劑、丸劑、粉劑、錠劑、囊劑、扁囊劑、酏劑、混懸液、乳液、溶液、糖漿劑、氣霧劑(作為固體或在液體介質(zhì)中)、含有例如高達10重量％所述活性化合物的軟膏劑、軟和硬明膠膠囊、無菌可注射溶液和無菌包裝粉劑的形式。

在口服制劑中合適的賦形劑的一些實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿和甲基纖維素。所述制劑還可包含：潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；濕潤劑；乳化劑和助懸劑；防腐劑，例如羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯；甜味劑；和調(diào)味劑。

本文所述式I的化合物的藥物組合物可采用本領域已知的步驟進行配制，以在給藥至患者后提供所述活性成分的快速、持續(xù)或延遲釋放。用于口服給藥的控釋藥物遞送系統(tǒng)包括滲透泵系統(tǒng)和溶出系統(tǒng)，其含有聚合物涂布的容器或藥物-聚合物基質(zhì)制劑?？蒯屜到y(tǒng)的實例提供在美國專利號3,845,770；4,326,525；4,902,514；和5,616,345中。另一用于本發(fā)明方法中的制劑采用了經(jīng)皮遞送裝置(貼劑)。這種經(jīng)皮貼劑可用于以控制量提供本發(fā)明化合物的連續(xù)或不連續(xù)輸注。用于遞送藥劑的經(jīng)皮貼劑的構(gòu)造和使用是本領域熟知的。參見，例如，美國專利號5,023,252、4,992,445和5,001,139。這種貼劑可被構(gòu)造為用于連續(xù)、脈沖或按需要遞送藥劑。

在一些實施方案中，將本文所述式I的化合物的組合物以單位劑型配制。術語“單位劑型”是指適合作為用于人受試者的單元劑量的物理分散單元，各單元含有預定量的活性物質(zhì)(該預定量為經(jīng)計算得到所需療效的量)，以及合適的藥物賦形劑(例如，片劑、膠囊、安瓿)。

在其他實施方案中，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物，以約50mg、約100mg、約150mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg、約450mg、約500mg、約550mg、約600mg、約650mg、約700mg、約800mg、約900mg、約1100mg、約1200mg、約1300mg、約1400mg、約1500mg、或約1600mg、約1700mg、或約1800mg的單位劑量口服給藥。在其他實施方案中，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，以約200mg、約600mg、或約800mg、或約900mg、或約1200mg的單位劑量口服給藥。在一些實施方案中，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物，以約200mg或約800mg的單位劑量口服給藥。

上述用于式I化合物口服給藥的劑量可每日一次或每日兩次(BID)進行給藥。例如，在一些實施方案中，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物，以約50mg BID、約100mg BID、約150mg BID、約200mg BID、約250mg BID、約300mg BID、約350mg BID、約400mg BID、約450mg BID、約500mg BID、約550mg BID、約600mg BID、約650mgBID、約700mg BID、約800mg BID、約900mg BID、約1100mg BID、約1200mg BID、約1300mg BID、約1400mg BID、約1500mg BID、或約1600mg BID、約1700mg BID、或約1800mg BID的單位劑量口服給藥。在其他實施方案中，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物，以約200mg BID、約400mg BID，或約600mg BID、或約800mg BID、或約1000mg BID的單位劑量口服給藥。在一些實施方案中，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物，以約200mg BID、或約800mg BID的單位劑量口服給藥。在一個實施方案中，將所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物，以約800mg BID的單位劑量口服給藥。

本發(fā)明的長春花生物堿或其藥學上可接受的鹽，通過IV給藥。在一個實施方案中，所述長春花生物堿為硫酸長春新堿且小瓶的量為1mg/1ml。在一些實施方案中，所述長春花生物堿為硫酸長春新堿且小瓶為2ml，包含1mg或2mg硫酸長春新堿。在另一實施方案中，“硫酸長春新堿”，USP，為白色至灰白色粉末。其在甲醇中可溶，在水中易溶，但在95％乙醇中僅微溶。在98％乙醇中，硫酸長春新堿，USP，具有最大值在221nm的紫外線光譜(∈+47,100)。

“硫酸長春新堿注射劑”，USP，為無菌、無防腐劑的一次性使用溶液，其可在2mL(1mg和2mg)小瓶中用于靜脈內(nèi)應用。每mL包含1mg硫酸長春新堿USP、100mg甘露醇和注射用水(USP)。添加適量硫酸或氫氧化鈉以控制pH。硫酸長春新堿注射(USP)的pH范圍為4.0至5.0。

制品和試劑盒

包含所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的組合物(包括，例如，制劑和單位劑量)可在適當?shù)娜萜髦兄苽洳⒎胖?，并標記為用于治療指定病癥。因此，還提供了制品，例如包含單位劑型的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽的容器和含該化合物使用說明的標簽。在一些實施方案中，所述制品是包含單位劑型的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，和至少一種藥學上可接受的載劑的容器。在另一實施方案中，該制品為一種容器，其包含式I的化合物或其藥學上可接受的鹽和至少一種藥學上可接受的載劑的單位劑型，以及含長春花生物堿或藥學上可接受的鹽的小瓶。

也考慮了試劑盒。例如，試劑盒可包含單位劑型的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，和含有所述組合物在治療醫(yī)學病癥中的使用說明的藥品說明書。在一些實施方案中，所述試劑盒包含所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽和至少一種藥學上可接受的載劑的單位劑型，以及含長春花生物堿或藥學上可接受的鹽的溶液的小瓶。

在該試劑盒中的使用說明可為用于治療癌癥，包括，例如，惡性血液病或惡性實體瘤癌癥。在一些實施方案中，在該試劑盒中的所述使用說明可為用于治療癌癥，例如白血病或淋巴瘤，包括復發(fā)和難治的白血病或淋巴瘤。在一些實施方案中，在該試劑盒中的所述使用說明可為用于治療急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、慢性髓性白血病(CML)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、低侵襲性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)、難治性iNHL、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥(WM)、T細胞淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、淋巴漿細胞性淋巴瘤(LPL)或邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)。在一個實施方案中，在該試劑盒中的所述使用說明可用于治療慢性淋巴細胞性白血病(CLL)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一個實施方案中，所述NHL是彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、淋巴漿細胞性淋巴瘤(LPL)和邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)。在一個實施方案中，所述惡性血液病是低侵襲性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)。在一些實施方案中，在該標簽中指明的疾病或病癥可包括，例如，癌癥的治療。

在所述制品或所述試劑盒的一些實施方案中，式I的化合物的單位劑量具有約50mg、約100mg、約150mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg、約450mg、約500mg、約550mg、約600mg、約650mg、約700mg、約800mg、約900mg、約1100mg、約1200mg、約1300mg、約1400mg、約1500mg、或約1600mg、約1700mg、或約1800mg的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽。在一個實施方案中，所述單位劑量具有約400mg的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽。在所述制品或所述試劑盒的一個實施方案中，單位劑量的所述式I化合物或其藥學上可接受的鹽，是片劑。

實施例

包括以下實施例用以闡明本發(fā)明的實施方案，且所述實施例不旨在限定本發(fā)明的范圍。本領域技術人員應理解，本文公開的技術表示的是用于實施本發(fā)明的技術。本領域技術人員將理解，根據(jù)本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可對本發(fā)明的實施例進行修改。

實施例1

式I的化合物相比于多柔比星、長春新堿和環(huán)磷酰胺在10個彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系、4個多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞系、2個濾泡性淋巴瘤(FL)細胞系和1個套細胞淋巴瘤(MCL)細胞系中的效果

該實施例評估式I的化合物(圖1)或其藥學上可接受的鹽，在10個彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系、4個多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞系、2個濾泡性淋巴瘤(FL)細胞系和1個套細胞淋巴瘤(MCL)細胞系中抑制惡性B-細胞活力的功效。該實施例還評估和比較了相比式I的化合物或其藥學上可接受的鹽的功效，在相同的10個彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系、4個多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞系、2個濾泡性淋巴瘤(FL)細胞系和1個套細胞淋巴瘤(MCL)細胞系中多柔比星、長春新堿和環(huán)磷酰胺抑制惡性B-細胞活力的功效。

Cell Titer Glo活力測試：所有步驟在Branford的Gilead Sciences，Inc.進行，將式(I)的化合物、環(huán)磷酰胺、多柔比星和硫酸長春新堿溶于DMSO以制備儲液，將其以1000X在DMSO中在96孔板格式中連續(xù)稀釋3倍，從而各化合物的測試的最終起始分析濃度分別為10μM、200μM、10μM和1μM。將化合物板在沒有血清或添加物的RPMI中稀釋100倍，產(chǎn)生10X儲液。在適合細胞系的100μl的生長培養(yǎng)基(補充有100U/L青霉素-鏈霉素)中將細胞以10,000–20,000細胞/孔接種在96-孔板中。OCI-Ly3、OCI-Ly4和OCI-Ly7在Iscove’s+20％FBS中生長，OCI-Ly19在αMEM+20％FBS中生長，且所有其它細胞系在RPMI+10％FBS中生長。向各孔以0.1％DMSO的終濃度添加11μl 10X化合物，且細胞在37℃在5％CO₂中培養(yǎng)72小時。細胞活力使用Cell Titer Glo(Promega，Madison，WI)按照制造商的方案在Envision讀板器上(Perkin Elmer，Waltham，MA)評估。EC₅₀值使用4參數(shù)可變斜率模型通過GraphPad Prism 6.0軟件測定。所有EC₅₀值表示來自一式兩份的劑量響應曲線的平均值。結(jié)果報告于下表1。

表1總結(jié)了4種化合物的功效，分別在Cell Titer Glow測試中對各細胞系進行了測試。在濃度分別<3000nM和<10000nM時，式I的化合物的測試結(jié)果和環(huán)磷酰胺的測試結(jié)果沒有在任一測試細胞系中顯示抑制細胞活力。計算抑制細胞活力的多柔比星和長春新堿的EC₅₀值且其范圍為分別為3.1-557nM和<1nM-103nM，如表1所示。

表1

實施例2

在10個彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系、4個多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞系、2個濾泡性淋巴瘤(FL)細胞系和1個套細胞淋巴瘤(MCL)細胞系中，式I的化合物與長春新堿的組合相對單獨的長春新堿的效果的對比效果

該實施例評估了式I的化合物或其藥學上可接受的鹽與長春新堿的組合，在10個彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系、4個多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞系、2個濾泡性淋巴瘤(FL)細胞系和1個套細胞淋巴瘤(MCL)細胞系中抑制惡性B-細胞活力的功效。該實施例還在相同的10個彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系、4個多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞系、2個濾泡性淋巴瘤(FL)細胞系和1個套細胞淋巴瘤(MCL)細胞系中，評估和比較了長春新堿作為單一藥劑抑制惡性B-細胞活力的功效，相比于式I的化合物或其藥學上可接受的鹽與長春新堿的組合的功效。

Cell Titer Glo活力測試：所有步驟在Branford，CT的Gilead Sciences，Inc.進行。長春新堿作為單一藥劑進行單獨測試，或與300nM式I的化合物組合進行測試，在0.03-10nM范圍內(nèi)的4種濃度時顯示該組合小于單一藥劑對細胞活力的EC₅₀。將式I的化合物和硫酸長春新堿溶于DMSO以在分別的96孔板對各化合物制備1000X的儲液，從而測試的最終起始分析濃度為300nM(式I的化合物)和10nM、3nM、1nM和0.3nM(長春新堿)。將化合物板在不含血清或添加物的RPMI中連續(xù)稀釋100倍并混合在一起以創(chuàng)建組合或單一藥劑在2％DMSO中的10X儲液。將細胞以10,000–20,000細胞/孔接種在96孔板中適合細胞系的100μl生長培養(yǎng)基中，該生長培養(yǎng)基補充有100U/L青霉素-鏈霉素。OCI-Ly3、OCI-Ly4和OCI-Ly7在Iscove’s+20％FBS中生長，OCI-Ly19在αMEM+20％FBS中生長，且所有其它細胞系在RPMI+10％FBS中生長。在含有細胞的每個孔中，以0.2％DMSO的終濃度添加11μl的無血清培養(yǎng)基中的10X化合物混合物，并將細胞在37℃ 5％CO₂中培育72小時。細胞活力按照制造商的方案在Envision讀板器上(Perkin Elmer，Waltham，MA)使用Cell Titer Glo(CTG，Promega，Madison，WI)評估。記錄單獨化合物處理和組合的CTG信號。結(jié)果示于下圖2。

圖2詳細描述在代表4種血液癌癥類型：DLBCL、MM、FL和MCL的17個惡性B細胞系中式I化合物(圖1)與長春新堿的組合相對于單獨使用長春新堿(圖2)的抑制效果。

實施例3

在惡性DLBCL B-細胞系DHL-10中，式I的化合物與長春新堿的組合相對式I的化合物與A)考布他汀(obretastatin)A4、B)秋水仙堿、C)多柔比星和D)紫杉醇的組合的效果的對比效果

該實施例評估式I的化合物(圖1)或其藥學上可接受的鹽與長春新堿的組合在惡性彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系DHL-10中抑制惡性B-細胞活力的功效。該實施例還評估和比較了，相比于式I的化合物或其藥學上可接受的鹽與長春新堿組合的功效，式I的化合物或其藥學上可接受的鹽與A)考布他汀(cobretastatin)A4、B)秋水仙堿、C)多柔比星和D)紫杉醇的組合，在惡性彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系DHL-10中抑制惡性B-細胞活力的功效。

Cell Titer Glo活力測試：所有步驟在Branford，CT的Gilead Sciences，Inc.進行。將長春新堿、考布他汀A4、秋水仙堿、多柔比星和紫杉醇溶于DMSO中以制備儲液，將1000X的儲液在96孔板格式中，在DMSO中連續(xù)稀釋3倍，從而，除了多柔比星從10μM開始以外，所有化合物的測試的最終起始分析濃度為1μM。將化合物板在不含血清或添加物，但含有1％DMSO或3μM式I化合物的RPMI中稀釋100倍以創(chuàng)建10X儲液。將DLBCL細胞系DHL-10以每孔10,000個細胞接種在補充有10％FBS和100U/L青霉素-鏈霉素的RPMI中。在包含細胞的每個孔中，以0.2％DMSO的終濃度添加11μl無血清的培養(yǎng)基中的10X化合物混合物，并將細胞在37℃ 5％CO₂中培育72小時。按照制造商的方案，在Envision讀板器(Perkin Elmer，Waltham，MA)上使用Cell Titer Glo(CTG，Promega，Madison，WI)評估細胞活力。記錄單獨化合物處理和組合的CTG信號。使用四參數(shù)可變斜率模型，以GraphPad Prism 6.0軟件測定EC₅₀值。結(jié)果顯示于圖2中。單獨化合物或與300nM式I化合物的組合抑制存活DHL-10細胞的EC₅₀值的變化顯示于表2中。

圖3總結(jié)了式I的化合物和長春新堿的組合相對式I的化合物和考布他汀A4、式I的化合物和秋水仙堿，式I的化合物和多柔比星、以及式I的化合物和紫杉醇的組合的效果。

表2

實施例4

在惡性DLBCL B-細胞系DHL-10中式I的化合物與長春新堿的組合相比式I的化合物與長春堿的組合的對比效果

該實施例評估了式I的化合物或其藥學上可接受的鹽與長春新堿的組合在惡性彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系DHL-10中抑制惡性B-細胞活力的功效。該實施例還評估和比較了式I的化合物或其藥學上可接受的鹽與長春堿的組合在惡性彌漫型大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系DHL-10中抑制惡性B-細胞活力的功效。

Cell Titer Glo活力測試：單獨測試3nM的長春新堿和長春堿，或測試其與100nM式I的化合物的組合。將式I的化合物、硫酸長春堿和硫酸長春新堿溶于DMSO中，以在分別的96孔板制備各化合物1000X的儲液，從而使式I化合物的最終起始分析濃度為100nM，而長春堿和長春新堿的濃度為3nM。將化合物板在不含血清或添加物的RPMI中連續(xù)稀釋100倍并混合在一起以創(chuàng)建在2％DMSO中的組合或單一藥劑的10X儲液。將DHL-10細胞以10,000細胞/孔接種在96孔板中的100μl的RPMI+10％FBS(補充有100U/L青霉素-鏈霉素)中。在包含細胞的每個孔中，以終濃度為0.2％DMSO添加11μl無血清培養(yǎng)基中的10X化合物混合物，并將細胞在37℃ 5％CO₂中培育72小時。細胞活力使用Cell Titer Glo(CTG，Promega，Madison，WI)按照制造商的方案評估，且在Envision讀板器上(Perkin Elmer，Waltham，MA)讀取。記錄單獨化合物處理和組合的CTG信號。結(jié)果示于圖4。

圖4描繪和總結(jié)了當化合物共同給藥時，圖1化合物(式I的化合物)和兩種長春花生物堿之一(分別為長春新堿和長春堿)的組合，在DLBCL細胞系DHL-10中的抑制作用(圖4)。

實施例5

在表達Syk的實體瘤細胞系中式I的化合物與長春新堿的組合相對在不表達Syk的實體瘤細胞系中式I的化合物與長春新堿的組合的對比效果

該實施例評估式I的化合物或其藥學上可接受的鹽與長春新堿的組合在表達Syk的胰腺細胞系MIA PaCa-2中抑制細胞活力的功效。該實施例也評估了式I的化合物和長春新堿的組合在不表達Syk的細胞系HepG2中抑制細胞活力的功效。

Cell Titer Glo活力測試：在惡性胰腺細胞系MIA PaCa-2和肝細胞癌HepG2細胞系中，長春新堿被單獨測試，或與4種濃度的式I的化合物(300nM、100nM、33nM和11nM)組合測試。將式I的化合物和硫酸長春新堿溶于DMSO以在分別的96孔板中制備各化合物1000X的儲液，從而式I的化合物測試的最終起始分析濃度為300-11nM，而長春新堿的濃度為3nM。將化合物板在不含血清或添加物的RPMI中連續(xù)稀釋100倍并混合在一起以創(chuàng)建組合或單一藥劑在2％DMSO中的10X儲液。將MIA PaCa-2和HepG2細胞以5,000細胞/孔接種在96孔板中的100μl的RPMI+10％FBS(補充有100U/L青霉素-鏈霉素)中。在包含細胞的每個孔中，以終濃度為0.2％DMSO添加11μl無血清培養(yǎng)基中的10X化合物混合物，并將細胞在37℃ 5％CO₂中培育72小時。細胞活力使用Cell Titer Glo(CTG，Promega，Madison，WI)按照制造商的方案在Envision讀板器上(Perkin Elmer，Waltham，MA)評估。記錄單獨化合物處理和組合的CTG信號。結(jié)果示于圖5。

圖5總結(jié)了在表達Syk的惡性胰腺細胞系MiaPaca中(圖5a)和在不表達Syk的惡性結(jié)腸細胞系HepG2中(圖5b)式I的化合物和長春新堿的組合對細胞活力的抑制。

Syk蛋白測試：將細胞系在補充有10％FBS和100U/L青霉素-鏈霉素的RPMI中對數(shù)生長過夜。經(jīng)由在室溫下，以300x g離心8分鐘在50mL管中收集1x 10⁷個細胞。在冰上，在200uL的含有蛋白酶(Roche，Palo Alto CA)和磷酸酶抑制劑(Sigma，Saint Louis MO；Santa Cruz Technologies，Dallas TX)的1X RIPA緩沖液(Cell Signaling Technology，Danvers MA)中將細胞團塊裂解15分鐘。將溶胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至V形底96孔板中并直接使用或在-80℃冷凍以供第二天使用。以4-12％SDS-Bis/Tris凝膠分離蛋白質(zhì)并在硝基纖維素上進行印跡(blotted)。在Rockland Odyssey阻斷緩沖液中阻斷印跡并與總Syk抗體4D10(Santa Cruz)和pSyk-Y_525/6(Cell Signaling Technologies)一起培育。將一抗稀釋1000倍并在室溫下培育1小時。在含有1.0％Tween的Tris緩沖的鹽水(TBS-T)中清洗印跡3次，清洗5分鐘。然后，將印跡與山羊α小鼠IgG(H+L)、AlexaFluor 680(Life Sciences公司)和山羊α兔IgG(H+L)、DyLight 800(Thermo Scientific)(各自在阻斷緩沖液中稀釋20,000倍)在室溫下培育1小時。將印跡在TBS-T中清洗3次，清洗5分鐘，并在Odyssey凝膠成像儀(LI-COR)上進行分析。

圖6描繪了在MiaPaca和HepG2惡性結(jié)腸細胞系中的Syk表達水平(圖6)。

實施例6

在一些惡性實體瘤細胞系中Syk表達的測定

(圖7)

Syk蛋白測試：將細胞系對數(shù)生長過夜，且經(jīng)由在室溫下以300x g離心8分鐘在50mL管中收集1x 10⁷個細胞。在冰上，在200uL的含有蛋白酶(Roche，Palo Alto CA)和磷酸酶抑制劑(Sigma，Saint Louis MO；Santa Cruz Technologies，Dallas TX)的1X RIPA緩沖液(Cell Signaling Technology，Danvers MA)中將細胞團裂解15分鐘。將溶胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至V形底96孔板中并直接使用或在-80℃冷凍以供第二天使用。以4-12％SDS-Bis/Tris凝膠分離蛋白質(zhì)并在硝基纖維素上進行印跡。在Rockland Odyssey阻斷緩沖液中阻斷印跡并與總Syk抗體4D10(Santa Cruz)一起培育。將一抗稀釋1000倍并在室溫下培育1小時。在含有1.0％Tween的Tris緩沖的鹽水(TBS-T)中清洗印跡3次，清洗5分鐘。然后，將印跡與山羊α小鼠IgG(H+L)、AlexaFluor680(Life Sciences公司)(在阻斷緩沖液中稀釋20,000倍)在室溫下培育1小時。將印跡在TBS-T中清洗3次，清洗5分鐘，并在Odyssey凝膠成像儀(LI-COR)上進行分析。參見圖7。

實施例7

在彌漫性大B細胞淋巴瘤的SU-DHL-10小鼠異種移植模型中評估entosplentinib和長春新堿單獨及組合時的功效

在雄性SCID米色鼠的皮下細胞系腫瘤異種移植模型中使用人彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞系SU-DHL-10，在entosplentinib和長春新堿的2x 2的劑量水平矩陣中評估作為單一藥劑的entosplentinib及entosplentinib與長春新堿的組合在體內(nèi)的功效。

制劑-在0.5％HPMC-0.2％Tween 80(pH 3.5，50mM醋酸鹽緩沖液，而較低劑量通過直接稀釋制備)的完全載劑中配制entosplentinib。使用攪拌棒混合高劑量制劑(且依需要，短暫地高速均質(zhì)化(polytroned)以破裂化合物團塊)以形成黃色溶液(pH＝1.8)，此黃色溶液在30分鐘內(nèi)變成不透明懸浮液。每天新鮮制備給藥用懸浮液并在治療之間貯存在4℃下，避免光照。

以0.9％無菌鹽水稀釋該儲液以制備長春新堿的最高劑量組的制劑，而較低劑量通過以鹽水直接稀釋該儲液來制備。該高劑量制劑的pH值為7.08。該給藥制劑是在每次治療前現(xiàn)場制備。

動物-本研究使用雄性Harlan SCID米色鼠(C.B-17/IcrHsd-Prkdc^scidLyst^bg-J)。在實驗第1天這些小鼠為6-7周齡，且被喂食可自由采食的經(jīng)照射的Harlan 2918.15嚙齒類動物的食物及水。將動物飼養(yǎng)在靜態(tài)籠子內(nèi)，此靜態(tài)籠子的Clean Room內(nèi)具有Bed-O’Cobs^TM寢具(The Andersons Lab Bedding Products)，該Clean Room向氣泡環(huán)境中提供H.E.P.A.過濾空氣，每小時進行100次的全室換氣(complete air changes)。所有治療、體重測定及腫瘤測量均在氣泡環(huán)境中進行。將環(huán)境控制在70°±2°F的溫度范圍及30-70％的濕度范圍內(nèi)。

細胞-從Leibniz Institute DSMZ-德國微生物和細胞培養(yǎng)保藏中心(DSMZ)取得SU-DHL-10細胞。將其生長在RPMI 1640培養(yǎng)基中，此RPMI 1640培養(yǎng)基以1％100mM丙酮酸鈉、1％1M HEPES緩沖液、1％的45％葡萄糖溶液改性并補充有10％非經(jīng)熱滅活的胎牛血清(FBS)和1％100X青霉素/鏈霉素/L-谷氨酰胺(PSG)。將生長環(huán)境保持在37℃具有5％CO₂氣氛的培育箱中。將細胞在8℃200rcf離心8分鐘，吸除上清液并通過移液來將小團塊重新懸浮在冷Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)中。以臺盼藍溶液稀釋均質(zhì)細胞懸浮液的等分試樣并使用Luna自動細胞計數(shù)器計數(shù)。植入前細胞活力為91％。將細胞懸浮液在8℃，200rcf離心8分鐘。吸出上清液并將細胞團塊重新懸浮在冷的50％無血清培養(yǎng)基:50％Matrix(Corning)中使得最終濃度為2.5E+07個細胞/ml。在植入期間將細胞懸浮液保持在濕冰上。植入后，用臺盼藍溶液稀釋該剩余細胞的等分試樣并計數(shù)以測定植入后的細胞活力(91％)。在第0天，使用27號針及注射器經(jīng)由皮下途徑在試驗動物的高腋部(剛好在前肢下方)植入在0.2ml的50％無血清培養(yǎng)基:50％Matrix中的5.0x 10⁶個細胞。

根據(jù)腫瘤負荷(由測徑器測量進行估計)將所有小鼠分至各研究組。在治療期間和治療之后通過監(jiān)測腫瘤體積/重量來評估效力。使用測徑器測量，每周測量腫瘤負荷(mg)三次并通過長橢球的體積公式將其轉(zhuǎn)換為腫瘤質(zhì)量，假設單位密度為：

腫瘤負荷(mg)＝(L x W²)/2

其中L和W分別為正交腫瘤長度和寬度測量值(mm)。

本研究中分布成功的標準為，所有組的平均腫瘤負荷為研究群體的整體平均腫瘤負荷的10％之內(nèi)。第16天開始治療時整體平均腫瘤負荷為197mm³。

組1：載劑對照(entospletinib)在50mM乙酸鹽緩沖液中的0.5％HPMC、0.2％Tween 80，pH 3.5，每12小時口服給藥一次，保持19天(16-32天)，且載劑對照(長春新堿)的0.9％鹽水從口服給藥第三天開始每7天靜脈內(nèi)給藥一次(第18、25和32天)。

組2：Entosplentinib以每12小時75mg/kg口服給藥，保持6.5天(第16-22天)；然后降低至每12小時50mg/kg，保持10.5天(第22-32天)，組合有鹽水，其每7天靜脈內(nèi)給藥一次，從口服給藥第三天開始(第18、25和32天)。

組3：Entosplentinib以每12小時25mg/kg口服給藥，保持19天(第16-32天)，組合有鹽水，其從口服給藥第三天開始每7天靜脈內(nèi)給藥一次(第18、25和32天)。

組4：Entosplentinib的載劑每12小時口服給藥一次，保持19天(第16-32天)，組合有長春新堿，其以0.5mg/kg從口服給藥第三天開始每7天靜脈內(nèi)給藥一次(第18、25和32天)。

組5：Entosplentinib的載劑每12小時口服給藥一次，保持19天(第16-32天)，組合有長春新堿，其以0.15mg/kg從口服給藥第三天開始每7天靜脈內(nèi)給藥一次(第18、25和32天)。

組6：Entosplentinib以每12小時75mg/kg口服給藥一次，保持6.5天(第16-22天)；然后由于體重損失降低至每12小時50mg/kg，保持10.5天(第22-32天)，組合有長春新堿，其以0.5mg/kg從口服給藥第三天開始每7天靜脈內(nèi)給藥一次(第18、25和32天)。

組7：Entosplentinib以每12小時25mg/kg口服給藥，保持19天(第16-32天)，組合有長春新堿，其以0.5mg/kg從口服給藥第三天開始每7天靜脈內(nèi)給藥一次(第18、25和32天)。

組8：Entosplentinib以每12小時75mg/kg口服給藥，保持6.5天(第16-22天)；然后降低至每12小時50mg/kg，保持10.5天(22-32天)，組合有長春新堿，其以0.15mg/kg從口服給藥第三天開始每7天靜脈內(nèi)給藥一次(第18、25和32天)。

組9：Entosplentinib以每12小時25mg/kg口服給藥，保持19天(第16-32天)，組合有長春新堿，其以0.15mg/kg從口服給藥第三天開始每7天靜脈內(nèi)給藥一次(第18、25和32天)。

所有小鼠根據(jù)治療那天的個體體重給藥(0.1ml/20g)。

在腫瘤植入后第16天，具有確定腫瘤的動物(每組n＝9只動物)通過以75mg/kg或25mg/kg每天兩次(BID)的劑量口服管飼載劑或entosplentinib，以此治療3天。在第三天，動物接受鹽水或長春新堿的靜脈內(nèi)給藥，且在給藥后0.5、2或12小時收集血漿和腫瘤樣品。另外12只動物/組通過以計劃的劑量水平(25mg/kg和75mg/kg BID)口服管飼載劑或entosplentinib，這樣治療19天(在研究第16天開始)，并在開始給藥entosplentinib后的第三天(研究的第19天)開始每7天一次(Q7D)經(jīng)由靜脈內(nèi)給藥鹽水或長春新堿(0.5mg/kg和0.15mg/kg)，共3個劑量。給藥75mg/kg BID的entosplentinib劑量水平，共6.5天，隨后由于在給藥第三天所收集的血漿樣品中所測得的血漿濃度高于計劃的血漿濃度且在以0.5mg/kg長春新堿共同治療的組中體重減輕，因而將劑量降至50mg/kg BID。此劑量水平被指定為75/50mg/kg。

通過測量腫瘤體積來評估效力。在給藥entosplentinib的第三天(第19天)及給藥的最后一天(第32天)評估entosplentinib和長春新堿的血漿水平。通過每日觀察、體重(每周3次)和研究結(jié)束時循環(huán)血液細胞計數(shù)來評估耐受性。

75mg/kg的entosplentinib劑量降低至50mg/kg后，所有評估的劑量水平和組合均能被耐受。25和50mg/kg BID的entosplentinib劑量導致研究結(jié)束時血漿濃度分別超過在體外過釩酸鹽剌激的小鼠中抑制SYK的全血EC₅₀和EC₈₀值(在C_min(波谷)時)。給藥0.15和0.5mg/kg長春新堿均導致腫瘤生長明顯受抑制。單獨給藥25或75/50mg/kg的entosplentinib可抑制腫瘤生長，但程度低于使用長春新堿時所見到的程度。

添加75/50mg/kg水平的entosplentinib導致對腫瘤生長抑制顯著改善，超越單獨使用長春新堿時的抑制效果，在0.5mg/kg長春新堿劑量下，腫瘤生長抑制％(TGI)從85％增加至96％，而在0.15mg/kg長春新堿劑量下，％TGI從42％增加至71％。在任一劑量的長春新堿中添加25mg/kg的entosplentinib不會顯著增加對腫瘤生長的抑制。而接受作為單一藥劑的entosplentinib或長春新堿的組并未完全或部分消退，接受75/50mg/kg entosplentinib與0.5mg/kg長春新堿的組合的小鼠中有50％具有部分響應且有8％完全消退，并有8％在研究結(jié)束時無腫瘤。單獨的entosplentinib和長春新堿，以及二者的組合的腫瘤生長抑制和耐受性總結(jié)于下表中。

耐受劑量的entosplentinib和長春新堿的功效的總結(jié)

a腫瘤生長抑制的百分比(％TGI)通過以下計算，用治療的腫瘤平均值的δ除以對照腫瘤平均值的δ(以百分比表示)，然后從100％減去。

b NA不適用，因為此為對照。

向攜帶SU-DHL-10皮下異種移植物的動物給藥entosplentinib與長春新堿的組合，其顯示，引起SYK的經(jīng)計算的EC₈₀波谷覆蓋范圍(trough coverage)的一定劑量的entospletinib導致對腫瘤生長抑制的顯著增加，且部分腫瘤消退增加至50％(相比之下，單獨的entospletinib或長春新堿治療的對應數(shù)據(jù)為0％)，其中8％完全消退。