本發(fā)明為去勢治療相關(guān)癥狀治療領(lǐng)域。去勢治療（ADT）或雄激素抑制療法是一種常見的療法，用以與其他聚焦于根除前列腺癌的治療選項相結(jié)合來降低前列腺癌攻擊性。ADT期間，雄激素或者雄性荷爾蒙的水平在身體中減少以阻止它們到達前列腺癌細胞。雄激素，例如睪丸激素和二氫睪丸激素（DHT），刺激前列腺癌細胞的生長。然而，已發(fā)現(xiàn)如果雄激素水平降低，前列腺癌可更加緩慢地生長或甚至萎縮。在美國，據(jù)估計約三分之一的前列腺癌患者在治療其疾病期間將會在某點上接受ADT。

存在多種可用于降低雄激素水平的治療選項，例如睪丸切除術(shù)或者手術(shù)閹割，促黃體生長激素釋放激素（LHRH）類似物，例如亮丙瑞林（在美國冠以商標Lupron?, Eligard?出售），戈舍瑞林（在美國冠以商標Zoladex?出售），曲普瑞林（在美國冠以商標Trelstar?出售）和組氨瑞林（在美國冠以商標Vantas?出售）和LHRH拮抗劑，例如地加瑞克（在美國冠以商標Firmagon?出售）和阿比特龍（在美國冠以商標Zytiga?出售）。

大多數(shù)患有晚期前列腺癌的男人對ADT反應(yīng)良好。ADT通常在基于臨床分期（T3疾?。┑那傲邢侔U散出前列腺囊時需要，該時期為使用了GnRH激動劑/拮抗劑或者化學(xué)閹割的轉(zhuǎn)移性前列腺癌的第一線。

激素治療存在潛在的副作用，其可對生活質(zhì)量具有有害影響并增加病人的ADT治療終止風(fēng)險。例如，副作用可包括減少或無性欲，勃起功能障礙，男性性器官的收縮，熱潮紅，骨質(zhì)疏松癥，貧血，肌肉質(zhì)量減少，肌肉力量下降，身體脂肪增加和體重上漲，這些都歸因于荷爾蒙睪丸激素和雌激素水平的改變。目前，用于ADT相關(guān)副作用的治療方法為本領(lǐng)域已知。參見US 2009/0143344（熱潮紅-5HT2A或者D2R拮抗劑）；US 2007/0281977（熱潮紅-毒蕈堿受體拮抗劑）；US 2008/0080143（骨質(zhì)疏松癥，骨折，BMD損失，熱潮紅，男性乳腺發(fā)育，脫發(fā)-托瑞米芬）。然而，本領(lǐng)域仍然需要可降低ADT的某些副作用的替代療法。事實上，直至最近，推薦嘗試間歇去勢（IAD）以通過在已響應(yīng)ADT的患者中停止治療和隨后當證據(jù)顯示疾病再次發(fā)生或者惡化時重新開始ADT來最小化醫(yī)學(xué)閹割的副作用。然而，一組1749位患者隨機進行連續(xù)ADT與IAD、平均隨訪時間為9.8年的試驗證明連續(xù)ADT優(yōu)于IAD。提高ADT副作用耐受能力的治療可導(dǎo)致依從性的改善并給患者帶來更好的結(jié)果。

已發(fā)現(xiàn)選擇性雄激素受體調(diào)節(jié)劑（SARM）在雄激素組織中顯示出不同的活性譜。特別地，該類藥劑優(yōu)選在合成代謝組織例如肌肉或者骨骼中顯示出雄激素激動劑活性，但在其他雄激素組織例如前列腺或者精囊中僅顯示部分激動劑或甚至拮抗劑活性。因此，使用雄激素受體（AR）調(diào)節(jié)劑可減輕前列腺癌患者的ADT癥狀。

圖1闡明了實施例1化合物導(dǎo)致在睪丸切除8周并對任何雄激素刺激超級靈敏的大鼠中治療8周之后未見顯著的精囊重量增長。

圖2闡明了實施例1化合物導(dǎo)致在睪丸切除8周的大鼠中治療8周之后腰椎小梁骨礦物質(zhì)密度（LV-TBMD）顯著增加并顯示出腰椎小梁骨礦物質(zhì)含量（LV-TBMC）和橫截面面積（LV-TA）的增加趨勢。

圖3闡明了庚酸睪酮（TE）（1 mg/Kg-天）和多種劑量的實施例1化合物的結(jié)合顯示出以mg計的精囊濕重（標準化至以克計的體重）降低的趨勢，這由TE單獨引起。

圖4闡明了實施例1化合物與1 mg/Kg TE共同治療SD大鼠導(dǎo)致藥劑依賴性地降低了以毫克計的前列腺濕重（標準化至以克計的體重）。

圖5闡明了TE（1 mg/Kg-天）和多種劑量的實施例1化合物的結(jié)合顯示出以毫克計的精囊濕重（標準化至以克計的體重）降低的趨勢，這由TE單獨引起。

圖6闡明了實施例1化合物與1 mg/Kg TE共同治療SD大鼠導(dǎo)致藥劑依賴性地降低了以毫克計的前列腺濕重（標準化至以克計的體重）。

圖7闡明了在向健康的人類志愿者施用實施例1化合物之后在腓腸肌束（小腿肌肉面積）處通過基于外圍計算機斷層攝影的成像測量得到小腿肌肉面積的增加。

圖8闡明了在向健康的人類志愿者施用實施例1化合物之后通過DEXA測量得到全身瘦肉量的增加。使用Dunnett’s試驗（p<0.05），5 mg劑量水平的男性（藍色棒）的效果相比0 mg安慰劑劑量是統(tǒng)計學(xué)顯著的。

圖9闡明了當在任意時間點或者任意劑量的實施例1化合物下與安慰劑相比時，前列腺特異性抗原（SPA）水平自基線無顯著改變。

圖10闡明了在向生殖腺健康的人類志愿者施用實施例1化合物之后血清睪丸激素水平的降低。鑒于其相對更高的血清睪丸激素水平，治療之后的降低在男性中更為顯著。右邊表格反映出在5 mg劑量Ph1a研究之后的暴露量評估。

圖11闡明了在向生殖腺健康的人類志愿者施用實施例1化合物之后對于1型原骨膠原的N-終端前肽（P1NP）（骨合成代謝的生物標記物）的陽性暴露量-響應(yīng)關(guān)系。

AR調(diào)節(jié)劑化合物(S)-(7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯，或者表示為氨基甲酸, N-[(2S)-7-氰基,-1,2,3,4-四氫-4-(2-吡啶基甲基)環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基]-, 1-甲基乙基酯，通過結(jié)構(gòu)式I表示，已顯示在健康志愿者中增加瘦肉量并降低脂肪量。此外，在12周之后在健康的志愿者中使用(S)-(7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯治療之后未觀察到血細胞比容的顯著改變或前列腺特異性抗原（PSA）的改變。此外，使用(S)-(7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯治療睪丸切除大鼠未顯示精囊重量的顯著增長。

因而，本發(fā)明提供了一種治療癥狀的方法，所述癥狀為由ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果，包括向需要該治療的患者施用有效量的式I化合物。在進一步的實施方案中，患者為前列腺癌患者。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療骨質(zhì)量、骨力量、肌肉質(zhì)量或者肌肉力量損失的方法，所述骨質(zhì)量、骨力量、肌肉質(zhì)量或者肌肉力量損失為由ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果。在另一個進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療性欲損失和熱潮紅的方法，所述性欲損失和熱潮紅為由ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果。

此外，本發(fā)明提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽在需要其的患者中治療，特別是治療ADT癥狀的用途。在進一步的實施方案中，患者為前列腺癌患者。此外，本發(fā)明提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽在治療作為由ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果的癥狀中的用途。更進一步，本發(fā)明提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽在治療前列腺癌患者的ADT癥狀中的用途。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明化合物或其藥學(xué)可接受鹽在制備用于治療前列腺癌患者的ADT癥狀的藥物中的用途。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明化合物或其藥學(xué)可接受鹽在制備用于治療作為由ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果的癥狀的藥物中的用途。

此外，本發(fā)明提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽在治療中，特別是治療作為ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果的骨質(zhì)量、骨力量、肌肉質(zhì)量或者肌肉力量損失中的用途。更進一步，本發(fā)明提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽在治療作為由ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果的骨質(zhì)量、骨力量、肌肉質(zhì)量或者肌肉力量損失中的用途。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明化合物或其藥學(xué)可接受鹽在制備用于治療作為由ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果的骨質(zhì)量、骨力量、肌肉質(zhì)量或者肌肉力量損失的藥物中的用途。

此外，本發(fā)明提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽在治療中，特別是治療作為ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果的性欲損失和熱潮紅中的用途。更進一步，本發(fā)明提供了本發(fā)明化合物或其藥學(xué)可接受鹽在治療作為由ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果的性欲損失和熱潮紅中的用途。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明化合物或其藥學(xué)可接受鹽在制備用于治療作為由ADT誘導(dǎo)的繼發(fā)性性腺功能減退結(jié)果的性欲損失和熱潮紅的藥物中的用途。

雄激素受體調(diào)節(jié)劑式I化合物、和制備所述化合物的方法以及使用所述化合物作為用于例如性腺功能減退、骨質(zhì)量或骨密度損失和肌肉質(zhì)量或肌肉力量損失的治療適應(yīng)癥的有效治療劑的方法陳述于US-2010-0069404（2010年3月18日公開，在此通過引用引入）中。還可參見WO 2008/063867。雄激素受體（AR）調(diào)節(jié)劑式I化合物為雄激素受體的強力和選擇性調(diào)節(jié)劑。

更具體地，本發(fā)明提供了一種治療前列腺癌患者的ADT癥狀的方法，包括向需要該治療的患者施用有效量的式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽，結(jié)構(gòu)如下所示：

。

如本文所用，術(shù)語“患者”指人。

如本文所用，術(shù)語“治療（treating，to treat，或者treatment）”包括抑制、減緩、停止、降低或者逆轉(zhuǎn)現(xiàn)有癥狀、紊亂、病況或疾病的進展或嚴重性。

如本文所用，術(shù)語“T1-T4”指美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）用以描述癌癥已擴散程度的TNM分期系統(tǒng)的T分類。T分類表明腫瘤的存在并描述了原發(fā)性腫瘤的程度。更高的數(shù)字表明增加的尺寸、程度或浸潤程度。每種癌癥類型都具有在該數(shù)字下的分類細節(jié)。對于前列腺癌，T1表示醫(yī)生使用例如經(jīng)直腸超聲檢查的成像無法感知或看見腫瘤。T2表示醫(yī)生使用數(shù)字直腸檢查（DRE）能夠感知該癌癥或者使用例如經(jīng)直腸超聲檢查的成像能夠看見該癌癥，但其仍然顯示為局限于前列腺。T3表示該癌癥已開始生長并擴散出前列腺和可能已經(jīng)擴散至精囊。T4表示該癌癥已生長入前列腺臨近組織（除精囊外），例如尿道括約?。◣椭刂婆拍虻募∪猓?、直腸、膀胱和/或骨盆壁。

如本文所用，術(shù)語“有效量”指式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽的量或劑量，當向患者施用時，在診斷或治療的患者中提供了所需效果。在確定對患者的有效量時，主治醫(yī)師考慮多種因素，包括但不限于患者身高、年齡和總體健康；所涉及具體疾病或病癥；疾病或病癥的程度或者損害或者嚴重性；各個患者的響應(yīng)；所施用的具體化合物；給藥模式；所施用制劑的生物利用度特征；所選劑量方案；伴隨藥物的使用以及其他相關(guān)環(huán)境。

式I化合物和其藥學(xué)可接受鹽通常在一個很寬的劑量范圍內(nèi)有效。例如，單個藥劑的日劑量通常為約1 mg/天-約1000 mg/天，優(yōu)選約1 mg/天-約500 mg/天，約1 mg/天-約250 mg/天，約1 mg/天-約100 mg/天，1 mg/天-約75 mg/天和1 mg/天-約25 mg/天。最優(yōu)選地，單個藥劑的日劑量通常為約1 mg/天-約5 mg/天。最優(yōu)選式I化合物以選自每日1 mg、5 mg、25 mg和75 mg的日劑量使用。

雄激素受體調(diào)節(jié)劑式I化合物優(yōu)選配制成藥物組合物，通過使得化合物可生物利用的任何途徑施用。施用途徑可為多種方式，由藥物的物理性質(zhì)和患者及護理者的便利性限制。優(yōu)選地，雄激素受體調(diào)節(jié)劑式I化合物配制成口服或者腸胃外給藥，包括靜脈內(nèi)或皮下給藥。該藥物組合物和制備其的過程為本領(lǐng)域已知。（參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006）)。

優(yōu)選式I化合物為游離堿。

制備和實施例

以下方法、制備和實施例進一步闡述本發(fā)明并代表本發(fā)明化合物的典型合成。試劑和原料易于獲得或者可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地合成。應(yīng)理解制備和實施例用以舉例說明而非限制，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可作出多種變形。所描述的各路線的具體合成步驟可以不同的方式組合，或者與來自不同過程的步驟聯(lián)合，來制備式I化合物或其鹽。各步產(chǎn)物可通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法回收，包括萃取、蒸發(fā)、沉淀、層析、過濾、研磨和結(jié)晶。另外，除非另有說明，所有取代基如前定義。

除非另有說明，本文所述化合物可使用Accelrys? Draw version 4.0（Accelrys, Inc., San Diego, CA.）、IUPACNAME ACDLABS或者ChemDraw? Ultra 12.0命名和編號。本發(fā)明化合物的R或者S構(gòu)型可通過標準技術(shù)例如X-射線分析和與手性-HPLC保留時間的相關(guān)性測定。各同分異構(gòu)體、對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在合成式I化合物的任意方便點通過例如選擇性結(jié)晶技術(shù)或手性色譜法的方法分離或拆分（參見例如，J. Jacques, et al., " Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 以及E.L. Eliel and S.H. Wilen,“ Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994）。命名“異構(gòu)體1”和“異構(gòu)體2”指分別自手性色譜第一和第二洗脫出的化合物，并且如果手性色譜在合成早期開始，則將相同的命名法應(yīng)用于后續(xù)的中間體和實施例。另外，以下方案中描述的某些中間體可含有一個或多個氮保護基。該可變的保護基在每次出現(xiàn)時可相同或不同，取決于具體的反應(yīng)條件和所要進行的具體轉(zhuǎn)化。保護和脫保護條件為技術(shù)人員所公知并描述于文獻中（參見例如“Greene’s Protective Groupsin Organic Synthesis”, Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007）。

試劑和原料易于被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員獲得。U.S.專利號7,968,587（在此通過引用并入）公開了(S)-(7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯的合成。

如本文所用，以下術(shù)語具有指定的含義：“ADME”指吸收、分布、代謝和排泄；“DMAC”指N,N-二甲基乙酰胺；“DMF”指二甲基甲酰胺；“ECG”指心電圖；“EDTA”指乙二胺四乙酸；“ee”指對映異構(gòu)體過量；“EtOAc”指乙酸乙酯；“EtOH”指乙醇；“HOAc”指乙酸；“HPLC”指高效液相色譜；“LCMS”指液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；“LY”指實施例1化合物；“MeOH”指甲醇；“min”指分鐘；“MS”指質(zhì)譜；“MTBE”指叔丁基甲基醚；“NOAEL”指無可觀察到的不良反應(yīng)水平；“Orx”指睪丸切除；“SE”指標準誤差；“TE”指庚酸睪酮；“TFA”指三氟乙酸；“THF”指四氫呋喃；和“UV”指紫外線。

中間體1

(±)-2-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-7-腈

將(±)-2-(3-氧代-環(huán)戊基)-異吲哚-1,3-二酮 (12.7 g, 55.3 mmol)和4-氰基苯基肼-HCl (8.53 g, 50.3 mmol)混合于HOAc (200 mL)和4N HCl 二氧雜環(huán)己烷 (50 mL)中。使用機械攪拌，加熱反應(yīng)至90 ℃保持18 h，然后加入額外的4N HCl 二氧雜環(huán)己烷 (20 mL)。加熱反應(yīng)至100 ℃保持18 h。用水 (600 mL)稀釋反應(yīng)混合物和通過真空過濾收集黑色固體。使用MeOH (200 mL)超聲固體，然后收集并在真空烘箱中干燥，得到10.94 g (66%)灰棕色固體。MS (m/z): 328 (M+H), 326 (M-H)。

中間體2

(±)-2-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-7-腈

將2-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-7-腈 (5 g, 15.3 mmol)的DMF (25 ml) 混合物加熱至40 ℃。加入碳酸銫 (10.4 g, 32.4 mmol)和2溴甲基吡啶氫溴酸鹽 (4.05 g, 16 mmol)。40 ℃下攪拌所得混合物24 h。將所得混合物加入水(250 mL)中并攪拌1 h。過濾固體并真空干燥收集的物質(zhì)。將所得固體加入EtOH (25 mL)中并回流30 min。冷卻所得混合物至22 ℃并過濾。真空干燥所得固體至恒重以提供4.8 g (75%)標題化合物。MS (m/z): 419 (M+H)。

中間體3

(±)-2-氨基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-7-腈鹽酸鹽

將2-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-7-腈 (77 g, 184 mmol)加入THF (1.3 L)和EtOH (230 mL)中。攪拌所得混合物10 min并隨后加入一水合肼 (20 mL, 400 mmol)。22 ℃下攪拌所得混合物16 h。過濾所得混合物并蒸發(fā)母液。溶解所得殘留物于二氯甲烷 (300 mL) 中。加入4M HCl的二氧雜環(huán)己烷 (50 mL)溶液并攪拌所得混合物2 h。過濾并真空干燥所分離的固體至恒重以提供54 g (90%)標題化合物。MS (m/z): 289 (M+H).

實施例1

(S)-(7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯

步驟1: (±)-(7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯

向 (±)-2-氨基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-7-腈 (2.32 g, 8.05 mmol)和二異丙基乙基胺 (9.65 mmol, 1.68 mL)的二氯甲烷 (10 mL)溶液加入氯甲酸異丙酯 (8.86 mmol, 8.9 mL)并室溫攪拌過夜。乙酸乙酯稀釋并用10% K₂CO₃溶液洗滌 (2×)。Na₂SO₄干燥有機部分，過濾并濃縮以獲得3.3 g。柱色譜 (0-100%乙酸乙酯/二氯甲烷) 純化以獲得2.48 g (82%)外消旋產(chǎn)物。LCMS 375.2 (M+H)。

替代方法:

將(±)2-氨基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-7-腈鹽酸鹽 (35 g, 108 mmol)加入二氯甲烷 (350 mL)和吡啶(70 mL)的混合物中。氮氣下攪拌所得混合物并冷卻至5 ℃。加入氯甲酸異丙酯 (1M甲苯溶液, 162 mL, 162 mmol)。移除冰浴并在22 ℃下攪拌所得混合物。16 h之后蒸發(fā)溶劑。將所得殘留物加入水 (350 mL)中并攪拌2 h。過濾并45 ℃下真空干燥收集的固體。將所得固體加入乙酸乙酯 (400 mL)中并加熱所得混合物至回流。然后冷卻至22 ℃并過濾所得固體。將所得濕固體加入乙酸乙酯 (200 mL)中并加熱回流30 min。一小時內(nèi)冷卻所得混合物至22 ℃并隨后5 min內(nèi)冷卻至0-5 ℃。過濾所得混合物并真空干燥所分離的固體至恒重以提供23 g (62%)標題化合物。MS (m/z): 374 (M+H)。

步驟2: (R)-和(S)-(7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯

通過制備手性色譜分離實施例1化合物的對映體，使用Chiralpak AD柱 (8 × 33 cm)，使用100% EtOH在375 mL/min和250 nm洗脫。異構(gòu)體1 (R): 1.14 g, 99.9% ee (分析條件: Chiralpak AD-H柱，使用100% EtOH/0.2% 二甲基乙基胺洗脫；LCMS 375.2 (M+H)。異構(gòu)體2 (S): 1.67 g, 99.4% ee; LCMS 375.2 (M+H)。

實施例1化合物的替代路線，異構(gòu)體2: (S)-(7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯

將(S)-7-氰基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯 (13 g, 41.3 mmol)加入DMF (100 mL)中并使所得溶液升溫至40 ℃。一次性加入碳酸銫 (42 g, 129 mmol)并在40 ℃下攪拌所得混合物30 min。4 h內(nèi)分批加入2-溴甲基吡啶氫溴酸鹽 （21 g, 83 mmol)。在40 ℃下攪拌所得混合物18 h。將所得混合物加入0-5 ℃的冷水 (1 L)中并攪拌30 min。過濾分離固體并真空干燥至恒重。使所得物質(zhì)通過硅膠墊，用CH₂Cl₂/EtOAc (7/3)洗脫。合并含產(chǎn)物餾分并蒸發(fā)溶劑以得到淡棕色固體。自乙酸乙酯重結(jié)晶以得到15.3 g (77%)標題化合物。LC/MS (m/z) 375 (M+H)。

第二替代路線:

(HPLC條件-柱: Zorbax? SB-Phenyl, Rapid Resolution, 4.6 × 75 mm, 3.5 微米; 溶劑: 10% 乙腈/ 90% 水含0.05% TFA; 在230 nm的UV)

步驟1: (±)-(7-氰基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸叔丁基酯

用頂部攪拌、熱電偶、加料漏斗、氮氣入口和冷卻浴裝配12 L三頸圓底燒瓶。向燒瓶中加入 (±)-2-(1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-7-腈 (500 g, 1.53摩爾)和THF (5 L)。室溫攪拌所得漿料。以緩流自加料漏斗經(jīng)10分鐘加入一水合肼 (185.6 mL, 3.82摩爾)。室溫攪拌所得混合物過夜（約18 h）。向水浴加入涼水并向加料漏斗加入二叔丁基二碳酸酯 (875.1 g, 4.01摩爾; 提前融化為液體)。經(jīng)2小時加入至反應(yīng)混合物，維持釜溫度低于30 ℃。15 min之后，用HPLC分析以發(fā)現(xiàn)中間體胺的完全消耗。不銹鋼臺式過濾器中將反應(yīng)混合物過濾至聚丙烯墊上，并使用乙酸乙酯 (2 × 1 L) 洗滌所得濾餅。真空濃縮濾液以移除大部分的THF。通過硅膠塞 (4 Kg Kieselgel-60)純化所得混合物 (約1 L)，使用乙酸乙酯洗脫。真空濃縮所回收的洗脫液至黑色油。加入庚烷 (2 L)和乙酸乙酯 (350 mL)并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中室溫旋轉(zhuǎn)內(nèi)容物2 h。向水浴加冰并5 ℃下旋轉(zhuǎn)所得漿料額外的2 h。過濾所得固體，使用90/10 的庚烷/乙酸乙酯 (2 × 500 mL)沖洗并在35 ℃下真空干燥。獲得淺褐色固體的標題化合物，產(chǎn)率91.6%。

步驟2: (±)- (7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸叔丁基酯

用頂部攪拌、熱電偶和氮氣入口裝配20 L圓底燒瓶。向燒瓶中加入 (±)-(7-氰基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸叔丁基酯 (500 g, 1.68摩爾)和二氯甲烷 (5 L)。開始攪拌并加入四正丁基硫酸氫銨 (58.9 g, 0.168 mol)、隨后加入2-(溴甲基)吡啶氫溴酸鹽 (510.4 g, 2.02摩爾)。加入去離子水 (2 L)，隨后加入50% NaOH溶液 (445.3 mL, 8.41摩爾)。劇烈攪拌所得混合物過夜 (約21 h)。停止攪拌，分層并丟棄水層（上層）。使用去離子水 (3 × 4 L) 洗滌有機相，硫酸鈉干燥和真空濃縮至約500 mL。硅膠塞 (7 Kg Keiselgel 60) 純化粗物質(zhì)，使用1:1 的乙酸乙酯/庚烷作為洗脫液。真空濃縮所得洗脫液以提供560克灰白色固體的標題化合物 (81.4%)。

步驟3: 異構(gòu)體1, (R)-和異構(gòu)體2, (S)- (7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸叔丁基酯

使用以下分析手性HPLC方法以分析對映體: 4.6 × 150 mm Chiralpak AD-H柱 (Chiral Technologies), 20:80:0.2 乙腈/3A級變性乙醇/二甲基乙基胺流動相，0.6 mL/min流速，UV檢測@ 255 nm。對映體1于4.0 min洗脫，和對映體2于5.2 min洗脫。8%雜質(zhì) (255 nm)于3.6 min洗脫。通過制備手性HPLC純化 (±)- (7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸叔丁基酯 (528 g)，使用以下條件：8 × 33 cm Chiralpak AD柱，與分析相同的流動相，375 mL/min流速，270 nm 下UV檢測。將108 g樣品溶解于流動相，最終濃度為75 mg/mL。裝填4.0 g/注射， 在3.5-5.5 min之間洗脫出對映體1餾分和在6-10 min之間洗脫出對映體2。設(shè)置最終運行時間為7.5 min/注射，與對映體2曲線部分堆疊，每次注射后立即洗脫以減少溶劑消耗。硅膠塞上純化剩余的420 g，使用Merck 9385 60 Angstrom 230-400目硅膠，使用1:2:7 的二氯甲烷/庚烷/甲基叔丁基醚溶劑體系洗脫。使用3.5 kg硅膠墊以140 g樣品/硅膠塞真空過濾。5柱體積之后，外消旋物開始顯現(xiàn)。使用100% 甲基叔丁基醚、隨后100%丙酮以將剩余外消旋物洗出所述硅膠塞。以此方式獲得總計358.5 g的98+%純外消旋物。如上通過制備手性HPLC拆分該物質(zhì)。獲得208.8 g (99.9% ee)對映體1（R異構(gòu)體）和197 g (99.6% ee)對映體2（S異構(gòu)體）。

步驟4: (S)-2-氨基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-7-腈鹽酸鹽

用加熱罩、空氣攪拌器、溫度探頭、氮氣入口和加料漏斗裝配3 L三頸圓底燒瓶。向燒瓶加入(S)-(7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸叔丁基酯 (85.0 g, 0.22摩爾)和EtOH (850 mL)。一次性加入濃HCl (180 mL, 2.20摩爾)。加熱所得溶液至45-50 ℃并攪拌90 min，之后通過HPLC分析以指示原料的徹底消耗。將所得混合物轉(zhuǎn)移至Buchi燒瓶，使用去離子水 (595 mL) 稀釋并真空濃縮以移除EtOH。分兩次加入EtOAc (2 x 170 mL)并再次汽提以移除EtOAc和殘余的EtOH。將所得含水濃縮物轉(zhuǎn)移至5 L反應(yīng)瓶并冷卻至10-15 ℃。維持反應(yīng)溫度于< 30 ℃，同時通過滴加5 M NaOH (950 mL)調(diào)節(jié)溶液的pH至11-12。使用CH₂Cl₂ (1300 mL, 800 mL)萃取所得混合物。使用去離子水(500 mL)洗滌合并的CH₂Cl₂萃取物，Na₂SO₄干燥并真空濃縮以得到淡綠色固體的標題化合物 (65.0 g, 103 %)。

步驟5: (S)-(7-氰基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯

用冷卻浴、空氣攪拌器、溫度探頭和加料漏斗裝配2 L反應(yīng)燒瓶。向燒瓶加入(S)-2-氨基-4-吡啶-2-基甲基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-7-腈鹽酸鹽 (62.8 g, 0.218摩爾), DMF (188 mL)和三乙胺 (33.4 mL, 0.240 mol)。使用冰/丙酮浴將所得溶液冷卻至0 ℃。維持溫度于<10 ℃，同時經(jīng)加料漏斗滴加氯甲酸異丙酯 (218 mL, 0.218 mol, 1 M于甲苯中)。當完成添加時，移除冷卻浴并使得混合物升溫至室溫。1小時之后，通過HPLC分析指示反應(yīng)完成，并將混合物倒入去離子水 (1256 mL)和EtOAc (1884 mL)的溶液中。分層，過濾有機層并使用1:1的水:鹽水溶液再次洗滌，然后Na₂SO₄干燥。在55 ℃下真空濃縮至約15體積，并使所得物冷至室溫，獲得白色沉淀。加入庚烷 (628 mL)并攪拌20 min。將所得混合物濃縮回至約15體積。過濾固體，使用庚烷洗滌并干燥以獲得蓬松白色固體的標題化合物 (68.9 g, 84.5%)。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆), 8.49 (dd, 1H), 7.86 (d, 1H, J = 1.5), 7.71-7.75 (m, 1H), 7.60 (d, 1H, J = 9.0), 7.57 (d, 1H, J = 9.0), 7.36 (dd, 1H), 7.28-7.26 (m, 1H), 7.14 (d, 1H, J=7.5), 5.44 (s, 2 H), 4.79-4.72 (m, 1H), 4.71-4.66 (m, 1H), 3.22-3.20 (m, 1H), 3.16-3.12 (m, 1 H), 2.73-2.66 (m, 2 H), 1.16 (dd, 6 H)。

第三替代合成

步驟1

在DMAC中使用Zn(CN)₂, Zn(OAc)₂, Zn和Pd(dppf)₂Cl₂?CH₂Cl₂處理(7-溴-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基)-氨基甲酸異丙基酯 (I)以提供7-氰基-1,2,3,4-四氫-環(huán)戊二烯并[b]吲哚-2-基-氨基甲酸異丙基酯 (II)。加入水以沉淀技術(shù)級的II。將中間體II再溶解于MTBE和丙酮的混合物中并過濾所得漿料以移除無機成分。使用木炭、MgSO₄和FLORISIL?處理含II的濾液，然后通過庚烷結(jié)晶分離晶狀固體II。

步驟2

在DMAC中使中間體II與2-氯甲基吡啶鹽酸鹽 (III)和K₂CO₃反應(yīng)以得到技術(shù)級的實施例1化合物。通過加入水并過濾分離技術(shù)級的實施例1化合物。自EtOH重結(jié)晶三次以提供實施例1化合物。

試驗、體內(nèi)研究和臨床研究

睪丸切除大鼠試驗

使用總計86只未交配雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague Dawley Inc)。在6個月大時14只大鼠進行假手術(shù)和72只大鼠被閹割。大鼠維持于22 ℃下12 hr亮/黑循環(huán)，同時自由獲取食物 (TD 89222，含0.5% Ca和0.4% P, Teklad, Madison, WI)和水。睪丸切除（Orx）大鼠被允許骨損失2個月，稱重并隨機分入治療組，如以下表1所詳述。在第一天處死第1組和第2組作為基線對照，第3組和第4組假手術(shù)和睪丸切除對照組被給藥溶媒 (0.25%CMC/Twin80)。第5組以注射劑給予PTH (1-38) sc。第6-13組經(jīng)管飼法口服施用SARM。全部治療為每日一次，共持續(xù)2個月。

對于動態(tài)組織形態(tài)測定，在治療開始的第一天，除基線大鼠外全部大鼠接受二甲苯酚橙 90mg/kg sc。全部大鼠在被處死之前的第14、13天和第4、3天給予鈣黃綠素 10mg/kg s.c。

樣品制備:

PTH (1-38) (Zeneca (Cambridge Research Biochemicals) Ref # - DG-12-14071, 批號 14071): 含2%滅活大鼠血清的酸化鹽水溶媒。

實施例1化合物: 1% CMC/0.25%Tween 80 0.5ml/大鼠，基于體重。

端點 & 參數(shù)測量

1、體重: 之前和兩周一次，給藥量相應(yīng)調(diào)整

2、NMR: 研究開始和結(jié)束時

3、肌肉: 自左腓腸肌、四頭肌、比目魚肌、肛提肌、精囊 (SV)、前列腺和心臟獲得濕重，然后收集用于RNA或組織學(xué)分析。

4、自全部動物收集終末血清樣品并于-80 ℃下儲存在1x100 μl (OCN) , 2x 150 ( IGF-1并儲存) , 1x 300 μl (Chem 18) , 2x500 μl (之一用于BSALP，并儲存)

5、骨收集:將一塊大腿骨和腰椎固定（于50/50乙醇/鹽水中）用于CT和生物力學(xué)實驗；收集一塊脛骨用于PALP/鈣黃綠素分析，同時撕下骨骺（于70%乙醇中），收集另一塊脛骨用于組織形態(tài)分析（70%乙醇）

4、PK測定: 取下前幾天，每劑量組中3只大鼠 (僅測試品n=3)于以下時間點尾部采血以得到約0.2 ml血液置于EDTA試管中：0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 8和24小時。樣品轉(zhuǎn)至ADME用于血漿濃度分析。

按照基本如前所述的方案，實施例1化合物在治療睪丸切除8周且高度響應(yīng)于任何雄激素刺激的大鼠8周之后未見精囊重量的顯著增長。

如圖2和表3所示，使用實施例1化合物治療睪丸切除8周的大鼠8周之后導(dǎo)致腰椎骨小梁骨礦物質(zhì)密度 (LV-TBMD)的顯著增長并顯示出腰椎骨小梁骨礦物質(zhì)含量 (LV-TBMC)和橫截面面積 (LV-TA) 的增長趨勢。

體內(nèi)研究以探究實施例1化合物在TE存在下的直接拮抗效果

共使用36只ORX和6只假手術(shù)Wistar雄性大鼠 (8周大時睪丸切除并使其消瘦4周)。大鼠維持于22 ℃下12 hr亮/黑循環(huán)，自由獲取食物 (含0.95% Ca和0.67%P的 TD 5001, Teklad, Madison, WI)和水?；隗w重將大鼠隨機分入治療組 (n=6)。除TE外全部組的給藥途徑為口服。TE皮下給藥。每日給藥，在8周結(jié)尾時，大鼠被實施安樂死，稱重并切割組織。自每個動物收集肛提肌、前列腺和精囊。結(jié)果繪制為平均值 ± SE。

如圖3和表4所示，庚酸睪酮 (1 mg/Kg-天)和各種劑量實施例1化合物的結(jié)合顯示出以mg計的精囊濕重（標準化為以g計的體重）的降低趨勢，這是由TE單獨誘導(dǎo)的。

如圖4和表5所示，實施例1化合物與1 mg/Kg TE共同治療SD大鼠導(dǎo)致以mg計的前列腺濕重（標準化至以g計的體重）劑量依賴性降低。

實施例1化合物與合成睪丸激素R1881相比顯示，體外使用人類前列腺癌細胞，實施例1化合物比R1881促使產(chǎn)生的雄性激素更少。相比而言，與人類雄激素受體的生化結(jié)合親和力(Ki，單位nM)僅適度減少。

大鼠中的四周口服毒性研究

進行該研究是為了評估暴露4周后實施例1化合物在大鼠中的潛在毒性和毒代動力學(xué)。三個治療組，每組10只雄性和10只雌性CD? [Crl:CD?(SD)]大鼠，分別以15, 150和1500 mg/kg/天的劑量水平施用測試品。10只動物/性別的另一額外組用作對照并供以溶媒，在源自反滲透的純凈水中的5%維生素E TPGS、1%羥乙基纖維素、0.05% Dow Corning Antifoam 1510-US。測試品或者溶媒經(jīng)口服管飼法施用于全部組，每天一次，連續(xù)28天，劑量體積為15 mL/kg。另外，18只動物/性別/組的三個組用作毒代動力學(xué) (TK)動物并以與主研究組相同的方式和劑量體積分別以15, 150和1500 mg/kg/天的劑量水平接受測試品。3只動物/性別的另一額外組用作毒代動力學(xué)對照并以與治療組相同的方式和劑量體積接受溶媒。

對所有動物每天進行兩次發(fā)病率，死亡率，損傷以及食物和水的供應(yīng)的觀察。每周僅對主研究動物進行臨床體征的觀察。每周測量和記錄所有動物的體重，并且對于主研究動物每周測量和記錄食物消耗。試驗前對所有動物進行眼科檢查，并在最終尸檢前僅對主研究動物進行眼科檢查。在尸體剖檢時從所有主研究動物收集用于臨床病理學(xué)評價的血液樣品。在給藥的最后一天收集尿樣。在第1天和第28天的指定時間點從TK動物收集用于測定測試品血漿濃度的血液樣品。在最終血液收集之后，對TK動物實施安樂死并丟棄尸體而不進行進一步評估。在最終尸檢時從主研究動物收集用于肝酶誘導(dǎo)分析的肝樣品。在研究終止時，進行尸檢檢查，記錄器官重量，并且顯微鏡檢查前列腺和精囊組織。尸檢時對來自前5只雄性大鼠/組的左睪丸進行額外的顯微鏡檢查。卵巢，子宮與子宮頸，陰道和女性乳腺被確定為目標器官。

按照基本如上所述的方案，全身暴露量（AUC_0-24hr）是高度可變的并且以小于劑量比例的方式增加，在雌性中暴露量超過在雄性中所觀察到的。在給藥28天后沒有肝微粒體酶誘導(dǎo)的證據(jù)。

研究期間沒有計劃外死亡，并且沒有測試品相關(guān)的臨床跡象。與對照相比，接受≥ 150 mg/kg/天的雌性的體重和食物消耗更大。這些效應(yīng)不影響動物的整體健康，并且不被認為是不利的。雄性中沒有明顯的體重或食物消耗效應(yīng)。

在任一性別中，在血液學(xué)、凝血或尿分析參數(shù)上都沒有測試品相關(guān)的影響，并且在雄性中沒有測試品對臨床化學(xué)參數(shù)的相關(guān)影響。在雌性中測試品對臨床化學(xué)參數(shù)的相關(guān)影響限于150和1500 mg/kg/天劑量下的堿性磷酸酶增加（分別為1.33和1.45倍增加），在150和1500 mg/kg/天劑量下總蛋白的減少（分別減少9%和10%），在150和1500 mg/kg/天劑量下白蛋白的減少（兩種劑量都下降12%）和在1500 mg/kg/天劑量下球蛋白的減少（相對于對照降低11%）。這些變化是最小數(shù)量級的，并且不被認為是不利的。

在任一性別中都沒有測試品相關(guān)的肉眼可見的或器官重量的變化，并且在雄性中沒有測試品相關(guān)的微觀變化。在雌性中在劑量水平≥ 15 mg/kg/天的乳腺和卵巢中以及在劑量水平≥ 150 mg/kg/天的子宮（和帶子宮頸）和陰道中存在測試品相關(guān)的微觀變化。這些微觀變化與劑量水平≥ 150 mg/kg/天的雌性大鼠中生殖周期的劑量相關(guān)延長一致，被認為與測試品的藥理學(xué)相關(guān)，并且不被認為是不利的。

基于以上所述結(jié)果，本研究的NOAEL被認為是1500 mg/kg/天，最高給藥劑量。在1500 mg/kg/天的NOAEL劑量下，平均穩(wěn)態(tài)全身暴露量（AUC_0-24hr）在雄性中為102337 ng*hr/mL，而在雌性中為216853 ng*hr/mL。

大鼠中的六個月口服毒性研究

本研究的目的是在每天口服管飼26周之后調(diào)查實施例1化合物在Sprague-Dawley大鼠中的毒性并確定毒代動力學(xué)，以及在12周恢復(fù)期后評價任何發(fā)現(xiàn)的可逆性。治療的動物通過口服管飼法以15, 150或1500 mg/kg/天的日劑量供以于5%維生素E TPGS，1%羥乙基纖維素，0.05% Dow Corning Antifoam 1510-US的純化水中的實施例1化合物。每日向溶媒對照（在主研究中為15只大鼠/性別，恢復(fù)研究中為5只大鼠/性別）給予于純凈水中的5%維生素E TPGS，1%羥乙基纖維素，0.05%Dow Corning Antifoam 1510-US的口服管飼劑量。每個治療主研究組分配15只雄性和15只雌性。將5只雄性和5只雌性分配給溶媒對照和150 mg/kg/天組的恢復(fù)研究。對用于溶媒對照組的6只大鼠/性別和用于實施例1化合物治療組的12只大鼠/性別的另外附屬組評價毒代動力學(xué)。所有給藥以15 mL/kg體積給藥。

在每日口服管飼給藥之后，盡管在最低劑量和最高劑量之間，特別是在第91和182天，在雄性和雌性中均觀察到非重疊的平均AUC（0-24h）值，但是實施例1化合物的暴露量在所有劑量下都是高度可變的。通常，單劑量和多劑量暴露量（C_max和AUC_（0-24h））對于雄性和雌性從15至1500 mg/kg/天均低于比例地增加。雌性在所有天都展示出比雄性更高的暴露量。在第1天，雌性暴露量比雄性高出7倍，但是該差異到第182天時減少至1-3倍。在多次劑量后，直到第182天，任何劑量組都未觀察到實施例1化合物的積累。

按照基本如上所述的方案，研究過程中沒有歸因于實施例1化合物施用的死亡。眼科或尿分析參數(shù)方面無化合物相關(guān)影響。

在治療的雌性中以劑量依賴性方式注意到實施例1化合物相關(guān)的臨床體征，并且包括油性皮毛的發(fā)生率增加和皮毛的薄皮發(fā)生率降低。在恢復(fù)期的前6周中，在先前用150 mg/kg/天治療的雌性中也注意到油性皮毛，但在12周恢復(fù)期的后半期中不再存在于這些動物中。在恢復(fù)期結(jié)束時，在治療和對照雌性中毛皮的薄皮發(fā)生率沒有差異。

在用實施例1化合物治療的雄性中，在所有劑量水平下體重均降低，當在治療期結(jié)束時與對照雄性相比時達到-12%。在雌性中，存在相反的趨勢，在治療期結(jié)束時，治療的雌性體重比同時對照組高22%。在恢復(fù)期結(jié)束時仍然觀察到雄性的變化，但是在雌性中沒有。

治療的雄性顯示較低的食物消耗，并且治療的雌性通常在整個與治療相關(guān)體重效果相應(yīng)研究期間顯示比對照組更高的食物消耗。在恢復(fù)期期間，治療雄性的食物消耗保持低于對照組，但是在12周時間結(jié)束時，差異的大小變得可以忽略不計。在恢復(fù)期期間，與對照組相比，治療雌性的食物消耗沒有差異。

以≥150 mg/kg/天的劑量施用實施例1化合物與雌性中增加的嗜中性粒細胞計數(shù)，絕對網(wǎng)織紅細胞計數(shù)，堿性磷酸酶，鉀和降低的球蛋白相關(guān)。在1500 mg/kg/天的雄性中，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶和總膽紅素增加。在所有劑量水平的雌性中觀察到最小減少的總蛋白和白蛋白。在12周恢復(fù)期后，在接受150 mg/kg/天的大鼠中，血液學(xué)、臨床生物化學(xué)和尿分析參數(shù)沒有差異，表明這些發(fā)現(xiàn)的可逆性。

與實施例1化合物治療相關(guān)的發(fā)現(xiàn)主要與雄性和雌性生殖組織相關(guān)，并且通常歸因于分子的藥理學(xué)。不良結(jié)果局限于睪丸，并發(fā)生在所有實施例1化合物治療組中。在1500 mg/kg/天的組中，以及在具有睪丸損傷的給予15或150 mg/kg/天的個別雄性中，睪丸和附睪重量減少。在睪丸和附睪中觀察到與施用實施例1化合物相關(guān)的雄性生殖組織中的肉眼可見的結(jié)果。在給予≥50 mg/kg/天的雄性和給予15 mg/kg/天的單個雄性中觀察到軟和/或小睪丸和小附睪。在所有劑量水平觀察到睪丸的微觀結(jié)果，其本質(zhì)上是退化的并包括細長精子細胞的消耗、間質(zhì)細胞萎縮和精母細胞的單細胞壞死。睪丸結(jié)果與循環(huán)黃體化激素（LH）減少一致，所述循環(huán)黃體化激素減少導(dǎo)致在間質(zhì)細胞水平的LH發(fā)信號減少。此外，循環(huán)LH水平的降低導(dǎo)致睪丸分泌睪丸激素減少，從而在生精小管的水平減少雄激素發(fā)信號。用實施例1化合物治療也與給予≥150 mg/kg/天的雄性中觀察到的前列腺重量減少有關(guān)。雄性中的這些生殖和內(nèi)分泌變化可能與實施例1化合物的藥理學(xué)活性相關(guān)，但之前在4周研究中沒有確認。盡管與實施例1化合物相關(guān)的藥理學(xué)一致，但是基于量值，在所有劑量水平看到的睪丸形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)被認為是不利的。在12周恢復(fù)期結(jié)束時，對雄性生殖組織和LH和睪丸激素的影響被逆轉(zhuǎn)。

所有劑量水平下，實施例1化合物的施用與雌性卵巢和肉眼可見的小卵巢的重量減少有關(guān)。在給予≥150 mg/kg/天的雌性中，觀察到垂體重量和LH循環(huán)水平的降低。在雌性生殖組織中觀察到與施用實施例1化合物相關(guān)的微觀結(jié)果。在≥150 mg/kg/天的劑量水平下觀察到子宮和陰道的微觀結(jié)果，而在所有劑量水平下觀察到卵巢和乳腺的結(jié)果。在雌性生殖組織中觀察到的微觀結(jié)果和循環(huán)LH水平的減少可能與實施例1化合物的藥理活性相關(guān)。在包括乳腺的雌性生殖組織中的發(fā)現(xiàn)與之前報道的在4周重復(fù)劑量毒性研究中的那些一致。雌性生殖變化可能已影響生殖能力，但不影響動物的整體健康。在12周恢復(fù)結(jié)束時，對雌性生殖組織和LH的影響被逆轉(zhuǎn)。

所有劑量水平下的雌性中和給予≥150 mg/kg/天的雄性中，實施例1化合物的施用與胸腺重量的減少相關(guān)。在給予1500 mg/kg/天的雄性中觀察到小胸腺的肉眼可見的結(jié)果。在≥150 mg/kg/天的劑量水平下，在肝、脾、胸腺（雄性）和皮膚（雌性）中觀察到與施用實施例1化合物相關(guān)的其它微觀結(jié)果。在所有劑量水平下觀察到皮膚的微觀結(jié)果。所有這些變化在12周恢復(fù)期結(jié)束時不再存在。沒有與施用實施例1化合物相關(guān)的其它微觀結(jié)果、器官重量變化和肉眼可見的結(jié)果。

總之，通過每日口服管飼法，以0, 15, 150和1500 mg/kg/天的劑量水平施用實施例1化合物持續(xù)26周，與通常歸因于該分子的藥理學(xué)的雄性和雌性生殖組織的形態(tài)學(xué)和激素變化相關(guān)，并且在之前用150 mg/kg/天治療的動物中在12周后可逆。不良結(jié)果局限于睪丸，并發(fā)生在所有實施例1化合物治療組中。基于這些退行性睪丸變化的量級，在本研究中不能建立沒有可觀察到的不良反應(yīng)水平（NOAEL），因此被認為是<15 mg/kg/天。

大鼠中的雄性生育力和毒代動力學(xué)研究

本研究的目的是確定在交配期之前和期間由雄性大鼠的治療引起的對生殖過程的潛在不利影響。這包括確定雄性功能性生殖效應(yīng)。此外，在附屬動物中進行實施例1化合物的血漿水平毒代動力學(xué)評估。

實施例1化合物通過管飼法以0, 3, 30和1000 mg/kg的劑量口服給藥。在交配前，整個3周交配期間，并持續(xù)到安樂死前一天，每天治療雄性大鼠（20只/組）持續(xù)10周（總共100至101個劑量）。不治療雌性大鼠。每天兩次觀察所有動物的垂死和死亡率。每天記錄對于雄性大鼠的臨床觀察；每周兩次記錄雄性的體重和食物消耗。所有雄性在最后一次給藥后1天安樂死。對所有雄性進行的精子產(chǎn)生終點評價包括運動性和形態(tài)以及附睪精子濃度。稱重并保留來自所有雄性的睪丸、附睪、前列腺和精囊/凝固腺/流體。顯微鏡檢查存活雄性的睪丸、附睪、前列腺、精囊和凝固腺。對于具有交配證據(jù)的每個雌性，在妊娠第15天進行腹腔鏡子宮切除術(shù)。向分配至毒代動力學(xué)階段的另外3、18、18和18只雄性分別給予0、 3、 30和1000 mg/kg劑量的該化合物，并且在研究第0和70天給藥后適當間隔對其進行毒代動力學(xué)評價。

對雄性大鼠每日口服給藥實施例1化合物后，到達C_max的時間在第0天為2至8小時，在第70天為0.5至2小時。平均暴露量（通過AUC0-24小時測量）增加3至30 mg/kg，約為第0天的7.8倍和第70天的4.5倍，但在30和1000 mg/kg劑量之間保持相似，表明暴露量超過30 mg/kg時達到平頂。單次和多次劑量之間的暴露量通常相似。

按照基本如上所述的方案，在研究第24和70天分別發(fā)現(xiàn)毒代動力學(xué)時期的30 mg/kg組中的一只雄性和主要時期的溶媒對照組中的一只雄性死亡。在1000 mg/kg組不存在死亡率的情況下，30 mg/kg組的死亡不被認為是化合物相關(guān)的。在日常檢查中，在30 mg/kg組中的4只雄性和在1000 mg/kg組中的3只雄性分別在研究第8天和第20天開始被注意到一只或兩只眼睛周圍紅色物質(zhì)的發(fā)生率增加。在每日檢查或給藥后約1小時，在3、 30和1000 mg/kg組中沒有發(fā)現(xiàn)雄性的其他化合物相關(guān)的臨床結(jié)果。平均體重，體重增加和食物消耗在所有劑量水平都不受化合物施用的影響。

在30和1000 mg/kg組中觀察到劑量依賴性降低的絕對和相對（對身體和腦重量）雄性生殖器官重量包括睪丸、附睪（完整和尾片）、前列腺和精囊/凝固腺/附屬流體。在睪丸中觀察到的器官重量效應(yīng)對應(yīng)于特征在于睪丸間質(zhì)細胞和生殖上皮萎縮的組織學(xué)變化。這些發(fā)現(xiàn)以及在兩組中附睪中的成熟精子數(shù)減少和在1000 mg/kg組中發(fā)現(xiàn)附屬性腺分泌物減少被認為與通過睪丸間質(zhì)細胞或者通過抑制靶器官中的激素受體導(dǎo)致的雄激素（睪丸激素）的合成和/或分泌的下調(diào)一致。在1000 mg/kg 組的生殖器官注意到的效果對應(yīng)于降低的生殖功能。在30和1000 mg/kg組中，在附屬性腺（前列腺、精囊和凝固腺）中注意到的器官重量效果被認為與化合物的藥理學(xué)相關(guān)。

在1000mg/kg組中注意到對精子形成終點的化合物相關(guān)的影響。在1000mg/kg組中觀察到降低的附睪重量，并且對應(yīng)于該組中降低的平均附睪精子濃度。此外，在1000mg/kg下觀察到形態(tài)正常精子以百分比計的化合物相關(guān)的減少，這是頭部不存在或與鞭毛分離的精子數(shù)量較高的結(jié)果。這些影響與1000 mg/kg組雄性的交配、生育力和交配指數(shù)降低相關(guān)。此外，與溶媒對照組相比，在1000mg/kg組中觀察到稍長的性交前間隔。3和30mg/kg組的精子形成終點和生殖性能不受化合物施用的影響。

在3、30和1000mg/kg的劑量水平，胚胎的子宮內(nèi)存活不受將化合物施用于雄性動物的影響。

總之，在任何劑量水平，沒有對雄性體重或食物消耗的影響，或不利的化合物相關(guān)的臨床發(fā)現(xiàn)。在30和1000mg/kg發(fā)生對雄性生殖組織和精子發(fā)生參數(shù)的化合物相關(guān)的不良影響。在1000mg/kg中發(fā)生雄性生殖器官重量的減少，并且對應(yīng)于對附睪精子濃度和形態(tài)的影響。此外，在1000mg/kg時在睪丸、附睪、前列腺、精囊和凝固腺中觀察到微觀改變，這對應(yīng)于該組中交配、生育力和交配指數(shù)的減少。雖然基于組，生殖性能的降低通常與雄性生殖組織的組織學(xué)變化相關(guān)，但是基于個體動物，該相關(guān)性并不總是明顯的。在30mg/kg組中，注意到生殖器官重量的減少以及睪丸和附睪中的微觀改變。在30mg/kg時未觀察到對生殖功能的相應(yīng)影響，這表明藥理學(xué)信號雖然存在，但不足以影響功能性生殖?；谶@些發(fā)現(xiàn)，雄性生殖毒性和雄性全身毒性的NOAEL為3mg/kg。3mg/kg的劑量水平對應(yīng)于研究第70天的暴露量（AUC 0-24小時）值為10,954 ng·hrs/mL。

狗中的四周口服毒性研究

進行該研究以評價實施例1化合物（一種選擇性雄激素受體調(diào)節(jié)劑（SARM））在狗中每日兩次口服膠囊施用4周后的潛在毒性和毒代動力學(xué)。三只雄性和三只雌性比格犬的三個治療組分別以6、 60或300mg/kg/天的劑量水平施用測試品。三只動物/性別的一個額外組作為對照并通過口服膠囊接受溶媒，80%PEG 3350/20%維生素E TPGS（v/v）。通過口服膠囊，以1.5mL/kg /劑量的劑量體積，將測試品或者溶媒每天兩次，連續(xù)28天施用于所有組。

對所有動物每天兩次進行死亡率，發(fā)病率，損傷以及食物和水的供應(yīng)的觀察。每周進行詳細的臨床觀察。在接收后一天，隨機化分組之前和研究期間每周測量和記錄體重。每周測量和記錄食物消耗。眼科檢查在試驗前和終末剖檢前進行。體檢在試驗前進行。在第1周和第4周進行神經(jīng)學(xué)檢查。在開始給藥之前和在第3天和第26天早晨測試品給藥之前和之后約2小時（±15分鐘）進行ECG檢查兩次。在試驗前收集兩次血液樣品，并且在終末剖檢之前從所有動物收集用于臨床病理學(xué)評價的血液和尿液樣品。在第1天和第28天的指定時間點從所有動物收集用于測定測試品血漿濃度的血液樣品。從測試種類的濃度 - 時間數(shù)據(jù)測定測試品的毒代動力學(xué)參數(shù)。在研究終止時，進行剖檢檢查，記錄器官重量，并且顯微鏡檢查睪丸、附睪和前列腺。通過分析冷凍肝樣品的總細胞色素P450含量來測定實施例1化合物誘導(dǎo)細胞色素P450的潛力。

按照基本如上所述的方案，在來自對照動物的任何血漿樣品中都沒有發(fā)現(xiàn)可測量（<1ng/mL）的實施例1化合物濃度。在雄性和雌性之間沒有觀察到實施例1化合物血漿濃度的差異，表明對暴露量沒有性別影響。在給予6和60mg/kg /天的動物中，實施例1化合物的暴露量以小于劑量比例的方式增加，并且在60mg/kg /天時顯示出達到平頂，因為血漿濃度與300mg/kg/天相似。

狗中的52周毒性和毒代動力學(xué)研究

本研究的目的是當通過膠囊每天向狗施用至少52周時，評價測試品實施例1化合物的毒性并測定其毒代動力學(xué)，并且評價在13周恢復(fù)后任何作用的可逆性，持久性或延遲發(fā)生。

將雄性和雌性純種比格犬分組，并且根據(jù)表9經(jīng)口服含有1mL/kg的0 [在反滲透水中的1%（w/v）羧甲基纖維素鈉（低粘度/ 25-50cps），0.5%（w/v）十二烷基硫酸鈉和0.05%（v/v）Dow Corning? Antifoam 1510-US]、 3、10或100mg實施例1化合物/kg體重的膠囊給藥。所有動物接受相同數(shù)量的膠囊，組1動物僅接受含有溶媒對照品的膠囊。來自組1和4的每種性別的三只動物被指定為回收動物。

毒性評估基于死亡率，臨床體征，體重和體重變化，食物消耗，眼部和神經(jīng)學(xué)評價，ECG測量，激素分析（睪丸激素，孕酮，黃體生成激素和促卵泡激素），精液評價（射精體積和精子數(shù)，密度，形態(tài)和運動性），以及臨床和解剖病理學(xué)。收集血樣用于探測性代謝物分析和毒代動力學(xué)評價。

按照基本如上所述的方案，實施例1化合物的全身暴露量隨著劑量水平從3增至100mg/kg而增加。平均C_max和AUC_0-24hr的增加通常小于劑量比例。在毒代動力學(xué)參數(shù)中沒有觀察到一致的性別相關(guān)差異。在狗中多次給予實施例1化合物后觀察到實施例1化合物的積累。

直到預(yù)定處死之前所有動物都還存活?；衔锵嚓P(guān)的臨床體征是在給予> 3mg/kg的動物中觀察到流淚增加和在給予>3 mg/kg的雌性中減少或不存在發(fā)情周期。

在平均體重，體重增加和食物消耗方面沒有注意到毒理學(xué)上的重要差異。沒有發(fā)生眼科或神經(jīng)系統(tǒng)異常。

在給予100mg/kg的組合性別中，在給藥階段的第3、86和359天，在給藥前和給藥后2小時觀察到延長的QT間隔和校正的QT（QTc）間隔。在所有給藥期間的間隔中，在100mg/kg的組合性別中的平均QTc間隔的增加幅度為相對于對照動物平均值的14至21毫秒（6至9%）。在給予100mg/kg的組合性別的恢復(fù)期第88天或在給予3或10mg/kg動物的給藥期第3、86或359天，在QT或QTc間隔上沒有觀察到與化合物相關(guān)的變化。在給予3、10或100mg/kg的動物中在給藥期的第3、 86或者359天或者在給予100 mg/kg動物中在恢復(fù)期的第88天沒有觀察到在PR間期，QRS持續(xù)時間，RR間期或心率的與實施例1化合物相關(guān)的變化。在心電圖的定性評估期間沒有歸因于實施例1化合物的節(jié)律異?；蚨ㄐ訣CG變化。

在所有劑量水平上在雄性給藥期間在總精子數(shù)上發(fā)生了與實施例1化合物相關(guān)的劑量依賴性減少，并且歸因于射精重量的減少。在第52周評估（給藥期的第355和360天）時，相對于對照組，對于施用3、10或100mg/kg的雄性，總精子數(shù)分別減少> 55，> 50和> 91%。對總精子數(shù)的影響在恢復(fù)期完全逆轉(zhuǎn)。對于任何組沒有注意到對平均精子密度、運動性或形態(tài)上的與實施例1化合物相關(guān)的影響。

在給藥> 3 mg/kg的雄性和雌性中注意到激素變化。這些變化與測試品的藥理學(xué)一致，并與微觀變化相關(guān)。在雄性中，觀察到睪丸激素減少和LH增加。在雌性中增加的LH和降低的孕酮與無情欲和顯微鏡下觀察到的黃體的減少一致。在恢復(fù)期期間激素水平回到對照水平。

化合物相關(guān)的臨床病理學(xué)效應(yīng)在所有劑量水平下對于雄性和雌性都限于丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的最低至輕度增加（給予100mg/kg的雌性最受影響），并且對于給予3或10mg/kg的雄性和雌性，限于膽固醇的最低至中度降低（給予3mg/kg的動物最受影響）。100mg/kg下對丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的作用在恢復(fù)期后表現(xiàn)出可逆性。3和10mg/kg下對膽固醇濃度影響的可逆性無法評估，因為這些劑量水平下的動物沒有處于恢復(fù)期。這些效應(yīng)都不與相應(yīng)的微觀結(jié)果相關(guān)。

在雄性和雌性的生殖組織中注意到藥理學(xué)上預(yù)期的化合物相關(guān)形態(tài)學(xué)變化。在雄性中發(fā)生與化合物相關(guān)的和可逆的前列腺、附睪和肝/膽囊重量減少，這些減少，除了肝/膽囊變化之外，與微觀結(jié)果相應(yīng)。在前列腺中，給予> 3mg/kg的雄性具有可逆的前列腺腺泡上皮萎縮。給予> 3mg/kg的雄性具有可逆的附睪尾（尾巴）直徑的減小，而給予100mg/kg的雄性具有可逆的附睪性導(dǎo)管上皮萎縮。給予>3 mg/kg的雌性在卵巢中具有黃體減少/不存在，同時具有無情欲期循環(huán)階段。這種變化通常伴隨著乳腺中小葉發(fā)育缺乏以及次生生殖組織對無情欲期的預(yù)期響應(yīng)：子宮、子宮頸、陰道和乳腺具有與延長的無情欲期相當?shù)牟煌A段的（stage-appropriate）萎縮特征。

總的來說，雌性中的這些發(fā)現(xiàn)與化合物相關(guān)的對正常生殖循環(huán)的破壞一致。在恢復(fù)期，給予100mg/kg的2/3雌性具有間情期繁殖周期階段和小葉乳腺發(fā)育，表明向正常周期性活動的恢復(fù)，盡管在恢復(fù)期沒有注意到生殖周期的臨床證據(jù)。

此外，在腎上腺和皮膚/皮下組織中觀察到化合物相關(guān)的和可逆的微觀結(jié)果。在腎上腺中，給予>10 mg/kg的雄性和給予100 mg/kg的雌性的束狀帶和網(wǎng)狀帶的空泡形成減少。在皮膚中，在給予>3 mg/kg的動物中觀察到皮脂腺空泡形成減少。

總之，通過膠囊將實施例1化合物以3、 10或100 mg/kg的劑量水平每日施用給狗52周，沒有導(dǎo)致不利的與化合物相關(guān)的結(jié)果。生殖功能變化發(fā)生在所有實施例1化合物治療組的雄性（精子計數(shù)和射精量減少）和雌性（發(fā)情周期減少/不存在）中并與微觀結(jié)果相關(guān)。這些變化不影響動物的整體健康; 與測試品的藥理作用一致; 并且可逆。因此，NOAEL為100mg/kg。在給藥361天后，100mg/kg的劑量在雄性和雌性中分別對應(yīng)于1496和1885ng/mL的平均Cmax值和22582和31505ng·hr/mL 的AUC_{0-24 h}值。

用實施例1化合物對完整大鼠或狗治療1至12個月的時間導(dǎo)致前列腺尺寸的顯著降低，這進一步表明其不會隨時間推移產(chǎn)生前列腺增生的雄激素風(fēng)險。

體內(nèi)研究以探索實施例1化合物在TE存在下的任何直接拮抗劑作用

使用總共36只睪丸切除（ORX）和6只假手術(shù)的Wistar雄性大鼠（8周大時睪丸切除并使其消瘦4周）。大鼠維持于22 ℃下12 hr亮/黑循環(huán)，同時自由獲取食物 (含0.95% Ca和0.67%P的 TD 5001, Teklad, Madison, WI)和水?；隗w重將大鼠隨機分入治療組 (n=6)。除TE外全部組的給藥途徑為口服。TE皮下給藥。在每日給藥8周結(jié)束時，對大鼠實施安樂死，稱重并切割組織。自每個動物收集肛提肌、前列腺和精囊。結(jié)果繪制為平均值 ± SE。

如圖5和表11所示，庚酸睪酮（1mg/Kg-天）和各種劑量的實施例1化合物的結(jié)合顯示以mg計的精囊濕重（標準化為以克計的體重）的降低趨勢，這是通過TE單獨誘導(dǎo)的。

如圖6和表12所示，實施例1化合物與1 mg/Kg TE共同治療SD大鼠導(dǎo)致以mg計的前列腺濕重（標準化為以克計的體重）的劑量依賴性降低。

實施例1化合物與合成睪丸激素R1881相比顯示體外使用人類前列腺癌細胞，實施例1化合物比R1881促產(chǎn)雄性激素更少。相比而言，與人類雄激素受體 (hAr; Ki ，單位nM)的生化結(jié)合親和力僅適度減少。

健康志愿者中的Ia期研究

該1期研究是隨機、安慰劑對照、雙盲、單劑量、不完全交叉、劑量遞增設(shè)計，在由健康男人和絕經(jīng)婦女組成的3個給藥組中進行。將30名受試者（每組10名）隨機分配到每個給藥組。

在兩個給藥期間，受試者被允許進入臨床研究單位（CRU）過夜。受試者在第1天的早餐后口服給藥，并在給藥后在CRU保持約24小時。在每組中，給藥期之間的清除期為14至45天。出院后隨訪研究發(fā)生在最后一次劑量（時期2）后約5天。劑量遞增的適當性在每個遞增步驟通過安全性測量來確定。本研究使用受試者-研究者雙盲交叉設(shè)計來提供所有安全性和耐受性測量的受試者數(shù)據(jù)。這種設(shè)計有利于AE的客觀評價。

遵循基本如上所述的方案。作為不完全交叉設(shè)計的結(jié)果，約50%的受試者接受單劑量的實施例1化合物和安慰劑劑量以便增強顯著安全性或耐受性信號的檢測。約50%的受試者以2個劑量水平接受實施例1化合物，這允許進行PK參數(shù)和其它終點的劑量依賴性的同一受試者分析。選擇最小5天給藥間隔期以使治療期之間的遺留效應(yīng)最小化。

本研究的計劃劑量范圍為5至1000mg的實施例1化合物，并且基于在大鼠中的體內(nèi)效果，使用如下假設(shè)：在大鼠中產(chǎn)生80%骨效應(yīng)（中間水平負荷和股骨頸負荷的平均值）所需的暴露量與人體所需的暴露量相同。基于異速生長預(yù)測的人清除率（33L/h，90%置信區(qū)間[CI]：24至46L/h）和生物利用度（49%），預(yù)期在人類中的這種反應(yīng)發(fā)生在約71mg/天（90%CI：29至321mg/天）的劑量。

這些數(shù)據(jù)表明，如圖7所示，在將實施例1化合物給予健康人志愿者后，通過基于外周計算機斷層攝影的成像測量，在腓腸肌束（小腿肌肉面積）處的小腿肌肉面積增加。

這些數(shù)據(jù)表明，如通過DEXA測量的，在將實施例1化合物給予健康人類志愿者后，全身瘦肌肉質(zhì)量增加。如圖8和表14和15所示，使用Dunnett's檢驗（p <0.05），與0mg安慰劑劑量相比，5mg劑量水平的男性（藍色條）的效果是統(tǒng)計學(xué)顯著的。

如圖9和表16所示，這些圖的數(shù)據(jù)證明，當在任何時間點或?qū)嵤├?化合物的任何劑量下與安慰劑相比時，前列腺特異性抗原（SPA）水平與基線相比沒有顯著變化。

健康志愿者中的Ib期研究

這是在健康受試者中進行的實施例1化合物的1期、隨機、安慰劑對照、受試者和研究者盲法、多劑量、劑量遞增、平行研究。該研究在6個治療組中進行，并且受試者被隨機化以接受每日劑量的實施例1化合物或安慰劑4周。在每次劑量遞增之前進行安全性和耐受性評價。本研究的主要納入/排除標準是受試者是健康男性或健康絕經(jīng)女性，年齡在30至80歲之間，包括30和80歲; 體重指數(shù)（BMI）在18和32kg/m²之間，包括18和32kg/m²。

受試者在篩選后進入研究并隨機化。在第1和29天，受試者在臨床研究單位（CRU）住院。在第1天，第2天和第28天，受試者在早餐后口服給藥。所有安全性試驗在早餐前和在至少12小時的隔夜禁食之后收集。

在第1天后，按照預(yù)定程序、早餐和給藥，受試者在第二天（第1天給藥后約24小時）出院。第28天后，按照預(yù)定程序，受試者在第29天（第28天給藥后約24小時）出院。

這些數(shù)據(jù)證明在將實施例1化合物給予生殖腺健康的人體志愿者后，血清睪丸激素水平降低。鑒于男性相對較高的血清睪丸激素水平，治療后的降低在男性中更明顯。右側(cè)的表反映了在5mg劑量的Ph1a研究后的暴露量評估，如圖10所示。

如圖11和表16所示，這些數(shù)據(jù)表明，在將實施例1化合物給予生殖腺健康的人類志愿者之后，1型原骨膠原的N-末端前肽(P1NP，用于骨合成代謝的生物標記物)的陽性暴露量 - 響應(yīng)關(guān)系。