本發(fā)明涉及用于制造具有皮膚附屬器官(皮膚付屬器官)的全厚皮膚(全層皮膚)的方法以及制造的具有皮膚附屬器官的全厚皮膚。

背景技術(shù)：

在化妝品或皮膚藥品的開發(fā)中使用小鼠和大鼠等進行藥理學/安全性試驗。然而，近年來，考慮到動物福利，在世界范圍內(nèi)搜尋動物實驗的替代方法的開發(fā)。

雖然已經(jīng)開發(fā)了使用模擬動物的表皮或真皮的經(jīng)培養(yǎng)細胞或細胞片層(細胞シ一ト)的替代測試方法作為動物實驗的替代方法，但是這些替代皮膚不包括動物皮膚所具有的皮膚附屬器官(例如毛囊、指/趾甲、皮脂腺、汗腺和乳腺)。因為沒有皮脂或汗等的分泌，不具有皮膚附屬器官的替代皮膚的皮膚屏障功能較差，并且難以獲得接近活體中的那些測試結(jié)果的測試結(jié)果。此外，用不具有皮膚附屬器官的替代皮膚也不能獲得有關(guān)化妝品或藥品對皮膚附屬器官本身之影響的測試結(jié)果。

至于用于制造具有皮膚附屬器官的人造皮膚的方法，已經(jīng)嘗試例如在裸鼠的皮膚切除部位共培養(yǎng)脂肪來源的干細胞、表皮角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞的方法(專利文獻1)。

引用列表

[專利文獻1]日本公開未經(jīng)審查的專利申請公開No.2009-11588

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問題

例如，在如上述專利文獻1中記載的方法中，雖然部分地包括皮膚附屬器官，但是誘導的皮膚附屬器官將與裸鼠皮膚成為一體并不可分離，因此難以獲得包含皮膚附屬器官的干細胞來源的全厚皮膚(即，至少包含表皮層、真皮層和皮下組織的皮膚組織)。本發(fā)明人專注該技術(shù)問題以嘗試開發(fā)用于高效地制造完全源自目的個體的具有皮膚附屬器官的全厚皮膚的方法。

解決問題的手段

作為解決上述問題反復研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過用可激活Wnt途徑的生物活性物質(zhì)刺激胚狀體，并使其與支架材料結(jié)合，然后將其移植到動物中，可高效地制造具有皮膚附屬器官的全厚皮膚，從而完成本發(fā)明。

換言之，本發(fā)明提供了用于制造具有皮膚附屬器官的全厚皮膚的方法，其特征在于：

所述“具有皮膚附屬器官的全厚皮膚”至少包含以下(1)-(3)：

(1)包含表皮層和真皮層的皮膚，

(2)至少一種類型的皮膚附屬器官，和

(3)皮下組織，

其中所述方法包括以下步驟：

(a)用可激活Wnt途徑的生物活性物質(zhì)刺激胚狀體的步驟，

(b)制備包含以下(A)和(B)的綴合物的步驟：

(A)在步驟(a)中刺激的所述胚狀體的全部或一部分，和

(B)支架材料

(c)將所述步驟(b)中制備的所述綴合物移植到動物中的步驟，以及

(d)在所述動物中制造源自所述綴合物的全厚皮膚的步驟。

此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于所述動物是非人動物。

此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于所述非人動物是非人免疫缺陷動物。

此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于所述Wnt途徑是經(jīng)典Wnt途徑。

此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于所述“可激活Wnt途徑的生物活性物質(zhì)”選自：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt6、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10b和TGF-β。此外，所述“可激活Wnt途徑的生物活性物質(zhì)”可以是例如Wnt受體激動劑。

此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于所述胚狀體是由iPS或ES細胞產(chǎn)生的胚狀體。

此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于所述支架材料是膠原凝膠。

此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于所述移植是移植到腎包膜下(腎皮膜下)。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了通過上述任何方法制造的具有皮膚附屬器官的全厚皮膚。

毋庸置疑，上述本發(fā)明的一個或更多個特征的任何組合涵蓋在本發(fā)明中。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明的制造全厚皮膚的方法，可在多能干細胞來源的畸胎瘤中以高發(fā)生率制造具有皮膚附屬器官的全厚皮膚。由于通過本發(fā)明的方法制造的全厚皮膚具有與活的動物體類似的功能性皮膚附屬器官，因此其可以例如有利地用于化妝品或藥品的藥理學或安全性測試。此外，例如，通過用來自不同個體(例如來自不同的種族、膚色、年齡、性別等的個體)的多能干細胞制造本發(fā)明的全厚皮膚，可根據(jù)化妝品或藥品的目標進行適當?shù)乃幚韺W或安全測試。

此外，通過本發(fā)明的方法制造的全厚皮膚通過移植到動物皮膚中而具有極低的引起腫瘤的風險，因此也可以有利地用于移植到活體中。

附圖簡述

圖1示出了通過體內(nèi)移植多個胚狀體形成的畸胎瘤的HE染色圖像，所述胚狀體經(jīng)受Wnt10b刺激。左圖示出了包含外胚層囊腫毛囊的皮膚組織，右圖示出了黏膜樣組織。

圖2A示出作為本發(fā)明之一個實施方案的用于形成包封多種器官的畸胎瘤的方法的示意圖。在膠原凝膠中由iPS細胞形成三維排列的胚狀體，然后在體內(nèi)移植以形成畸胎瘤。此外，從胚狀體形成的第7天開始進行持續(xù)24小時的Wnt10b刺激，然后進行三維排列。圖2B示出了在畸胎瘤中形成的多種器官的分類。各個圖中的a-d分別示出了以下的典型組織圖像，a：皮膚樣組織，b：黏膜樣組織，c：由移行上皮組成的囊腫組織和d：由內(nèi)胚層性上皮組成的囊腫組織。圖中的各個符號分別表示Cyst：囊腫腔，Epi：上皮組織，Der：真皮組織，Ad：脂肪組織，LP：黏膜固有層，Sand M：平滑肌組織。c中的囊腫上皮組織由包含復層鱗狀上皮(＊)和杯狀細胞(箭頭)的簡單柱狀上皮形成。圖2C示出了將用源自經(jīng)受Wnt10b刺激的胚狀體的畸胎瘤誘導的器官的發(fā)生率(黑條)和用源自未經(jīng)受Wnt10b刺激的胚狀體的畸胎瘤誘導的器官的發(fā)生率(亮條)進行比較的圖。圖2D示出了將每1g源自經(jīng)受Wnt10b刺激的多個胚狀體的畸胎瘤所誘導的毛囊形成數(shù)目(黑條)與每1g源自未經(jīng)受Wnt10b刺激的多個胚狀體的畸胎瘤所誘導的毛囊形成數(shù)目(光條)進行比較的圖。

圖3示出了由源自經(jīng)受Wnt10b刺激的胚狀體的畸胎瘤誘導的分泌腺樣結(jié)構(gòu)的組織圖像。左圖示出了HE染色圖像，中央的圖示出了通過抗淀粉酶抗體的熒光免疫染色圖像，右圖示出了通過抗E鈣黏蛋白抗體的免疫染色圖像。圖中的箭頭示出了在腺泡樣組織中細胞質(zhì)中的顆粒淀粉酶。圖中的虛線的范圍示出了腺泡組織的范圍，圖中的“D”示出了近端血管樣結(jié)構(gòu)。

圖4是示出了包含iPS誘導的毛囊的全厚皮膚移植到裸鼠后隨時間推移的照片。分離包含由iPS細胞誘導的毛囊的皮膚囊腫，切成包含約20個毛囊的全厚皮膚并移植到裸鼠的背部皮膚中，隨時間推移觀察移植后的毛干生長。這些照片示出了從移植在3個位置的包含毛囊的全厚皮膚生長的毛干的追蹤實例。

圖5是示出了源自iPS誘導的毛囊的毛發(fā)之毛發(fā)周期的分析的圖。隨時間推移觀察由iPS細胞誘導的毛囊的毛干生長。確定生長毛發(fā)的毛孔，并對毛發(fā)生長期以及第一至第三毛發(fā)周期的毛發(fā)生長靜息和脫落期的天數(shù)進行計數(shù)。從追蹤的毛發(fā)的最大生長期的放大照片將毛發(fā)類型(描述為Zigzag毛發(fā)、Awl/Guard頭發(fā)以及對于不能通過體毛的形態(tài)學定義確定的毛發(fā)描述為“無法分型的毛發(fā)”)區(qū)分開。黑色圓圈示出了毛干生長期的天數(shù)，白色圓圈表示出了毛發(fā)生長靜息和脫落期的天數(shù)。

圖6示出了對從iPS誘導的毛囊的移植位點發(fā)育的組織進行Y染色體標記的熒光原位雜交(FISH)的結(jié)果。描述為“FISH”的圖示出了移植到裸鼠的整個組織區(qū)域以及周圍宿主皮膚的Y染色體FISH的低放大倍數(shù)圖像。描述為“DIC”的圖是FISH中示出的組織的微分干涉圖像，箭頭示出了具有黑色素色素沉著的iPS誘導的毛發(fā)。在FISH的低放大倍數(shù)圖像中，組織區(qū)域由白色矩形示出，并且放大的照片示于a-d中。圖中的白點是通過FISH檢測的Y染色體。

圖7是示出了從iPS誘導的毛囊的移植位點發(fā)育的組織中再生干細胞微環(huán)境(ニツチが)的免疫染色圖像。圖7a和7b示出了為毛囊上皮干細胞標志物的抗CK15和抗CD34抗體的雙重免疫染色圖像。圖7a是包含iPS誘導的毛囊移植部位的全厚皮膚的低放大倍數(shù)圖像，由虛線框住的區(qū)域示出了移植的組織。圖7a中由白色矩形框住的區(qū)域的放大圖像示于圖7b中。圖7b中的箭頭示出了通過抗CK15和抗CD34抗體共染色的毛囊外根鞘。圖7c和7d示出了針對皮脂腺祖細胞標志物Lrig1和上皮干細胞標志物CK15的免疫染色圖像。圖7c中的虛線區(qū)域表示移植的組織。圖7c中由白色矩形框住的區(qū)域的放大照片示于圖7d中，Lrig1陽性細胞用箭頭指示，CK15陽性細胞用楔形指示。在圖中，SG表示皮脂腺。圖7e示出了使用抗Lgr6抗體的免疫染色圖像。Lgr6在皮脂腺附著位點附近的外根鞘(箭頭)處表達。圖7f示出使用抗Lgr5抗體的免疫染色圖像。認為Lgr5在生長期毛囊的可變區(qū)表達，特別是在毛發(fā)基質(zhì)區(qū)(箭頭)附近的上皮細胞中強烈表達。

圖8是示出了iPS誘導的毛囊與從iPS誘導的毛囊的移植位點發(fā)育的組織中的豎毛肌和神經(jīng)連接的圖。將包含源自iPS的毛囊的全厚皮膚移植到裸鼠的背部，當iPS細胞來源的毛囊進入第三生長期時收集組織以產(chǎn)生厚度為100μm的組織切片。分別示出了通過識別平滑肌標志物鈣調(diào)理蛋白(カルポニン)和神經(jīng)纖維標志物神經(jīng)絲H(neurofilament H，NF-H)的抗體的熒光免疫染色圖像(圖8a)以及通過透射光的同一切片的立體顯微圖像(圖8b)。通過立體顯微鏡成像在毛囊中觀察到其中毛干含有黑色素的毛囊(圖8b，黑色箭頭)示出其源自iPS細胞。在低放大倍數(shù)圖像的白色矩形內(nèi)，宿主毛囊的區(qū)域(圖8c，宿主)和包含iPS細胞來源的毛囊區(qū)域(圖8d，iPS1和圖8e，iPS2)的放大圖示于圖c-e中。示出了與各個毛囊連接的鈣調(diào)理蛋白陽性豎毛肌(白色箭頭)和NF-H陽性神經(jīng)纖維(白色箭頭)。

具體實施方式

本文中使用的“多能干細胞”是指具有能夠分化為活體的任何和所有的細胞類型的分化多樣性以及甚至在經(jīng)過增殖和分化后仍能保持分化多樣性的自我復制能力二者的細胞，其實例包括ES細胞或iPS細胞。

本文使用的“ES細胞(胚胎干細胞)”是指由胚泡期(動物發(fā)育的早期)中屬于胚胎的一部分的內(nèi)細胞團產(chǎn)生的干細胞株，其具有能夠分化為多種細胞的分化多樣性以及甚至在經(jīng)過分裂和增殖后保持分化多樣性的自我復制能力。

可用于本發(fā)明的ES細胞的來源不受特別限制，可使用源自任何和所有動物的內(nèi)細胞團的ES細胞。例如，作為ES細胞的來源，可使用源自人、小鼠、大鼠、豬或猴的內(nèi)細胞團的ES細胞。

本文中使用的“iPS細胞(誘導多能干細胞)”是指通過將例如幾種類型的基因和/或試劑引入體細胞中而被賦予能夠分化成大量細胞的分化多樣性以及甚至在經(jīng)過分裂和增殖后保持分化多樣性的自我復制能力的細胞，如同ES細胞。

可用于本發(fā)明的iPS細胞的來源不受特別限制，可使用源自任何和所有動物的iPS細胞。例如，作為iPS細胞的來源，可使用源自人、小鼠、大鼠、豬或猴的iPS細胞。此外，本發(fā)明中所使用的將成為iPS細胞之來源的體細胞也不受特別限制，可使用由源自任何和所有組織的細胞誘導的iPS細胞。另外，可用于本發(fā)明的誘導iPS細胞的方法也不受特別限制，可使用通過任何方法誘導的iPS細胞，只要該方法可從體細胞誘導iPS細胞即可。

在本發(fā)明中，用于培養(yǎng)多能干細胞而不使其分化的方法不受特別限制，可適當選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基或與其一致的培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基。例如，小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)可用作培養(yǎng)多能干細胞的飼養(yǎng)細胞。此外，可使用通常用于培養(yǎng)多能干細胞的培養(yǎng)基作為用于培養(yǎng)多能干細胞的培養(yǎng)基，其組成不受特別限制。

本文使用的“畸胎瘤”是具有雙胚層或三胚層成分的高度分化的生殖細胞腫瘤，也稱為畸胎樣瘤(奇形種)。本文使用的“畸胎瘤”包括組織學上類似于當多能干細胞移植到活體時可能產(chǎn)生的畸胎樣瘤的結(jié)構(gòu)。雖然畸胎瘤有時在體內(nèi)自然產(chǎn)生，但是也可通過將多能干細胞移植到動物中來人工產(chǎn)生畸胎瘤。

在本發(fā)明中，將細胞移植到動物中的部位不受特別限制，例如，可以移植到動物的腎包膜下、皮下或睪丸。

在本發(fā)明中，用于將細胞移植到動物中的方法不受特別限制，例如，當移植到小鼠的腎包膜下時，在腎包膜中切開2-3mm的切口，腎小囊和腎實質(zhì)分離，可在其間移植細胞。

在本發(fā)明中，用于確認在具有移植了多能干細胞的動物中形成畸胎瘤的方法不受特別限制，例如，可通過在移植后3至4周進行剖腹手術(shù)來進行確認，并且可通過外觀目視確認腫瘤塊形成。優(yōu)選地，可通過對腫瘤塊進行組織學分析來確認三胚層組織形成，其是畸胎瘤的特征。

如本文使用的“全厚皮膚”是指包含至少以下(1)-(3)的層狀組織結(jié)構(gòu)：

(1)包含表皮層和真皮層的皮膚，

(2)至少一種類型的皮膚附屬器官，和

(3)皮下組織。

本文使用的“皮膚附屬器官”是指(但不限于)經(jīng)由構(gòu)成皮膚的表皮層和上皮組織連接的并且具有固有功能的角質(zhì)器官和外分泌腺。本文使用的皮膚附屬器官是指(但不限于)例如分布在皮膚中的器官，例如毛囊、指/趾甲、皮脂腺、汗腺和乳腺。

本文使用的“皮下組織”是支持皮膚和皮膚附屬器官并且將其與其他器官系統(tǒng)結(jié)合的組織，其實例包括但不限于：皮下脂肪組織、由平滑肌組織形成的肉膜(皮筋層)和由膠原纖維或彈性纖維形成的結(jié)締組織。

如本文使用的“器官原基”是指被確定為隨著體內(nèi)發(fā)育階段的進展而發(fā)育成特定器官的胚胎區(qū)域或胚胎結(jié)構(gòu)，有時簡稱為“原基“。活體中幾乎所有的器官都是如下發(fā)育而來：通過胎兒階段的發(fā)育程序從上皮細胞系干細胞和間充質(zhì)譜系干細胞誘導的器官原基發(fā)育至給定位置和給定數(shù)目。

在本發(fā)明中，用于確認在畸胎瘤中形成目的全厚皮膚的方法不受特別限制，例如，可通過解剖畸胎瘤以及從外觀上查找被認為是具有皮膚附屬器官(例如毛囊、指/趾甲、皮脂腺、汗腺和乳腺)的全厚皮膚來進行確認。優(yōu)選地，產(chǎn)生畸胎瘤組織切片以及可從組織結(jié)構(gòu)確認給定器官的鑒定。當要進行更詳細的確認時，可通過原位雜交法分析在各個器官中表達的基因是否在適當?shù)奈稽c表達。

本文使用的“胚狀體”是指當在懸浮液中培養(yǎng)多能干細胞例如ES細胞或iPS細胞時形成的細胞團。胚狀體可呈現(xiàn)胚狀體形式，并且可以由多種組織構(gòu)成?？捎糜诒景l(fā)明的用于產(chǎn)生胚狀體的方法不受特別限制，例如，可使用在低附著板中接種多能干細胞的方法、懸浮多能干細胞的細胞懸浮液滴的懸滴法，以及在振蕩下培養(yǎng)懸浮液中多能干細胞的培養(yǎng)皿的方法。

例如，當通過在低附著板中接種iPS細胞的方法產(chǎn)生胚狀體時，可通過在96孔低附著板中以1500個細胞至10000個細胞/200μl/孔，更優(yōu)選2000個細胞至4000個細胞/200μl/孔接種和培養(yǎng)iPS細胞來產(chǎn)生胚狀體。當接種的細胞小于1500個細胞/200μl/孔時，存在不能適當形成胚狀體的風險，而當接種的細胞大于10000個細胞/200μl/孔時，存在由于胚狀體中的營養(yǎng)不良引起的壞死的風險。

此外，從本發(fā)明中使用的胚狀體的懸浮培養(yǎng)開始起的天數(shù)不受特別限制，例如可優(yōu)選使用從懸浮培養(yǎng)開始起第5至9天的那些胚狀體。

在本發(fā)明中，當胚狀體用于移植時，可將胚狀體的全部或一部分用于移植。胚狀體可直接用于移植，或者也可僅將胚狀體的一部分用于移植。當僅將胚狀體的一部分用于移植時，優(yōu)選使用胚狀體的表面組織。由于胚狀體的表面層是由上皮細胞系構(gòu)成，因此通過使用胚狀體的表面組織進行移植可以更高效地在畸胎瘤中制造全厚皮膚。

在本發(fā)明中，用于從胚狀體僅分離表面組織的方法不受特別限制。例如，胚狀體的表面組織可通過在立體顯微鏡下通過注射器以顯微手術(shù)物理收集。

如本文使用的“支架材料”是指通常通過使細胞和材料在材料上或材料內(nèi)部接觸來表達和促進多種細胞功能例如細胞粘附、增殖、分化、活化、運動、遷移和形態(tài)變化的材料，并且不受特別限制，只要其在移植多能干細胞時是有利的即可。例如，可使用膠原凝膠作為支架材料，優(yōu)選可使用I型膠原凝膠、III型膠原凝膠、IV型膠原凝膠和基質(zhì)膠(Matrigel)。通過將多能干細胞包封在支架材料中，然后對其進行移植，防止多能干細胞在移植的組織中消失，并且用作組織存活的支架，因此可更有效地在畸胎瘤中制造全厚皮膚。此外，通過將多能干細胞包封在支架材料中，然后將其進行移植，可將胚狀體移植到膠原凝膠中，同時保持所期望的構(gòu)型。通過使用在膠原凝膠中表面組織彼此接觸的各個胚狀體進行移植，可更高效地在畸胎瘤中制造全厚皮膚。

在本發(fā)明中，產(chǎn)生包含“胚狀體的全部或一部分”和支架材料的綴合物的方法不受特別限制?！芭郀铙w的全部或一部分”和支架材料可以離體結(jié)合，然后用于移植，或者可通過首先在體內(nèi)引入支架材料，然后注射待與其結(jié)合的“胚狀體的全部或一部分”進行移植。此外，例如，當采用膠原凝膠用作支架材料并將其與胚狀體的全部或一部分結(jié)合時，可通過將胚狀體放在溶膠狀態(tài)的膠原凝膠中然后固化來產(chǎn)生膠原凝膠與胚狀體的全部或一部分的綴合物。

如本文使用的“可激活Wnt途徑的生物活化物質(zhì)”可以是例如可激活經(jīng)典Wnt途徑(也稱為β聯(lián)蛋白途徑)的生物活化物質(zhì)或可激活非經(jīng)典Wnt途徑(平面細胞極性途徑；PCP途徑，也稱為Ca²⁺途徑)的生物活化物質(zhì)?？杉せ頦nt途徑的典型的生物活化物質(zhì)的實例可以是例如Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt6、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10b和TGF-β，可激活Wnt途徑的非經(jīng)典生物活性物質(zhì)的實例可以是例如Wnt4、Wnt5a和Wnt11。在例如Maksim V.Plikus等(Science332，586(2011))中描述了Wnt10b可激活經(jīng)典Wnt途徑(β聯(lián)蛋白途徑)的事實。在Kemp等(Functional Development and Embryology 1(1)，1-13(2007))中描述了Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt6、Wnt7b、Wnt8a和Wnt8b可激活經(jīng)典Wnt途徑(β聯(lián)蛋白途徑)和Wnt4、Wnt5a和Wnt11可激活非經(jīng)典Wnt途徑的事實，以及在Sato(Acta Derm Venereol 2006；86：300-307)中描述了TGF-βb可穩(wěn)定皮膚成纖維細胞中β聯(lián)蛋白的表達的事實。

在本發(fā)明中，用于移植細胞的動物的類型不受特別限制，并且任何和所有的動物均可用于移植。優(yōu)選地，通過使用非人動物例如豬、牛、猴、狒狒、狗、貓、大鼠或小鼠進行移植，可以避免將細胞移植到人中而產(chǎn)生的倫理問題。更優(yōu)選地，通過使用非人免疫缺陷動物進行移植，可避免由于活體的免疫功能引起的排斥，并且可有效地產(chǎn)生畸胎瘤。此外，通過使用非人免疫缺陷動物進行移植，可在非人免疫缺陷動物的活體中產(chǎn)生源自另一種類型動物之細胞的畸胎瘤。例如，通過將人來源的多能干細胞移植到非人免疫缺陷動物中，可在非人免疫缺陷動物的活體中產(chǎn)生人細胞來源的畸胎瘤。

如本文使用的“免疫缺陷動物”是指缺乏活體的部分或全部免疫功能的動物。缺乏免疫功能的類型不受特別限制，但是所述動物優(yōu)選是這樣的缺乏免疫功能的動物，使得移植到該活體的來自另一種類型的動物的細胞或組織不被消除。例如，在免疫缺陷小鼠的情況下，可使用SCID小鼠、裸小鼠、NOD小鼠、NOD-SCID小鼠、IL-2Rg敲除小鼠、RAG2敲除小鼠、NOG小鼠或RAG2/IL-2Rg雙敲除小鼠，優(yōu)選可使用SCID小鼠。此外，例如，在免疫缺陷大鼠的情況下，可使用SCID大鼠。此外，在免疫缺陷豬的情況下，可使用IL-2rg敲除豬。

在本發(fā)明中，從畸胎瘤切除所期望的器官的方法不受特別限制，例如，可通過顯微手術(shù)進行切除。

注意，本文使用的術(shù)語將用于描述特定實施方案，并且不旨在限制本發(fā)明。

此外，除非內(nèi)容明確指示以其他方式理解，否則本文所使用的術(shù)語“包括/包含”意指存在所描述的項目(例如組分、步驟、要素和數(shù)字)，并且不排除其他項目(如組分、步驟、要素和數(shù)字)的存在。

除非另有定義，否則本文使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)和科學術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員廣泛認可的那些相同的含義。除非另有明確定義，否則本文使用的術(shù)語應被解釋為具有與本文和相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中的含義一致的含義，并且不應被解釋為具有理想化或過度形式化的含義。

有時使用例如第一和第二的術(shù)語來表達各種要素，并且應認識到，這些要素不受這些術(shù)語的限制。這些術(shù)語僅用于將一個要素與另一個要素區(qū)分開的目的，并且例如可以在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下將第一要素描述為第二要素，以及類似地，將第二要素描述為第一要素。

現(xiàn)在將通過實施例更具體地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明可通過多種實施方案來實現(xiàn)，不應被解釋為限于本文所描述的實施例。

實施例

通過體內(nèi)移植包含胚狀體的綴合物形成全厚皮膚

1.材料和方法

(1)實驗動物

C.B-17/lcr-scid/scidJcl小鼠購自CLEA(Tokyo，Japan)，scid/scid hr/hr(SHO)小鼠購自Charles River(Kanagawa，Japan)。小鼠的管理和操作符合NIH實驗室動物指南。所有實驗在東京理科大學的實驗動物管理委員會的批準下進行。

(2)細胞培養(yǎng)

將小鼠iPS細胞(mGF-iPS-3F-3)與用絲裂霉素C(Nacalai Tesque)處理的SNLP 76.7-4飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)。對于培養(yǎng)用培養(yǎng)基，使用補充有15％胎牛血清(Japan Bio Serum)、50單位/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、1×10^-4M 2-巰基乙醇和1×10^-4M非必需氨基酸(均來自Invitrogen)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基(不含丙酮酸鈉的DMEM；Nacalai Tesque)。每天更換培養(yǎng)基，在傳代培養(yǎng)后第2天，用補充有0.25％胰蛋白酶-1mM EDTA(Invitrogen)的D-PBS(-)(Nacalai Tesque)溶液傳代培養(yǎng)。

將SNLP 76.7-4飼養(yǎng)細胞在用0.1％明膠水溶液明膠包被的培養(yǎng)皿上在37℃下培養(yǎng)2小時或更長時間。對于培養(yǎng)用培養(yǎng)基，使用補充有7％胎牛血清、50單位/mL青霉素、50μg/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺(均來自Invitrogen)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基(不含丙酮酸鈉的DMEM；Nacalai Tesque)。將絲裂霉素C添加到所述培養(yǎng)基中至終濃度為12μg/ml，使SNLP 76.7-4飼養(yǎng)細胞在37℃下反應2小時15分鐘以對SNLP76.7-4飼養(yǎng)細胞進行絲裂霉素處理。然后，將經(jīng)反應的細胞以2.5×10⁴細胞/cm²接種在明膠包被的皿中。將絲裂霉素處理后培養(yǎng)了24小時或更長時間的那些細胞用作與iPS細胞共培養(yǎng)的飼養(yǎng)細胞。

(3)胚狀體的產(chǎn)生

通過酶處理將iPS細胞與飼養(yǎng)細胞一起從培養(yǎng)皿中分離，并通過溫和吹吸使其成為單細胞。使用細胞分選儀(FACS AriaIII，BD)，通過SSC和FSC除去飼養(yǎng)細胞，僅分選出iPS細胞。將分選的iPS細胞懸浮在(2)中描述的iPS細胞培養(yǎng)基中至1.5x10⁴個細胞/ml，并進一步以3,000個細胞/200μL/孔接種在96-孔低附著板中(Lipidure，NOF)。

(4)胚狀體的Wnt10b刺激

通過(2)和(3)中描述的方法將iPS細胞接種在低細胞粘附板中，然后用補充有10％胎牛血清(Japan Bio Scrum)、50單位/mL青霉素和50μg/ml鏈霉素的Iscove′s改良的Dulbecco′s培養(yǎng)基(IMDM；GIBCO)培養(yǎng)7天。在接種后第4天，更換一半培養(yǎng)基，在培養(yǎng)第7天，通過相差顯微鏡確認胚狀體形成，并對沒有形態(tài)缺陷的胚狀體進行Wnt10b刺激。將在PBS中的0.1mg/mL Wnt10b(R&D)作為原液添加到iPS細胞的培養(yǎng)基中至1μg/mL。將形成有胚狀體的孔中的一半培養(yǎng)基棄去，并將這一半用包含Wnt10b(終濃度500ng/mL)的用于iPS細胞的培養(yǎng)基更換。將在補充有Wnt10b培養(yǎng)基中的胚狀體在CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

(5)通過移植iPS細胞來源的胚狀體形成畸胎瘤

在施加有薄硅脂(シリコングリ一ス)的無菌塑料皿上形成三十微升冷的I型膠原凝膠(Nitta明膠)滴，在凝膠形成之前快速并入32或48個胚狀體，并將其在37℃下在CO₂培養(yǎng)箱中孵育10分鐘以凝膠。將并入胚狀體的膠原凝膠各自移植到在麻醉下的C.B-17/lcr-scid/scidJcl小鼠(7-10周齡)的兩個腎的腎包膜下。在移植后第28或30天，處死移植有iPS細胞來源的胚狀體的小鼠，并切除畸胎瘤。

(6)畸胎瘤中囊腫的組織學分析

為了對畸胎瘤中的囊性上皮進行分析并對誘導的器官進行組織學分析，測量了切除的畸胎瘤的重量并拍攝宏觀照片，然后將上面提到的畸胎瘤浸入Mildform 10N固定液(Wako)中并在室溫下固定過夜。根據(jù)常規(guī)方法將固定的畸胎瘤組織石蠟包埋或冷凍包埋，并產(chǎn)生厚度為10μm的連續(xù)切片。將全部或部分的連續(xù)切片用Mayer′s蘇木精HE染色以進行畸胎瘤中囊腫的組織學分析。為了分析畸胎瘤中毛囊形成發(fā)生率，對從塊表面起3mm的厚度進行組織化學分析，并用直立顯微鏡Axioimager A1(Carl Zeiss)和AxioCAM MRc5(Carl Zeiss)對已形成的毛囊的數(shù)目進行計數(shù)。對在連續(xù)切片上其中毛球部變得最大的毛囊進行計數(shù)。此外，用直立顯微鏡Axioimager A1(Carl Zeiss)和AxioCAM MRc5(Carl Zeiss)拍攝組織圖像。

2.結(jié)果

(7)通過體內(nèi)移植包含胚狀體的綴合物形成全厚皮膚和黏膜樣組織

(7-1)包含胚狀體的綴合物的體內(nèi)移植的組織學分析

對于通過體內(nèi)移植包含胚狀體的綴合物形成的畸胎瘤中的囊腫，觀察連續(xù)切片的HE染色圖像以分析組織學特征。結(jié)果，具有皮脂腺的毛囊與皮膚樣囊腫連接，并且以皮脂腺的連接點為邊界，分散有成纖維細胞的嗜酸性真皮層定位于囊腫上皮的方向，并脂肪組織分布到毛球部的方向。囊腫的表皮層具有規(guī)則排列的基底細胞層、極性細胞層、顆粒層和角質(zhì)層，并且顯示角質(zhì)層為典型的皮膚表皮組織，因為其以清楚的層狀狀態(tài)朝向囊腔的內(nèi)部分離。顯示毛干從毛囊的開口朝向囊腫內(nèi)腔生長(圖1，黑色箭頭)。皮脂腺和毛囊的連接部位是毛囊漏斗形部分或毛孔(毛穴)的開口(圖1，左，白色楔形)，并且認為皮脂可通過毛孔分泌到上皮的外層。這種結(jié)構(gòu)與天然皮膚的組織學特征完全匹配，并且顯示以囊腔為中心誘導的全厚皮膚。另一方面，在黏膜樣囊腫中未觀察到外胚層器官例如毛囊，有些模糊的單層角質(zhì)化上皮層被為松散結(jié)締組織的黏膜固有層和黏膜下層包圍，平滑肌層和分泌腺樣組織排列在黏膜下層，并且顯示其與黏膜等在組織學上類似(圖1，右)。

(7-2)通過在胚狀體形成期間添加Wnt10b誘導上皮組織區(qū)域

對通過(3)-(5)中所描述的方法在小鼠腎包膜下形成的畸胎瘤的組織切片進行HE染色(圖2A)，根據(jù)形成的囊腫的上皮組織和周圍間質(zhì)組織的組織學特征將其類為皮膚樣(復層鱗狀角質(zhì)化上皮層/真皮層/脂肪或橫紋肌)、黏膜樣(復層鱗狀角質(zhì)化上皮/黏膜固有層/橫紋肌)、移行上皮(復層鱗狀角質(zhì)化上皮和單層柱狀上皮的移行形式)或內(nèi)胚層上皮樣(單層柱狀上皮/黏膜固有層/橫紋肌)，并測量其構(gòu)造比(圖2B)。結(jié)果，與通過未經(jīng)Wnt10b刺激的胚狀體的移植相比，當移植經(jīng)受Wnt10b刺激的胚狀體時，內(nèi)胚層上皮樣中囊腫減少，并且皮膚樣和黏膜樣的發(fā)生率提高(圖2C)。

(7-3)通過添加Wnt10b提高毛囊形成發(fā)生率

與未經(jīng)Wnt10b處理的組(39±21，n＝8)相比，源自經(jīng)Wnt10b刺激所刺激的胚狀體(285±128，n＝4)的1g畸胎瘤中包含的誘導毛囊的數(shù)目顯著提高(圖2D)。此外，當測量胚狀體移植到腎囊后第28至30天畸胎瘤中誘導的從毛干中生長的毛囊的長度時，Wnt10b添加組中的長度是未處理組的兩倍。

(7-4)通過添加Wnt10b誘導外分泌腺組織

在源自經(jīng)Wnt10b刺激的胚狀體的畸胎瘤的HE組織分析中，觀察到其中外分泌腺的許多腺泡結(jié)構(gòu)已聚集的結(jié)構(gòu)(圖1，右)。因此，當使用針對僅由唾液腺和胰腺外分泌腺分泌的淀粉酶的抗體對與外分泌腺的腺泡相似的組織進行免疫染色時，在針對上皮細胞標志物E鈣黏蛋白陽性的細胞的細胞質(zhì)中顯示出分泌囊泡的顆粒陽性圖像特征。根據(jù)該結(jié)果，表明不僅毛囊而且外分泌腺(例如唾液腺)也被Wnt10b刺激誘導(圖3)。

(8)評估iPS細胞來源的毛囊和全厚皮膚的質(zhì)量和功能

(8-1)由于移植到皮膚中的iPS誘導的毛發(fā)的生長能力

為了研究畸胎瘤中誘導的全厚皮膚中包含的毛囊器官是否是完全功能性的和可移植的，切除包含通過體內(nèi)移植iPS細胞誘導的毛囊的全厚皮膚，切成毛發(fā)組，并移植到裸鼠皮膚中。很明顯，移植的毛發(fā)組在移植到皮膚中后第7天脫落，此后，毛發(fā)在第14天以66％的發(fā)生率(117例中有77例)生長(圖4)。顯示iPS細胞來源的毛囊和皮膚組織再生了可移植到活體皮膚的功能。

(8-2)iPS誘導的毛發(fā)的毛發(fā)周期分析

為了研究畸胎瘤中誘導的全厚皮膚中包含的毛囊器官是否重復毛發(fā)周期并且是永久功能性的，切除包含通過體內(nèi)移植iPS細胞誘導的毛囊的全厚皮膚，切成毛發(fā)組并移植到裸鼠皮膚中(在本說明書中，通過本發(fā)明的方法由iPS細胞誘導的毛囊被稱為“iPS誘導的毛囊”，通過移植iPS誘導的毛囊而誘導的毛發(fā)稱為“iPS誘導的毛發(fā)”)。對從經(jīng)歷所述移植的組生長的毛干的毛發(fā)類型進行區(qū)分，發(fā)現(xiàn)包含作為體毛包括的Zigzag、Awl和Guard毛發(fā)。因此，當將根據(jù)毛發(fā)類型追蹤毛干生長到第三毛發(fā)周期并分析毛干生長期以及毛干生長靜息和脫落期的長度時，顯示它們重復與成人體毛類似的周期性(圖5)。從這些結(jié)果，表明iPS誘導的毛發(fā)再生了活體的干細胞微環(huán)境，并永久重復頭發(fā)周期。

(8-3)iPS誘導的毛發(fā)的起源分析

為了證明(8-2)中描述的方法中移植的全厚皮膚和生長的毛發(fā)源自iPS細胞，標記Y染色體并進行熒光原位雜交(FISH)。因為本實驗中使用的iPS細胞是來自雄性小鼠的細胞，并且移植的Balb/c nu/nu小鼠是雌性小鼠，所以核中的Y染色體被綠色熒光染料標記，并分析從移植物產(chǎn)生的器官(生長的全厚皮膚和毛囊)的起源。結(jié)果，很明顯，包含皮膚附屬器官(例如毛囊)的全厚皮膚由Y染色體陽性細胞(即由iPS細胞誘導的細胞)組成(圖6)。此外，雖然與毛囊連接的上皮層是Y染色體陽性，但在宿主組織中未檢測到Y(jié)染色體。

(8-4)iPS誘導毛發(fā)的微環(huán)境分析

為了闡明由iPS細胞誘導的包含在全厚皮膚中的誘導毛發(fā)是否形成干細胞微環(huán)境，用上皮干細胞標志物CD34和CK15進行免疫染色。此外，為了闡明上皮干細胞微環(huán)境是否屬于可變區(qū)或者皮脂腺和皮膚表皮是否可再生，分析了Lgr5、Lgr6和Lrig1陽性細胞的行為。由于在組織學上被定義為在皮脂腺下側(cè)上的凸起外根鞘的凸起區(qū)域作為干細胞微環(huán)境，其中對CD34和CK15均為陽性的毛囊上皮干細胞是局部的，并且對于維持毛囊穩(wěn)態(tài)是必需的，通過用這些作為標志物進行免疫染色來分析iPS誘導的毛囊。結(jié)果，當用紅色熒光標記CD34并且用綠色熒光標記CK15時，組織學上對應于iPS誘導的毛囊的凸起區(qū)域的外根鞘被染為黃色(圖7b，箭頭)。由此，顯示共表達CD34和CK15的上皮干細胞儲存在凸起區(qū)域中。因此，顯示iPS誘導的毛發(fā)構(gòu)建上皮干細胞微環(huán)境。已知在生長期毛囊，作為毛發(fā)基質(zhì)祖細胞的Lgr5陽性細胞分布在毛囊可變區(qū)的外根鞘細胞下方和毛發(fā)基質(zhì)的Auber的臨界線中，以及在靜止期毛囊，Lgr5陽性細胞定位在次級毛芽(二次毛芽)中。此外，Lgr6和Lrig1陽性細胞從位于皮脂腺附著位點附近的凸起的上部定位。當在iPS誘導的毛囊的生長期和靜息期中分析Lgr5、Lgr6和Lrig1陽性細胞的行為時，在與天然毛發(fā)相同的位點處確認Lgr5、Lgr6和Lrig1各自的表達(圖7)。

(8-5)iPS誘導的毛囊和周圍組織之間的連接

為了確定iPS誘導的毛囊是否與豎毛肌和神經(jīng)連接，產(chǎn)生厚度為100μm的切片，用針對神經(jīng)纖維標志物神經(jīng)絲、平滑肌標志物鈣調(diào)理蛋白和橫紋肌標志物肌鈣蛋白的抗體進行免疫染色，并用共聚焦激光顯微鏡分析。在自然體毛中，由鈣調(diào)理蛋白陽性平滑肌構(gòu)成的豎毛肌與凸起區(qū)域連接。為此，自深叢(plexus)延伸的交感神經(jīng)布置成圍繞豎毛肌，從而形成神經(jīng)肌肉連接部位以接受神經(jīng)控制。由于iPS誘導的毛囊是有色毛發(fā)，并且可以與宿主毛囊區(qū)分開，將iPS誘導的毛囊與宿主毛囊區(qū)分開，然后通過免疫染色分析神經(jīng)纖維和豎毛肌的連接。結(jié)果，與自然體毛類似，鈣調(diào)理蛋白陽性豎毛肌與凸起區(qū)域連接(圖8，箭頭)，并且神經(jīng)纖維與其連接(圖8，楔形)。此外，神經(jīng)毛囊連接部位不僅見于毛囊和豎毛肌之間的連接，而且也見于亞凸上皮(サブバルジの上皮)(圖8)。在凸起區(qū)域周圍觀察到神經(jīng)纖維連接，神經(jīng)末梢分布在凸起區(qū)域的ORS最外層，并且可見神經(jīng)毛囊連接部位(圖8)。

(8-6)通過裸鼠皮下移植單個iPS細胞和包含iPS誘導的毛囊的全厚皮膚的致瘤性測定(造腫瘍アツセイ)

為了測試由iPS細胞誘導的全厚皮膚的移植是否會形成腫瘤，將包含對應于20個毛囊的全厚皮膚移植到裸鼠的背部皮膚，在三個月內(nèi)追蹤由于腫瘤細胞增殖引起的腫瘤塊形成。作為比較組，創(chuàng)建從相同iPS細胞系制成單細胞的iPS細胞，以1×10⁴、1×10⁵和1×10⁶個細胞進行皮內(nèi)移植，并追蹤相同的持續(xù)時間。結(jié)果，在單細胞移植中，在任何數(shù)目的細胞中可見由于腫瘤形成而引起的腫瘤塊增加，在移植后20至40天可見腫瘤形成，并且腫瘤形成傾向于依賴移植細胞的數(shù)目更快(表1)。相反，在iPS誘導的毛囊的移植中，在移植后直到90天的追蹤中沒有觀察到由于腫瘤形成而引起的腫瘤塊增加(表1)。

[表1]

表1.通過裸鼠皮內(nèi)移植iPS誘導的毛囊和單個iPS細胞的致瘤性

從上述結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明的方法，可高效地人工制造具有皮膚附屬器官的全厚皮膚。此外，表明通過本發(fā)明的方法制造的全厚皮膚具有極低的通過移植引起腫瘤的風險，并且還非常有希望作為預期移植到活體的器官形成技術(shù)。