本發(fā)明涉及治療或預(yù)防與核纖層蛋白A和/或核纖層蛋白C耗減或LMNA突變有關(guān)的病癥的化合物，所述病癥例如核纖層蛋白病(laminopathy)、早衰癥、正常老化和癌癥。發(fā)明背景由A和B型核纖層蛋白組成的核纖層保持核形態(tài)，并起牽系染色質(zhì)的錨泊平臺的作用(T.Dechat等(2008)GenesDev.22，832)。核纖層蛋白與多種染色質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)相互作用，并且還通過包括Nesprin和SUN蛋白在內(nèi)的跨膜蛋白質(zhì)與細(xì)胞骨架間接連接(M.Crisp等(2006)J.CellBio.172,41)。編碼核纖層蛋白A和C的LMNA的突變引起稱為核纖層蛋白病的多種人類疾病(H.J.Worman,G.Bonne(2007)Exp.CellRes.313,2121)。這些包括埃-德肌營養(yǎng)不良(Emery-Dreifussmusculardystrophy，AD-EDMD)(G.Bonne等(1999)Nat.Genet.21,285)和嚴(yán)重的老化加速疾病HutchinsonGilford早老綜合征(HGPS)(A.DeSandre-Giovannoli等(2003)Science300,2055；M.Eriksson等(2003)Nature423,293)。在不同的人類癌癥中還觀察到A型核纖層蛋白失調(diào)，所述A型核纖層蛋白在人類癌癥中異常表達(dá)或定位(J.L.Broers等(1993)Am.J.Pathol.143,211；S.F.Moss等(1999)Gut45,723；R.S.Venables等(2001)Br.J.Cancer84,512)。核纖層蛋白A/C耗減或LMNA突變引起與總?cè)旧|(zhì)組織丟失有關(guān)的擴(kuò)大的畸形核(G.Galiova等(2008)Eur.J.CellBiol.87,291)。然而，與核纖層蛋白病有關(guān)的一系列臨床表型的確切分子原因有待確定。雖然這些病理的一些可能反映引起細(xì)胞脆性的核纖層蛋白結(jié)構(gòu)破壞中的主要分子缺陷(“結(jié)構(gòu)假設(shè)”)，但是許多似乎可能產(chǎn)生于對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)或其它核過程(例如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù))的下游作用(K.L.Wilson等(2001)Cell104,647)。引人關(guān)注的是，最新研究表明改進(jìn)核纖層蛋白病理性細(xì)胞的核結(jié)構(gòu)也可改善染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和其它細(xì)胞過程中的某些下游缺陷，因此改善某些疾病相關(guān)表型(C.Y.Chen等(2012)Cell149,565；J.I.Toth等(2005)PNAS102,12873；M.Columbaro等(2005)CellMol.LifeSci.62,2669)。因此存在提供糾正核結(jié)構(gòu)缺陷和改進(jìn)核纖層蛋白病理性人細(xì)胞的細(xì)胞適合度，從而治療核纖層蛋白病和早衰癥的治療的需要。發(fā)明概述按照本發(fā)明的第一個方面，提供下式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，用于治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥：其中：W、Y和Z各自表示CH或W、Y和Z之一表示氮，而其它兩個基團(tuán)表示CH；環(huán)A表示：X表示S、O或NRa；Ra表示氫、羥基、=O、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基或鹵代C1-6烷氧基；R5表示氫、羥基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、COH、COOH、COOC1-6烷基、氰基、NH2或NO2；n表示選自0-5的整數(shù)；各R1獨(dú)立表示C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、氰基、羥基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2；R2表示氫、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；R3選自氫或–N=R4基團(tuán)，使得當(dāng)環(huán)A表示式(i)或(iii)時，R3表示–N=R4，而當(dāng)環(huán)A表示式(ii)時，R3表示氫；R4表示–C(R4a)(R4b)、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烯基或芐基，其中所述環(huán)烷基或芐基被C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、氰基、羥基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2任選取代；R4a和R4b獨(dú)立選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、氰基、羥基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2、NO2、C3-8環(huán)烷基或芐基，其中所述環(huán)烷基或芐基被C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、氰基、羥基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2任選取代。附圖簡述圖1：恢復(fù)核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞的核形狀和染色質(zhì)致密度的KAT抑制劑的鑒定。A)與陰性對照(siCT)相比U2OS細(xì)胞中的核纖層蛋白A/C耗減(siLMNA)的分析。B)通過DAPI染色觀察到的核形狀。C)來自3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性MNase消化概況(左)和相應(yīng)的定量測定(右)。D)亞環(huán)戊基-[4-(4'-氯苯基)噻唑-2-基)腙(化合物2)的分子結(jié)構(gòu)。E)在用化合物2處理后通過DAPI染色觀察到的核形狀拯救。F)非處理(NT)細(xì)胞或用指定化合物處理的細(xì)胞中核圓度(nuclearcircularity)的定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>212)的均值±s.d.)。G)來自3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性MNase消化概況(左)和相應(yīng)的siLMNA細(xì)胞的定量測定(右)。H)核面積的定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>198)的均值±s.d.)。I)用siLMNA轉(zhuǎn)染并用化合物2處理的表達(dá)GFP-H2B的U2OS細(xì)胞中核形狀拯救的實(shí)時成像照片。J)通過流式細(xì)胞術(shù)分析的細(xì)胞周期概況。PI：碘化丙錠。比例尺：20μm。圖2：小分子化合物2拯救不同核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞的核形狀缺陷。A)和B)通過核纖層蛋白A/C(siLMNA)耗減并且用不同的KATi處理的HeLa(A)或RPE-1(B)細(xì)胞的DAPI染色的核形狀顯現(xiàn)。比例尺：50μm。C)和D)來自A)和B)所示DAPI染色的HeLa(C)或RPE-1(D)細(xì)胞的核圓度的CellProfiler定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>252)的均值±s.d)。E)通過流式細(xì)胞術(shù)分析的細(xì)胞周期概況。PI：碘化丙錠。F)規(guī)定癌細(xì)胞系中的核纖層蛋白A/C表達(dá)水平的分析。下圖：癌細(xì)胞中相對于正常RPE-1細(xì)胞的核纖層蛋白A/C表達(dá)的ImageJ定量測定。G)DAPI染色的代表性照片，其顯示在用化合物2處理后表達(dá)低核纖層蛋白A/C的癌細(xì)胞的核形狀改善。比例尺：20μm。圖3：在用化合物2處理后核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞的核形狀拯救不依賴于有絲分裂。在S期通過阿非迪霉素同步然后在阿非迪霉素存在下用化合物2處理以防止有絲分裂進(jìn)入的細(xì)胞中通過DAPI染色觀察到的核形狀拯救。比例尺：20μm。圖4：N-乙酰轉(zhuǎn)移酶NAT10是小分子化合物2的細(xì)胞靶。A)可點(diǎn)擊類似物(clickableanalogue)化合物3和可點(diǎn)擊無活性對照分子參比化合物A的分子結(jié)構(gòu)。B)U2OS核圓度的定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>224)的均值±s.d.)。C)用于小分子標(biāo)記的點(diǎn)擊化學(xué)策略的原理。D)化合物3的生物素化類似物的分子結(jié)構(gòu)。E)小分子生物素化化合物3牽出后蛋白質(zhì)的銀染和在5當(dāng)量的非可點(diǎn)擊分子化合物2存在下降低的特異性條帶(參見箭頭)的鑒定。對應(yīng)于NAT10的條帶以及其它特異性和非特異性條帶被放大在右邊(*)。F)在U2OS細(xì)胞中預(yù)溫育的可點(diǎn)擊分子化合物3和參比化合物A的牽出和結(jié)合的蛋白質(zhì)的分析。G)通過蛋白質(zhì)印跡法觀察到的對照或NAT10耗減細(xì)胞(siNAT10)中NAT10(紅色)和熒光標(biāo)記的化合物3(綠色)的高分辨代表性顯微鏡照片(下圖)。比例尺：10μm。H)通過圓二色譜學(xué)(右)分析純化的(銀染，左)NAT10折疊，顯示遞增濃度的化合物2對NAT10螺旋特征的遞增作用。I)Remodelin(化合物1)的分子結(jié)構(gòu)，Remodelin為一種穩(wěn)定和有效的化合物2的類似物。圖5：分子的亞細(xì)胞定位和其對NAT10定位的作用的分析。A)與分子化合物3(參見圖2)相反，顯示非特異性染色的可點(diǎn)擊對照分子參比化合物A的熒光標(biāo)記。比例尺：20μm。B)按規(guī)定轉(zhuǎn)染或處理的細(xì)胞內(nèi)核纖層蛋白A/C和NAT10染色的IF照片。比例尺：20μm。圖6：篩選化合物2類似物以鑒定核形狀拯救的結(jié)構(gòu)要求。A)用指定的化合物2類似物處理的siLMNA細(xì)胞中通過DAPI染色的核形狀分析。B)通過siLMNA細(xì)胞的DAPI染色觀察到的劑量依賴性核形狀拯救，顯示與化合物2相比Remodelin的效能增加約5倍。比例尺：20μm。圖7：通過Remodelin抑制NAT10活性介導(dǎo)LMNA耗減細(xì)胞的核形狀拯救。A)U2OS細(xì)胞中NAT10和核纖層蛋白A/C耗減的分析。B)通過DAPI染色顯現(xiàn)的核形狀(左)和核圓度的定量測定(右)(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>267)的均值±s.d.)。比例尺：20μm。C)NAT10與其已知的結(jié)構(gòu)域的圖示。用星號表示在D)中鑒定的G641E突變。D)人NAT10殘基10-917的模型化3D結(jié)構(gòu)，顯示了乙酰輔酶A結(jié)合部位(左)和通過用Swiss-ProtPDB觀測儀顯現(xiàn)的NAT10突變(G641E，右)破壞Ac-CoA結(jié)合。E)體外乙?；瘻y定法，顯示了NAT10對于微管蛋白的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。F)穩(wěn)定表達(dá)siRNA抗性FLAG-NAT10WT或FLAG-NAT10G641E(FLAG-NAT10MUT)的細(xì)胞中核圓度的定量測定(左)(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>198)的均值±s.d.)和通過DAPI染色顯現(xiàn)的核形狀(右)。比例尺：20μm。圖8：NAT10突變G641E(MUT)不影響其定位。A)NAT10GNAT(Gcn5相關(guān)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶)結(jié)構(gòu)域的比對，顯示了G641殘基的保守性。B)來自人HEK293細(xì)胞的純化的FLAG-NAT10WT或G641E突變體(MUT)的銀染。這些蛋白質(zhì)用于乙酰轉(zhuǎn)移酶活性測定法。C)穩(wěn)定表達(dá)FLAG-NAT10WT和MUT的siRNA抗性構(gòu)建體的U2OS細(xì)胞的表征。通過蛋白質(zhì)印跡法觀察到構(gòu)建體的表達(dá)和對siRNA的抗性，和D)使用抗NAT10抗體或抗FLAG抗體通過IF染色證實(shí)兩種構(gòu)建體的正確定位。比例尺：10μm。圖9：Remodelin靶向NAT10以改善HGPS細(xì)胞的核形狀和適合度。A)在相同群體倍增下與匹配的正常成纖維細(xì)胞相比HGPS細(xì)胞系中核纖層蛋白A/C的代表性免疫熒光(IF)照片。比例尺：10μm。B)在Remodelin處理時畸形核的定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>213)的均值±s.e.m.)。C)HGPSAG11498細(xì)胞中的核纖層蛋白A/C染色(左)和畸形核的定量測定(右；3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>176)的均值±s.e.m.)。比例尺：50μm。D)在Remodelin或FTI處理后γH2AX的蛋白質(zhì)印跡分析。E)在Remodelin或ATM/ATR抑制(ATM/ATRi)時γH2AX染色的免疫熒光分析。F)通過IF觀察到的γH2AX陽性細(xì)胞的定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>127)的均值±s.e.m.)。G)在Remodelin或ATM/ATR抑制劑處理時的HGPS增殖(9個重復(fù)樣品的均值±s.e.m)。H)老化相關(guān)β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞的定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>127)的均值±s.e.m.)。I)在群體倍增12次(PDL12)時在8天Remodelin處理后及在Remodelin處理幾周和12次細(xì)胞分裂(PDL24)后HGPSAG11498中老化相關(guān)β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞的定量測定(2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>298)的均值±s.d.)。圖10：Remodelin以劑量依賴性方式拯救老化的MRC5細(xì)胞而非WS細(xì)胞的核形狀。A)通過Remodelin拯救在群體倍增44次(PD44)時在培養(yǎng)物中的MRC5老化細(xì)胞中通過DAPI染色觀察到的畸形核。B)在遞增濃度的Remodelin后畸形核的定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±s.e.m.)。C)非核纖層蛋白病理性Werner綜合征細(xì)胞(WS)的DAPI染色，顯示在Remodelin處理時無核形狀改善。D)畸形核的CellProfiler定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±s.d.，n>273)。比例尺：50μm。圖11：非熱原性細(xì)胞中Remodelin防止FTI誘導(dǎo)的核形狀缺陷。A)在Remodelin或FTI處理后核纖層蛋白A/C加工的分析，顯示了Remodelin不是FTI。B)在規(guī)定的處理后核纖層蛋白A/CIF染色的代表性照片。箭頭表明FTI誘導(dǎo)的正常成纖維細(xì)胞的畸形核。比例尺：50μm。C)用規(guī)定的細(xì)胞系和抑制劑處理的畸形核的定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±s.e.m.，n>178)。D)DAPI染色的代表性照片，顯示了FTI和Remodelin對U2OS細(xì)胞的核形狀的作用。比例尺：20μm。圖12：Remodelin改善HGPS細(xì)胞的總體細(xì)胞適合度。A)通過蛋白質(zhì)印跡法觀察到的正常成纖維細(xì)胞和HGPSAG11498細(xì)胞的NAT10耗減，并顯示siNAT10對核纖層蛋白A/C表達(dá)和加工沒有作用。B)IF圖像，顯示在Remodelin處理時HGPS細(xì)胞中核形狀改善和γH2AX灶的數(shù)目減少。比例尺：10μm。C)蛋白質(zhì)印跡分析，顯示Remodelin在受測試的2種HGPS細(xì)胞系中降低γH2AX水平。D)IF圖像，顯示在Remodelin處理時埃-德肌營養(yǎng)不良細(xì)胞(EDMD)中核形狀改善和γH2AX染色密度降低。比例尺：10μm。E)蛋白質(zhì)印跡分析，顯示Remodelin降低EDMD中的γH2AX水平。F)蛋白質(zhì)印跡分析，顯示在HGPSAG11498細(xì)胞中Remodelin對p53和DNA損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用。G)H)中定量測定的H3K9me3或SUN1形式的代表性IF圖像。比例尺：20μm。I)IF染色，顯示更強(qiáng)和更均一的DAPI染色，以及在Remodelin處理時通過NAT10染色觀察到的核結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。比例尺：10μm。J)在Remodelin處理時在EdU摻入HGPS細(xì)胞中2小時后的流式細(xì)胞術(shù)分析，顯示了DNA復(fù)制速率提高。K)在用p53抑制劑(Pifithrin)或用規(guī)定的KAT抑制劑處理后老化相關(guān)β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞的定量測定，顯示了這些化合物無一減緩HGPSAG11498的老化。圖13：抑制NAT10乙酰轉(zhuǎn)移酶活性更改微管組構(gòu)以拯救核形狀缺陷。A)α-微管蛋白的反轉(zhuǎn)IF照片的微管網(wǎng)顯現(xiàn)。B)在細(xì)胞用微管或肌動蛋白細(xì)胞骨架破壞劑處理后的核形狀顯現(xiàn)。C)siLMNA細(xì)胞中核形狀(DAPI)和Golgi(抗巨蛋白)完整性的顯現(xiàn)。D)在Remodelin或諾考達(dá)唑(Nocod.)處理時多聚(P)和可溶性(S)微管蛋白的分級分離。E)用siNAT10轉(zhuǎn)染并表達(dá)規(guī)定siRNA抗性構(gòu)建體的細(xì)胞中的微管再生長測定法。α-微管蛋白IF染色(左)顯示成核期：t=5分鐘和微管錨定(t=15分鐘)。右：具有規(guī)定形式的細(xì)胞的定量測定(3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其中n>103)的均值±s.e.m.)。F)核纖層蛋白病理性細(xì)胞具有與無序的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)的擴(kuò)大的畸形核。在Remodelin處理時，NAT10乙酰轉(zhuǎn)移酶活性被抑制，導(dǎo)致中心體上的微管錨定破壞并向核被膜釋放出微管力。這種機(jī)械應(yīng)力向核的釋放有助于核形狀拯救和細(xì)胞合適度和染色質(zhì)組織的總體改善。比例尺：20μm。圖14：Remodelin靶向HGPS細(xì)胞中的微管網(wǎng)以改善核形狀。A)在細(xì)胞用微管破壞劑處理后的核形狀顯現(xiàn)和定量測定。B)用Remodelin處理的HGPSAG11498細(xì)胞中的微管再生長測定。α-微管蛋白反轉(zhuǎn)IF染色顯示在Remodelin處理時正常的微管解聚(T=0)和成核期(T=5分鐘)但微管錨定的缺陷(T=15分鐘)。C)B)中的微管再生長測定法，顯示了在規(guī)定HGPS細(xì)胞系中在NAT10耗減(siNAT10)時微管錨定的缺陷(T=15分鐘)，并與用對照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(siCT)進(jìn)行了比較。比例尺：20μm。圖15：化合物2抑制具有低核纖層蛋白A/C表達(dá)的癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。A)用或不同50μM化合物2處理1周的規(guī)定癌細(xì)胞系的群體倍增時間，顯示了表達(dá)低水平的核纖層蛋白A的細(xì)胞對該分子更敏感。B)前列腺22RV1癌細(xì)胞的基質(zhì)膠侵襲測定法的代表性照片，顯示了在用50μM化合物2處理時無侵襲。C)在用50μM化合物2處理后來自規(guī)定的低表達(dá)癌細(xì)胞系的跨孔遷移測定和基質(zhì)膠侵襲測定的量化。圖16：化合物2降低核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯。A)以相同的密度接種用siRNA對照(siCT)或siRNA核纖層蛋白A/C(siLMNA)轉(zhuǎn)染的U2OS細(xì)胞，用環(huán)己米特(CHX)處理24小時以抑制蛋白質(zhì)合成并用DAPI染色。DAPI染色的代表性照片顯示siLMNA細(xì)胞對CHX有更大抗性。B)蛋白質(zhì)合成通過定量測定HPG(一種甲硫氨酸的可點(diǎn)擊類似物)的摻入來測量。FACS分析顯示在增加化合物2的劑量后在表達(dá)低核纖層蛋白A的U2OS細(xì)胞(B)或正常RPE細(xì)胞(C)中定量測定HPG強(qiáng)度。圖17：小鼠中Remodelin的藥代動力學(xué)測定。A)在ICR小鼠中在IV1mg/kg和PO5mg/kg劑量水平后評價了Remodelin的藥代動力學(xué)。在IV1mg/kg給藥后，半壽期(T1/2)為0.915小時，清除率為139mL/分鐘/kg。在PO5mg/kg給藥后，半壽期(T1/2)為1.81小時，在0.25小時(Tmax)達(dá)到最大血漿濃度(Cmax，409ng/mL)，且口服暴露為259ng/小時/mL(AUC0-∞)，生物利用度為43.5%。B)從A)所示曲線獲得的結(jié)果詳情。圖18和19：核形狀拯救的結(jié)構(gòu)要求的分析。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例6。圖20：化合物2以劑量依賴性方式抑制A431黑素瘤細(xì)胞系的生長。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例7。圖21：核纖層蛋白A/C敲除的U2OS細(xì)胞比野生型細(xì)胞對化合物2和類似物更敏感。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例8。圖22：化合物2在LMNAKO細(xì)胞中特異性地抑制整體蛋白質(zhì)翻譯。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例9。圖23：NAT10的耗減導(dǎo)致與用化合物2處理類似的增殖、遷移和侵襲抑制。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例10。圖24：化合物2體內(nèi)毒性和體外特異性的評價。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例11。圖25：化合物2處理對HutchinsonGilford早老綜合征小鼠模型的作用。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例12。圖26：體內(nèi)化合物2的分子作用。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例13。圖27：作為NAT10抑制的潛在生物標(biāo)志物的乙?；⒐艿鞍椎脑u價。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例14。圖28：工程改造LmnaG609G/G609G/NAT10+/-小鼠用于遺傳驗(yàn)證。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例15。圖29：微陣列分析顯示化合物2對于HGPS細(xì)胞中的基因表達(dá)調(diào)節(jié)有特異性。該分析的結(jié)果描述于實(shí)施例16。發(fā)明詳述按照可提及的本發(fā)明的一個具體方面，提供下式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，用于治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥：其中：W、Y和Z各自表示CH或W、Y和Z之一表示氮，而其它兩個基團(tuán)表示CH；環(huán)A表示：X表示S、O或NRa；Ra表示氫、羥基、=O、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基或鹵代C1-6烷氧基；R5表示氫、羥基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、COH、COOH、COOC1-6烷基、氰基、NH2或NO2；n表示選自0-5的整數(shù)；各R1獨(dú)立表示C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、氰基、羥基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2；R2表示氫、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；R3選自氫或–N=R4基團(tuán)，使得當(dāng)環(huán)A表示式(i)或(iii)時，R3表示–N=R4，而當(dāng)環(huán)A表示式(ii)時，R3表示氫；R4表示–C(R4a)(R4b)、C3-8環(huán)烷基或芐基，其中所述環(huán)烷基或芐基被C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、氰基、羥基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2任選取代；R4a和R4b獨(dú)立選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、氰基、羥基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2、NO2、C3-8環(huán)烷基或芐基，其中所述環(huán)烷基或芐基被C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、氰基、羥基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2任選取代。本文所用術(shù)語“鹵代”或“鹵素”是指氟、氯、溴或碘。本文所用術(shù)語“氰基”是指其中碳原子與氮原子三鍵鍵合的基團(tuán)(即-C≡N)。本文所用術(shù)語“羥基”是指其中氧原子與氫原子鍵合的基團(tuán)。本文所用術(shù)語“C1-6烷基”作為基團(tuán)或基團(tuán)的一部分是指含有1-6個碳原子的線性或支鏈飽和烴基。所述基團(tuán)的實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基或己基等。本文所用術(shù)語“C2-6烯基”作為基團(tuán)或基團(tuán)的一部分是指含有2-6個碳原子和含有碳碳雙鍵的線性或支鏈烴基。本文所用術(shù)語“C2-6炔基”作為基團(tuán)或基團(tuán)的一部分是指具有2-6個碳原子和含有碳碳三鍵的線性或支鏈烴基。本文所用術(shù)語“C1-6烷氧基”作為基團(tuán)或基團(tuán)的一部分是指-O-C1-6烷基，其中C1-6烷基如本文定義。所述基團(tuán)的實(shí)例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。本文所用術(shù)語“鹵代C1-6烷基”作為基團(tuán)或基團(tuán)的一部分是指本文定義的C1-6烷基，其中一個或一個以上的氫原子被鹵素置換。因此術(shù)語“鹵代C1-6烷基”包括一鹵代C1-6烷基以及多鹵代C1-6烷基。有1、2、3或更多個被鹵素置換的氫原子，因此鹵代C1-6烷基可具有1、2、3或更多個鹵素。所述基團(tuán)的實(shí)例包括氟乙基、氟甲基、三氟甲基或三氟乙基等。本文所用術(shù)語“鹵代C1-6烷氧基”作為基團(tuán)或基團(tuán)的一部分是指本文定義的–O-C1-6烷基，其中一個或一個以上的氫原子被鹵素置換。因此術(shù)語“鹵代C1-6烷氧基”包括一鹵代C1-6烷氧基以及多鹵代C1-6烷氧基。有1、2、3或更多個被鹵素置換的氫原子，因此鹵代C1-6烷氧基可具有1、2、3或更多個鹵素。所述基團(tuán)的實(shí)例包括氟乙基氧基、二氟甲氧基或三氟甲氧基等。本文所用術(shù)語“C3-8環(huán)烷基”作為基團(tuán)或基團(tuán)的一部分是指含有3-8個碳原子的飽和烴環(huán)。所述基團(tuán)的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基等。本文所用術(shù)語“芐基”作為基團(tuán)或基團(tuán)的一部分是指與CH2基團(tuán)連接的苯環(huán)。為了避免疑惑，除非另有說明，否則術(shù)語“取代的”意指被一個或多個規(guī)定的基團(tuán)取代。在其中基團(tuán)可選自多個備選基團(tuán)的情況下，所選的基團(tuán)可相同或不同。為了避免疑惑，術(shù)語“獨(dú)立地”意指其中一個以上取代基選自多個可能的取代基，這些取代基可相同或不同。在一個實(shí)施方案中，W、Y和Z各自表示CH。在一個實(shí)施方案中，環(huán)A表示式(i)或(ii)。在又一個實(shí)施方案中，環(huán)A表示式(i)。在一個備選實(shí)施方案中，環(huán)A表示式(ii)。在又一個備選實(shí)施方案中，環(huán)A表示式(iii)。在一個實(shí)施方案中，X表示S或O。在又一個實(shí)施方案中，X表示S(即噻唑環(huán))。在一個備選實(shí)施方案中，X表示O(即噁唑環(huán))。在一個實(shí)施方案中，R5表示氫或鹵素(例如溴)。在又一個實(shí)施方案中，R5表示氫。在一個實(shí)施方案中，n表示0-3的整數(shù)。在一個實(shí)施方案中，n表示1-2的整數(shù)。在又一個實(shí)施方案中，n表示1。在一個備選實(shí)施方案中，n表示2。在一個實(shí)施方案中，R1表示氰基、羥基、鹵素(例如氯或溴)、C1-6烷氧基(例如甲氧基)、COOH、NO2、鹵代C1-6烷基(例如三氟甲基)或鹵代C1-6烷氧基(例如三氟甲氧基)。在又一個實(shí)施方案中，R1表示氰基、羥基、鹵素(例如氯或溴)、C1-6烷氧基(例如甲氧基)、COOH或NO2。在再一個實(shí)施方案中，R1表示氰基、鹵素(例如氯或溴)或NO2，例如氰基或鹵素。在再一個實(shí)施方案中，R1表示氰基。在又一個備選實(shí)施方案中，R1表示鹵素，例如氯。在又一個備選實(shí)施方案中，R1表示鹵代C1-6烷基，例如三氟甲基。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，R1基團(tuán)可在式(I)苯環(huán)的對位、鄰位或間位上連接。在一個實(shí)施方案中，R1位于2、3或4位(即鄰位、間位或?qū)ξ?，特別是間(3)位和/或?qū)?4)位。在又一個實(shí)施方案中，R1位于間(3)位，例如當(dāng)R1為鹵素或氰基，特別是鹵素時。在一個備選實(shí)施方案中，R1位于對(4)位，例如當(dāng)R1為氰基、氯或三氟甲基時。在一個實(shí)施方案中，n表示1，且所述R1基團(tuán)存在于式(I)的苯環(huán)的3或4位上。在一個實(shí)施方案中，n表示1，且R1表示氰基、羥基、鹵素(例如氯或溴)、C1-6烷氧基(例如甲氧基)、COOH、NO2或鹵代C1-6烷基(例如三氟甲基)。在又一個實(shí)施方案中，n表示1，且R1表示氰基、羥基、鹵素(例如氯或溴)、C1-6烷氧基(例如甲氧基)、COOH或NO2。在一個實(shí)施方案中，n表示2，且所述R1基團(tuán)存在于式(I)的苯環(huán)的2和4位或3和4或2和3位上，例如2和4或3和4位。在一個實(shí)施方案中，n表示2，且兩個R1基團(tuán)表示氯(即3,4-二氯)或R1表示C1-6烷氧基(例如甲氧基)和羥基(即2-羥基-4-甲氧基)。在一個備選實(shí)施方案中，n表示2，且兩個R1基團(tuán)表示羥基(即3,4-二羥基)。在一個實(shí)施方案中，R2表示氫或C2-6炔基(例如乙炔基)。在又一個實(shí)施方案中，R2表示氫。在又一個備選實(shí)施方案中，R2表示乙炔基。在一個實(shí)施方案中，R3表示–N=R4。在一個實(shí)施方案中，R4表示–C(R4a)(R4b)(例如–C(Me)2)、未取代的C3-8環(huán)烷基、未取代的C3-8環(huán)烯基或未取代的芐基。在又一個實(shí)施方案中，R4表示未取代的C3-8環(huán)烷基或未取代的芐基。在一個實(shí)施方案中，R4表示C3-8環(huán)烷基，例如環(huán)戊基或環(huán)己基(例如未取代的環(huán)戊基或未取代的環(huán)己基)。在又一個實(shí)施方案中，R4表示C3-8環(huán)烷基，例如環(huán)戊基(例如未取代的環(huán)戊基)。在一個備選實(shí)施方案中，R4表示C3-8環(huán)烯基，例如環(huán)戊烯基或環(huán)己烯基(例如未取代的環(huán)戊烯基或未取代的環(huán)己烯基)。在一個實(shí)施方案中，R4被選自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵素、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基或羥基的1或2個基團(tuán)任選取代。在一個實(shí)施方案中，式(I)的化合物選自化合物1-21或其備選的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、游離酸制備物或游離堿制備物。在又一個實(shí)施方案中，式(I)的化合物選自化合物1-12或其備選的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、游離酸制備物或游離堿制備物。在再一個實(shí)施方案中，式(I)的化合物選自化合物1-11，例如化合物1-8或其備選的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、游離酸制備物或游離堿制備物。在再一個實(shí)施方案中，式(I)的化合物選自化合物1-3或其備選的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、游離酸制備物或游離堿制備物。在一個備選實(shí)施方案中，式(I)化合物是選自以下的化合物：化合物1、3、4、5、6、7和8，例如化合物3或8或其備選的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、游離酸制備物或游離堿制備物。在一個實(shí)施方案中，式(I)化合物為4-(4-氰基苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基肼基)噻唑(化合物1)或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、游離酸制備物或游離堿制備物。在一個備選實(shí)施方案中，式(I)化合物為4-(4-氯苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基肼基)噻唑或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、游離酸制備物或游離堿制備物，例如鹽酸鹽。在一個備選實(shí)施方案中，式(I)化合物為4-(4-氯苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基-1-(丙-2-炔-1-基)肼基)噻唑(化合物3)或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、游離酸制備物或游離堿制備物。在一個備選實(shí)施方案中，式(I)化合物為4-(4-三氟甲基苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基肼基)噻唑(化合物13)或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、游離酸制備物或游離堿制備物，例如氫溴酸鹽。按照本發(fā)明的又一個方面，提供下式(I)a的化合物用于治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥：(I)a其中R1、R2、R3、R5、X和n如上文定義。按照本發(fā)明的又一個方面，提供下式(I)b的化合物用于治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥：(I)b其中R1、R2、R3、R5和n如上文定義。按照本發(fā)明的又一個方面，提供下式(I)c的化合物用于治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥：(I)c其中R1、R2和n如上文定義。按照本發(fā)明的又一個方面，提供下式(I)d的化合物用于治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥：(I)d其中R1和n如上文定義。某些式(I)的化合物是新的，因此按照本發(fā)明的又一個方面，提供選自以下的式(I)化合物：化合物3、化合物8、化合物11、化合物13-17和化合物19-21；及其任一種的鹽和溶劑合物。在一個實(shí)施方案中，化合物選自化合物3或8。NAT10抑制更概括地講，應(yīng)了解，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了NAT10抑制和改善核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞或具有LMNA突變的細(xì)胞中的核結(jié)構(gòu)和染色質(zhì)組織之間的新的聯(lián)系。因此，在本發(fā)明的又一個方面，提供NAT10抑制劑用于治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化和癌癥(例如特征在于低水平的LMNA表達(dá)的癌癥)，特別是核纖層蛋白病和早衰癥。N-乙酰轉(zhuǎn)移酶10，亦稱為“NAT10”(或最初為hALP)，是一種N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，其從細(xì)菌到人是高度保守的(參見圖8)。曾提出哺乳動物NAT10為賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(KAT)，而其細(xì)菌同系物TmcA，是一種已知的RNA胞嘧啶乙酰轉(zhuǎn)移酶(Chimnaronk等(2009)Embo.J.28,1362)。KAT酶具有調(diào)節(jié)組蛋白和其它蛋白質(zhì)的乙?；癄顟B(tài)的能力，因此影響整體染色質(zhì)組織。因此，本文提及術(shù)語“NAT10抑制劑”是指能夠抑制NAT10的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的分子。哺乳動物NAT10的已知底物是組蛋白和微管蛋白(Shen等(2009)Exp.CellRes.315,1653)。本發(fā)明人已鑒定了NAT10的小分子抑制劑，其通過微管網(wǎng)的重構(gòu)導(dǎo)致核形態(tài)拯救。因此，本文公開的經(jīng)鑒定的NAT10小分子抑制劑為研究有價值的時空分辨率的核纖層蛋白病相關(guān)過程提供新的機(jī)會，并且可用于緩解核纖層蛋白病或引起早老的疾病。抑制可通過與NAT10直接或間接結(jié)合而發(fā)生，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)是顯而易見的。篩選方法按照本發(fā)明的又一個方面，提供篩選能夠抑制NAT10活性的物質(zhì)作為NAT10抑制劑的方法及其在治療中的用途。鑒于本發(fā)明人描述了NAT10抑制和治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥之間的聯(lián)系的事實(shí)，還提供篩選旨在預(yù)防或治療受試者的核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥的候選藥物的方法，所述方法包括通過測量試驗(yàn)物質(zhì)對NAT10活性的作用來鑒定能夠抑制NAT10活性的所述試驗(yàn)物質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，篩選方法包括：a.使核纖層蛋白A和/或核纖層蛋白C耗減細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)接觸；b.在設(shè)定的時間后測量NAT10活性的水平；和c.對測量的NAT10活性的水平與在不加入試驗(yàn)物質(zhì)時觀察到的進(jìn)行比較。在一個實(shí)施方案中，篩選方法在體外進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，通過使用小干擾RNA(siRNA)以干擾LMNA基因的表達(dá)，來獲得核纖層蛋白A和/或核纖層蛋白C耗減細(xì)胞。在又一個實(shí)施方案中，通過使用SEQIDNO:1和2的siRNA雙鏈體獲得核纖層蛋白A和/或核纖層蛋白C耗減細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，篩選方法提供用于鑒定能夠抑制NAT10活性和拯救核形狀缺陷的化合物的具體指導(dǎo)?；衔锏闹苽浔疚闹?，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”旨在說明對患者無害的鹽。所述鹽包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽、藥學(xué)上可接受的金屬鹽和藥學(xué)上可接受的堿加成鹽。酸加成鹽包括無機(jī)酸以及有機(jī)酸的鹽。提及式(I)化合物及其分組還包括例如下文所述的離子形式、鹽、溶劑合物、異構(gòu)體(包括幾何和立體化學(xué)異構(gòu)體)、互變異構(gòu)體、N-氧化物、酯、前藥、同位素及其受保護(hù)的形式；優(yōu)選其鹽或互變異構(gòu)體或異構(gòu)體或N-氧化物或溶劑合物；更優(yōu)選其鹽或互變異構(gòu)體或N-氧化物或溶劑合物，甚至更優(yōu)選其鹽或互變異構(gòu)體或溶劑合物。下文中，在本發(fā)明的任何方面定義的化合物及其離子形式、鹽、溶劑合物、異構(gòu)體(包括幾何和立體化學(xué)異構(gòu)體)、互變異構(gòu)體、N-氧化物、酯、前藥、同位素及其受保護(hù)的形式(化學(xué)過程中的中間化合物除外)稱為“本發(fā)明的化合物”。本文所述化合物包括其以任何和全部立體異構(gòu)體(例如適當(dāng)?shù)姆菍τ钞悩?gòu)體和對映異構(gòu)體)的形式的應(yīng)用。例如，手性化合物被要求保護(hù)或被要求作為單一對映異構(gòu)體或?qū)τ钞悩?gòu)體的混合物(例如外消旋混合物)使用。式(I)的許多化合物可以鹽(例如酸加成鹽，在某些情況下有機(jī)或無機(jī)堿的鹽例如羧酸鹽、磺酸鹽和磷酸鹽)的形式存在。所有這類鹽都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，且提及式(I)化合物包括化合物的鹽形式?？赏ㄟ^常規(guī)化學(xué)方法，例如描述于PharmaceuticalSalts:Properties,Selection,andUse,P.HeinrichStahl(編輯),CamilleG.Wermuth(編輯),ISBN:3-90639-026-8,Hardcover,388頁,August2002的方法，從含有堿性或酸性部分的母體化合物合成本發(fā)明的鹽?？偟膩碇v，可在水或有機(jī)溶劑或兩者的混合物中，使這些化合物的游離酸或堿形式與合適的堿或酸反應(yīng)來制備所述鹽；總的來講，可使用非水介質(zhì)，例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。可與各種酸(無機(jī)酸和有機(jī)酸兩者)形成酸加成鹽(單或二鹽)。酸加成鹽的實(shí)例包括與選自以下的酸形成的單鹽或二鹽：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗壞血酸(例如L-抗壞血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟腦酸、樟腦磺酸、(+)-(1S)-樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、檸檬酸、環(huán)拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、甲酸、富馬酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡糖醛酸(例如D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、馬尿酸、氫鹵酸(例如氫溴酸、鹽酸、氫碘酸)、羥乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、馬來酸、蘋果酸、(-)-L-蘋果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、煙酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、L-焦谷氨酸、水楊酸、4-氨基-水楊酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、對甲苯磺酸、十一烯酸和戊酸以及酰化氨基酸和離子交換樹脂。一組特定的鹽包括從以下酸形成的鹽：乙酸、鹽酸、氫碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、馬來酸、蘋果酸、羥乙磺酸、富馬酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸(methanesulfonic/mesylate)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、乙酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡糖醛酸和乳糖酸。一種特定的鹽是鹽酸鹽。另一種特定的鹽是酸式硫酸鹽，亦稱半硫酸鹽。當(dāng)式(I)化合物含有胺官能團(tuán)時，這些可按照技術(shù)人員熟知的方法(例如通過與烷化劑反應(yīng))形成季銨鹽。所述季銨化合物在式(I)的范圍內(nèi)。應(yīng)了解，本發(fā)明的化合物可作為單鹽或二鹽存在。本發(fā)明化合物的鹽形式通常是藥學(xué)上可接受的鹽，藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例論述于Berge等,1977,"PharmaceuticallyAcceptableSalts,"J.Pharm.Sci.,第66卷,第1-19頁。然而，不是藥學(xué)上可接受的鹽也可作為中間體形式制備，所述中間體形式然后可轉(zhuǎn)化成藥學(xué)上可接受的鹽。可用于例如本發(fā)明化合物的純化或分離的這類非藥學(xué)上可接受的鹽形式，也構(gòu)成本發(fā)明的部分。有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，許多有機(jī)化合物可與它們在其中進(jìn)行反應(yīng)或從中沉淀或結(jié)晶的溶劑形成復(fù)合物。這些復(fù)合物稱為“溶劑合物”。例如，與水的復(fù)合物稱為“水合物”。本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的溶劑合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的溶劑合物包括其水合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，某些經(jīng)保護(hù)的式(I)化合物的衍生物(可在最后的脫保護(hù)階段之前制備)本身可能不具有藥理活性，但在某些情況下可以口服或胃腸外給藥且之后在體內(nèi)代謝形成有藥理活性的本發(fā)明化合物。所述衍生物因此可稱為“前藥”。本發(fā)明化合物的所有這類前藥包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。適于本發(fā)明化合物的前藥官能團(tuán)的實(shí)例描述于DrugsofToday，第19卷，第9期，1983，第499–538頁和TopicsinChemistry，第31章，第306–316頁和“DesignofProdrugs”,H.Bundgaard,Elsevier,1985,第1章(所述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識到，當(dāng)合適的官能團(tuán)存在于本發(fā)明的化合物中時，可在所述官能團(tuán)上安置本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的作為“前藥部分”的某些部分(例如H.Bundgaard載于“DesignofProdrugs”所描述的，所述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。本發(fā)明的化合物和各種鹽的范圍還包括其多晶型物。式(I)化合物可以多種不同的幾何異構(gòu)形式和互變異構(gòu)形式存在，且提及式(I)化合物包括所有這些形式。本發(fā)明包括全部藥學(xué)上可接受的同位素標(biāo)記的本發(fā)明化合物，即式(I)化合物，其中一個或多個原子被具有相同原子序數(shù)但原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于通常在自然界存在的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子置換。適于包括在本發(fā)明化合物中的同位素的實(shí)例包括氫(例如2H(D)和3H(T))、碳(例如11C、13C和14C)、氯(例如36Cl)、氟(例如18F)、碘(例如123I、125I和131I)、氮(例如13N和15N)、氧(例如15O、17O和18O)、磷(例如32P)和硫(例如35S)的同位素。某些同位素標(biāo)記的式(I)化合物，例如摻入放射性同位素的式(I)化合物可用于藥物和/或底物組織分布研究。式(I)化合物還可具有有價值的診斷性質(zhì)，因?yàn)樗鼈兛捎糜跈z測或鑒定標(biāo)記的化合物和其它分子、肽、蛋白質(zhì)、酶或受體之間形成的復(fù)合物。檢測或鑒定方法可使用用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的化合物，所述標(biāo)記物質(zhì)例如放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)(例如魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、水母發(fā)光蛋白和螢光素酶)等。放射性同位素氚即3H(T)和碳-14即14C由于其易于摻入和簡易的檢測手段而特別可用于該目的。用較重的同位素例如氘即2H(D)取代可提供產(chǎn)生于較大代謝穩(wěn)定性的某些治療優(yōu)勢，例如體內(nèi)半壽期延長或劑量要求降低，因此在某些情況下是優(yōu)選的。用正電子發(fā)射同位素例如11C、18F、15O和13N取代可用于正電子發(fā)射成像術(shù)(PET)研究用于檢查靶標(biāo)占據(jù)。一般可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)或通過與隨附實(shí)施例和制備例所述方法類似的方法使用合適的同位素標(biāo)記的試劑替換之前使用的未標(biāo)記的試劑，來制備同位素標(biāo)記的式(I)化合物。用于制備化合物的方法按照本發(fā)明的又一個方面提供用于制備本文定義的式(I)化合物的方法，所述方法包括：(a)當(dāng)A表示(i)時，使下式(II)的化合物與下式(III)的化合物反應(yīng)(II)其中W、Y、Z、R1和n如上文定義，L1表示合適的離去基團(tuán)，例如氯或溴；(III)其中R2和R3如上文定義；(b)使式(I)化合物的受保護(hù)的衍生物脫保護(hù)；和/或(c)使式(I)化合物或其受保護(hù)的衍生物相互轉(zhuǎn)化為其它的式(I)化合物或其受保護(hù)的衍生物；和(d)任選形成式(I)化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。方法(a)通常包括在合適的溶劑(例如異丙醇)存在下使式(II)化合物與式(III)化合物在合適的溫度(例如室溫)下反應(yīng)6至24小時。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，其中A表示(ii)和(iii)的式(I)化合物的制備可按與方法(a)所述程序類似的方式進(jìn)行。有機(jī)合成技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，上述流程中兩個或更多個化學(xué)步驟可連續(xù)運(yùn)行而無需分離中間材料。方法(b)通常包括任何合適的脫保護(hù)反應(yīng)，其條件將取決于保護(hù)基的性質(zhì)。當(dāng)保護(hù)基表示tBoc時，所述脫保護(hù)反應(yīng)可通常包括在合適的溶劑中使用合適的酸。例如，酸可適宜地包括三氟乙酸或鹽酸，而溶劑可適宜地包括二氯甲烷、乙酸乙酯、1,4-二噁烷、甲醇或水。任選可使用溶劑的混合物，例如甲醇水溶液或乙酸乙酯/1,4-二噁烷。應(yīng)認(rèn)識到，當(dāng)保護(hù)基表示tBoc時，使用上述合適的酸脫保護(hù)可得到作為藥學(xué)上可接受的鹽的式(I)化合物，其可直接分離?；蛘撸刹捎帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法分離作為游離堿的式(I)化合物，之后任選按照方法(d)轉(zhuǎn)化成藥學(xué)上可接受的鹽。羥基可作為例如醚(-OR)或酯(-OC(=O)R)而被保護(hù)，例如作為：叔丁基醚；四氫吡喃基(THP)醚；芐基、二苯甲基(二苯基甲基)或三苯甲基(三苯基甲基)醚；三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基醚；或乙?；?-OC(=O)CH3)。醛或酮基團(tuán)可分別作為例如縮醛(R-CH(OR)2)或縮酮(R2C(OR)2)而被保護(hù)，其中羰基(>C=O)用例如伯醇處理。醛或酮基團(tuán)容易在酸存在下使用過量的水通過水解再生。胺基可作為例如酰胺(-NRCO-R)或氨基甲酸酯(-NRCO-OR)而被保護(hù)，例如作為：甲基酰胺(-NHCO-CH3)；芐基氨基甲酸酯(-NHCO-OCH2C6H5、-NH-Cbz或NH-Z)；作為叔丁基氨基甲酸酯(-NHCO-OC(CH3)3、-NH-Boc)；2-聯(lián)苯基-2-丙基氨基甲酸酯(-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5、-NH-Boc)；作為9-芴基甲基氨基甲酸酯(-NH-Fmoc)；作為6-硝基藜蘆基氨基甲酸酯(-NH-Nvoc)；作為2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(-NH-Teoc)；作為2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(-NH-Troc)；作為烯丙基氨基甲酸酯(-NH-Alloc)或作為2(-苯基磺?；?乙基氨基甲酸酯(-NH-Psec)。胺(例如環(huán)狀胺和雜環(huán)N-H基團(tuán))的其它保護(hù)基包括甲苯磺?；?toluenesulphonyl/tosyl)和甲磺?；?methanesulphonyl/mesyl)、芐基例如對甲氧基芐基(PMB)和四氫吡喃基(THP)基團(tuán)。方法(c)通常包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相互轉(zhuǎn)化程序。例如，在式(I)化合物中，第一取代基可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法轉(zhuǎn)化成第二備選取代基。用于將前體化合物轉(zhuǎn)化成式I化合物的各種眾所周知的官能團(tuán)相互轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，描述于JerryMarch，AdvancedOrganicChemistry,第4版，JohnWiley&Sons，1992。例如可能的金屬催化的官能化例如使用有機(jī)錫試劑(Stille反應(yīng))、Grignard試劑和與氮親核體的反應(yīng)描述于“PalladiumReagentsandCatalysts”[JiroTsuji,Wiley,ISBN0-470-85032-9]和HandbookofOrganoPalladiumChemistryforOrganicSynthesis[第1卷,Ei-ichiNegishi編輯,Wiley,ISBN0-471-31506-0]。方法(d)可如下進(jìn)行：通過將溶于合適溶劑中的游離堿形式的式(I)化合物用化學(xué)計量的或過量的藥學(xué)上可接受的有機(jī)或無機(jī)酸處理，然后通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，例如溶劑蒸發(fā)或結(jié)晶，分離所得到的鹽。適當(dāng)時，之前在方法(a)、(b)和(c)描述的反應(yīng)后于或先于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個或多個反應(yīng)并以適當(dāng)?shù)捻樞蜻M(jìn)行以實(shí)現(xiàn)上文定義的R1、R2、R3、R4和R5的必要取代，得到其它的式(I)化合物。所述反應(yīng)(其條件可存在于文獻(xiàn)中)的非限制性實(shí)例包括：反應(yīng)官能團(tuán)的保護(hù)，反應(yīng)官能團(tuán)的脫保護(hù)，鹵化，脫鹵，脫烷，胺、苯胺、醇和酚的烷基化和芳化，羥基上的Mitsunobu反應(yīng)，合適基團(tuán)上的環(huán)加成反應(yīng)，硝基、酯、氰基、醛的還原，過渡金屬催化的偶聯(lián)反應(yīng)，?；酋；?磺?；囊?，皂化/酯基團(tuán)的水解，酯基的酰胺化(amidification)或反酯化，羧基的酯化或酰胺化，鹵素交換，被胺、硫醇或醇親核取代，還原性胺化，羰基和羥基胺基團(tuán)上的肟形成，S-氧化，N-氧化，成鹽作用。可按照下列流程1，從式(IV)化合物制備式(II)化合物：流程1其中W、Y、Z、R1、n和L1如上文定義。步驟(i)通常包括使用合適的試劑，例如1.1eqNXS、1.5eqpTSA和MeCN，接著加熱至回流2-24小時。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，下式(III)化合物是已知的或可按已知程序從已知原料制備。例如，式(V)化合物(其中R2表示氫和R3表示–N=環(huán)丙基)可按照以下流程2制備：流程2步驟(i)通常包括使式(V)和(VI)化合物在合適的溶劑(例如異丙醇)中反應(yīng)，接著加熱至回流16小時。所需中間體，例如式(IV)、(V)和(VI)化合物是市購可獲得的、文獻(xiàn)中已知的、通過類似于文獻(xiàn)中的方法制備或按照與描述于下面的實(shí)施例實(shí)驗(yàn)程序的方法類似的方法制備。治療方法如上文所述，認(rèn)為本發(fā)明的化合物可用于治療或預(yù)防與核纖層蛋白A和/或核纖層蛋白C耗減或LMNA突變有關(guān)的病癥，例如核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化和癌癥，特別是核纖層蛋白病和早衰癥。因此，按照本發(fā)明的又一個方面，提供本發(fā)明的化合物用作藥物，優(yōu)選人用藥物。按照又一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的化合物在制備用于治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥、特別是核纖層蛋白病或早老的藥物中的用途。按照本發(fā)明的又一個方面，提供治療或預(yù)防有需要的人的核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥的方法，所述方法包括給予所述人治療有效量的本文定義的化合物。本文提及“核纖層蛋白病”是指由編碼核纖層的蛋白質(zhì)的基因突變(例如核纖層蛋白A/C耗減和/或LMNA基因的缺陷)引起的一組遺傳病癥。核纖層蛋白病包括營養(yǎng)不良和早衰(即早老)疾病。核纖層蛋白病的實(shí)例包括但不限于：非典型Werner綜合征；Barraquer-Simons綜合征；Buschke-Ollendorff綜合征；心肌??；夏科-馬里-圖思病(Charcot-Marie-Toothdisease)；埃-德肌營養(yǎng)不良(X-連鎖的(EDMD)、常染色體顯性(EDMD2)或常染色體隱性(EDMD3))；Dunnigan型家族性局部脂質(zhì)營養(yǎng)不良(FPLD)；Greenberg發(fā)育異常；Hutchinson-Gilford早老綜合征(HGPS)；脫髓鞘性成人起病常染色體顯性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ADLD)；肢帶型肌營養(yǎng)不良1B型(LGMD1B)；脂肪萎縮并糖尿病、肝性脂肪變性、肥厚型心肌病和白黑皮丘疹(LDHCP)；下頜骨肢端發(fā)育異常并A型脂肪營養(yǎng)不良(MADA)；下頜骨肢端發(fā)育異常并B型脂肪營養(yǎng)不良(MADB)；Pelger-Huet異常(Pelger-Huetanomaly,PHA)；Pelizaeus-Merzbacher??；或限制性皮膚病(RD)。本文提及“早老”是指引起個體加速老化的病癥。所述病癥可稱為“早老癥”，包括：Hutchinson-Gilford早老綜合征(HGPS)；Werner綜合征；Bloom綜合征；Rothmund-Thomson綜合征；Cockayne綜合征；或著色性干皮病。已報告了LMNA在幾種類型的癌癥中減量調(diào)節(jié)(參見Zink等(2004)Nat.Rev.；Wu等(2009)J.Exp.Clin.CancerRes.)。在一些癌癥中觀察到的核纖層蛋白A表達(dá)完全丟失表明核纖層蛋白可用作腫瘤抑制物(J.L.Broers等,AmJPathol1993；S.F.Moss等,Gut1999；R.S.Venables等,BrJCancer2001)。重要的是，核纖層蛋白A/C表達(dá)的減量調(diào)節(jié)與癌癥侵襲性和預(yù)后差相關(guān)(E.J.Belt等,Europeanjournalofcancer2011；N.D.Willis等,PLoSOne2008；N.D.Willis等,BiochemSocTrans2008)。內(nèi)核膜上功能性纖層的丟失顯示促進(jìn)癌細(xì)胞的畸形核。然而，核纖層蛋白A/C表達(dá)降低與可更容易擠入小血管的較軟的核有關(guān)，這可能有助于提高這些癌細(xì)胞的侵襲潛力。為此，由于本發(fā)明的化合物能夠改善核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞的核形狀，故應(yīng)了解本發(fā)明的化合物也可用于治療這些癌癥。實(shí)際上，較高劑量的化合物降低癌細(xì)胞侵襲和遷移以及細(xì)胞增殖，特別在表達(dá)低水平的核纖層蛋白A/C的癌細(xì)胞中?？赏ㄟ^本文所述化合物治療的癌癥類型的實(shí)例包括但不限于乳腺癌、腸癌、膀胱癌、骨癌、腦癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌或子宮癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑素瘤。該化合物還可靶向癌干細(xì)胞。本文所用術(shù)語“藥物”是指用于治療、治愈或改善疾病或治療、改善或緩解疾病的癥狀的藥物制劑。藥物制劑包含對其所給予的受試者是無害形式的藥理活性成分和經(jīng)設(shè)計以穩(wěn)定活性成分并影響其進(jìn)入循環(huán)或靶組織的吸收的其它組分。在一個實(shí)施方案中，本文所述藥物為人用藥物。應(yīng)認(rèn)識到本文提及“治療”延展到復(fù)發(fā)的預(yù)防、防止和癥狀(不論輕度、中度還是重度)的抑制或改善以及已確診病況的治療。藥物組合物按照又一個方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的化合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合物用于治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥。在與組合物的其它成分相容且對其接受者無害的意義上，載體、稀釋劑和/或賦形劑必須是“可接受的”。本發(fā)明的化合物還可與一種或多種另外的活性成分聯(lián)用。在又一方面，本發(fā)明因此提供包含本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物以及一種或多種另外的活性成分的組合。當(dāng)本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物與針對同一疾病狀態(tài)的一種或多種另外的活性成分聯(lián)用時，各種化合物的劑量可不同于當(dāng)單獨(dú)使用該化合物時的劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易地了解合適的劑量。應(yīng)認(rèn)識到用于治療所需的本發(fā)明化合物的量將隨待治療的病況的性質(zhì)和患者的年齡和狀態(tài)而變化，并且最終將由主治醫(yī)生或獸醫(yī)斟酌決定。一種或多種另外的活性成分可為用于治療或預(yù)防核纖層蛋白病、早衰癥、正常老化或癌癥的活性成分。所述活性成分的合適的非限制性實(shí)例包括：普伐他汀、唑來膦酸、雷帕霉素、法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑例如氯那法尼等。可方便地提供上文提及的組合用于藥物制劑的形式中，因此包含上文規(guī)定的組合以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物制劑包括本發(fā)明的又一個方面。所述組合的各個成分可通過任何方便的途徑以單獨(dú)的或組合的藥物制劑序貫或同時給予。當(dāng)給藥是序貫時，可先給予本發(fā)明的化合物或一種或多種另外的活性成分。當(dāng)給藥是同時時，可在相同或不同的藥物組合物中給予所述組合。當(dāng)在同一制劑中混合時，應(yīng)認(rèn)識到兩種化合物必須穩(wěn)定并且彼此且與制劑的其它組分相容。當(dāng)單獨(dú)配制時，它們可以任何合適的制劑、以本領(lǐng)域?qū)τ谒龌衔锸且阎姆绞椒奖愕靥峁＝o藥本發(fā)明的化合物可作為未加工的化學(xué)品給予，但活性成分優(yōu)選作為藥物制劑提供。本發(fā)明的化合物可以常規(guī)劑型給予，所述劑型可按照本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)程序，通過將本發(fā)明的化合物與標(biāo)準(zhǔn)藥用載體或稀釋劑混合來制備。這些程序可包括混合、制粒和適當(dāng)時將成分壓制或溶解成所需制劑?？膳渲票景l(fā)明的藥物組合物用于通過任何途給藥，包括呈適于口服、局部或胃腸外給予哺乳動物(包括人)的形式。組合物可呈片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、錠劑、乳膏劑或液體制劑(例如口服或無菌胃腸外溶液劑或混懸劑)的形式。本發(fā)明的局部制劑可作為例如軟膏劑、乳膏劑或洗劑、眼用軟膏劑和滴眼劑或滴耳劑、浸透敷料劑和氣霧劑提供，并且可含有合適的常規(guī)添加劑例如防腐劑、促進(jìn)藥物滲透的溶劑及軟膏劑和乳膏劑中的軟化劑。制劑還可含有相容的常規(guī)載體，例如乳膏或軟膏基料和用于洗劑的乙醇或油醇。所述載體可以制劑的約1%直到約98%存在。更通常它們可構(gòu)成高達(dá)制劑的約80%。用于口服給藥的片劑和膠囊劑可為單位劑量呈現(xiàn)形式，并可含有常規(guī)賦形劑例如粘合劑，例如糖漿、阿拉伯樹膠、明膠、山梨糖醇、西黃蓍膠或聚乙烯吡咯烷酮；填充劑，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨糖醇或甘氨酸；壓片潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；崩解劑，例如馬鈴薯淀粉；或可接受的潤濕劑例如十二烷基硫酸鈉。片劑可按照正常藥學(xué)實(shí)踐眾所周知的方法包衣?？诜后w制劑可呈例如水性或油性混懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑或酏劑的形式，或可作為干制品提供用于用前與水或其它合適的溶媒復(fù)溶。所述液體制劑可含有常規(guī)添加劑，例如助懸劑例如山梨糖醇、甲基纖維素、葡萄糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪、乳化劑例如卵磷脂、脫水山梨醇單油酸酯或阿拉伯樹膠；非水性溶媒(其可包括食用油)，例如杏仁油、油性酯例如甘油、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，且需要時，常規(guī)矯味劑或著色劑。栓劑可含有常規(guī)栓劑基料，例如可可脂或其它甘油酯。對于胃腸外給藥，液體單位劑型使用化合物和無菌溶媒(優(yōu)選為水)制備。根據(jù)所用的溶媒和濃度，可將化合物懸浮或溶于溶媒中。在制備溶液劑時，可將化合物溶于注射用水中，過濾除菌后裝入合適的小瓶或安瓿中并密封。有利的是，可將例如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑等作用劑溶于溶媒中。為了提高穩(wěn)定性，可將組合物裝入小瓶中后冷凍，并真空除水。然后將干的凍干粉在小瓶中密封，并可提供附帶的注射用水小瓶以在用前重配液體。胃腸外混懸劑以大致相同的方式制備，只是將化合物懸浮于溶媒而不是溶解，且滅菌不能通過過濾完成?？赏ㄟ^在懸浮于無菌溶媒中之前暴露于環(huán)氧乙烷中使化合物滅菌。有利的是，表面活性劑或潤濕劑包括在組合物中以促進(jìn)化合物的均勻分布。根據(jù)給藥方法，組合物可含有0.1%重量、例如10-60%重量的活性物質(zhì)。當(dāng)組合物包含劑量單位時，各單位可含有例如5-1000mg活性成分。根據(jù)給藥途徑和頻率，用于成人治療的劑量的范圍可為10-3000mg/天。對于口服給藥，典型劑量的范圍可為50-1500mg/天，例如120-1000mg/天。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明化合物的最適量和各劑量的間隔將取決于待治療的病況的性質(zhì)和程度、給藥的形式、途徑和部位及待治療的具體哺乳動物，且所述最適可通過常規(guī)技術(shù)確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)認(rèn)識到，最適療程，即對于確定的天數(shù)，每天給予的本發(fā)明化合物的劑量數(shù)目可由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)療程確定試驗(yàn)確定。所有的出版物，包括但不限于本說明書引用的專利和專利申請均通過引用結(jié)合到本文中，好像每個個別的出版物具體而單獨(dú)指明通過引用結(jié)合到本文中，就像全文給出一樣。實(shí)施例通過下面的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明。在下面的程序中，在各起始原料后，通常提供通過編號提及的描述或?qū)嵗?。這僅僅為協(xié)助化學(xué)技術(shù)人員而提供。起始原料不一定從所提及的批次制備。當(dāng)提及使用“類似”程序時，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的，所述程序可包括少量變化，例如反應(yīng)溫度、試劑/溶劑量、反應(yīng)時間、后處理?xiàng)l件或色譜純化條件。所有的溶劑和試劑采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化或按市售來源(Sigma-Aldrich)供應(yīng)的使用。NMR譜使用氘化溶劑以300K在Bruker500MHz儀中獲得。1HNMR譜峰裂圖樣的注釋包括：單峰(s)，雙峰(d)，三峰(t)，寬峰(br)和多重/重疊峰(m)。信號引述為δ值(單位ppm)，耦合常數(shù)(J)引述為赫茲。在Micromass?Q-Tof(ESI)光譜儀中記錄質(zhì)譜。一般程序?qū)⒑线m的酮或醛以0.5M的終濃度溶于異丙醇中，在等摩爾量的氨基硫脲存在下回流24小時。相應(yīng)的縮氨基硫脲經(jīng)過濾分離，并從熱乙醇中重結(jié)晶。將等摩爾量的縮氨基硫脲和所需的鹵代酮以0.2M的終濃度在室溫下在異丙醇中攪拌過夜。將所得產(chǎn)物從熱乙醇中重結(jié)晶幾次，得到純產(chǎn)物，無需進(jìn)一步純化便可使用。化合物14-(4-氰基苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基肼基)噻唑(Remodelin)將2-亞環(huán)戊基肼-1-硫代甲酰胺(carbothioamide)(其可按上文流程2所述制備)(1g，4.46mmol)和2-溴-4’-氰基乙酰苯(其可按上文流程1所述制備)(700mg，4.45mmol)在12ml異丙醇中在室溫下攪拌過夜。沉淀經(jīng)過濾，并從熱乙醇中重結(jié)晶，得到所需化合物的氫溴酸鹽(559mg，1.98mmol，45%)，為淺黃色針狀物。將其以10mg/mL的濃度重懸浮于DMSO中用于細(xì)胞測定法。1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ12.11(brs),7.84(d,J=9.0Hz,2H),7.81(d,J=9.0Hz,2H),6.84(s,1H),2.61(t,J=9.0Hz,2H),2.51(t,J=9.0Hz,2H),1.94–1.80(m,4H)；13CNMR(125MHz,CDCl3)：δ173.8,169.5,138.8,133.5,131.3,126.3,118.0,114.1,103.8,33.7,31.2,25.2,25.0；HRMS(m/z)：[M]+對于C15H15N4S，計算為283.1009；實(shí)測為283.1017?；衔?4-(4-氯苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基肼基)噻唑鹽酸鹽將氨基硫脲(20g，220mmol)和環(huán)戊酮(19.43ml，220mmol)在500ml異丙醇中回流24小時。沉淀經(jīng)過濾，從熱乙醇中重結(jié)晶，得到相應(yīng)的縮氨基硫脲(2-亞環(huán)戊基肼-1-硫代甲酰胺)，為淺黃色晶體。將2-亞環(huán)戊基肼-1-硫代甲酰胺(10g，63mmol)和2,4’-二氯乙酰苯(12g，63mmol)在300ml異丙醇中在室溫下攪拌過夜。沉淀經(jīng)過濾，并從熱乙醇中重結(jié)晶，得到所需化合物的鹽酸鹽(16g，48mmol，77%)，為淺黃色針狀物。將其以10mg/mL的濃度重懸浮于DMSO中用于細(xì)胞測定法。光譜數(shù)據(jù)與之前描述于文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)一致(F.Chimenti等,(2009)J.Med.Chem.52,530)?；衔?4-(4-氯苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基-1-(丙-2-炔-1-基)肼基)噻唑向化合物2(1g，3mmol)在新蒸餾的DMF(75ml)溶液中加入K2CO3(1.375g，10mmol)、三乙胺(1.4ml，10mmol)和炔丙基溴(1.2ml，5mmol，80wt%在甲苯中)。在室溫下12小時后溶液變紫。加入炔丙基溴(1.2ml)，再攪拌反應(yīng)混合物12小時。然后溶劑經(jīng)減壓蒸發(fā)，將粗制殘余物溶于CH2Cl2中，用NH4Cl和NaCl的飽和溶液洗滌幾次，經(jīng)MgSO4干燥。溶劑經(jīng)減壓蒸發(fā)，在常規(guī)柱色譜法后得到所需產(chǎn)物(0.35g，1mmol，34%)，為褐色油狀物。TLC(己烷：CH2Cl2，80:20)：Rf=0.25；1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ7.78(d,J=8.0Hz,2H),7.32(d,J=8.0Hz,2H),6.86(s,1H),4.65(s,2H),2.64–2.55(m,4H),2.22(s,1H),1.86–1.82(m,4H)；13CNMR(125MHz,CDCl3)：δ184.9,171.8,150.6,133.4,133.3,128.6(2C),127.3(2C),105.2,78.3,72.5,42.7,33.8,31.5,24.9,24.4；HRMS(m/z)：[M]+對于C17H16ClN3S，計算為329.0758；實(shí)測為329.0747。應(yīng)了解，化合物4-12按與上述化合物1-3類似的方式制備：化合物134-(4-三氟甲基苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基肼基)噻唑氫溴酸鹽將2-亞環(huán)戊基肼-1-硫代甲酰胺(3.0g，18.7mmol)和2-溴-4’-(三氟甲基)乙酰苯(5.0g，18.7mmol)在異丙醇(150mL)中在室溫下攪拌24小時。沉淀經(jīng)過濾，從熱乙醇中重結(jié)晶3次，得到標(biāo)題化合物的氫溴酸鹽，為嫩黃色針狀物(1.5g，3.7mmol，20%)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ11.12(brs,2H),7.80(d,J=8.5Hz,2H),7.65(d,J=8.5Hz,2H),6.87(s,1H),2.53(t,J=7.0Hz,2H),2.47(t,J=7.0Hz,2H),1.93–1.75(m,4H)。13CNMR(75MHz,CDCl3)δ171.9,169.4,140.3,131.8(q,J=32.0Hz),131.6,126.5(brq,J=3.5Hz,2C),126.1(2C),123.7(q,J=274.0Hz),103.5,33.5,30.6,25.1,24.9。HRMS(m/z)：[M+H]+對于C15H15F3N3S，計算為326.0933；實(shí)測為326.0950。應(yīng)了解，化合物14-21可按與上述化合物1-3和13類似的方式制備：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)材料與方法細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染使U2OS和SaOS-2骨肉瘤細(xì)胞、HeLa宮頸癌細(xì)胞、A431黑素瘤細(xì)胞、NCI-SNU5胃癌細(xì)胞、MRC-5肺成纖維細(xì)胞和Werner綜合征患者來源的SV40成纖維細(xì)胞在補(bǔ)充10%胎牛血清(BioSera)、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μgml-1鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma-Aldrich)中生長。正常皮膚原代成纖維細(xì)胞GM03440和HutchinsonGilford早老綜合征(HGPS)皮膚原代成纖維細(xì)胞AG11498和AG06297購自CoriellCellRepositories，并分別在傳代數(shù)9-12和20-23間使用。使細(xì)胞在如上補(bǔ)充的DMEM中生長。使RPE-1視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在如上補(bǔ)充并用碳酸氫鈉緩沖的DMEM和HamF12混合培養(yǎng)基中生長。使HMV-II黑素瘤細(xì)胞系、22RV1前列腺癌細(xì)胞、NCI-H82和NCI-H69肺癌細(xì)胞和NCI-N87胃癌細(xì)胞系在如上補(bǔ)充的RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)中生長。使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U2OS細(xì)胞在含有1mgml-1G418(Invitrogen)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中維持。siRNA雙鏈體獲自LifeSciences：核纖層蛋白A/CstealthRNAi：CCAUGAAGGAGGAACUGGACUUCCA(SEQIDNO:1)和GCGUGAGGAGUUUAAGGAGCUGAAA(SEQIDNO:2)、NAT10stealthRNAi：GAGCAUGGACCUCUCUGAAUACAUA(SEQIDNO:3)，作為對照siRNA，使用stealthRNAi陰性對照雙鏈體。按照生產(chǎn)商說明書，分別使用Lipofectamine2000和LipofectamineRNAiMax(LifeSciences)進(jìn)行質(zhì)粒DNA和siRNA轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后48-72小時分析細(xì)胞。藥物處理將下列KAT和KDAC抑制劑用于核形狀拯救篩選中，將細(xì)胞與所述分子孵育16小時：曲古抑菌素A(1μM)、丁酸鈉(5mM)、tubacin(10μM)、SAHA(5μM)、姜黃色素(10μM)、藤黃醇(50μM)、漆樹酸(1μM)、MB-3(5μM)、4-(4-氯苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基肼基)噻唑(化合物2)(50μM)、4-(4-氯苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基-1-(丙-2-炔-1-基)肼基)噻唑(化合物3)(50μM)和亞環(huán)戊基-[4-(4-氰基苯基)噻唑-2-基)肼(化合物1)(Remodelin)(10-50μM)。對于HGPS細(xì)胞適合度測定法，使1μM的Remodelin溫育1-10天，每3天更新培養(yǎng)基。對于長期老化測定法，使細(xì)胞在含有1μMRemodelin或僅DMSO的培養(yǎng)基中保持并傳代12次群體倍增。使用來自CellSignaling的老化β-半乳糖苷酶染色試劑盒#9860(Senescenceβ-GalactosidaseStainingKit#9860)，在Remodelin處理8天后當(dāng)細(xì)胞處于群體倍增12時，然后在Remodelin處理幾周，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到群體倍增24時，對老化進(jìn)行評價。分別使用200ng/ml、1μg/ml和1μM的諾考達(dá)唑、秋水仙素和拉春庫林A(Sigma-Aldrich)。使用5μg/ml的阿非迪霉素(Sigma-Aldrich)持續(xù)16小時。法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑FTI-277購自TocrisBioscience并以5μM使用。ATMi(KU55933)和ATRi(ATR-45)分別獲自TocrisBioscience和OhioStateUniversity，并以10μM和500nM使用。使用10μM的Pifithrinα(Sigma-Aldrich)。GFP-H2B細(xì)胞的實(shí)時成像將U2OS細(xì)胞用siLMNA轉(zhuǎn)染48小時后加入50μM的(化合物2)。用配備100xUPlanSApo/1.40油浸物鏡(Olympus)并用SoftWoRx軟件(AppliedPrecision)控制的DeltavisionPersonalDV(AppliedPrecision，512x512CoolSNAPHQ2攝影機(jī))，以0.2μm間隔的z-堆棧，每15分鐘拍攝照片持續(xù)16小時。然后用ImageJ軟件從圖像中剪輯影片。流式細(xì)胞術(shù)按指定，使10μMEdU溫育2小時。將細(xì)胞在4%低聚甲醛(Sigma-Aldrich)中固定。使用Click-iT?EdU流式細(xì)胞術(shù)測定試劑盒(LifeSciences)，對EdU進(jìn)行熒光標(biāo)記。在含有0.1%Triton-X-100和0.5mgml-1無DNA酶的RNA酶A(DNasefreeRNaseA)(Sigma-Aldrich)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，將DNA用50mgml-1碘化丙錠(Sigma-Aldrich)染色。使樣品通過配備CellQuest軟件的FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)處理。應(yīng)用FlowJo軟件(TreeStar)分析結(jié)果。核圓度和核面積定量測定使用“objectsizeshape”度量，應(yīng)用CellProfiler軟件以量化來自DAPI染色照片的核圓度和核面積。AreaShape度量允許計算相當(dāng)于圓度的形狀因子指數(shù)(4×π×面積/周長2)(形狀因子為1反映出完整的圓)以及計算核面積。增殖測定法將HGPS細(xì)胞以相同數(shù)目接種到24孔培養(yǎng)皿中。次日，將Remodelin(1μM)或小分子化合物2(1-10μM)加入孔中，將板轉(zhuǎn)移到IncuCyte顯微鏡(EssenBioScience)中。在幾天內(nèi)每2小時拍攝相差照片。細(xì)胞匯合的百分比通過CellPlayer集成軟件(EssenBioScience)計算，并用GraphPadPrism?軟件分析。從人細(xì)胞中純化蛋白質(zhì)HEK293細(xì)胞用NAT10構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染，在48小時后收獲在PBS中。使細(xì)胞在新補(bǔ)充50U/mlbenzonase和無EDTA蛋白酶抑制劑混合劑(Roche)的IP裂解緩沖液(20mMTrispH7.5、40mMNaCl、2mMMgCl2、0.5%NP-40)中在室溫下裂解5分鐘。在該最初的裂解步驟后，將NaCl濃度調(diào)節(jié)至450mM，并使樣品在4℃下旋轉(zhuǎn)孵育。通過離心使裂解物澄清(13,200rpm，在4℃下20分鐘)，在回收后，使NaCl濃度平衡至150mM。在補(bǔ)充蛋白酶抑制劑的IP緩沖液(25mMTrispH7.5、150mMNaCl、1.5mMDTT、10%甘油、0.5%NP-40)中將裂解物用于免疫沉淀反應(yīng)。靶蛋白用與蛋白A/G-Dynabeads(LifeSciences)偶聯(lián)的抗FLAG抗體(M2，Sigma-Aldrich)俘獲。將復(fù)合物用含有遞增量的NaCl(250mM、500mM和1M)的IP緩沖液洗滌。之后，將免疫復(fù)合物在含有遞減量的NaCl(1M、500mM、250mM和150mM)的TBS中洗滌。此時，洗脫使用過量的三重-Flag肽(SigmaAldrich)進(jìn)行。將洗脫的蛋白質(zhì)加載至凝膠上，純化通過銀染(SilverQuestkit，LifeSciences)證實(shí)。可溶性微管蛋白或多聚化微管蛋白的分析將用5μMRemodelin預(yù)處理16小時或用10μM諾考達(dá)唑預(yù)處理8小時的U2OS細(xì)胞在MT穩(wěn)定緩沖液(MSB)(85mMPIPES[pH6.9]、1mMEGTA、1mMMgCl2、2M甘油、含4μg/ml泰素的0.5%Triton)中裂解。將裂解物保持在4℃下2分鐘，然后以13,000rpm離心10分鐘。將表示蛋白質(zhì)的可溶性部分的上清液轉(zhuǎn)移到管中，加入Laemmli緩沖液。將表示蛋白質(zhì)的多聚化部分的沉淀在不含Triton的MSB中洗滌一次，然后重新懸浮于Laemmli緩沖液中。將等量的裂解物加載到梯度凝膠中。微管再生長測定法在siRNA轉(zhuǎn)染后48小時，通過在用或不用5-10μMRemodelin預(yù)處理16小時的細(xì)胞中在4℃下冷處理1小時使微管解聚。將冷的培養(yǎng)基用預(yù)熱的培養(yǎng)基更換，使細(xì)胞在37℃下孵育5或15分鐘以分別允許微管成核和錨定。按免疫熒光程序中所述將細(xì)胞在PFA中固定，并用抗α-微管蛋白抗體染色。免疫印跡如下制備總細(xì)胞提取物：通過在SDS裂解緩沖液(4%SDS、20%甘油和120mMTris-HCl，pH6.8)刮擦細(xì)胞，在95℃下煮沸5分鐘，接著通過25號針10個沖程。在加載前，將裂解物用0.01%溴酚藍(lán)和200mMDTT的溶液稀釋，并在95℃下煮沸5分鐘。將蛋白質(zhì)在4-12%梯度凝膠(NUPAGE，LifeSciences)上通過SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜(Protran；Whatman)上。與IRDye熒光團(tuán)偶聯(lián)的第二抗體來自LI-CORBiosciences。檢測和量化用成像儀(Odyssey；LI-CORBiosciences)進(jìn)行。免疫熒光細(xì)胞用PBS洗滌，并用含2%PFA的PBS固定20分鐘。細(xì)胞用PBS/0.2%TritonX-100透化5分鐘，并用含有5%BSA的PBS/0.2%Tween20(PBS-T)封閉。使蓋玻片與第一抗體一起孵育1小時，并與AlexaFluor488或594熒光團(tuán)(LifeTechnologies)偶聯(lián)的合適的第二抗體一起孵育30分鐘后，用2μg/mlDAPI孵育。用FluoView1000共焦顯微鏡(Olympus)拍攝照片。對于高分辨成像，用兩者都配備了100xUPlanSApo/1.40油浸物鏡(Olympus)并用SoftWoRx軟件(AppliedPrecision)控制的DeltavisionPersonalDV(AppliedPrecision，1024x1024CoolSNAPHQ2攝影機(jī)，0.2μm間隔的z-堆棧)或常規(guī)模式的DeltavisionOMXV3(AppliedPrecision，512x512CascadeII攝影機(jī)(Photometrics)，0.125μm間隔的z-堆棧)，獲取z-堆棧。然后用保守模式的SoftWoRx(AppliedPrecision)進(jìn)行去卷積。順序獲取不同的信道?？牲c(diǎn)擊分子的熒光標(biāo)記如上所述，將細(xì)胞用可點(diǎn)擊分子化合物3或參比化合物A(1-氯-4-乙炔苯(ethynilbenzene)，購自Sigma-Aldrich)一起預(yù)孵育2小時后固定并透化。點(diǎn)擊反應(yīng)物使用含Alexafluor488Azide的InvitrogenClick-iT試劑制備，并避光與固定的細(xì)胞一起孵育1小時。在用另一種蛋白質(zhì)共標(biāo)記的情況下，在抗體孵育前進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)?？贵w用于該研究的抗體為：微球菌核酸酶消化敏感性測定法1x106細(xì)胞經(jīng)胰蛋白消化，收獲，并用1ml1xRSB緩沖液(10mMTris，pH7.6、15mMNaCl和1.5mMMgCl2)洗滌一次。在離心(3,00xg)后，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于1ml含1%Triton-X100的1xRSB緩沖液中，通過用松動配備的玻璃杵5個沖程勻漿以釋放核。核通過離心(13,000xg)收集，并用1ml緩沖液A(15mMTris，pH7.5、15mMNaCl、60mMKCl、0.34M蔗糖、0.5mM亞精胺、0.15mM精胺、0.25mMPMSF和0.1%β-巰基乙醇)洗滌兩次。將核重新懸浮于緩沖液A中，等分成100μl等分試樣。將1.2μl0.1MCaCl2加入各等分試樣中，核通過加入0.25μl200U/mlMNase(Sigma-Aldrich)來消化，在30℃下孵育。在不同的時間點(diǎn)將各等分試樣放回冰上，通過加入3μlEDTA立即終止消化。DNA使用QiagenPCR純化試劑盒純化，將1500ngDNA在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。消化概況應(yīng)用ImageJ分析，并相對于各泳道的總密度調(diào)節(jié)值以抵銷DNA加載變化。賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(KAT)測定法使用自HEK293細(xì)胞純化的NAT10和5μg富含豬微管蛋白(Tebu-bio)的純化的MAP作為底物，使用熒光HAT測定試劑盒(ActiveMotif)進(jìn)行KAT測定法。使用50μM的Remodelin和可點(diǎn)擊分子2。圓二色(CD)光譜法CD實(shí)驗(yàn)采用Chirascan圓二色光譜儀(AppliedPhotophysics，UK)進(jìn)行。在TBS0.1%NP-40(Sigma-Aldrich)中終濃度為10μM的200μl純化的FLAG-NAT10裝入光程長度為1mm的石英杯中，轉(zhuǎn)移到光譜儀中。在25℃下在180-350nm的波長范圍內(nèi)以1秒鐘響應(yīng)時間、1nm間距(pitch)和1.5-nm帶寬記錄CD掃描。加入溶于DMSO的化合物2，在記錄掃描前，將溶液孵育5分鐘。CD光譜是緩沖液扣減的，在300nm下零校正，并歸一化(摩爾橢圓率θ以105degcm2dmol?1引用)。DNA操作所有DNA構(gòu)建體通過DNA測序被證實(shí)為沒有突變。下面提供用于該研究的DNA寡核苷酸清單。pICE-FLAG通過將退火引物FLAG-S和FLAG-AS克隆至HindIII-和BamHI消化的pICE(一種新的賦予哺乳動物細(xì)胞嘌羅霉素抗性的合成質(zhì)粒)中而產(chǎn)生(BrittonS,CoatesJ,JacksonSP.JCellBiol.2013)。為了產(chǎn)生對NAT10siRNA有抗性的NAT10cDNA，使用引物對NAT10-F和NAT10-siR-R或NAT10-siR-F和NAT10-R，從IMAGE克隆5166101(SourceBioscience)擴(kuò)增NAT10cDNA。使用引物NAT10-F和NAT10-R，通過PCR使所得PCR產(chǎn)物融合在一起。將所得PCR產(chǎn)物用BamHI和MluI消化并克隆至用相同的限制性內(nèi)切酶消化的pICE-FLAG中。為了產(chǎn)生pICE-FLAG-NAT10-G641E，按照生產(chǎn)商說明書并使用引物NAT10-G641E-F和NAT10-G641E-R，使用QuickChange位點(diǎn)定向誘變試劑盒(AgilentTechnologies)將G641E突變引入pICE-FLAg-NAT10中。表1:DNA寡核苷酸清單用于蛋白質(zhì)牽出測定的小分子使用市購可得的O-(2-氨基乙基)-O’-(2-疊氮基乙基)七乙二醇和(+)-生物素N-羥基琥珀酰亞胺，從化合物3(“生物素化化合物3”)合成生物素化衍生物?；衔?(“PEG4生物素化化合物3”)和對照參比化合物A(“PEG4生物素化化合物A”)的其它生物素化衍生物通過在細(xì)胞提取物中加入PEG4甲酰胺-6-疊氮基己烷基生物素(LifeSciences)和點(diǎn)擊試劑而原位產(chǎn)生。生物素化小分子牽出將細(xì)胞收獲在PBS中，在補(bǔ)充1mMPMSF和蛋白酶抑制劑(Roche)的RIPA緩沖液中在4℃下旋轉(zhuǎn)裂解30分鐘。通過以16,000xg離心10分鐘收集上清液。然后將上清液與40μM生物素化小分子(生物素化化合物3)或用于競爭實(shí)驗(yàn)與200μM(化合物2)和40μM(生物素化化合物3)一起孵育2小時。將鏈霉抗生物素包被的磁珠(DynabeadsM-280Streptavidin，LifeSciences)用結(jié)合緩沖液(25mMTris.HCl、150mMNaCl、0.1%Triton)洗滌3次，與上清液在4℃下旋轉(zhuǎn)孵育1小時。磁珠用結(jié)合緩沖液洗滌3次，接著在Laemmli緩沖液中煮沸5分鐘以洗脫出蛋白質(zhì)。然后將樣品加載到4-12%梯度凝膠(NUPAGE，LifeSciences)上，通過銀染(SilverQuest染色試劑盒，LifeSciences)分析，切割特異性條帶，并通過LC-MS/MS分析。可點(diǎn)擊小分子牽出PEG4生物素化化合物3從化合物2、市購可得的O-(2-氨基乙基)-O’-(2-疊氮基乙基)七乙二醇和(+)-生物素N-羥基琥珀酰亞胺合成，之后與細(xì)胞提取物一起孵育(用于牽出和質(zhì)譜分析)。生物素化化合物3和PEG4生物素化化合物A從化合物2和3原位產(chǎn)生，在活細(xì)胞中預(yù)孵育2小時后，在細(xì)胞提取物中加入市購可得的PEG4甲酰胺-6-疊氮基己烷基生物素和點(diǎn)擊試劑(用于點(diǎn)擊-牽出和蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證)。如下將點(diǎn)擊反應(yīng)試劑加入細(xì)胞裂解物中：10μM生物素疊氮化物(PEG4甲酰胺-6-疊氮基己烷基生物素，LifeSciences)、10mM抗壞血酸鈉(Sigma-Aldrich)、2mMCuSO4(LifeSciences)。將點(diǎn)擊反應(yīng)物在4℃下避光旋轉(zhuǎn)孵育1小時。然后如上所述將鏈霉抗生物素珠粒孵育1小時，洗脫樣品，并加載到凝膠上后，進(jìn)行免疫印跡法。結(jié)果實(shí)施例1：通過KAT抑制劑拯救核形狀因?yàn)楹死w層蛋白蛋白質(zhì)起維持核結(jié)構(gòu)和將染色質(zhì)錨定在核邊緣的支架的作用(J.Gotzmann,R.Foisner(1999)Crit.Rev.Eukaryot.GeneExpr.9,257)，所以小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的核纖層蛋白A/C的耗減(siLMNA)在不同的人細(xì)胞系中引起核形狀缺陷(圖1A，B和圖2A，B)。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)核纖層蛋白A/C耗減還與總的染色質(zhì)松弛有關(guān)，如通過微球菌核酸酶(MNase)敏感性增強(qiáng)和核面積增加所觀察到的(圖1B，C)。因此，據(jù)推理，核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞中染色質(zhì)的再壓實(shí)可改善其一些核結(jié)構(gòu)缺陷。賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(KAT)和賴氨酸脫乙酰酶(KDAC)具有調(diào)節(jié)組蛋白和其它蛋白質(zhì)的乙?；癄顟B(tài)的能力，因此影響總的染色質(zhì)組織。因此，在siLMNA細(xì)胞的染色質(zhì)壓實(shí)和核形狀上，對已知抑制各KAT或KDAC酶的活性的各種天然和合成小分子(參見材料與方法)的作用進(jìn)行了評價。這將KAT抑制劑4-(4-氯苯基)-2-(2-亞環(huán)戊基肼基)噻唑(化合物2)(F.Chimenti等,(2009)J.Med.Chem.52,530)(圖1D)鑒定為在不同的核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞系中完全恢復(fù)核形狀和圓度(圖1E、F和圖2A-D)。盡管在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中最初被鑒定為GCN5網(wǎng)抑制劑的小分子化合物2(F.Chimenti等,(2009)J.Med.Chem.52,530)，經(jīng)典的GCN5抑制劑MB-3(M.Biel等(2004)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.43,3974)不改善siLMNA細(xì)胞的核圓度(圖1F)，表明了小分子依賴性核形狀拯救不依賴于GCN5抑制。分子化合物2還改善siLMNA細(xì)胞的總的染色質(zhì)致密度，如MNase敏感性降低(圖1G)和核面積減少(圖1H)所觀察到的。通過使用表達(dá)GFP標(biāo)記的組蛋白H2B的細(xì)胞(GFP-H2B)，通過實(shí)時成像觀察到，siLMNA細(xì)胞的完全核形狀拯救發(fā)生在用化合物2處理的12小時內(nèi)，獨(dú)立于有絲分裂(圖1I和圖3)且不顯著影響細(xì)胞周期概況(圖1J和圖2E)。然而，化合物2改善顯示核纖層蛋白A/C表達(dá)降低的幾個癌細(xì)胞系的核形態(tài)(圖2F，G)，這表明所觀察到的作用不是siRNA介導(dǎo)的核纖層蛋白A/C耗減所特有的。實(shí)施例2：通過化合物2的化學(xué)標(biāo)記鑒定蛋白質(zhì)靶標(biāo)為了鑒定分子化合物2的推定的生物學(xué)靶標(biāo)并闡明改善核形態(tài)的機(jī)制，建立了基于分子的策略，其包括借助“點(diǎn)擊化學(xué)”進(jìn)行分子的細(xì)胞官能化以找到并驗(yàn)證藥物相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合物。為此，策略性地將炔基引入化合物2的腙部分中，從而產(chǎn)生顯示與化合物2(圖4B)同等細(xì)胞活性的“可點(diǎn)擊”類似物化合物3(圖4A)，并使用無活性可點(diǎn)擊分子參比化合物A作為陰性對照(圖4A，B)。雖然炔部分在生物學(xué)上是惰性的，但它可在銅暴露時與攜帶疊氮基的任何分子選擇性地反應(yīng)(V.V.Rostovtsev等(2002)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.41,2596)，因此允許在細(xì)胞中標(biāo)記小分子(圖4C)。作為第一步，產(chǎn)生化合物3的生物素化衍生物(生物素化化合物3)(圖4D)，并與細(xì)胞提取物一起孵育。然后與生物素化化合物3締合的蛋白質(zhì)用鏈霉抗生物素珠粒找回，并通過凝膠電泳分離(圖4E)。在進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)期間，鑒定出其染色強(qiáng)度在過量的競爭化合物2存在下降低的幾種蛋白質(zhì)類別。然后根據(jù)此競爭標(biāo)準(zhǔn)從凝膠上切割與生物素化化合物3選擇性相互作用的蛋白質(zhì)，并通過質(zhì)譜法(LC-MS/MS)鑒定。引人注目地，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶10(NAT10)是通過上述程序鑒定的唯一KAT蛋白(參見表2)，因此是化合物2的唯一可能相關(guān)的靶標(biāo)。表2：化合物2的生物素類似物牽出乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)NAT10。通過小分子生物素化化合物3找回并通過液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)鑒定的具體蛋白質(zhì)命中(hit)。進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)其作為化合物2的生物相關(guān)靶標(biāo)的潛力，注意到之前已將NAT10與SUN1核被膜蛋白關(guān)聯(lián)(Y.H.Chi等(2007)J.Bio.Chem.282,27447)，最近顯示其耗減拯救LMNA耗減細(xì)胞中的核形狀(C.Y.Chen等(2012)Cell149,565)，并且表明NAT10的KAT活性針對微管和組蛋白底物(Shen等(2009)Exp.CellRes.315,1653)。為了證實(shí)NAT10和化合物2之間的相互作用，將細(xì)胞與可點(diǎn)擊生物活性類似物化合物3或非生物活性對照參比化合物A一起預(yù)孵育以允許其與活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)靶結(jié)合。接下來，通過加入含有生物素的接頭使分子官能化，然后使用鏈霉抗生物素珠粒找回結(jié)合的蛋白質(zhì)。該分析顯示化合物3但非參比化合物A特異性地找回NAT10(圖4F)，從而證實(shí)NAT10在活細(xì)胞的情況下是化合物2的靶標(biāo)，并表明這個方案選出特異性蛋白質(zhì)配偶體而無需使用光交聯(lián)劑(S.E.Ong等(2009)PNAS106,4617；X.Li,T.M.Kapoor(2010)J.Am.Chem.Soc.132,2504)。在平行研究中，將細(xì)胞用化合物3或參比化合物A處理，固定，然后將化合物3用熒光團(tuán)官能化(R.Rodriguez等(2009)Nat.Chem.Biol.8,301)以允許通過高分辨顯微鏡術(shù)顯現(xiàn)其亞細(xì)胞分布(圖4G)。重要的是，雖然針對無活性的對照參比化合物A幾乎沒有或沒有觀察到細(xì)胞染色(圖5A)，但在核中有主要蓄積的化合物3，以及在核周邊和胞質(zhì)中有一些染色(圖4G和圖5A)。此外，觀察到標(biāo)記的化合物3和NAT10染色的顯著重疊，進(jìn)一步證實(shí)了親和力牽出研究。與這些觀察結(jié)果一致，siRNA介導(dǎo)的NAT10耗減(圖4G，下圖)導(dǎo)致核中分子化合物3蓄積的顯著減少(圖4G)而不改變核仁構(gòu)造?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)證實(shí)NAT10在細(xì)胞中是化合物2的特異性靶標(biāo)。為了評價化合物2和NAT10之間的相互作用是否是直接的，將自人HEK293細(xì)胞純化的NAT10(圖4H，左圖)用化合物2滴定，而NAT10構(gòu)象通過圓二色譜學(xué)監(jiān)測(圖4H，右圖)。在不存在化合物時，NAT10譜在210nm處顯示特征性負(fù)信號，反映出α-螺旋的存在。在加入化合物2時，觀察到絕對摩爾橢圓率以濃度依賴性方式明確增加，與通過超分子釘住(supramolecularstapling)(一種使人聯(lián)想起之前描述的共價分子內(nèi)釘住(covalentintramolecularstapling)的方法)穩(wěn)定蛋白質(zhì)一致(R.E.Moellering等(2009)Nature462,182)。這些數(shù)據(jù)顯示化合物2和NAT10之間的直接物理相互作用，并且表明通過分子穩(wěn)定的蛋白質(zhì)折疊可抑制NAT10活性。在我們的分析期間，發(fā)現(xiàn)化合物2在暴露于光或空氣時快速降解。為此并且為了試圖鑒定更有效的分子，研究了化合物2的結(jié)構(gòu)變體以不同的劑量拯救LMNA耗減細(xì)胞的核形狀的能力。這揭示了雖然中心的噻唑腙核是核形狀拯救所必需的，但環(huán)戊烷環(huán)可大大改變，而僅細(xì)微的芳族修飾是容許的(圖6A)。因此這些研究鑒定出在對位含有氰基官能團(tuán)的化合物1(圖4I)為該系列最有效和穩(wěn)定的類似物，與化合物2相比具有5倍的功效改進(jìn)(圖6B)?；谄渲厮躶iLMNA細(xì)胞的核結(jié)構(gòu)的能力，該類似物被命名為“Remodelin”，并用于下列實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3：NAT10抑制介導(dǎo)核形狀拯救上述研究表明Remodelin和相關(guān)化合物可通過NAT10打靶逆轉(zhuǎn)核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞的核形狀。為了探索該構(gòu)思，使人U2OS細(xì)胞中的NAT10和核纖層蛋白A/C共耗減(圖7A)。這引人注目地揭示了與用Remodelin觀察到的作用相當(dāng)，NAT10耗減完全拯救由核纖層蛋白A/C耗減引起的核形態(tài)缺陷(圖7B；在RPE-1和HeLa細(xì)胞中觀察到類似作用)。由于發(fā)現(xiàn)分子化合物2(Remodelin的類似物)為KAT抑制劑，因此評估了NAT10乙酰轉(zhuǎn)移酶活性是否被Remodelin改變，以及是否參與核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞的核形狀拯救。為此，利用Phyre2在線服務(wù)器(L.A.Kelley,M.J.Sternberg(2009)Nat.Protoc.4,363)，從其高度保守的細(xì)菌同系物TmcA的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生人NAT10的區(qū)域10-917的3D模型(Chimnaronk等(2009)Embo.J.28,1362)(圖7C，D)。然后通過將該模型與同Ac-CoA復(fù)合的最初的TmcA結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，來預(yù)測乙酰輔酶A結(jié)合的部位(圖7D)。然后使保守的Gly641突變成Glu(G641E)(圖8A)，預(yù)測這將阻斷NAT10乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(圖7D，右)。實(shí)際上，從人HEK293細(xì)胞表達(dá)和純化的野生型(WT)和G641E突變體(MUT)NAT10蛋白的生物化學(xué)測定(圖8B)顯示G641E突變破壞NAT10KAT活性(圖7E)。此外，在這些反應(yīng)中加入Remodelin或可點(diǎn)擊生物活性化合物3破壞NAT10WTKAT活性，揭示了Remodelin是NAT10抑制劑。為了研究NAT10KAT活性在控制核形狀中的功能，產(chǎn)生了表達(dá)siRNA抗性NAT10WT或G641E構(gòu)建體的穩(wěn)定細(xì)胞系。鑒于兩種蛋白質(zhì)的正確表達(dá)和亞細(xì)胞定位(圖8C，D)，使核纖層蛋白A/C和內(nèi)源NAT10蛋白質(zhì)共耗盡，并對核形狀形態(tài)學(xué)進(jìn)行了研究。引人注目地，雖然核纖層蛋白A/C耗減在表達(dá)NAT10WT的細(xì)胞中損害核圓度，但這在表達(dá)無催化活性的NAT10MUT的細(xì)胞中不是這種情況(圖7F)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)從而證實(shí)通過突變或通過Remodelin作用使NAT10KAT活性鈍化恢復(fù)siLMNA細(xì)胞的正常核形態(tài)。實(shí)施例4：Remodelin靶向NAT10以改善HGPS細(xì)胞的適合度發(fā)現(xiàn)了Remodelin拯救核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞的核形狀缺陷，使用來源于攜帶雜合顯性點(diǎn)突變LMNAc.1824C>,p.G608G的HGPS患者的2個原代成纖維細(xì)胞系(AG11498和AG06267)，研究了其對LMNA突變細(xì)胞的核形狀的作用。由于該突變，HGPS細(xì)胞表達(dá)核纖層蛋白A的永久法尼基化的截短形式(稱為Progerin)，其隨細(xì)胞傳代數(shù)在核邊緣蓄積。這導(dǎo)致核膜折疊和核起泡(圖9A)，并且至少部分是造成HGPS患者的早老表型的原因(K.Cao等(2011)J.Clin.Invest.121,2833)。值得注意的是，Remodelin顯著減少具有畸形核的HGPS細(xì)胞的數(shù)目(圖9A，B)，并且對培養(yǎng)中老化的原代MRC5成纖維細(xì)胞也具有這種作用(圖10A，B)，所述細(xì)胞在持續(xù)傳代時也變得畸形并積累Progerin(P.Scaffidi,T.Misteli(2006)Science312,1059)。相比之下，Remodelin對非核纖層蛋白病理Werner綜合征細(xì)胞的畸形核沒有可測出的作用，表明了核形狀拯救對核纖層蛋白相關(guān)缺陷是特異性的(圖10C，D)。法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)已被用于HGPS細(xì)胞以防止法呢基化Progerin在核膜上的毒性蓄積。實(shí)際上，非法呢基化Progerin遠(yuǎn)離核被膜重新定位，因此核起泡減少(B.C.Capell等(2005)PNAS102,12879)。為了確定Remodelin是否導(dǎo)致法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制，通過蛋白質(zhì)印跡法檢查了核纖層蛋白A加工(圖11A)。重要的是，這證實(shí)了Remodelin不阻斷前核纖層蛋白A切割和成熟，與引起前核纖層蛋白A中間體蓄積的FTI不同。雖然這表明Remodelin不抑制法呢基轉(zhuǎn)移酶活性，但是發(fā)現(xiàn)Remodelin和FTI對于核形狀改善不起協(xié)同作用，表明了它們影響共同的途徑(圖11B，C)。值得注意地，與對Remodelin所觀察到的不同，根據(jù)其提議的作用方式，F(xiàn)TI不改善LMNA耗減細(xì)胞的核形態(tài)。此外，雖然FTI改善HGPS細(xì)胞的核形狀，但它可能通過FTI處理對不表達(dá)Progerin的正常細(xì)胞具有相反作用(圖11B，C)，所述FTI處理導(dǎo)致未加工的核纖層蛋白A和B的蓄積和不當(dāng)定位以及中心體脫離缺陷(V.L.Verstraeten等(2011)PNAS108,4997；M.W.Glynn,T.W.Glover(2005)Hum.Mol.Genet.14,2959；Y.Wang等(2012)Nucleus3,452)。相比之下，Remodelin在正常人成纖維細(xì)胞中不誘導(dǎo)核形狀缺陷；實(shí)際上，它在所述成纖維細(xì)胞中防止FTI誘導(dǎo)的核形狀缺陷(圖11B-D)。關(guān)鍵地，在Remodelin處理或NAT10耗減時在HGPS細(xì)胞中觀察到相當(dāng)?shù)幕魏藬?shù)目的減少(圖9C和圖12A)，導(dǎo)致我們得出結(jié)論(對于siLMNA細(xì)胞也是這樣)：Remodelin所致NAT10抑制是造成HGPS細(xì)胞的核形狀改善的原因。雖然核形狀改善不總是與HGPS細(xì)胞表型的總體改善有關(guān)(M.X.Ibrahim等(2013)Science340,1330)，但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Remodelin改善整體HGPS細(xì)胞適合度(正如通過γH2AX和自身磷酸化ATM(未修復(fù)DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志物)的穩(wěn)態(tài)水平降低和DNA損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)降低所觀察到的)(圖9D和圖12B，C，F(xiàn))、改善染色質(zhì)和核仁組織(正如通過H3K9me3和NAT10染色評價的)和減少核被膜上SUN1蓄積(圖12G-I)。Remodelin無可檢出地影響siLMNA細(xì)胞中SUN1的表達(dá)和定位，這意味著由Remodelin所致核形狀拯救的機(jī)制截然不同于SUN1耗減時所觀察到的(C.Y.Chen等(2012)Cell149,565)。引人關(guān)注的是，來源于患有埃-德肌營養(yǎng)不良(EDMD)的患者的細(xì)胞還顯示在Remodelin處理時γH2AX的水平降低(圖12D，E)，表明了Remodelin可能對其它類型的核纖層蛋白病具有更廣泛的應(yīng)用。通過頂端DNA損傷反應(yīng)激酶ATM和ATR阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也降低γH2AX(圖9E，F(xiàn))。然而，與Remodelin(其也改善DNA復(fù)制(圖12J)、提高細(xì)胞增殖能力(圖9G)并降低老化(圖9H，I；從圖12K來看應(yīng)注意，其它KAT抑制劑不降低老化)不同，抑制ATM和ATR減少增殖和誘導(dǎo)老化(圖9G，H)。如圖12K所示，在p53途徑抑制時觀察到類似作用。這些數(shù)據(jù)因此支持以下構(gòu)想：Remodelin在HGPS細(xì)胞中減少DNA損傷的數(shù)量，雖然損傷仍存在，但是在ATM/ATR抑制時不再正確地發(fā)出信號，導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯和老化。另外，Remodelin改善HGPS細(xì)胞染色質(zhì)致密度(如通過DAPI染色強(qiáng)度觀察到的)(圖12G)和核仁組織，而不改變NAT10定位(圖12I)。重要的是，Remodelin的這些作用與HGPS細(xì)胞的適合度整體加強(qiáng)(如DNA復(fù)制增加所觀察到的)(圖12J)、細(xì)胞增殖能力提高(圖9G)和老化細(xì)胞的比例降低(圖9H)有關(guān)。突出顯示了其長期受益的潛力，發(fā)現(xiàn)了甚至在處理幾周后Remodelin仍防止HGPS細(xì)胞老化(圖9I)。實(shí)施例5：NAT10抑制改組微管以恢復(fù)核形狀NAT10主要定位于核仁(一個核區(qū)室)，通過研究證實(shí)了其在保持整體核組織和核形狀的作用，所述研究顯示耗減核仁蛋白核磷蛋白(NPM1)、纖維蛋白或SENP5導(dǎo)致核形狀改變(M.A.Amin等(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.360,320；A.DiBacco等(2006)Mol.CellBiol.26,4489；M.A.Amin等(2008)Biochem.J.415,345)。在NPM1的情況下，這已被證實(shí)通過微管穩(wěn)定性的變化而發(fā)生(G.Wang等(2010)J.Biol.Chem.285,19060)，所述變化然后通過細(xì)胞骨架和核被膜的連接來影響核。因?yàn)檫@種情況，并且因?yàn)槲⒐艿鞍资且阎腘AT10底物，所以通過免疫熒光檢查細(xì)胞的微管網(wǎng)，并在Remodelin處理時觀察到顯著的重構(gòu)。此外，通過使用細(xì)胞補(bǔ)體系統(tǒng)，證實(shí)了相當(dāng)?shù)奈⒐苤貥?gòu)通過NAT10耗減或通過NAT10催化結(jié)構(gòu)域的突變失活而被觸發(fā)(圖13A)。按照通過Remodelin處理或NAT10抑制在微管改組和核形狀拯救之間有功能連接，微管破壞藥物諾考達(dá)唑和秋水仙素也拯救siLMNA細(xì)胞(圖13B)和HGPS細(xì)胞(圖14A)的核形狀缺陷，而拉春庫林A，一種肌動蛋白聚合的抑制劑，增加核變形(圖13B)。這些結(jié)果因此表明微管但非肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)在核纖層蛋白A/C耗減的情況下可拯救核形狀。重要的是，證實(shí)了Remodelin的作用與高爾基體碎片化或微管蛋白解聚無關(guān)，因?yàn)榕c諾考達(dá)唑或秋水仙素不同，Remodelin不影響高爾基體完整性(圖13C)或微管蛋白組裝成聚合物(圖13D)。這些差異有助于解釋為什么與響應(yīng)諾考達(dá)唑或秋水仙素暴露的情況不同，在Remodelin處理時細(xì)胞不在有絲分裂時蓄積。為了解NAT10如何修飾微管組織，通過在冷誘導(dǎo)的解聚并釋放到溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基中后進(jìn)行再生長測定法，分析微管動力學(xué)。雖然在siLMNA細(xì)胞(圖13E，t=5分鐘)和HGPS細(xì)胞(圖14B)中在NAT10抑制后最初的微管再生長(成核期)顯得正常，但是在siLMNA細(xì)胞(圖13E)和HGPS細(xì)胞(圖14B)中通過Remodelin處理或通過NAT10G641E突變(圖13E，t=15分鐘)，明顯影響然微管與中心體的錨定，這表明了NAT10KAT活性促進(jìn)微管錨定。與此一致，在參與微管錨定的PCM-1蛋白耗減時，在siLMNA細(xì)胞中觀察到核形狀拯救(A.Dammermann,A.Merdes(2002)J.CellBiol.159,255)。因?yàn)槲⒐軐耸┘哟俪珊吮荒せ蔚耐饬?M.C.King等(2008)Cell134,427)，因此該結(jié)果支持這樣的模型，其中在核纖層蛋白病理性細(xì)胞中抑制NAT10KAT活性減少微管錨定，從而對核被膜釋放外力并促進(jìn)核形狀拯救和細(xì)胞適合度的整體加強(qiáng)(圖13F)。該模型與之前的研究一致，該研究表明通過修改基質(zhì)剛度在核上釋放微管力使核纖層蛋白病理性細(xì)胞的核形狀正常化(C.Tamiello等(2013)Nucleus4,61)，并有助于解釋為什么Remodelin像其它微管改組劑一樣(N.Suzuki等(1998)PNAS95,10499)，在非早衰細(xì)胞中糾正FTI誘導(dǎo)的核形狀缺陷(圖11)。實(shí)施例6：核形狀拯救的結(jié)構(gòu)要求的分析在U2OS細(xì)胞(siLMNA)中通過siRNA使核纖層蛋白A/C耗減以誘導(dǎo)畸形核。然后將細(xì)胞用化合物2的不同類似物處理16小時，并通過DAPI染色分析核形狀拯救。結(jié)果見圖18和圖19，該圖顯示了受測分子的結(jié)構(gòu)及其拯救核形狀的能力。實(shí)施例7：化合物2以劑量依賴性方式抑制A431黑素瘤細(xì)胞系的生長將表達(dá)低水平的核纖層蛋白A蛋白的A431細(xì)胞(參見圖2)以低密度接種，并用規(guī)定濃度的化合物2處理。采用IncuCyteZOOM?，隨時間推移自動監(jiān)測細(xì)胞生長。結(jié)果見圖20。增殖測定法顯示以劑量依賴性方式抑制A431細(xì)胞生長。10μMRemodelin的濃度足以降低這些細(xì)胞的增殖達(dá)約50%，而高達(dá)50μMRemodelin不影響表達(dá)高水平的核纖層蛋白A/C的細(xì)胞(參見圖15)。實(shí)施例8：核纖層蛋白A/C敲除的U2OS細(xì)胞比野生型細(xì)胞對化合物2和類似物更敏感采用CripR/Cas9技術(shù)，工程改造LMNA敲除(KO)U2OS細(xì)胞系。將LMNAKO細(xì)胞對化合物2的敏感性與表達(dá)野生型LMNA的細(xì)胞(LMNAWT)相比。采用IncuCyteZOOM?，隨時間推移自動監(jiān)測細(xì)胞生長。結(jié)果見圖21，將該圖分成兩個圖以更易于讀取曲線。上圖顯示化合物2對于抑制LMNAKO細(xì)胞的細(xì)胞生長的特異性。下圖顯示與化合物2相比，化合物13對LMNAKO細(xì)胞生長抑制的效能增加。實(shí)施例9：化合物2明確在LMNAKO細(xì)胞中抑制整體蛋白質(zhì)翻譯將表達(dá)野生型或KOLMNA的U2OS細(xì)胞用化合物2處理24小時并與可點(diǎn)擊甲硫氨酸類似物HPG一起孵育1小時以測量整體蛋白質(zhì)翻譯。然后將HPG用Alexafluor488點(diǎn)擊，通過對10000個細(xì)胞的FACS定量測定整體熒光強(qiáng)度。圖22中的曲線顯示在LMNAKO細(xì)胞中但非在LMNAWT細(xì)胞中在化合物2添加時整體蛋白質(zhì)翻譯強(qiáng)降低，這可說明在之前圖中觀察到的細(xì)胞生長抑制的差異。實(shí)施例10：與用化合物2處理相比NAT10的耗減導(dǎo)致對增殖、遷移和侵襲的類似抑制在U2OS細(xì)胞(siNAT10)中通過siRNA使NAT10耗減，然后將細(xì)胞用化合物2處理16小時后，接種在基質(zhì)膠上用于遷移/侵襲測定法。平行地，分別接種來自同一板的細(xì)胞以評價細(xì)胞增殖。結(jié)果見圖23，并表示為與未處理對照細(xì)胞(siCT)相比細(xì)胞數(shù)的百分比。圖示顯示用化合物2抑制NAT10或用siRNA使之耗減導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的類似的降低。實(shí)施例11：化合物2體內(nèi)毒性和體外特異性的評價以規(guī)定的每日劑量口服給予小鼠化合物2持續(xù)14天，結(jié)果見圖24。圖24的左圖：體重變化顯示高達(dá)400mg/kg/天的高劑量化合物是口服極耐受的，不顯著減輕體重。圖24的右圖：用規(guī)定劑量治療的小鼠在14天治療結(jié)束時心臟和肌肉中化合物2濃度的測量。圖示顯示心臟和肌肉兩者中極高濃度的化合物，表明了化合物隨時間推移蓄積。圖24的下圖顯示化合物2不抑制主要的賴氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶蛋白(KAT)體外對其組蛋白底物的活性，表明了對NAT10抑制的高特異性和因此體內(nèi)潛在的低毒性。實(shí)施例12：化合物2處理對HutchinsonGilford早老綜合征小鼠模型的作用圖25的左圖：與野生型小鼠相比，經(jīng)改造以在兩個等位基因上攜帶G609G突變的HGPS小鼠模型顯示較小的尺寸和背部彎曲。圖25的中圖：HGPS小鼠從3周齡起用每日口服劑量的100mg/kg/天化合物2治療，直到因>20%體重丟失而被淘汰。在用化合物2治療幾天后，小鼠顯示毛發(fā)發(fā)灰，這可能反映了靶命中(targetengagement)。圖25的右圖：僅用溶媒(LmnaG609G/G609GV)或用化合物2(LmnaG609G/G609G2)治療的HGPS小鼠(LmnaG609G/G609G)的整體存活率顯示在化合物2處理時小鼠的中值存活率顯著增加(+25%)。小鼠數(shù)/組n=10。實(shí)施例13：體內(nèi)化合物2的分子作用收獲用化合物2治療的野生型小鼠或LmnaG609G/G609G小鼠的組織，提取蛋白質(zhì)，加載到蛋白質(zhì)印跡上，所述蛋白質(zhì)印跡見圖26。LmnaG609G/G609G小鼠的確顯示progerin表達(dá)(主要在肺組織中易檢出)，證實(shí)了其基因型。通過DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γH2AX評價了DNA損傷，所述γH2AX采用LicorOdyssey成像系統(tǒng)定量測定。在蛋白質(zhì)印跡下顯示與總H2AX相比γH2AX的相對量，并顯示在心臟和肺兩者中與未治療小鼠相比，用化合物2治療的LmnaG609G/G609G小鼠的組織中DNA損傷明顯減少。未在肝提取物中觀察到作用，表明化合物2可能不在肝中蓄積。實(shí)施例14：作為NAT10抑制的潛在生物標(biāo)志物的乙酰基微管蛋白的評價由于微管蛋白是NAT10的直接底物，對來源于HGPS患者的細(xì)胞(圖27的左圖和下圖)以及LmnaG609G/G609G小鼠(圖27的右圖)的微管蛋白乙?；竭M(jìn)行了評價。在患者細(xì)胞和LmnaG609G/G609G小鼠兩者中，微管蛋白乙?；@得較高，表明了NAT10可能過度活化。LmnaG609G/G609G小鼠用化合物2治療導(dǎo)致微管蛋白乙?；浇档?圖27的右圖)，表明了這種乙?；瘶?biāo)志可為體內(nèi)NAT10抑制的良好的生物標(biāo)志物。實(shí)施例15：工程改造LmnaG609G/G609G/NAT10+/-小鼠用于遺傳驗(yàn)證圖28的左上圖：肺蛋白質(zhì)提取物中NAT10表達(dá)水平的評價顯示與WT或LmnaG609G/G609G(圖28的右上圖)相比，NAT10+/-小鼠中的NAT10表達(dá)降低約50%。圖28的下圖：規(guī)定小鼠基因型的體重，顯示了與LmnaG609G/G609G小鼠相比LmnaG609G/G609G/NAT10+/-小鼠中體重的強(qiáng)增加，并表明了NAT10的50%降低足以至少部分地拯救LmnaG609G/G609GHGPS小鼠的表型。實(shí)施例16：微陣列分析顯示HGPS細(xì)胞中化合物2對基因表達(dá)調(diào)節(jié)的特異性將正常成纖維細(xì)胞或HGPS成纖維細(xì)胞以1μM化合物2慢性處理保持在培養(yǎng)中達(dá)12次群體倍增(圖29的上圖)或用針對NAT10的siRNA轉(zhuǎn)染3天(圖29的下圖)。提取RNA，通過微陣列分析整體基因表達(dá)?；鹕綀D(Volcanoplot)顯示化合物2對HGPS細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)節(jié)的極高特異性，其中約1000個基因受影響超過2倍，而在正常成纖維細(xì)胞中只有24個基因受影響。文氏圖(圖29的組圖2)顯示與正常成纖維細(xì)胞相比，通過化合物2處理拯救約一半的HGPS中錯誤調(diào)節(jié)的基因。圖29的下組圖：火山圖和文氏圖顯示NAT10耗減(對于NAT10耗減效率參見下面的WB)導(dǎo)致與正常成纖維細(xì)胞相比HGPS細(xì)胞中約2倍基因表達(dá)的改變。長期化合物2處理還影響約30%的HGPS細(xì)胞中受NAT10耗減影響的基因，表明了這些是受NAT10乙酰轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)節(jié)的基因。綜上所述，本發(fā)明人鑒定并表征了小分子Remodelin為改善核形狀及早衰和核纖層蛋白A/C耗減細(xì)胞兩者的適合度的新的作用劑。據(jù)本發(fā)明人所知，Remodelin是還降低HGPS細(xì)胞中的γH2AX穩(wěn)態(tài)水平(這被認(rèn)為是造成其早老表型的原因)的第一個分子。重要的是，通過使用基于無偏的體內(nèi)和體外點(diǎn)擊化學(xué)的方法，將NAT10鑒定為通過微管網(wǎng)重構(gòu)而負(fù)責(zé)核形態(tài)拯救的Remodelin的細(xì)胞靶。因此，NAT10的“小分子抑制劑”提供以有價值的時空分辨率研究核纖層蛋白病相關(guān)過程的新的機(jī)會(T.U.Mayer等(1999)Science286,971)，并且適當(dāng)時可產(chǎn)生新的藥物類別用以緩解營養(yǎng)不良和早老疾病。在整個說明書和隨附權(quán)利要求書中，除非文中另有要求，否則措詞“包含”和變化例如“包括”和“含有”應(yīng)理解為意指包括所述整數(shù)、步驟、整數(shù)組群或步驟組群但不排除任何其它整數(shù)、步驟、整數(shù)組群或步驟組群。本說明書和權(quán)利要求書構(gòu)成其部分的申請相對于任何后續(xù)申請可用作優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)。所述后續(xù)申請的權(quán)利要求可涉及本文所述的任一特征或特征組合。它們可呈產(chǎn)品、組合物、方法或用途權(quán)利要求的形式，并可通過舉例且非限制地包括隨附權(quán)利要求。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3