本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種青口貝提取物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著全球人口老齡化趨勢(shì)的加劇，以特定神經(jīng)細(xì)胞和組織逐漸衰退乃至死亡為主要特征的神經(jīng)退行性疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類生命健康和生活質(zhì)量的重大疾病，并引起國際生物醫(yī)藥領(lǐng)域的關(guān)注。由于神經(jīng)退行性疾病具有復(fù)雜的病理過程，受氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)異常聚集等多種因素的影響，因此當(dāng)機(jī)體處于氧化脅迫環(huán)境時(shí)，其內(nèi)源性活性氧聚集增加，使得胞內(nèi)抗氧化代謝失衡，抗氧化酶的活性降低，同時(shí)損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和dna等生物大分子物質(zhì)，造成細(xì)胞內(nèi)酶活性變化、代謝紊亂、dna損傷和細(xì)胞凋亡。此外，蛋白質(zhì)異常聚集形成的產(chǎn)物也會(huì)誘發(fā)氧化、炎癥等多種脅迫反應(yīng)，由此導(dǎo)致慢性、持續(xù)性神經(jīng)元的損傷、壞死并導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變。因此，通過抑制活性氧的產(chǎn)生和疾病蛋白質(zhì)的異常聚集是研究神經(jīng)保護(hù)作用的重要策略。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)延年益壽和神經(jīng)保護(hù)有悠久的研究歷史，而豐富的海洋生物資源種類則為之提供了龐大的資源庫。自20世紀(jì)70年代以來，人們已經(jīng)從海洋生物中分離出數(shù)萬種新型化合物，包括肽類、蛋白質(zhì)類、多糖類、生物堿類、萜類、大環(huán)聚酯類等類型。其中，肽類是海洋生物活性物質(zhì)中數(shù)量最龐大的一類化合物，達(dá)數(shù)萬種之多，包括海洋肽類毒素與海洋生物活性肽等。多肽類藥物具有分子量小、無免疫原性、結(jié)構(gòu)簡單、副作用小、活性高等優(yōu)點(diǎn)。此外，由于海洋生物生存的特定環(huán)境，海洋生物多肽的結(jié)構(gòu)與陸生動(dòng)植物肽(糖肽)有很大不同，多為小分子環(huán)肽，含有豐富的d型氨基酸、羥基酸、噻酚、惡唑環(huán)，有的還含有烯鍵與炔鍵，這大大提高了肽的生物穩(wěn)定性及生物利用度。研究證實(shí)生物活性肽具有多種藥理活性，可用于預(yù)防和延緩衰老及衰老相關(guān)的多種疾病。因此，發(fā)掘海洋生物資源中具有抗氧化、延緩衰老、神經(jīng)保護(hù)作用的活性成分有助于促進(jìn)我國海洋資源的綜合開發(fā)與利用。

青口貝，屬雙殼類軟體動(dòng)物，中國北方俗稱為海虹，南方俗稱為青口。青口貝肉的干制品稱作淡菜，是馳名中外的海產(chǎn)食品之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)和藥食價(jià)值，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)59％，含8種人體必需的氨基酸，營養(yǎng)價(jià)值高于一般貝、魚、蝦、肉類等，具有補(bǔ)肝益腎、調(diào)經(jīng)活血的功效。明代醫(yī)家倪朱謨對(duì)其功效贊嘆“淡菜，補(bǔ)虛養(yǎng)腎之藥也”，是一味補(bǔ)腎填精的藥食兩用之物；《本草拾遺》記載道：“主虛羸勞損，因產(chǎn)瘦瘠，血?dú)饨Y(jié)積，腹冷、腸鳴、下痢，腰疼、帶下、疝瘕”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，貽貝多肽具有降血壓、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等方面的功效。

公開號(hào)為cn102952838a、發(fā)明名稱為“一種免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽的制備方法及其相應(yīng)片劑的制備方法”的中國專利公開了利用堿性蛋白酶和中性蛋白酶分別水解貽貝蛋白后，經(jīng)脫鹽、濃縮和噴霧干燥得免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽，制得的片劑用作老年人和體弱多病者的日常保健產(chǎn)品。公開號(hào)為cn103710414a、發(fā)明名稱為“貽貝寡肽的制備方法及其應(yīng)用”的中國專利公開了利用堿性冷提法提取貽貝蛋白，經(jīng)復(fù)合酶解和超濾后的貽貝寡肽，并以小鼠和果蠅模型驗(yàn)證其抗氧化和延衰的功效，應(yīng)用于制備抗氧化活性和延緩衰老作用的食品。然而堿性冷提法條件不夠溫和，會(huì)破壞蛋白的風(fēng)味和色澤，同時(shí)可能造成環(huán)境污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用的青口貝提取物及其制備方法與應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種青口貝提取物的制備方法，青口貝去殼取肉加水進(jìn)行組織勻漿，勻漿液離心取上清，過濾收集濾液。

其中，所述水的加入量為青口貝肉的3倍～10倍。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述青口貝提取物的制備方法中所述離心為5000g～15000g。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述青口貝提取物的制備方法中所述離心時(shí)間為10min～50min。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述青口貝提取物的制備方法中所述過濾為0.45μm孔徑的濾膜過濾。

在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述濾膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。

進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述青口貝提取物的制備方法還包括對(duì)濾液進(jìn)行濃縮、干燥的步驟。

優(yōu)選的，所述干燥為冷凍干燥。

本發(fā)明還提供了上述制備方法制得的青口貝提取物。

自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。因此，通過測(cè)定對(duì)自由基的清除率，可以反映以清除活性氧自由基為主的抗氧化能力。本發(fā)明所述青口貝提取物加入dpph溶液，于520nm波長下測(cè)定吸光度，以加入等體積水開始計(jì)時(shí)，于520nm波長下測(cè)定空白吸光度，計(jì)算dpph自由基清除率。結(jié)果顯示本發(fā)明所述青口貝提取物，能夠顯著地清除體外dpph自由基，且呈現(xiàn)出劑量依賴性的作用效果。

百草枯是一類電子受體，作用于細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)，在細(xì)胞內(nèi)活化為氧自由基是毒作用的基礎(chǔ)，所形成的過量超氧化陰離子自由基及過氧化氫(h2o2)等可引起多組織器官細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，從而造成多系統(tǒng)組織器官的損害。因此，抑制其對(duì)細(xì)胞的氧化損傷能夠有效緩解神經(jīng)毒性。本發(fā)明所述青口貝提取物分別加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中培養(yǎng)，加入百草枯對(duì)秀麗線蟲進(jìn)行氧化脅迫造模，定時(shí)統(tǒng)計(jì)秀麗線蟲存活的比率，檢測(cè)所述文蛤多肽對(duì)百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫的影響，結(jié)果顯示本發(fā)明所述青口貝提取物可以顯著延長秀麗線蟲的氧化脅迫存活率，提高秀麗線蟲耐氧化脅迫條件的能力，緩解機(jī)體因氧化脅迫而產(chǎn)生早衰的問題。

在秀麗線蟲體內(nèi)，幾乎所有與長壽相關(guān)的基因表達(dá)都與抵抗環(huán)境脅迫有關(guān)，例如氧化、缺氧、熱激、uv輻射和重金屬等脅迫條件。除抗氧化脅迫以外，對(duì)機(jī)體抗熱激脅迫的能力也指示著延緩衰老的作用。本發(fā)明將所述青口貝提取物加入到l1期的野生型秀麗線蟲幼蟲中培養(yǎng)后進(jìn)行反復(fù)熱激培養(yǎng)直到所有秀麗線蟲死亡，檢測(cè)所述青口貝提取物對(duì)熱激脅迫的影響。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述青口貝提取物能夠延長秀麗線蟲在熱激脅迫條件下的生存時(shí)間，提高存活率，具有抗熱激脅迫活性，緩解由熱激脅迫造成的細(xì)胞損傷。

本發(fā)明將所述青口貝提取物加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中培養(yǎng)后定時(shí)統(tǒng)計(jì)秀麗線蟲的存活情況，檢測(cè)所述青口貝提取物對(duì)秀麗線蟲壽命的影響。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述青口貝提取物能夠延長秀麗線蟲在自然條件下的存活時(shí)間，具有延緩衰老進(jìn)程的作用。

轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲ha759可以在ash神經(jīng)元中表達(dá)polyq蛋白。由于polyq蛋白是亨廷頓疾病中的關(guān)鍵致病蛋白，抑制其聚集可有效緩解神經(jīng)毒性。本發(fā)明將所述青口貝提取物加入l1期的轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲ha759幼蟲中，置于16℃培養(yǎng)36h后，于23℃再次培養(yǎng)36h后收集線蟲備用。將趨化板中間用30μl8m甘油劃一條直線，將平板分為a和b區(qū)。a區(qū)距邊緣0.5cm處點(diǎn)上2μl1m的nan3，同側(cè)距邊緣1cm處點(diǎn)上2μl0.5％的苯甲醛乙醇溶液。在b區(qū)距甘油1cm處的平行線上均勻標(biāo)記4個(gè)蟲液位點(diǎn)，板子放入23℃培養(yǎng)箱90min后取出，計(jì)算a區(qū)和b區(qū)線蟲條數(shù)，計(jì)算回避指數(shù)(avoidanceindex，ai)。結(jié)果顯示本發(fā)明所述青口貝提取物能夠提高秀麗線蟲ha759的避化率，有效的抑制蛋白質(zhì)的異常聚集，從而降低疾病蛋白的神經(jīng)毒性，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。

因此，本發(fā)明提供了所述青口貝提取物在制備抗氧化或神經(jīng)保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可將本發(fā)明所述青口貝提取物直接或間接加入制備不同劑型時(shí)所需的藥學(xué)上可接受的各種常用輔料，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑等，以常規(guī)藥物制劑方法，制成常用制劑如片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。其中，填充劑如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解劑如瓊脂，碳酸鈣，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸鹽和碳酸鈉，低取代羥丙基纖維素；潤滑劑如滑石粉，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，月桂硫酸鈉；粘合劑如羧甲基纖維素，藻酸鹽，明膠，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯膠。

本發(fā)明所述青口貝提取物還可以制備成抗氧化或神經(jīng)保護(hù)作用的保健品。

由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種青口貝提取物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述青口貝提取物的制備方法為青口貝去殼取肉加水進(jìn)行組織勻漿，勻漿液離心取上清，過濾收集濾液。本發(fā)明提供的制備方法，能夠充分利用青口貝豐富資源得到具有抗衰老和神經(jīng)保護(hù)作用的青口貝提取物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所述制備方法制得的青口貝提取物均具有很好的抗衰老和神經(jīng)保護(hù)作用，可以用于制備成抗衰老和神經(jīng)保護(hù)作用的藥物或者抗衰老和神經(jīng)保護(hù)作用的保健品，應(yīng)用范圍廣泛，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效應(yīng)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實(shí)施例4dpph自由基清除率實(shí)驗(yàn)中不同濃度的實(shí)施例1制備的青口貝提取物的dpph自由基清除率；

圖2示實(shí)施例5抗百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫實(shí)驗(yàn)中不同濃度的實(shí)施例1制備的青口貝提取物對(duì)秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；

圖3示實(shí)施例6抗熱激脅迫實(shí)驗(yàn)中不同濃度的實(shí)施例1制備的青口貝提取物對(duì)秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；

圖4示實(shí)施例7秀麗線蟲壽命實(shí)驗(yàn)中不同濃度的實(shí)施例1制備的青口貝提取物對(duì)秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；

圖5示實(shí)施例8秀麗線蟲避化實(shí)驗(yàn)中不同濃度的實(shí)施例1制備的青口貝提取物對(duì)秀麗線蟲的避化率。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)闡述。

實(shí)施例1、青口貝提取物的制備

以青口貝為材料，去殼取肉，清水洗凈后，以1:3的比例加入水，進(jìn)行組織勻漿，勻漿液經(jīng)4℃、5000g離心50min。取上清液，經(jīng)0.45μm孔徑的硝酸纖維素膜過濾，將濾液經(jīng)濃縮、冷凍干燥處理，獲得青口貝提取物干粉。

實(shí)施例2、青口貝提取物的制備

以青口貝為材料，去殼取肉，清水洗凈后，以1:10的比例加入水，進(jìn)行組織勻漿，勻漿液經(jīng)4℃、15000g離心10min。取上清液，經(jīng)0.45μm孔徑的尼龍膜過濾，將濾液經(jīng)濃縮、冷凍干燥處理，獲得青口貝提取物干粉。

實(shí)施例3、青口貝提取物的制備

以青口貝為材料，去殼取肉，清水洗凈后，以1:5的比例加入水，進(jìn)行組織勻漿，勻漿液經(jīng)4℃、10000g離心20min。取上清液，經(jīng)0.45μm孔徑的硝酸纖維素膜過濾，將濾液經(jīng)濃縮、冷凍干燥處理，獲得青口貝提取物干粉。

實(shí)施例4、dpph自由基清除率實(shí)驗(yàn)

將實(shí)施例1-3制備的青口貝提取物分別加水溶解配制成濃度為0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml的樣品溶液，對(duì)照組為等體積的水，分別依次加入dpph溶液，于520nm波長下測(cè)定吸光度，以加入等體積水開始計(jì)時(shí)，于520nm波長下測(cè)定空白吸光度，計(jì)算dpph自由基清除率。結(jié)果如圖1所示。

其中，dpph自由基清除率計(jì)算公式如下：

dpph自由基清除率(％)＝[1-(asample-a0sanple)/(acontrol-a0control)]×100％

式中，asample表示青口貝提取物組的吸光度值，acontrol表示對(duì)照組的吸光度值，a0sample表示青口貝提取物組的空白吸光度值，a0control表示對(duì)照組的空白吸光度值。自由基清除率以mean±sd表示，采用t檢驗(yàn)比較多肽組和對(duì)照組的差異性。

由圖1結(jié)果可見實(shí)施例1制備的青口貝提取物在0.125mg/ml～4mg/ml的濃度范圍內(nèi)，能夠顯著地清除體外dpph自由基，且呈現(xiàn)出劑量依賴性的作用效果。

實(shí)施例2的青口貝提取物和實(shí)施例3制備的青口貝提取物在0.125mg/ml～4mg/ml的濃度范圍內(nèi)，也均能夠顯著地清除體外dpph自由基，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。

實(shí)施例5、百草枯氧化脅迫實(shí)驗(yàn)

將實(shí)施例1-3制備的青口貝提取物以0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、和2mg/ml濃度，分別加至50mm百草枯造模的秀麗線蟲培養(yǎng)液中，同時(shí)設(shè)置：陽性對(duì)照組加以2mg/ml的gsh作為陽性受試物，空白對(duì)照組加以等體積的s.medium。各組置于20℃培養(yǎng)24h后，定時(shí)統(tǒng)計(jì)秀麗線蟲存活的比率，直至全部蟲子死亡。存活率以生存曲線表示，采用kaplan-meier法分析比較青口貝提取物組和空白對(duì)照組的差異性。結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果顯示實(shí)施例1制備的青口貝提取物在0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的濃度時(shí)能夠延長氧化脅迫條件下秀麗線蟲的生存時(shí)間，提高存活率。

而實(shí)施例2的青口貝提取物和實(shí)施例3制備的青口貝提取物在0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的濃度時(shí)也均能夠延長氧化脅迫條件下秀麗線蟲的生存時(shí)間，提高存活率。

表明本發(fā)明所述青口貝提取物能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現(xiàn)象。

實(shí)施例6、熱激存活試驗(yàn)

將實(shí)施例1-3制備的青口貝提取物以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml濃度分別加至l1期秀麗線蟲的培養(yǎng)基中，對(duì)照組加入等體積的s.medium，20℃條件下恒溫培養(yǎng)至成蟲期后，將蟲子轉(zhuǎn)移到之前準(zhǔn)備好的3cm的空白ngm培養(yǎng)板上，每個(gè)給藥濃度處理的秀麗線蟲轉(zhuǎn)至三個(gè)ngm培養(yǎng)板，每板約50條蟲子。將轉(zhuǎn)移好蟲子的培養(yǎng)板拿至37℃恒溫箱進(jìn)行熱激處理1h后取出，快速統(tǒng)計(jì)蟲子的死亡數(shù)目，然后每隔1h再熱激1h，持續(xù)統(tǒng)計(jì)秀麗線蟲存活率，直至所有線蟲全部死亡。結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果顯示實(shí)施例1制備的青口貝提取物在0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的濃度時(shí)能夠增加秀麗線蟲熱激條件下的存活時(shí)間。

而實(shí)施例2的青口貝提取物和實(shí)施例3制備的青口貝提取物在在0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的濃度時(shí)也均能夠增加秀麗線蟲熱激條件下的存活時(shí)間。表明青口貝提取物能夠緩解由于熱激造成的細(xì)胞損傷。

實(shí)施例7、壽命試驗(yàn)

將實(shí)施例1-3制備的青口貝提取物以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml分別飼喂成蟲初期的野生型秀麗線蟲，對(duì)照組加入等體積的s.medium，將培養(yǎng)板置于20℃進(jìn)行培養(yǎng)，以給藥的時(shí)間點(diǎn)記為壽命統(tǒng)計(jì)的第0天，之后每隔1天統(tǒng)計(jì)一次各組秀麗線蟲存活率，直至所有蟲子全部死亡。存活率以生存曲線表示，并采用kaplan-meier法分析比較青口貝提取物組和對(duì)照組的差異性。結(jié)果如圖4所示。

結(jié)果顯示實(shí)施例1制備的青口貝提取物以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的濃度給藥處理后，相較于對(duì)照組，各組顯著地能夠延長秀麗線蟲的平均壽命，且在改濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性。

而實(shí)施例2的青口貝提取物和實(shí)施例3制備的青口貝提取物以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的濃度給藥處理后，相較于對(duì)照組，各組均能夠顯著地延長秀麗線蟲的平均壽命，且在改濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性

表明本發(fā)明所述青口貝提取物具有延緩衰老進(jìn)程的作用。

實(shí)施例8、避化試驗(yàn)

將實(shí)施例1-3制備的青口貝提取物以0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml濃度分別加入l1期的轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲ha759幼蟲中，對(duì)照組加入等體積的smedium，置于16℃培養(yǎng)36h后，于23℃再次培養(yǎng)36h后收集線蟲備用。將趨化板中間用30μl8m甘油劃一條直線，將平板分為a和b區(qū)。a區(qū)距邊緣0.5cm處點(diǎn)上2μl1m的nan3，同側(cè)距邊緣1cm處點(diǎn)上2μl0.5％的苯甲醛乙醇溶液。在b區(qū)距甘油1cm處的平行線上均勻標(biāo)記4個(gè)蟲液位點(diǎn)，板子放入23℃培養(yǎng)箱90min后取出，計(jì)算a區(qū)和b區(qū)線蟲條數(shù)，并用公式計(jì)算回避指數(shù)(avoidanceindex，ai)。ai的統(tǒng)計(jì)結(jié)果以mean±sd表示，采用t檢驗(yàn)比較青口組和對(duì)照組的差異性。結(jié)果如圖5所示。

其中，回避指數(shù)的計(jì)算公式為：

ai＝(a區(qū)的線蟲數(shù)量-b區(qū)的線蟲數(shù)量)/線蟲總數(shù)量

結(jié)果顯示實(shí)施例1制備的青口貝提取物在1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml濃度時(shí)，均能夠提高秀麗線蟲ha759的避化率。

而實(shí)施例2的青口貝提取物和實(shí)施例3制備的青口貝提取物在1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml濃度時(shí)，也均能夠提高秀麗線蟲ha759的避化率。說明本發(fā)明所述青口貝提取物能夠有效的抑制蛋白質(zhì)的異常聚集，從而降低疾病蛋白的神經(jīng)毒性，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。