本發(fā)明屬于藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物及制備方法。
背景技術(shù)：
胡椒和蓽拔是回族藥學(xué)典籍中治療腦卒中方劑中出現(xiàn)頻率最高，用藥量較大的藥對(duì)。臨床醫(yī)學(xué)研究證明很多含有這個(gè)藥物組合的回藥方劑對(duì)腦卒中病人神經(jīng)功能損傷都有很好的治療作用。回藥腦卒中治療方劑特點(diǎn)是藥材種類(lèi)繁多，無(wú)明確的君臣佐使之分，這給回藥腦卒中方劑的現(xiàn)代化開(kāi)發(fā)利用帶來(lái)很大的困擾。文獻(xiàn)整理研究表明，胡椒和蓽拔藥物組合物可能是腦卒中方劑中的核心藥物(類(lèi)似于中藥中的君藥)。目前對(duì)這一理論的支撐研究鮮見(jiàn)。隨著現(xiàn)代藥學(xué)學(xué)科的快速發(fā)展，有了很多新的研究方法和手段，對(duì)腦卒中方劑中主要藥物的活性部位的確定非常有必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物及制備方法，旨在明確胡椒和蓽拔藥物組合物中發(fā)揮腦卒中治療作用的有效部位，提供有效部位的制備方法，同時(shí)確定此有效部位在200mg/kg的劑量下對(duì)永久性腦缺血大鼠神經(jīng)功能損傷有明顯的恢復(fù)作用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物的制備方法，所述基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物的制備方法包括：
按照質(zhì)量比1∶1取胡椒和蓽拔藥材，粉碎后采用二氧化碳超臨界設(shè)備萃取，萃取至不出油為止；
將萃取后剩余的藥渣加入多功能提取罐，乙醇回流提取3次；
將提取液過(guò)濾后濃縮至無(wú)醇味，加3倍量的二氯甲烷萃取3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成流浸膏后放入鼓風(fēng)干燥箱中烘干既得活性部位。
進(jìn)一步，所述萃取壓力：300bar；萃取溫度：55℃；分離釜壓力：80bar；分離溫度50℃。
進(jìn)一步，所述10倍量70％的乙醇回流提取3次，每次2h，提取加熱溫度為90℃。
本發(fā)明提供的基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物及制備方法，采用二氧化碳超臨界技術(shù)去除刺激性較大的極低極性的部位，同時(shí)通過(guò)二氯甲烷萃取使有效部位不包含糖及其他大極性雜質(zhì)。在小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)中，制備的活性部位在1.5g/kg的劑量下未發(fā)生動(dòng)物的死亡及其他毒性特征，降低了胡椒和蓽拔組合物自身的刺激性；除longa評(píng)分外，此活性部位對(duì)永久性腦缺血大鼠的其他神經(jīng)功能癥狀都有不同程度的改善。結(jié)果充分證實(shí)所制備的有效部位毒性較低且具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物的制備方法流程圖。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
本發(fā)明實(shí)施例的基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物按照質(zhì)量比包括：胡椒和蓽拔＝1∶1。
如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物 的制備方法包括以下步驟：
s101：按照質(zhì)量比1∶1取胡椒和蓽拔藥材，粉碎后采用二氧化碳超臨界設(shè)備萃取，萃取壓力：300bar；萃取溫度：55℃；分離釜壓力：80bar；分離溫度50℃；萃取至不出油為止；
s102：將萃取后剩余的藥渣加入多功能提取罐，加10倍量70％的乙醇回流提取3次，每次2h，提取加熱溫度為90℃；
s103：將提取液過(guò)濾后濃縮至無(wú)醇味，加3倍量的二氯甲烷萃取3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成流浸膏后放入鼓風(fēng)干燥箱中65℃烘干既得活性部位。
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細(xì)的說(shuō)明。
1通過(guò)以下的實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細(xì)的說(shuō)明
1.1永久性大鼠腦缺血模型(pmcao)的建立
大鼠采用7％水合氯醛(0.5ml/100g體重)麻醉后，仰臥固定。剪開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉，暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(cca)、頸外動(dòng)脈(eca)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ica)。結(jié)扎eca與cca近心端，用動(dòng)脈夾夾閉ica遠(yuǎn)心端，于eca與ica分叉處作一切口，緩慢插入頭部光滑的尼龍線(頭部直徑為0.26mm)，插入深度為17-18mm左右，實(shí)現(xiàn)右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。結(jié)扎切口處，剪掉血管外的尼龍線，逐層縫合肌肉皮膚。假手術(shù)組尼龍線插入深度為5mm，其余處理同模型組，動(dòng)物蘇醒前用37℃的保溫毯維持體溫，蘇醒后立即轉(zhuǎn)入室溫下飼養(yǎng)。
1.2動(dòng)物分組及剔除
待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清醒后，進(jìn)行l(wèi)onga神經(jīng)功能評(píng)分，神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：
a.無(wú)神經(jīng)功能損傷癥狀，動(dòng)物正常活動(dòng)評(píng)0分；
b.將動(dòng)物尾巴提起后，左前肢屈曲1分；
c.將動(dòng)物放置平板上，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈2分；
d.將動(dòng)物放置平板上，用手輕推向左側(cè)傾倒3分；
e.動(dòng)物左側(cè)偏癱，不能自發(fā)行走意識(shí)朦朧或喪失4分。
將評(píng)分為2的動(dòng)物納入實(shí)驗(yàn)，所有死亡以及術(shù)后存活時(shí)間未達(dá)到取材時(shí)間要求的大鼠，均不列入。將大鼠隨機(jī)分組為模型組，假手術(shù)組(每組10只大鼠)；腦缺血4h后給藥，1次/d，給藥14天。
1.3神經(jīng)功能評(píng)分
1.3.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分
分別于pmcao后3d、6d、9d、12d、14d，按照l(shuí)onga5級(jí)評(píng)分法對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)分。
1.3.2姿勢(shì)反射實(shí)驗(yàn)
分別于pmcao后3d、6d、9d、12d、14d，按照l(shuí)onga5級(jí)評(píng)分法對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)分。
o分：提鼠尾離開(kāi)地面約1m，觀察前肢屈曲情況，正常大鼠雙前肢對(duì)稱(chēng)伸向地面。
1分：如手術(shù)對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或既有腕、肘的屈曲又有肩內(nèi)旋者，與任何數(shù)量的一致的前肢屈曲并沒(méi)有其他異常大鼠。
2分：將動(dòng)物置于平地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動(dòng)，正?；蜉p度功能失調(diào)的老鼠在兩個(gè)方向上都不平等地滑動(dòng)。嚴(yán)重功能障礙的大鼠持續(xù)減少，側(cè)推向健側(cè)阻力。
3分：大鼠有不停地向左側(cè)轉(zhuǎn)圈者。
1.3.3身體擺動(dòng)測(cè)試
提升鼠尾距地面1m處，分別在第3d、6d、9d、12d和14d對(duì)其進(jìn)行評(píng)分。
評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：
0分：軀干左右搖擺；
1分：不對(duì)稱(chēng)搖擺＜30℃；
2分：不對(duì)稱(chēng)搖擺＞30℃；
1.3.4橫木行走試驗(yàn)
橫木長(zhǎng)120cm，寬2.0或2.5cm，距地面80cm水平懸空放置。橫木一端連接一個(gè)暗盒，以適當(dāng)噪音刺激大鼠通過(guò)橫木。術(shù)前訓(xùn)練7d，分別于pmcao后3d、6d、9d、12d、14d為觀察時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。
評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：
6分：順利通過(guò)；
5分：通過(guò)，但損傷的后肢滑落1次；
4分：滑落超過(guò)1次但不到總步數(shù)50％；
3分：滑落次數(shù)超過(guò)總步數(shù)50％；
2分：試圖通過(guò)橫木，但從橫木上摔下；
1分：能靜臥在橫木上但無(wú)法移動(dòng)；
0分：不能靜臥在橫木上，直接從橫木上摔下；
1.3.5前肢抓握力測(cè)試
抓握力量測(cè)試評(píng)價(jià)大鼠腦缺血后前肢抓握力量的大小。測(cè)試者提住鼠尾，將大鼠置于拉力儀測(cè)試區(qū)域。當(dāng)測(cè)試者拉住鼠尾向后拉拽大鼠時(shí)，大鼠試圖以前肢抓握橫桿不放以免從橫桿滑脫。繼續(xù)拖拽大鼠，直至大鼠滑脫，讀取使大鼠滑脫的最大拉力值。分別于pmcao后3d、6d、9d、12d、14d為觀察時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。
1.4統(tǒng)計(jì)方法
用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件one-wayanova法檢驗(yàn)，如果方差齊，采用lsd檢驗(yàn)，如果方差不齊，采用tamhane’st2檢驗(yàn)，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2數(shù)據(jù)支持
2.1急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)中，制備的有效部位在1.5g/kg的劑量下未發(fā)生動(dòng)物的死亡及其他毒性特征，可以認(rèn)為有效部位安全無(wú)毒。
2.2活性部位對(duì)pmcao大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用
除longa評(píng)分外，活性部位對(duì)永久性腦缺血大鼠的其他神經(jīng)功能癥狀都有不同程度的改善。結(jié)果充分證實(shí)所制備的活性部位且具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。
2.2.1longa評(píng)分實(shí)驗(yàn)
結(jié)果顯示，與模型組比較，活性部位組(200mg/kg)神經(jīng)功能評(píng)分在3-14天均未見(jiàn)明顯降低。
表1活性部位對(duì)pmcao大鼠longa評(píng)分的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05；(n模型＝12；n活性部位＝9)
2.2.2姿勢(shì)反射實(shí)驗(yàn)
結(jié)果顯示，與模型組比較，活性部位組(200mg/kg)姿勢(shì)反射評(píng)分在6，9，12天均明顯降低(p＜0.05；p＜0.01)。
表2活性部位對(duì)pmcao大鼠姿勢(shì)反射的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05(n模型＝12；n活性部位＝9)
2.2.3身體擺動(dòng)實(shí)驗(yàn)
結(jié)果顯示，與模型組比較，活性部位組(200mg/kg)身體擺動(dòng)評(píng)分在3，6，9，14天均明顯降低(p＜0.05；p＜0.01)。
表3活性部位對(duì)pmcao大鼠身體擺動(dòng)的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05；**p＜0.01(n模型＝12；n活性部位＝9)
2.2.4橫木行走實(shí)驗(yàn)
結(jié)果顯示，與模型組比較，活性部位組(200mg/kg)橫木行走評(píng)分在3， 6，9天均明顯升高(p＜0.05)。
表4活性部位對(duì)pmcao大鼠橫木行走的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05(n模型＝12；n活性部位＝9)
2.2.5抓力測(cè)試實(shí)驗(yàn)
結(jié)果顯示，與模型組比較，活性部位組(200mg/kg)抓力值在6，9天明顯高于模型組(p＜0.05；p＜0.01)。
表5活性部位對(duì)pmcao大鼠抓力的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05；**p＜0.01(n模型＝12；n活性部位＝9)
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。