本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及CaV2.1通道在Ca2+依賴性的局部缺血模型中的作用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞膜去極化的時，電壓門控Ca²⁺(Ca_V)通道允許Ca²⁺進入到細(xì)胞內(nèi)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Ca_V通道在不同神經(jīng)元功能的調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要的作用歸因于細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度的升高^[1]。Ca_V通道是一種復(fù)雜的分子復(fù)合物，由α1，β，α2-δ和γ亞基組成^[2]。α1亞基對于進行適當(dāng)?shù)耐ǖ拦δ芎痛_定信道的基本特性是必不可少的^[1]。在突觸前終端，有三大Ca_V2通道類型，Ca_V2.1(P/Q型)，Ca_V2.2(N型)和Ca_V2.3(R型)，這三種類型廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)^[3]和參與Ca²⁺依賴的胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)^[4]。鑒于Ca_V2通道的關(guān)鍵作用在于控制特定神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，突觸前Ca_V2通道的表達、定位、結(jié)構(gòu)或調(diào)制發(fā)生缺陷都可能會導(dǎo)致異常的突觸信號和導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能障礙的各種模式。

Ca²⁺濃度的增加在缺血性神經(jīng)元損傷的發(fā)病機理中扮演著重要的角色^[5-8]，缺血時，Ca²⁺濃度通過細(xì)胞外空間Ca²⁺的內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)存儲Ca²⁺的釋放而升高^[9]。Ca_V2通道作為重要的Ca²⁺內(nèi)流路線，他們參與缺血性神經(jīng)元損傷的病理生理學(xué)是至關(guān)重要的。

檢測Ca_V2.1通道的功能和Ca_V2.1通道的疾病過程，小鼠遺傳學(xué)的研究可能是有用的。小鼠Cacna1a基因發(fā)生突變可編碼出Ca_V2.1通道成孔的α1單元，突變包括以Ca_V2.1電流缺乏的基因敲除菌株和包涵表現(xiàn)共濟失調(diào)現(xiàn)象為常見癥狀的自發(fā)突變^[10-12]。RollingNagoya小鼠在電壓測量S4段第三重復(fù)突變^[13]，leaner小鼠在剪接供體序列上發(fā)生突變，從而改變C-末端序列^[14]。Ca_V2.1通道的rollingNagoya型突變激活時有一個更低的電壓靈敏度，導(dǎo)致小腦受損突觸的傳遞^[15]。Ca_V2.1通道的leaner型突變導(dǎo)致了小腦中通道的低密度表達^[16]。以往的研究也表明，leaner突變型（60%）小鼠的浦肯野細(xì)胞中P型Ca²⁺電流的下降量比rollingNagoya（40%）突變型小鼠的要大^[13,16]。應(yīng)用Ca_V2.1通道α1亞基(Ca_V2.1α1)基因敲除小鼠來檢測Ca_V2.1通道和缺血性神經(jīng)損傷兩者之間的關(guān)系是不可能的，因為大多數(shù)的小鼠斷奶不生存。盡管rollingNagoya和leaner兩種突變型小鼠表現(xiàn)出正常的壽命，但是它們共濟失調(diào)的嚴(yán)重程度顯著不同，leaner突變小鼠要更嚴(yán)重些。由于Ca²⁺信號的精確調(diào)節(jié)對于神經(jīng)細(xì)胞突起是非常重要的，通過不同的Ca_V2.1通道突變體改變Ca²⁺離子流能夠引起神經(jīng)元和電路不同的功能障礙。因此，通過rollingNagoya，leaner小鼠和野生型小鼠的比較，可以闡明Ca_V2.1通道在缺血性神經(jīng)元損傷中的生理作用。

在本研究中，我們建立了一個大腦中動脈完全阻塞的體內(nèi)缺血模型和一個在海馬切片上氧-葡萄糖剝奪的體外缺血模型來研究Ca_V2.1通道在缺血性神經(jīng)元損傷中的作用，這些模型都是采用rollingNagoya和leaner小鼠來建立的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

細(xì)胞死亡和腦損傷導(dǎo)致局部缺血的主要原因是由Ca²⁺離子調(diào)節(jié)異常引起的。神經(jīng)元細(xì)胞膜的去極化導(dǎo)致電壓門Ca²⁺控通道的激活和Ca²⁺的內(nèi)流。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Ca_V通道在不同神經(jīng)元功能的調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要的作用歸因于細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度的升高。Ca_V通道是一種復(fù)雜的分子復(fù)合物，由α1，β，α2-δ和γ亞基組成^[2]。α1亞基對于進行適當(dāng)?shù)耐ǖ拦δ芎痛_定信道的基本特性是必不可少的。鑒于Ca_V2通道的關(guān)鍵作用在于控制特定神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，突觸前Ca_V2通道的表達、定位、結(jié)構(gòu)或調(diào)制發(fā)生缺陷都可能會導(dǎo)致異常的突觸信號和導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能障礙的各種模式。Ca²⁺濃度的增加在缺血性神經(jīng)元損傷的發(fā)病機理中扮演著重要的角色。Ca_V2通道作為重要的Ca²⁺內(nèi)流路線，他們參與缺血性神經(jīng)元損傷的病理生理學(xué)是至關(guān)重要的。檢測Ca_V2.1通道的功能和Ca_V2.1通道的疾病過程，小鼠遺傳學(xué)的研究可能是有用的。

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明第一方面提供Cav2.1α1mRNA的表達模式。

Cav2.1α1mRNA在野生型小鼠（n=6）、rollingNagoya和（n=5）和leanermice（n=5）在三種小鼠體內(nèi)分布都一樣（數(shù)據(jù)未顯示）。利用反義探針檢測到α1亞基在這三種小鼠大腦內(nèi)部都有一個廣泛的表達，尤其是在嗅球神經(jīng)元細(xì)胞，大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞，海馬神經(jīng)元細(xì)胞和小腦神經(jīng)元細(xì)胞中有強烈的表達。但是使用正義探針之后未檢測到任何的信號。用real-timeqRT-PCR來檢測CaV2.1α1mRNA在這三種小鼠中的嗅球、大腦皮層、尾狀殼核、海馬、小腦以及肝臟中的表達水平，總CaV2.1α1的相對表達水平并未有明顯的不同，肝臟部分未檢測到任何的PCR產(chǎn)物（數(shù)據(jù)未顯示）。

本發(fā)明第二方面提供CaV2.1α1基因突變小鼠在體內(nèi)缺血模型中梗死體積的降低。

對野生型小鼠（n=12），rollingNagoya（n=11）以及l(fā)eanermice（n=12）進行大腦中動脈阻塞處理，三種小鼠中的梗死區(qū)域有明顯不同。梗死區(qū)域在rollingNagoya中占大腦的總體積的比例為27.1±3.5%，leanermice中的比例為20.2±3.5%，野生型小鼠為42.9±4.5%。

本發(fā)明第三方面提供CaV2.1α1基因突變小鼠在體外缺血模型中[Ca2+]i的降低。

用海馬切片來檢測OGD處理后[Ca²⁺]i的變化，OGD處理后能使局部缺血。Ca_V2.1通道在海馬區(qū)域內(nèi)的表達十分強烈。在OGD處理前，在這三種小鼠中CA1區(qū)的錐體細(xì)胞層的基礎(chǔ)比率并未有明顯的區(qū)別（野生型：0.847±0.011；rollingNagoya：0.827±0.022；leanermice：0.803±0.013）。一旦OGD開始處理后，[Ca²⁺]i出現(xiàn)遞增，處理后的4min內(nèi)，野生型小鼠的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩組的小鼠。

綜上所述，本發(fā)明發(fā)明人證實了CaV2.1通道在Ca2+依賴性的局部缺血模型中的作用具

有實際應(yīng)用價值。

附圖說明：

圖1：腦梗死的評價（A）大腦中動脈阻塞處理后的一系列的腦區(qū)域。分別用TTC處理后的野生型小鼠（左），rollingNagoya（中），leanermice（右）。（B）和對照組相比，野生型小鼠（n=12），rollingNagoya（n=11）以及輕瘦型小鼠（n=12）中對梗死區(qū)域體積的統(tǒng)計。

圖2：海馬切片經(jīng)OGD誘導(dǎo)后[Ca²⁺]i增加的剖面圖。經(jīng)OGD處理后，取自野生型小鼠(n=14,closedsquare)，rollingNagoya(n=14,opencircle)，leanermice的(n=14,opentriangle)的海馬CA1區(qū)域的錐體細(xì)胞層的標(biāo)準(zhǔn)化曲線隨著時間的變化而變化。標(biāo)準(zhǔn)化曲線的數(shù)據(jù)是從OGD處理前5min開始搜集，到OGD處理結(jié)束后7min。水平黑色標(biāo)線指OGD處理組。

圖3：缺血環(huán)境下Ca_V2.1通道突變體介導(dǎo)的神經(jīng)保護作用機制。Ca_V2.1通道的重要性和鈣離子內(nèi)流與調(diào)節(jié)谷氨酸釋放一致。[Ca²⁺]i的升高在缺血性腦損傷的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。在局部缺血中，不同的Ca_V2.1通道突變體影響著不同的鈣離子電流以及谷氨酸的釋放，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。

具體實施方式：

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的原位雜交、實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、MCA閉塞、心肌梗死面積的評價、氧-葡萄糖剝奪海馬切片的Ca2+成像和統(tǒng)計分析方法及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

各實施例中所使用的所有的動物程序由上海交通大學(xué)和RIKEN動物實驗委員會批準(zhǔn)，并依照實驗室動物使用要求進行實驗。rollingNagoya小鼠由RIKEN生物資源中心提供，是C57BL/6J的第14代雜交小鼠。Leaner的小鼠由Jackson實驗室提供，具有C57BL/6J的遺傳背景。這些小鼠被免費獲得物顆粒和水，飼養(yǎng)溫度為23±1℃，濕度為55±5%，光暗周期為12/12-h（開燈時間為8：00到20:00）。所有的分析都是由一個不知道小鼠基因型，訓(xùn)練有素的實驗者來做。

原位雜交

用于原位雜交的16周齡雄性小鼠大腦的包埋蠟塊和石蠟切片是從Genostaff有限公司（日本東京）獲得的。對小鼠進行灌注，然后解剖取出大腦，用組織固定液（Genostaff）對其進行固定，然后根據(jù)專有程序進行石蠟包埋，最后進行切片，切片厚度為6um。雜交協(xié)議按照之前報道的那樣進行實施^[17]。我們設(shè)計了一個含有691個堿基片段的探針，從位置6068到6748的Ca_V2.1α1亞基CDNA，用地高辛標(biāo)記的RNA標(biāo)記試劑盒（德國，Mannhein，羅氏診斷）進行示蹤。用NBT/BCIP染色液（美國Sigma）進行著色反應(yīng)，過夜，然后用PBS洗。切片，kernechtrot染色液復(fù)染和安裝CC/安裝（診斷生物系統(tǒng)公司，普萊森頓，CA，USA）。

實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

從嗅球，大腦皮層，尾狀核，海馬體，小腦和16周雄性小鼠的肝中根據(jù)制造商的協(xié)議(美國表達載體,卡爾斯巴德,CA)使用試劑盒提取出總的RNA。使用ABI7700序列檢測系統(tǒng)，采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)量化感興趣基因的表達水平[18]。確定野生型和CaV2.1α1突變體基因表達的總量，我們所使用的引物是CT1F (5’-CTGCGCTA CTTCGAGAT GTG-3’) 和CT1R (5’-AACATAGTCA AAATATCGCAG CAC-3’), 所使用的探針是MT-prob e1 (5’-ATCCTCATGG TCATTGCCA TGAGCAG-CATCGCTCTGGCCGCCGA GGACCCGGTGC AGCCCAACGCACCCC-3’)。為了確定等效荷載，每個樣本中的18s核糖體RNA的量使用標(biāo)準(zhǔn)的引物和TaqMan探針測定。所有的樣本都進行了重復(fù)的分析，用平均值來表示基因表達的相對量化。野生型小鼠中mRNA的表達水平的計算與Ca_V2.1α1mRNA的表達水平是相關(guān)的。

MCA閉塞

MCA閉塞導(dǎo)致的體內(nèi)缺血的方法正如前邊所描述的一樣^[19]。用異氟烷對16周齡的雄性小鼠進行麻醉，使用一個水套加熱墊來使小鼠的體溫保持在(36±0.5攝氏度)。切開皮膚，將左側(cè)枕葉，甲狀腺上動脈，外頸動脈的分支和翼腭動脈暴露出來，電凝然后切開。用微型夾將頸總動脈結(jié)扎后，結(jié)扎并凝固左頸外動脈，切斷遠(yuǎn)端腦甲狀腺動脈。將一條21mm的單絲尼龍線（5–0，哈佛儀器，霍利斯頓，MA，USA；熱的直徑圓尖：0.2–0.3mm）插入到ECA中，輕輕地通過頸內(nèi)動脈，直至其尖端閉塞MCA的起源?？p線的位置如果正確，到左側(cè)大腦中動脈區(qū)域局部腦血流量就會突然下降，我們可以用激光多普勒血流儀來監(jiān)測10–15%的基本流動監(jiān)測。成功閉塞后，結(jié)扎固定到位，用手術(shù)夾閉合皮膚切口。

心肌梗死面積的評價

大腦中動脈閉塞24小時后，給小鼠注射過量的戊巴比妥鈉進行麻醉處死。取出大腦，然后用振動切片機（1000S，徠卡軟體系統(tǒng)，韋茨拉爾，德國）連續(xù)切為5冠切片（厚1mm）。這些部分浸泡在含有1%2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）的生理鹽水中，然后在37℃的環(huán)境下孵育30min。梗死圖像和整個對側(cè)大腦半球均采用數(shù)碼相機拍攝區(qū)域測量則使用圖像軟件（WinRoof版本5.7，山谷公司，東京，日本）。減去面積非梗死側(cè)大腦半球?qū)?cè)組織測定心肌梗死面積。梗死體積百分比通過將梗死面積的總和除以如前面所述的總對側(cè)半球求得^[20]。

氧-葡萄糖剝奪海馬切片的Ca2+成像

體外缺血被誘導(dǎo)正如前邊描述的^[21]。海馬腦片（350μm）是由5周齡的雄性小鼠用振動切片機（1000S，徠卡軟體系統(tǒng)）放在冰冷的人工腦脊液（ACSF）制作出來的。ACSF是由137mM的NaCl，2.5mMKCl，21mMNaHCO₃，0.58mMNaH₂PO₄，2.5mMCaCl₂,1.2mMMgCl₂和10mM的葡萄糖以及PH為7.4在飽和狀態(tài)下的95%O₂/5%CO₂。孵育2小時后，用Ca²⁺熒光指示劑Fura-PE3/AM和0.01%聚氧乙烯蓖麻油在37℃對切片進行染色45min。然后將切片徹底清洗30分鐘，以除去額外的細(xì)胞染料。35℃時，在熒光倒置顯微鏡階段對腦片進行灌流（4ml/min），并分別在340和380的波長下每分鐘對熒光信號進行捕捉。從CA1椎體細(xì)胞層兩個不同的區(qū)域?qū)a²⁺濃度在CA1區(qū)熒光比率的平均值進行估計（比=F340/F380）。應(yīng)用OGD，用95%N₂/5%CO₂使ACSF飽和，并用2-脫氧葡萄糖取代葡萄糖。規(guī)范OGD時Ca²⁺濃度的非時間性增加，標(biāo)準(zhǔn)化率等于基線比除以每一個得到的比例（應(yīng)用OGD前五個值的平均值）。然后在3分鐘的時間間隔使用運算箱計算標(biāo)準(zhǔn)比率上升的最大速率。

統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)是標(biāo)準(zhǔn)誤差的平均值，使用Excel2006對行為的統(tǒng)計分析和免疫細(xì)胞化學(xué)研究進行統(tǒng)計，采用重復(fù)測量的方差分析對數(shù)據(jù)進行分析，然后Tukey事后測試。

實施例1

Cav2.1α1mRNA的表達模式

我們用原位雜交的方法來評估Cav2.1α1mRNA在野生型小鼠（n=6）、rollingNagoya（n=5）和leanermice（n=5）的分布；在三種小鼠體內(nèi)分布都一樣（數(shù)據(jù)未顯示）。我們利用反義探針檢測到α1亞基在這三種小鼠大腦內(nèi)部都有一個廣泛的表達，尤其是在嗅球神經(jīng)元細(xì)胞，大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞，海馬神經(jīng)元細(xì)胞和小腦神經(jīng)元細(xì)胞中有強烈的表達。但是使用正義探針之后未檢測到任何的信號。我們用real-timeqRT-PCR來檢測CaV2.1α1mRNA在這三種小鼠中的嗅球、大腦皮層、尾狀殼核、海馬、小腦以及肝臟中的表達水平。在這三種小鼠的嗅球、大腦皮層、尾狀殼核、海馬、小腦中，總CaV2.1α1的相對表達水平并未有明顯的不同，（野生型小鼠，rolling Nagoya和leaner mice在嗅球中的值分別是1.01 ± 0.04, 1.03 ± 0.06, 1.04 ± 0.07，F(xiàn)(2,27) = 0.153, p > 0.05；大腦皮層分別為1.03 ± 0.01, 1.03 ± 0.04,1.04 ± 0.08，F(xiàn)(2,27) = 0.173, p > 0.05；尾狀殼殼中分別為1.02 ± 0.05, 1.03 ± 0.03, 1.04 ± 0.04, F(2,27) = 0.145, p > 0.05；海馬中分別為1.02 ± 0.01, 1.05 ± 0.08,and 1.02 ± 0.07，F(xiàn)(2,27) = 0.166, p > 0.05；小腦中分別為1.02 ± 0.02,1.03 ± 0.03, and 1.06 ± 0.03, F(2,27) = 0.182,p > 0.05）。而在三種小鼠的肝臟部分未檢測到任何的PCR產(chǎn)物（數(shù)據(jù)未顯示）。

實施例2

CaV2.1α1基因突變小鼠在體內(nèi)缺血模型中梗死體積的降低

對野生型小鼠（n=12），rollingNagoya（n=11）以及l(fā)eanermice（n=12）進行大腦中動脈阻塞處理。我們從顏色上來辨別腦梗死，為白色未染色區(qū)域，周邊是紅色活體組織。Fig.1A是一組具有代表性的實驗結(jié)果，它是梗死部分用TTC永久閉塞之后染色24h所得到的結(jié)果。經(jīng)大腦中動脈阻塞處理后，在這三種小鼠中的梗死區(qū)域有明顯不同。梗死區(qū)域在rollingNagoya中占大腦的總體積的比例為27.1±3.5%，leanermice中的比例為20.2±3.5%，野生型小鼠為42.9±4.5%。

實施例3

CaV2.1α1基因突變小鼠在體外缺血模型中[Ca²⁺]i的降低

為了調(diào)查在突變型小鼠中梗死體積的降低是否和神經(jīng)元鈣離子型號通路有關(guān)，我們用海馬切片來檢測OGD處理后[Ca²⁺]i的變化，OGD處理后能使局部缺血。Ca_V2.1通道在海馬區(qū)域內(nèi)的表達十分強烈。在OGD處理前，在這三種小鼠中CA1區(qū)的錐體細(xì)胞層的基礎(chǔ)比率并未有明顯的區(qū)別（野生型：0.847±0.011；rollingNagoya：0.827±0.022；leanermice：0.803±0.013）。一旦OGD開始處理后，[Ca²⁺]i出現(xiàn)遞增，處理后的4min內(nèi)，野生型小鼠的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩組的小鼠。在這三種小鼠中增加的最大比率也都是不同的。rollingNagoya中的增加速率為0.083±0.007/min(p<0.01)，leanermice為0.062±0.006/min(p<0.01)，野生型小鼠為0.105±0.008/min。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。