本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種生物誘導(dǎo)型人工硬腦膜及其制備方法。

背景技術(shù)：

硬腦膜是一層緊貼在顱骨內(nèi)側(cè)和腦組織之間的堅(jiān)硬膜性組織，由膠原纖維網(wǎng)和纏繞其中的成纖維細(xì)胞所組成，緊貼顱骨內(nèi)側(cè)，主要作用是保護(hù)大腦。當(dāng)人患顱內(nèi)腫瘤，硬腦膜組織容易受到侵蝕破壞；此外，因手術(shù)、外傷等原因也可能造成硬膜缺損。硬腦膜缺損可引起腦醫(yī)源性損傷、腦脊液滲漏、顱內(nèi)感染、繼發(fā)性癲癇等一系列并發(fā)癥。為預(yù)防腦、脊髓與周圍組織發(fā)生粘連，防治腦脊液漏和感染，并為神經(jīng)組織提供容納和保護(hù)作用，必須進(jìn)行及時有效的硬膜修補(bǔ)術(shù)。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，有10％—30％的腦外科手術(shù)都需要實(shí)施硬腦膜修補(bǔ)。

目前臨床上應(yīng)用的腦膜替代材料有三類:自體組織修補(bǔ)材料、異種生物材料和人工合成材料。自體組織修補(bǔ)材料雖然免疫反應(yīng)低，但屬于“以傷治傷”，造成患者的二次痛苦。異種生物材料具有良好的生物相容性，國內(nèi)臨床上常使用牛心包、羊心包、牛腹膜、豬腹膜、腸系膜以及牛跟腱膠原等，人工合成材料包括膨體聚四氟乙烯(ePTFE)和聚已內(nèi)酯納米纖維等，大量調(diào)查資料表明這些已有的硬腦膜材料存在排斥反應(yīng)，腦膜粘連，腦脊液滲漏，不可降解或降解速度過慢，降解產(chǎn)物有一定毒性，原材料來源有限，以及手術(shù)過程中不便于操作等其它缺陷。

大量研究資料表明，理想的硬腦膜修補(bǔ)材料需具備以下特點(diǎn)：(1)原料來源豐富，價(jià)廉易得，工藝簡單；(2)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無急性炎性反應(yīng)，不發(fā)生腦膜-腦粘連；(3)組織相容性好，無毒副作用，無免疫反應(yīng)；(4)安全，無致癌致畸作用，不傳播病毒；(5)合適的物理機(jī)械性能；(6)致密無滲漏；(7)合適的生物降解性(8)貯運(yùn)方便；(9)術(shù)前準(zhǔn)備及操作方便；(10)經(jīng)濟(jì)適用，價(jià)格適中等。

人體真皮組織的主要成分包括成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞成分和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、膠原等非細(xì)胞成分等。皮膚移植中，主要是細(xì)胞免疫引起的排斥，當(dāng)除去了具有較強(qiáng)免疫原性的細(xì)胞成分之后，脫細(xì)胞真皮(ADM)只留有很低的抗原性,而同種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)則幾乎不會引起宿主的排異反應(yīng),在宿主體內(nèi)可以長期存留，最終材料被正常組織吸收、改建。脫細(xì)胞真皮(ADM)的細(xì)胞成分及Ⅰ、Ⅱ型細(xì)胞相容性抗原已經(jīng)被完全清除掉,因而免疫活性很低,故而它不會誘發(fā)針對異體組織移植所產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng),也不會誘發(fā)非特異性異物反應(yīng)。這樣，既消除了應(yīng)用其它同種異體材料時可見的免疫反應(yīng)，又因?yàn)榉肿映⒔Y(jié)構(gòu)的存在成為一個模板，誘導(dǎo)組織內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞再生形成新的腦膜，并且有較長的保存期。Warren等用無細(xì)胞(人)真皮修補(bǔ)硬腦膜缺損200例，傷口感染率為2％，與未應(yīng)用或自體移植物的病人之間沒有明顯差異。無細(xì)胞人體真皮已經(jīng)在牙周病和整形重建外科中使用超過5.5萬例，到目前為止尚無傳遞疾病的報(bào)道。但這種材料是皮膚的衍生物，天然皮膚存在毛孔、汗腺、血管以及膠原纖維間隙等，存在天然的孔隙結(jié)構(gòu)，某些制品孔隙較大，可 能導(dǎo)致腦脊液滲漏。

總而言之，目前的硬腦膜修補(bǔ)材料中，絲素蛋白膜在制作工藝上仍有待進(jìn)一步改進(jìn)；羊膜在取材方法與交聯(lián)劑的選擇方面值得進(jìn)一步探究；高分子聚合材料的生物學(xué)毒性及理化性能也有待長期試驗(yàn)的確證；細(xì)菌纖維素膜在硬腦膜領(lǐng)域的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道；現(xiàn)有的膠原膜、膠原海綿等還存在降解速度不容易控制等問題，以致材料降解后新腦膜還未形成、材料較硬、容易破碎，縫合時容易撕裂，引起腦脊液滲漏。因此，新材料與新技術(shù)的各種優(yōu)點(diǎn)相互融合，制備具有誘導(dǎo)組織再生功能的新型硬腦膜替代材料將成為開發(fā)和應(yīng)用的必然趨勢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有各類硬腦膜修復(fù)材料存在的問題，從目標(biāo)材料的原料選擇、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)入手，綜合運(yùn)用系統(tǒng)工程、、再生醫(yī)學(xué)、仿生學(xué)和生物設(shè)計(jì)(Bio-Design)的原理和方法，提供一種具有誘導(dǎo)組織再生功能的膠原基復(fù)合硬腦膜；該方法制備的膠原基人工硬腦膜兼具膠原的優(yōu)異的生物相容性和脫細(xì)胞豬真皮良好的力學(xué)性能。且具備合適的孔隙結(jié)構(gòu)，能有效防止腦黏粘，能夠承受較高的顱內(nèi)高壓，促進(jìn)硬膜化進(jìn)程，可在腦部組織愈合的過程中可控降解，并可任意裁剪成所需形狀，存儲方便，臨床應(yīng)用操作簡便易行。產(chǎn)品具有良好的抗張強(qiáng)度和力學(xué)性能，可使用圓形針進(jìn)行無明顯損傷的縫合；在干態(tài)下可裁剪成任意所需形狀，在使用之前易水化。比起其他硬腦膜材料，它有更好的撕裂強(qiáng)度和操縱特性，因此在手術(shù)操作過程中，能很好的適應(yīng)濕法處理和鉗操縱過程。

本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述硬腦膜的方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

一種基于表面封閉處理技術(shù)的工藝穩(wěn)定的膠原基復(fù)合結(jié)構(gòu)的人工硬腦膜。設(shè)計(jì)目標(biāo)材料由雙層結(jié)構(gòu)組成：以脫細(xì)胞豬真皮支架為基底，將生物相容性優(yōu)良的復(fù)合膠均勻涂敷其上，形成有效防止腦脊液滲漏的薄膜。膠原纖維支架既保留了天然基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，又最大程度的保留了其發(fā)揮生物誘導(dǎo)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)——三股螺旋結(jié)構(gòu)，保證了生物活性。該方法制備的膠原基人工硬腦膜兼具膠原的優(yōu)異的生物相容性和脫細(xì)胞豬真皮良好的力學(xué)性能。

(1)脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)的制備：將生態(tài)豬皮剖層，采用消毒、表面清洗等技術(shù)去除原材料熱源；使用平平加、乙醇等試劑進(jìn)行脫脂處理；采用復(fù)合酶脫細(xì)胞工藝和曲拉通100清洗工藝相結(jié)合的方法，去除細(xì)胞成分；使用酸堿結(jié)合法進(jìn)一步對所得脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)進(jìn)行去除熱源處理；凍干備用；

(2)聚乙二醇和丙三醇進(jìn)行共聚交聯(lián)反應(yīng)得到一種復(fù)合膠。采用水平流涎和水平噴涂等方法將其涂敷在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)上，控制壓力、噴涂距離、噴涂速率等工藝參數(shù)，使涂層均勻分布，通過室溫晾干，恒溫干燥固化，即可在脫細(xì)胞豬真皮表面形成一層均勻的封閉膜，得到可有效防止腦脊液滲漏的膠原基復(fù)合硬腦膜

(3)配制洗脫液，將上述所得膠原基復(fù)合膜層，通過去離子水，去離子水與乙醇的互配物浸泡洗滌，以去除殘留物質(zhì)，再經(jīng)冷凍干燥成型，即得可有效防止腦脊液滲漏的雙層復(fù)合結(jié)構(gòu)之膠原基硬腦膜；

(4)通過上述方法制備的膠原基硬腦膜經(jīng)過滅菌、包裝后儲存；

所述步驟(1)中的膠原基硬腦膜的制備方法，其特征在于所述的采用過氧化氫滅活病毒，該步驟在恒溫超聲波清洗器或其他可震蕩的設(shè)備中進(jìn)行，其中過氧化氫的質(zhì)量濃度為0.05-3.0％，滅活時間為1h-3h，溫度范圍為10-40℃。

所述步驟(1)中的膠原基硬腦膜的制備方法，其特征在于所述的采用過氧化氫滅活病毒，該步驟在恒溫超聲波清洗器或其他可震蕩的設(shè)備中進(jìn)行，其中過氧化氫的質(zhì)量濃度為0.05-3.0％，滅活時間為1h-3h，溫度范圍為10-40℃。

所述步驟(1)中采用生物酶脫細(xì)胞工藝和Triton-100清洗工藝相結(jié)合的方法，去除細(xì)胞成分。其中生物酶的質(zhì)量濃度為0.01％-5％，Triton-100的質(zhì)量濃度為0.25-5％。

所述步驟(1)中使用酸堿結(jié)合法對所得脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)進(jìn)行去除熱源處理。其中使用的酸為鹽酸，堿為氫氧化鈉。

所述步驟(4)中的滅菌方式為低溫環(huán)氧乙烷滅菌，或采用鈷-60進(jìn)行輻照滅菌，滅菌劑量為25～50kGy；

采用上述方法制備得到的具有復(fù)合結(jié)構(gòu)的膠原基硬腦膜，其關(guān)鍵性能符合以下要求：

1.外觀：膠原基硬腦膜應(yīng)為白色薄片狀，干態(tài)具有一定硬度，濕態(tài)柔順、不易破裂。

2.尺寸：膠原基硬腦膜長度和寬度分別為25mm-100mm，厚度0.3～0.7mm。

3.吸收力：每克試樣的液體吸收量應(yīng)不小于3g。

4.抗?fàn)坷瓘?qiáng)度：持續(xù)15S施加10N拉力時不斷裂。

5.縫合強(qiáng)度：耐縫性不小于0.3N/mm。

6.灰分：灰分應(yīng)小于2％。

7.重金屬：重金屬含量≤10μg/g(m/m)

8.水分：水分含量≤10％。

9.酸堿度：膠原基硬腦膜檢驗(yàn)液與空白對照液的PH值之差應(yīng)不超過1.0。

10.無菌：產(chǎn)品應(yīng)無菌。

11.細(xì)菌內(nèi)毒素含量：細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于20EU/套。

12.細(xì)胞毒性：細(xì)胞毒性應(yīng)不大于1級。

13.遲發(fā)型超敏反應(yīng)：產(chǎn)品應(yīng)無遲發(fā)型超敏反應(yīng)。

14.AMES試驗(yàn)：結(jié)果應(yīng)為陰性。

15.小鼠淋巴瘤試驗(yàn)：結(jié)果應(yīng)為陰性。

16.染色體畸變試驗(yàn)：結(jié)果應(yīng)為陰性。

17.植入：皮下植入60天，顯微鏡下植入部位可見少量巨噬細(xì)胞和淋

巴細(xì)胞浸潤，可見膠原纖維和纖維細(xì)胞，未見異常反應(yīng)。皮下植入120天，組織相容性良好，樣品全部被吸收。

18.降解：皮下植入120天，樣品應(yīng)完全被降解吸收。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)和效果：

1.綜合運(yùn)用系統(tǒng)工程、再生醫(yī)學(xué)、仿生學(xué)和生物設(shè)計(jì)(Bio-Design)的原理和方法；

2.產(chǎn)品具有良好的抗張強(qiáng)度和力學(xué)性能，可使用圓形針進(jìn)行無明顯損傷的縫合；在干態(tài)下可裁剪成任意所需形狀，在使用之前易水化。比起其他硬腦膜材料，它有更好的撕裂強(qiáng)度和操縱特性，因此在手術(shù)操作過程中，能很好的適應(yīng)濕法處理和鉗操縱過程；

3.在制備技術(shù)上，利用固定化酶純化技術(shù)與Triton-100清洗工藝和酸堿法相結(jié)合的技術(shù)體系，制備清除抗原物質(zhì)和去除熱原的硬腦膜基質(zhì)材料—脫細(xì)胞豬皮膠原纖維；

4.在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上，本項(xiàng)目所制備的膠原基硬腦膜，面向大腦皮層一面為具有優(yōu)良生物相容性的聚乙二醇-丙三醇交聯(lián)共聚復(fù)合膠原液形成的膠原復(fù)合膠封閉膜，能有效防止黏粘效應(yīng)，同時背向大腦皮層一面為脫細(xì)胞豬真皮或高孔隙度的膠原膜，具有發(fā)達(dá)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使該產(chǎn)品迅速的血管化，與自身組織一體化，有效防止腦脊液的滲漏。

附圖說明

圖1所示的是膠原基硬腦膜的樣圖；

圖2所示的是本發(fā)明實(shí)施例2中的光學(xué)顯微鏡圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述，但不局限于此。

實(shí)施例1：

(1)脫細(xì)胞豬真皮的制備：將生態(tài)豬皮剖層，采用消毒、表面清洗等技術(shù)去除原材料熱源；使用平平加、乙醇等試劑進(jìn)行脫脂處理；采用復(fù)合酶脫細(xì)胞工藝和Triton-100清洗工藝相結(jié)合的方法，去除細(xì)胞成分；使用酸堿結(jié)合法進(jìn)一步對所得脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)進(jìn)行去除熱源處理；凍干備用；

(2)聚乙二醇和丙三醇進(jìn)行共聚交聯(lián)反應(yīng)得到一種復(fù)合膠。采用水平流涎和水平噴涂等方法將其涂敷在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)上，控制壓力、噴涂距離、噴涂速率等工藝參數(shù)，使涂層均勻分布，通過室溫晾干，恒溫干燥固化，即可在脫細(xì)胞豬真皮表面形成一層均勻的封閉膜，得到可有效防止腦脊液滲漏的膠原基復(fù)合硬腦膜；

(3)配制洗脫液，將上述所得膠原基復(fù)合膜層，通過去離子水，去離子水與乙醇的互配物浸泡洗滌，以去除殘留物質(zhì)，再經(jīng)冷凍干燥成型，即得可有效防止腦脊液滲漏的雙層復(fù)合結(jié)構(gòu)之膠原基硬腦膜；

(4)將冷凍干燥后的膠原基硬腦膜無菌封裝在醫(yī)用包裝袋內(nèi)，低溫環(huán)氧乙烷滅菌。

實(shí)施例2：

1.對制備的材料進(jìn)行物理性能檢測

(1)外觀：目力觀察和實(shí)際操作，膠原基硬腦膜為白色薄片狀，干態(tài)具有一定硬度，濕態(tài)柔順、不易破裂。。

(2)尺寸：以通用量具測量，膠原基硬腦膜長度和寬度分別為25mm-100mm，厚度0.3～0.7mm。。

(3)吸收力：按YY/T0471.1-2004中3.2的方法進(jìn)行試驗(yàn)時，每克試樣的

液體吸收量大于3g。

4)縫合強(qiáng)度檢測：方法：用4-0的外科縫線縫合在腦膜補(bǔ)片一端邊緣內(nèi)3毫米處，將縫線與硬腦膜補(bǔ)片的另一端固定在拉力儀上，用AI-7000S電子拉力機(jī)進(jìn)行拉伸，直到縫合點(diǎn)被撕裂，記錄下縫合點(diǎn)被撕裂時的拉力。縫合強(qiáng)度大于或等于50.34N。

5)抗張強(qiáng)度檢測方法：方法：使用拉伸(壓縮)試驗(yàn)機(jī)，將修補(bǔ)片裁剪成試樣，將試樣兩端固定在拉伸試驗(yàn)機(jī)的夾頭上,向外拉伸直到試樣斷裂?？箯垙?qiáng)度大于7Mpa。

2.化學(xué)性能檢測

1)灰分：方法：按照《中華人民共和國藥典》2010版灰分的檢測方法進(jìn)行檢測，灰分含量小于2％。

2)重金屬：方法：按照《中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄VIII H第二法測定，重金屬含量小于10μg/g。

3)酸堿度檢測：按照《中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄VI H規(guī)定的方法進(jìn)行測定，膠原基硬腦膜檢驗(yàn)液與空白對照液的PH值之差不超過1.0。

3.生物學(xué)性能檢測

1)內(nèi)毒素：按GB/T 14233.2規(guī)定方法進(jìn)行檢測，內(nèi)毒素含量小于10EU/g。

2)細(xì)胞毒性：按3g樣品加15ml浸提介質(zhì)比例，37±1℃，24±2hr制備試驗(yàn)液，浸提介質(zhì)：MEM培養(yǎng)基。取實(shí)驗(yàn)液按照GB/T 16886.5規(guī)定的試驗(yàn)法進(jìn)行，細(xì)胞毒性不大于1級。

4.組織學(xué)檢測

1)光學(xué)顯微鏡觀察：方法：石蠟包埋后的材料用蘇木精—伊紅染色，倒置相差顯微鏡觀察。結(jié)果：無細(xì)胞和細(xì)胞碎片殘留，膠原纖維連續(xù)無斷裂，如圖2所示。

本發(fā)明的上述實(shí)施例是對本發(fā)明的說明而不能用于限制本發(fā)明，與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。