本發(fā)明總體上涉及一種Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸及其應(yīng)用,具體而言,本發(fā)明涉及包含CCT重復(fù)序列的TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在制備用于治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù):
B細(xì)胞淋巴瘤是B細(xì)胞產(chǎn)生的實(shí)體瘤,其包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤,其分型眾多,霍奇金淋巴瘤包括經(jīng)典霍奇金淋巴瘤和結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤目前被認(rèn)為是起源于B細(xì)胞的腫瘤。非霍奇金淋巴瘤主要包括彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(MALT)、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞白血病、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL),以上5種B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤較為常見,占非霍奇金淋巴瘤的3/4。
彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤是最常見的一類淋巴瘤,約占非霍奇金淋巴瘤的30%左右。DLBCL的臨床表現(xiàn)、形態(tài)學(xué)、免疫表型及遺傳學(xué)特征極具異質(zhì)性。根據(jù)基因表達(dá)譜將DLBCL分為生發(fā)中心來源B細(xì)胞樣(germinal centre B-cell-like,GCB)和活化B細(xì)胞樣(activated B-cell-like,ABC)兩種亞型。生存分析顯示GCB型的總生存期明顯好于ABC型。就5年生存率來說,前者為76%,而后者僅為16%。近年來,越來越多的研究表明CD20分子靶向藥物利妥昔單抗聯(lián)合化療方案可以明顯提高CD20陽性DLBCL患者的完全緩解率和無病生存率,顯著縮小GCB型與非-GCB型的預(yù)后差異。
華氏巨球蛋白血癥(macroglobulinemia,WM)屬于罕見的B細(xì)胞淋巴瘤,又叫淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤,年發(fā)病率為0.3/10萬,在所有的B系淋巴瘤中占1%~2%,其主要特征為骨髓淋巴樣漿細(xì)胞浸潤、單克隆IgM血癥。WM為惰性淋巴瘤,有臨床癥狀的患者中位生存時(shí)間為5~6年。Treon等 (Treon SP.N Engl Med 2012;367(9):826-833)發(fā)現(xiàn)約90%的華氏巨球蛋白血癥存在MYD88 L265P突變。MYD88 L265P突變可能是促進(jìn)WM發(fā)生的早期致癌事件。近來研究表明,在多種B細(xì)胞腫瘤中發(fā)現(xiàn)MYD88的DNA序列因特定序位的堿基由T突變?yōu)镃,導(dǎo)致蛋白編碼區(qū)第265位氨基酸錯(cuò)義突變,即亮氨酸錯(cuò)變?yōu)楦彼?L→P)。此突變位點(diǎn)正好處于TIR(Toll-interleukin 1receptor,TIR)結(jié)構(gòu)域,在沒有TLR及IL-1R信號(hào)刺激的情況下MYD88也能發(fā)生二聚化,引發(fā)白介素-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1receptor-associated kinase,IRAK)介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)的激活,促進(jìn)細(xì)胞增殖。在攜帶MYD88 L265P的AB型彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中敲除IRAK4后,惡性細(xì)胞生長受限,而這種生長抑制可以通過引入野生型IRAK4糾正,對(duì)失活型IRAK4無效,IRAK4抑制劑可導(dǎo)致攜帶MYD88 L265P突變的ABC-DLBCL細(xì)胞株死亡,對(duì)攜帶野生型MYD88的GCB-DLBCL細(xì)胞株無致死作用。抑制MYD88/IRAK信號(hào)通路可以抑制NF-κB信號(hào),并使具有MYD88 L265P突變的ABC-DLBCL腫瘤細(xì)胞生長受到抑制。Ngo等(Ngo VN.Nature 2011;470(7332):115-119)通過RNA干擾、高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)29%ABC-DLBCL存在MYD88 L265P突變,而在其他類型的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤,如GCB-DLBCL和伯基特淋巴瘤中極少或者沒有MYD88 L265P突變。NF-κB信號(hào)途徑的持續(xù)激活是ABC-DLBCL的特征?;诖税l(fā)現(xiàn),本領(lǐng)域一直在致力于尋找能夠靶向治療具有MYD88 L265P突變的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明總體上涉及Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在治療B細(xì)胞淋巴瘤中的應(yīng)用,具體而言,本發(fā)明涉及Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在制備用于治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用,其中,所述B細(xì)胞淋巴瘤具有MYD88 L265P突變,優(yōu)選地,所述B細(xì)胞淋巴瘤是彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤,并且所述彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤是活化B細(xì)胞樣亞型。
本發(fā)明的寡核苷酸包含CCT重復(fù)序列[(CCT)n],其中,C是胞嘧啶,T是胸腺嘧啶,n是8至12的整數(shù),其中,所述寡核苷酸的序列選自:
SEQ ID NO.1:5’-cctcctcctcctcctcctcctcct-3’;
SEQ ID NO.2:5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’;
SEQ ID NO.3:5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’;
SEQ ID NO.4:5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’;
SEQ ID NO.5:5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’;
SEQ ID NO.6:5’-cctccTcctcctccTcctcctccTcctcctccTcct-3’;
其中,小寫字母t代表硫代修飾的堿基,大寫字母T代表未修飾的堿基。
本發(fā)明的Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸對(duì)具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生劑量依賴性抑制作用??傮w而言,所述Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸以1.25mg/kg體重至500mg/kg體重的劑量對(duì)具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生抑制作用。
在一種實(shí)施方式中,對(duì)具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生抑制作用的Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸的劑量為1.25mg/kg體重至12.5mg/kg體重,或12.5mg/kg體重至25mg/kg體重,或25mg/kg體重至50mg/kg體重,或50mg/kg體重至125mg/kg體重,或125mg/kg體重至250mg/kg體重,或250mg/kg體重至500mg/kg體重。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,對(duì)具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生抑制作用的Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸的劑量為5mg/kg體重,或12.5mg/kg體重,或25mg/kg體重,或50mg/kg體重。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體,其選自:溶液、稀釋劑、溶劑、分散劑、脂質(zhì)體、乳劑、糖衣、抗菌劑、抗真菌劑、等滲的和延緩吸收的試劑。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中,所述藥物被配制成口服給藥劑型、靜脈注射劑型、肌肉注射劑型、吸入給藥劑型、局部施用劑型。
本發(fā)明的寡核苷酸表現(xiàn)出Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性,其對(duì)于治療具有MYD88 L265P突變的ABC型DLBCL尤其有效,將本發(fā)明的寡核苷酸作用于具有MYD88 L265P突變的ABC型DLBCL,其可阻斷TLR7和TLR9與MYD88 L265P蛋白結(jié)合,從而阻斷NF-κB信號(hào)通路的活化,抑制ABC-DLBCL細(xì)胞生存,進(jìn)而有效抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖。由此,本發(fā)明的具有Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性的寡核苷酸可用于靶向治療具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤并可用于制備治療具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤的藥物。
附圖說明
圖1A至圖1C顯示了本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)和CpG685誘導(dǎo)的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖的抑制作用。X軸代表CFSE,y軸代表CD19+B細(xì)胞,在PBMC的增殖實(shí)驗(yàn)中,CFSE染色,培養(yǎng)6天,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖。
圖1A顯示了培養(yǎng)基組、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的寡核苷酸組對(duì)PBMC的增殖情況的影響。培養(yǎng)基組細(xì)胞增殖率3.78%,SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的寡核苷酸組的細(xì)胞增殖率分別為1.21%、0.823%和1.08%,寡核苷酸組和培養(yǎng)基組的細(xì)胞增殖率沒有差別,作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。
圖1B顯示了本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)IMQ(5μM)刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖的抑制情況。本發(fā)明的寡核苷酸與IMQ按照1:1、1:3、1:9、1:27的比例加入到PBMC中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD19+B細(xì)胞增殖。本發(fā)明的寡核苷酸的濃度從0μM增加至27μM,本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸均可抑制IMQ誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖,SEQ ID NO.1的寡核苷酸抑制CD19+B細(xì)胞增殖由30.60%降低至0.031%,SEQ ID NO.5的寡核苷酸抑制CD19+B細(xì)胞增殖由30.60%降低至0.059%,SEQ ID NO.6的寡核苷酸抑制CD19+B細(xì)胞增殖由30.60%降低至0.159%。
圖1C顯示了本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)CpG685(1μM)刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖的抑制情況。寡核苷酸的濃度從0μM增加至27μM,不同序列的寡核苷酸均可抑制CpG685誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖,SEQ ID NO.1的寡核苷酸抑制CD19+B細(xì)胞增殖由28.50%降低至1.03%,SEQ ID NO.5的寡核苷酸抑制CD19+B細(xì)胞增殖由28.50%降低至0.027%,SEQ ID NO.6的寡核苷酸抑制CD19+B細(xì)胞增殖由28.50%降低至1.08%。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次均得到類似的結(jié)果。
圖2A至圖2D分別顯示了CBA法檢測(cè)本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)IMQ或CpG685刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分泌的細(xì)胞因子IL-6和IL-10的抑制情況。X軸代表經(jīng)過不同處理的人PBMC組,y軸代表細(xì)胞因子的含量。對(duì)照組為培養(yǎng)基組和NOG組。
圖2A顯示了本發(fā)明的不同濃度的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)IMQ刺激PBMC分泌IL-6的影響。IMQ(5μM)和不同序列、不同濃度的寡核苷酸(分別為0、0.3、1.5、7.5和37.5μM)加入到PBMC中培養(yǎng)36h,CBA(BD)測(cè)定IL-6的含量;
圖2B顯示了本發(fā)明的不同濃度的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)IMQ刺激PBMC分泌IL-10的影響。IMQ(5μM)和不同序列的寡核苷酸(濃度分別為0、0.1、0.5、2.5和12.5μM)加入到PBMC中培養(yǎng)36h,CBA(BD)測(cè)定IL-10的含量;圖2A和圖2B說明本發(fā)明的寡核苷酸對(duì)IMQ誘導(dǎo)人PBMC分泌細(xì)胞因子IL-6和IL-10具有抑制作用,且呈劑量相關(guān)性。
圖2C顯示了本發(fā)明的不同濃度的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)CpG685刺激PBMC分泌IL-6的影響。CpG685(1μM)和本發(fā)明的寡核苷酸(濃度分別為0、1、3、9和27μM)加入到PBMC中培養(yǎng)36h,CBA法測(cè)定IL-6的含量;
圖2D顯示了本發(fā)明的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)在不同濃度條件下對(duì)CpG685刺激PBMC分泌IL-10的影響。CpG685(1μM)和本發(fā)明的寡核苷酸(濃度分別為0、1、3、9和27μM)加入到PBMC中培養(yǎng)36h,CBA測(cè)定IL-10的含量。圖2C和圖2D表明本發(fā)明的寡核苷酸對(duì)CpG685誘導(dǎo)人PBMC分泌細(xì)胞因子IL-6和IL-10具有抑制作用,且呈劑量相關(guān)性。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次均得到類似的結(jié)果,表示為平均值±SD。
圖3顯示了Sanger法DNA測(cè)序檢測(cè)細(xì)胞系OCI-Ly19和OCI-Ly3.3的MYD88突變位點(diǎn)。Sanger法DNA測(cè)序結(jié)果顯示,OCI-Ly19細(xì)胞的MYD88 PCR產(chǎn)物測(cè)序,該序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中的MYD88序列一致,不存在突變位點(diǎn),OCI-Ly19屬于MYD88野生型的細(xì)胞株。OCI-Ly3.3細(xì)胞的MYD88 PCR產(chǎn)物測(cè)序,該序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中的MYD88序列存在一個(gè)堿基的突變位點(diǎn)即T突變?yōu)镃,故OCI-Ly3.3屬于MYD88 L265P突變的細(xì)胞株。每株細(xì)胞測(cè)定2個(gè)克隆。
圖4A和圖4B顯示了流式細(xì)胞儀檢測(cè)OCI-Ly19細(xì)胞和OCI-Ly3.3細(xì)胞內(nèi)TLR7和TLR9的表達(dá)。X軸代表TLR7-PE或TLR9-APC,Y軸代表細(xì)胞數(shù)。檢測(cè)OCI-Ly19或OCI-Ly3.3的TLR7-PE和TLR9-APC的平均熒光強(qiáng)度(MIF)。從圖4A中可以看出,在OCI-Ly19細(xì)胞組,TLR7-PE和TLR9-APC較同型對(duì)照明顯右移,平均熒光強(qiáng)度(MIF)明顯高于同型對(duì)照組的MIF,說明OCI-Ly19細(xì)胞內(nèi)表達(dá) TLR7和TLR9蛋白。從圖4B中可以看出,在OCI-Ly3.3細(xì)胞組,TLR7-PE和TLR9-APC較同型對(duì)照明顯右移,平均熒光強(qiáng)度(MIF)明顯高于同型對(duì)照組的MIF,說明OCI-Ly3.3細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TLR7和TLR9蛋白。
圖5顯示了WST-1測(cè)定本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)OCI-Ly19細(xì)胞增殖無抑制作用,但明顯抑制OCI-Ly3.3細(xì)胞增殖。X軸代表寡核苷酸的濃度,Y軸代表細(xì)胞活率。SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6的寡核苷酸分別以0、5、10、20和40μM濃度作用OCI-Ly19或OCI-Ly3.3細(xì)胞72小時(shí),通過WST-1測(cè)定細(xì)胞活力,數(shù)值表示為平均值±SD。圖5表明隨著寡核苷酸濃度的增加,OCI-Ly19的細(xì)胞活力在100%左右,OCI-Ly3.3的細(xì)胞活力由100%逐漸下降,但當(dāng)本發(fā)明的寡核苷酸的濃度為40μM時(shí),其細(xì)胞活力為20%左右。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次均得到類似的結(jié)果。寡核苷酸濃度的增加對(duì)OCI-Ly19的細(xì)胞活力無影響;但是抑制OCI-Ly3.3的細(xì)胞活力,這種抑制作用具有濃度依賴性。
圖6顯示了CBA方法檢測(cè)本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)GCB-DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly19分泌IL-10無抑制作用,但可以抑制ABC-DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly3.3細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-10。X軸代表不同序列的寡核苷酸的濃度,Y軸代表IL-10的含量。CBA方法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-10的含量。將本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸以0、2、4、8、10和20μM的濃度與OCI-Ly19或OCI-Ly3.3共培養(yǎng)36小時(shí),結(jié)果顯示OCI-Ly19細(xì)胞分泌的IL-10較少,隨著寡核苷酸濃度的增加,OCI-Ly19分泌IL-10的量不發(fā)生改變。對(duì)于OCI-Ly3.3細(xì)胞而言,在寡核苷酸的濃度為10μM時(shí),IL-10幾乎接近0,。隨著寡核苷酸的濃度的增加,OCI-Ly3.3細(xì)胞分泌IL-10的量逐漸減少,這種抑制作用呈劑量相關(guān)性,且三種不同序列的寡核苷酸表現(xiàn)出相似的抑制作用。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次均得到類似的結(jié)果。
圖7A和圖7B顯示了PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)本發(fā)明的寡核苷酸(SEQ ID NO.6)對(duì)細(xì)胞系OCI-Ly19和OCI-Ly3.3細(xì)胞周期的影響。X軸代表寡核苷酸的濃度,Y軸代表細(xì)胞百分比。圖7A中SEQ ID NO.6的寡核苷酸在濃度分別為0、15和30μM的條件下和細(xì)胞OCI-Ly19一同培養(yǎng)72h,細(xì)胞周期結(jié)果顯示,不同濃度的SEQ ID NO.6的寡核苷酸對(duì)OCI-Ly19的細(xì)胞周期各期均沒有影響。圖7B中SEQ ID NO.6的寡核苷酸在濃度分別為0、15和30μM的條件下與細(xì)胞 OCI-Ly3.3培養(yǎng)72h,細(xì)胞周期結(jié)果顯示,SEQ ID NO.6在濃度為30μM時(shí),與濃度為0μM時(shí)相比(與對(duì)照組相比),OCI-Ly3.3細(xì)胞周期G1期細(xì)胞比例明顯增加,S期和G2,M期細(xì)胞比例明顯減少,SEQ ID NO.6的寡核苷酸阻止OCI-Ly3.3細(xì)胞由G1期向S期和G2,M期轉(zhuǎn)變,使得細(xì)胞停留在G1期,導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢。
具體實(shí)施方式
以下將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明涉及的多個(gè)方面進(jìn)行詳細(xì)說明,這些實(shí)施例僅用于舉例說明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解的是,本發(fā)明不受實(shí)施例中所描述的具體操作步驟的限制。
除非另有說明,本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語通常具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。
本發(fā)明總體上提供Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在制備用于治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用,其中,所述B細(xì)胞淋巴瘤具有MYD88 L265P突變,所述寡核苷酸包含CCT重復(fù)序列[(CCT)n],其中,C是胞嘧啶,T是胸腺嘧啶,n是8至12的整數(shù)。
Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸
一方面,本發(fā)明提供一種包含CCT重復(fù)序列[(CCT)n]的寡核苷酸,其中,C是胞嘧啶,T是胸腺嘧啶,n是8至12的整數(shù)。
本文中的術(shù)語“寡核苷酸”是指由糖(如脫氧核糖),磷酸基團(tuán)和堿基組成的分子,其中糖分子和堿基連接成核苷,核苷由磷酸基團(tuán)連接形成核苷酸,形成核苷的堿基有嘧啶和嘌呤,嘧啶有胸腺嘧啶(縮寫為T或t)和胞嘧啶(縮寫為C或c),嘌呤有腺嘌呤(adenine,縮寫為A或a)和鳥嘌呤(guanine,縮寫為G或g)。本發(fā)明中的寡核苷酸是指寡脫氧核苷酸,其是由自動(dòng)核酸合成儀器合成,因此這些寡核苷酸是人工合成的寡核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸包含CCT重復(fù)序列[(CCT)n],其中,C是胞嘧啶或其衍生物,T是胸腺嘧啶或其衍生物,n表示重復(fù)單位的個(gè)數(shù),其可以是8-12的整數(shù)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的寡核苷酸中的磷酸骨架可為未修飾的。
本發(fā)明的寡核苷酸中的磷酸骨架還可為部分修飾的或全部修飾的。所述修飾可包括多種化學(xué)修飾,例如,使用硫代磷酸酯部分修飾或全部修飾本發(fā)明的寡核苷酸中的堿基。所述修飾可在寡核苷酸的合成過程中進(jìn)行或者在合成之后進(jìn)行,并且所述修飾可發(fā)生在核苷之間的磷酸二酯橋鍵上、核糖單元上和/或天然核苷堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)上。當(dāng)在合成寡核苷酸的過程中進(jìn)行修飾時(shí),被修飾的堿基可被并入寡核苷酸內(nèi)部或位于寡核苷酸末端。當(dāng)在合成寡核苷酸之后進(jìn)行修飾時(shí),所述修飾可通過使用活性基團(tuán)進(jìn)行,例如,通過氨基修飾成分進(jìn)行,通過3’或5’羥基進(jìn)行,或通過磷酸酯基團(tuán)進(jìn)行。
本發(fā)明所述的化學(xué)修飾可包括對(duì)本發(fā)明的寡核苷酸的骨架進(jìn)行修飾,包括但不限于,用硫代磷酸酯對(duì)骨架進(jìn)行修飾,得到硫代磷酸酯骨架,這種骨架是一種穩(wěn)定的核酸分子的糖磷酸酯骨架,在該骨架中,至少一個(gè)核苷酸之間的鍵上,硫取代了未橋接的磷酸酯的氧,或者,在每個(gè)或每隔一個(gè)核苷酸之間的鍵上,硫取代了未橋接的磷酸酯的氧。還可對(duì)寡核苷酸骨架進(jìn)行其他修飾,例如,使用非離子型DNA類似物,例如,烷基磷酸酯和芳基磷酸酯,對(duì)骨架進(jìn)行修飾,其中,由烷基或芳基取代帶電荷的磷酸酯中的氧,或者使用磷酸二酯和烷基磷酸三酯對(duì)骨架進(jìn)行修飾,其中,將帶電荷的氧烷基化。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的寡核苷酸的序列選自:
SEQ ID NO.1:5’-cctcctcctcctcctcctcctcct-3’;
SEQ ID NO.2:5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’;
SEQ ID NO.3:5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’;
SEQ ID NO.4:5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’;
SEQ ID NO.5:5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’;
SEQ ID NO.6:5’-cctccTcctcctccTcctcctccTcctcctccTcct-3’;
其中,小寫字母t代表硫代修飾的堿基,大寫字母T代表未修飾的堿基。
本發(fā)明提供的寡核苷酸具有Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性,也被稱為Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸。在本發(fā)明中,“Toll樣受體(TLR)”是人TLR家族成員,該家族成員有11個(gè)受體,是哺乳動(dòng)物進(jìn)化中比較保守的一 個(gè)受體家族。TLR能特異性識(shí)別病原相關(guān)的分子模式(PAMP),不僅在激活天然免疫中發(fā)揮重要作用,而且還調(diào)節(jié)獲得性免疫,是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。TLR是Ⅰ型跨膜蛋白,可分為胞外區(qū),胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)三部分,其中胞外區(qū)可以識(shí)別特定的配體即能識(shí)別微生物的PAMP,胞內(nèi)區(qū)的結(jié)構(gòu)與IL-1的Ⅰ型受體同源,稱為Toll/白介素1受體同源結(jié)構(gòu)域(Toll/IL-1R homology domain,TIR),主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。TLR在多種免疫細(xì)胞都有表達(dá),如B細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞和特定類型的T細(xì)胞等。TLR在細(xì)胞中的定位不同,其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6存在于細(xì)胞膜表面,而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9則只存在于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)體和溶酶體上。TLR各自識(shí)別特定的PAMP,其中TLR1和TLR6分別識(shí)別三酰脂肽;TLR2可以識(shí)別肽聚糖、脂蛋白和酵母多糖;TLR3識(shí)別病毒雙鏈RNA(dsRNA)和Poly I:C;TLR4識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖;TLR5識(shí)別鞭毛素;TLR7和TLR8識(shí)別病毒單鏈RNA(ssRNA)和人工合成的小分子抗病毒化合物,例如咪喹莫特類化合物(Imiquimod(S26308),其是TLR7/8的配體于1988年由美國學(xué)者M(jìn)an Chen等首先報(bào)道。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了系列的類似化合物,如R837、R848等;咪喹莫特家族被證實(shí)可以通過TLR7/8-MYD88信號(hào)依賴通路產(chǎn)生IFN,具有抗病毒和抗腫瘤活性,可用作為B淋巴細(xì)胞活化劑;TLR9識(shí)別細(xì)菌和病毒的未甲基化的CpG DNA。
TLR/IL1-R與相應(yīng)病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)結(jié)合后,直接通過TIR結(jié)構(gòu)域或間接通過帶有TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor protein,TIRAP)和Bruton酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,BTK)激活MYD88,活化后MYD88通過DD結(jié)構(gòu)域間的同型互作招募IRAK4,后者使IRAK1發(fā)生磷酸化,并結(jié)合腫瘤壞死因子相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-asssociatd factor 6,TRAF6),形成與胞膜相連的TLR-MYD88-IRAK4-IRAK1-TRAF6復(fù)合物;隨后,IRAK1-TRAF6與復(fù)合物分離,結(jié)合蛋白激酶復(fù)合體TAK1-TAB1-TAB4,活化的TAK1與IRAK1解離,使復(fù)合物TRAF6-TAK1-TAB1-TAB4進(jìn)入胞質(zhì),在泛素化連接酶作用下,TRAF6泛素化而降解,活化的TAK1-TAB1-TAB4復(fù)合物分別通過磷酸化啟動(dòng)兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。第1條途徑:TAK1磷酸化異源三聚體,即IKK復(fù)合體(NEMO/IKKγ-IKKα-IKKβ),后者再使IκBα磷酸化后發(fā)生 泛素化降解,釋放由P65和P50兩份亞單位組成的NF-κB轉(zhuǎn)位至胞核,激活促進(jìn)細(xì)胞生長的NF-κB依賴性基因。第2條途徑:TAK1使絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑成分磷酸化后激活轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和c-Fos,c-Jun和c-Fos轉(zhuǎn)位至胞核,形成轉(zhuǎn)錄因子AP-1,激活MAPK依賴性基因。
Kian-Huat Lim等(Kian-Huat Lim.Cancer Research:April 15,2013;Volume 73,Issue 8,Supplement 1)發(fā)現(xiàn)在MYD88 L265P突變后,TLR7或TLR9可以結(jié)合MYD88 L265P蛋白,使MYD88發(fā)生二聚化,導(dǎo)致下游NF-κB信號(hào)的激活。在ABC-DLBCL的細(xì)胞系中敲除TLR7和TLR9之后可以明顯抑制NF-κB活化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在敲除了內(nèi)源TLR7或TLR9的ABC-DLBCL細(xì)胞系中,癌細(xì)胞增殖受到明顯抑制。在B細(xì)胞淋巴瘤中約90%的淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥(WM)、29%的活化型彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤,33%的中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(所有檢測(cè)標(biāo)本病理均為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤)、9%的粘膜相關(guān)淋巴瘤(MALT)、2.9%的慢性淋巴細(xì)胞白血病中均檢測(cè)出MYD88 L265P突變。本發(fā)明的寡核苷酸具有Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性,其在作用于具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤(例如,彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤,例如,ABC型彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤)中可以通過阻斷TLR7和TLR9與MYD88 L265P蛋白結(jié)合,阻斷NF-κB信號(hào)通路的活化,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。由此,本發(fā)明的具有Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性的寡核苷酸可用于靶向治療具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤并可用于制備治療具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤的藥物。
醫(yī)藥用途
另一方面,本發(fā)明提供一種使用本發(fā)明的具有Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性的寡核苷酸治療個(gè)體體內(nèi)的B細(xì)胞淋巴瘤的方法以及使用本發(fā)明的具有Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性的寡核苷酸在制備用于治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用,其中,所述B細(xì)胞淋巴瘤具有MYD88 L265P突變,例如:彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤,包括,活化B細(xì)胞樣亞型彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)。
在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明的上述寡核苷酸(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6)可與藥學(xué)上可接受的載體一同配制成用于治療彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的藥物制劑,其中,該藥物制劑可以根據(jù)臨床需要而配制成口服給藥劑型,靜脈注射劑型,肌肉注射劑型,吸入給藥劑型,局部施用劑型,等等。
進(jìn)一步而言,該藥物制劑還可包含額外的活性成分,其選自:CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松)、Btk抑制劑(Ibrutinib)、PI3Kδ抑制劑(Idelalisib)、mTOR抑制劑(Everolimus)、STAT3抑制劑(OPB-51602)、抗-CD20單克隆抗體(Rituximab)、SYK抑制劑(Fostamatinib)、Bcl-2抑制劑(Navitoclax)、蛋白酶抑制劑(Bortezomib)和免疫調(diào)節(jié)劑(Lenalidomide),上述額外的活性成分中的一種或幾種可與本發(fā)明的具有Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性的寡核苷酸一同聯(lián)合治療彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。
本發(fā)明所述的“藥學(xué)上可接受的載體”包括一種或多種固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì),所述載體適合將本發(fā)明中的寡核苷酸應(yīng)用于個(gè)體體內(nèi)。該載體可以是有機(jī)的、無機(jī)的、天然的或合成的。該載體包括各種溶液、稀釋劑、溶劑、分散劑、脂質(zhì)體、乳劑、糖衣、抗菌劑、抗真菌劑、等滲的和延緩吸收的試劑、和其他的適合本發(fā)明中的寡核苷酸應(yīng)用的載體。藥物學(xué)上可接受的載體的選擇決定于本發(fā)明中寡核苷酸應(yīng)用方式??勺⑸溆玫妮d體包括水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖溶液、甘油等。對(duì)于固體混合物(如粉末、丸、片劑、膠囊形式)而言,常用的非毒性固體載體包括:具有藥理學(xué)純度的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸鎂等。另外,作為生物學(xué)上中性的載體,應(yīng)用的藥理學(xué)組分中可以含有非毒性的輔助物質(zhì),包括濕化或乳化劑、防腐劑、PH緩沖試劑,醋酸鈉和單月桂酸酯等。上述藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的(參見,例如,Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990,第1289-1329頁,該參考文獻(xiàn)通過引用并入本文)。
舉例而言,填充劑的實(shí)例為乳糖一水合物、無水乳糖和各種淀粉。粘合劑的實(shí)例為各種纖維素和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素以及硅化微晶纖維素。合適的潤滑劑的實(shí)例,包括作用于被壓縮粉末的流動(dòng)性的藥劑,例如,膠態(tài)二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣和硅膠。增甜劑的實(shí)例是天然或人造增甜劑,例如蔗糖、木糖醇、糖精鈉、甜蜜素和天冬甜素。防腐劑的 實(shí)例為山梨酸鉀、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、苯甲酸及其鹽、諸如對(duì)羥基苯甲酸丁酯之類的對(duì)羥基苯甲酸的酯、諸如乙醇或苯甲醇之類的醇、諸如苯酚之類的酚化合物,或者四元化合物,例如,苯扎氯銨。合適的稀釋劑的實(shí)例包括藥物可接受的惰性填料,例如,微晶纖維素、乳糖、磷酸氫鈣和糖類。稀釋劑的實(shí)例包括微晶纖維素,諸如乳糖一水合物和無水乳糖之類的乳糖,磷酸氫鈣,甘露糖醇,淀粉,山梨糖醇,蔗糖和葡萄糖。合適的崩解劑包括輕度交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉和改性淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、羥基乙酸淀粉鈉及其混合物。
本發(fā)明的藥物制劑可為水溶液形式、鹽水溶液形式、顆粒、氣溶膠、粉末、片劑、糖衣片劑、微膠囊、栓劑、糖漿、乳液、懸浮劑、霜?jiǎng)⒌蝿┗蚱渌m于多種藥物遞送系統(tǒng)的形式。
本發(fā)明的藥物制劑可通過如下方式給藥:口服給藥、腸胃外給藥、舌下給藥、跨粘膜給藥、透皮給藥、直腸給藥、腹腔內(nèi)注射給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、局部給藥(以粉末、軟膏、凝膠、滴劑或透皮貼劑的形式局部給藥)、含服給藥,通過導(dǎo)管給藥、通過植入物給藥,等等。在任何給藥形式的情況下,本發(fā)明的藥物制劑必須是無菌的且在生產(chǎn)和存儲(chǔ)條件下為穩(wěn)定的,并且不會(huì)受到細(xì)菌或微生物污染。
本發(fā)明的藥物制劑還可被配制為通過注射(例如,快速注射或連續(xù)輸注)方式腸胃外給藥的劑型??梢詥挝粍┝啃问教峁┯糜谧⑸浣o藥的劑型,例如,以安瓶或多劑量容器的形式提供。本發(fā)明的藥物制劑可采用諸如油性載體或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液之類的形式并且可含有諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑之類的調(diào)節(jié)劑,并且可加入例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽(例如,海藻酸鈉)。
本發(fā)明的藥物制劑的懸浮液可制備成合適的油性注射懸浮液或水性注射懸浮液,其中,合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油(例如,芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如,油酸乙酯或甘油三酯)或脂質(zhì)體;水性注射懸浮液可包含能夠增加懸浮液的粘度的物質(zhì),例如,羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地,懸浮液還可含有合適的能夠增加化合物的溶解度的穩(wěn)定劑或試劑,從而可制備高度濃縮的溶液。對(duì)于注射而言,本發(fā)明的藥物制劑可被配制成水性溶液,優(yōu)選地配制成生理相容性緩沖液(例如,Hanks溶液、林格 氏溶液或生理鹽水緩沖液)。
優(yōu)選地,本發(fā)明的藥物制劑可為使用前溶解于合適的載體中的粉末形式,所述合適的載體例如,無菌無熱原水。
對(duì)于透過粘膜給藥而言,在該制劑中使用適于待穿透的屏障的滲透劑。這些滲透劑通常為本領(lǐng)域已知的。
對(duì)于口腔給藥而言,本發(fā)明的藥物制劑可以通過常規(guī)方式配制的片劑或含片的形式給藥。
對(duì)于吸入給藥而言,本發(fā)明的藥物制劑可被配制成便于通過使用合適的推進(jìn)劑(例如,二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體)以由加壓包或噴霧器提供的噴霧的形式遞送。在使用加壓噴霧的情況下,劑量單位可通過提供遞送計(jì)量的量的閥來確定。在吸入器或吹入器中使用的膠囊和藥筒(例如,明膠膠囊和藥筒)可被配制為含有本發(fā)明的藥物組合物和合適的粉末基體(例如,乳糖或淀粉)的粉末混合物的劑型。
本發(fā)明的藥物制劑還可包含合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這些載體或賦形劑的實(shí)例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類、淀粉、纖維素衍生物、明膠和諸如聚乙二醇之類的聚合物。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中,本發(fā)明的藥物制劑在用于治療彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的過程中還可與其他活性劑聯(lián)合給藥,所述其他活性劑選自:CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松)、Btk抑制劑(Ibrutinib)、PI3Kδ抑制劑(Idelalisib)、mTOR抑制劑(Everolimus)、STAT3抑制劑(OPB-51602)、抗-CD20單克隆抗體(Rituximab)、SYK抑制劑(Fostamatinib)、Bcl-2抑制劑(Navitoclax)、蛋白酶抑制劑(Bortezomib)和免疫調(diào)節(jié)劑(Lenalidomide)。
本發(fā)明所述的B細(xì)胞淋巴瘤是彌漫性大B淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL),是最常見的一類淋巴瘤,約占非霍奇金淋巴瘤的30%左右。DLBCL的臨床表現(xiàn)、形態(tài)學(xué)、免疫表型及遺傳學(xué)特征極具異質(zhì)性。DLBCL可發(fā)生于任何年齡,但以老年人多見,中位發(fā)病年齡為60~65歲,男性稍多于女性。臨床上以迅速增大的無痛性腫塊為典型表現(xiàn),約1/3的患者伴有發(fā)熱、盜汗、體重減輕等癥狀。DLBCL可發(fā)生于淋巴結(jié)內(nèi)或結(jié)外,約40%DLBCL原發(fā)于結(jié)外,主要是胃腸道,其他常見結(jié)外部位包括骨、睪丸、唾液 腺、甲狀腺、皮膚等。2000年Alizadeh等首先將cDNA微陣列技術(shù)應(yīng)用于DLBCL基因表達(dá)譜的研究。根據(jù)基因表達(dá)譜將DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞樣(germinal centre B-cell-like,GCB)和活化B細(xì)胞樣(activated B-cell-like,ABC)兩種亞型,生存分析顯示GCB型的總生存期明顯好于ABC型。就5年生存率來說,前者為76%,而后者僅為16%。近年來,越來越多的研究表明CD20分子靶向藥物利妥昔單抗聯(lián)合化療方案可以明顯提高CD20陽性DLBCL患者的完全緩解率和無病生存率,顯著縮小GCB型與非-GCB型的預(yù)后差異。Ngo等通過RNA干擾、高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)29%ABC型彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤存在MYD88 L265P,而在其他類型的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤如GCB型和伯基特淋巴瘤中極少或者沒有。MYD88 L265P突變使得MYD88發(fā)生二聚化,引起NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)激活,60%的ABC型DLBCL有核內(nèi)NF-κB表達(dá),而僅有小部分(約30%)GCB型DLBCL有核內(nèi)NF-κB表達(dá),研究證實(shí),持續(xù)性的NF-κB的激活是部分ABC型DLBC細(xì)胞存活所必需的。本文所述的MYD88本質(zhì)上是一種胞質(zhì)內(nèi)可溶性的銜接蛋白,是Toll樣受體和IL-1受體信號(hào)通路的調(diào)節(jié)分子,參與人體固有免疫。相對(duì)分子量35kDa,包含2個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)域。C端帶有與TLR分子胞內(nèi)段相同的TIR結(jié)構(gòu)域,通過同型相互作用與TLR/IL-1R相接,啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。N端是死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,DD),帶有死亡結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分子,參與凋亡相關(guān)的信號(hào)通路。
本發(fā)明的寡核苷酸表現(xiàn)出Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性,其對(duì)于治療具有MYD88 L265P突變的ABC型DLBCL尤其有效,將本發(fā)明的寡核苷酸作用于具有MYD88 L265P突變的ABC型DLBCL,其可阻斷TLR7和TLR9與MYD88 L265P蛋白結(jié)合,從而阻斷NF-κB信號(hào)通路的活化,抑制ABC-DLBCL細(xì)胞生存,進(jìn)而有效抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中,將本發(fā)明的寡核苷酸或包含本發(fā)明的寡核苷酸的藥物制劑給藥于受治者可緩解或治療ABC-DLBCL,對(duì)于具有MYD88 L265P的ABC-DLBCL型個(gè)體上發(fā)生的嚴(yán)重病理現(xiàn)象而言,將本發(fā)明的寡核苷酸或包含本發(fā)明的寡核苷酸的藥物制劑給藥于受治者可減輕ABC-DLBCL疾病的癥狀、抑制由MYD88 L265P介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)活化導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明所述的受治者是指應(yīng)用本發(fā)明寡核苷酸的人類個(gè)體和非人類脊椎動(dòng)物個(gè)體。非人類脊椎動(dòng)物包括非人類靈長類動(dòng)物,畜牧動(dòng)物和寵物動(dòng)物等。
治療有效量
在本發(fā)明的Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸用于制備治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥物方面,由本發(fā)明的寡核苷酸制成的用于治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥物制劑中包含治療有效量的本發(fā)明的寡核苷酸,所述治療有效量即為有效實(shí)現(xiàn)期望目的的量。對(duì)特定應(yīng)用有效的實(shí)際量將(尤其)取決于治療中的病癥。有效量的確定恰好在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)(尤其是根據(jù)本文具體公開的內(nèi)容)。
對(duì)于本文所述的寡核苷酸而言,治療有效量可最先通過細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)法確定。目標(biāo)血藥濃度為能夠抑制細(xì)胞生長或分裂的活性化合物的濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,細(xì)胞活性的至少25%被抑制。能夠誘導(dǎo)至少約30%、50%、75%或甚至90%或者更高的細(xì)胞活性抑制的活性化合物的目標(biāo)血藥濃度為目前優(yōu)選的??杀O(jiān)測(cè)患者體內(nèi)的細(xì)胞活性抑制的百分?jǐn)?shù),從而評(píng)估所達(dá)到的血藥濃度的適當(dāng)性,并且可上調(diào)或下調(diào)劑量以實(shí)現(xiàn)期望的抑制百分?jǐn)?shù)。
如本領(lǐng)域已知的,用于人體的治療有效量還可通過動(dòng)物模型來確定。例如,用于人體的劑量可被配制成實(shí)現(xiàn)已在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的有效循環(huán)濃度。如上所述,人體內(nèi)的劑量可通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞抑制和上調(diào)或下調(diào)劑量來調(diào)節(jié)。
治療有效劑量還可通過已知的表現(xiàn)出類似藥理學(xué)活性的化合物的動(dòng)物體內(nèi)或人體試驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定。所使用的劑量可基于與已知化合物進(jìn)行比較的所給藥的化合物的效力來調(diào)節(jié)(例如,Lakshmi Bhagat et al.,IMO-8400,a selective antagonist of TLRs 7,8and 9,inhibits MYD88 L265P mutation-driven signaling and cell survival:A potential novel approach for treatment of B-cell lymphomas harboring MYD88 L265P mutation,CANCER RESEARCH,October 1,2014 74:2574以及中國發(fā)明專利申請(qǐng)公開CN102171235A)。
本發(fā)明的Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸對(duì)具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生劑量依賴性抑制作用??傮w而言,所述Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸以1.25mg/kg體重至500mg/kg體重的劑量對(duì)具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生抑制作用。
在一種實(shí)施方式中,對(duì)具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生抑制作用的Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸的劑量為1.25mg/kg體重至 12.5mg/kg體重,或12.5mg/kg體重至25mg/kg體重,或25mg/kg體重至50mg/kg體重,或50mg/kg體重至125mg/kg體重,或125mg/kg體重至250mg/kg體重,或250mg/kg體重至500mg/kg體重。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,對(duì)具有MYD88 L265P突變的B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生抑制作用的Toll樣受體TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸的劑量為5mg/kg體重,或12.5mg/kg體重,或25mg/kg體重,或50mg/kg體重。
實(shí)施例
結(jié)合下面的非限定性實(shí)施例舉例說明本發(fā)明的TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸可用于緩解和治療具有MYD88 L265P突變的ABC型彌漫大B淋巴瘤。
在本發(fā)明的實(shí)施例中,應(yīng)用人PBMC、ABC-DLBCL細(xì)胞株OCI-Ly3.3細(xì)胞、GCB-DLBCL細(xì)胞株OCI-Ly19細(xì)胞,因?yàn)槿薖BMC含有TLR7和TLR9受體,故利用TLR7的配體IMQ和TLR9的配體CpG685刺激人PBMC后,免疫細(xì)胞增殖,本發(fā)明的TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸可以明顯抑制IMQ或CpG 685刺激的人PBMC增殖和炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-10的分泌。
對(duì)于DLBCL細(xì)胞系的研究,OCI-Ly19細(xì)胞屬于MYD88野生型,作為對(duì)照組,OCI-Ly3.3細(xì)胞屬于MYD88 L265P突變型,作為實(shí)驗(yàn)組。本發(fā)明的TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸可以抑制具有MYD88 L265P突變的ABC-DLBCL型OCI-Ly3.3細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子IL-10的分泌,而對(duì)于MYD88野生型的GCB-DLBCL型OCI-Ly19細(xì)胞無類似作用。
實(shí)施例中的咪喹莫特(Imiquimod(R-837),C14H16N4,HCl)購自Invivogen。本發(fā)明的實(shí)施例中使用的寡核苷酸是由長春華普生物技術(shù)有限公司合成,均經(jīng)無熱源處理。寡核苷酸中的內(nèi)毒素應(yīng)用鱟變形細(xì)胞溶解法檢測(cè)(Associates of Cape Cod,Inc)。以下顯示的是在實(shí)施例中應(yīng)用的寡核苷酸的序列和名稱:
NOG1;5’-cctcctcctcctcctcctcctcct-3’(SEQ ID NO.1);
NOG2:5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’(SEQ ID NO.5);
NOG3:5'-cctccTcctcctccTcctcctccTcctcctccTcct-3’(SEQ ID NO.6);
CpG 685:5’-tcgtcgacgtcgttcgttctc-3’(SEQ ID NO.7)。
實(shí)施例1.本發(fā)明的不同序列的NOG1-3寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)IMQ或CpG 685刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖的影響
用Ficoll–Hypaque密度梯度離心法從人外周血分離單個(gè)核細(xì)胞(Ficoll試劑購自Pharmacia公司,血液樣品由吉林省血液中心提供)。用臺(tái)酚蘭染色法確定人外周血單個(gè)核細(xì)胞的成活率為95%-99%。采用CFSE(Invivogen公司)進(jìn)行標(biāo)記,采用LSR Fortessa(BD公司)流式細(xì)胞儀檢測(cè)人外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖情況。
“CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester)”:是一種化學(xué)染料,全稱為羧基熒光素琥珀酰亞胺酯,是由羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯自由通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后被非特異性酯酶切除乙?;笮纬傻模軌蚺c細(xì)胞內(nèi)的多肽和蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性的、不可逆性的、穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合。CFSE對(duì)細(xì)胞沒有毒性,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,與蛋白質(zhì)結(jié)合后不會(huì)再分離,CFSE本身帶有綠色熒光基團(tuán),能夠被488nm的激光激發(fā),熒光信號(hào)一般被FITC通道接收。在細(xì)胞增殖時(shí),細(xì)胞內(nèi)的CFSE才會(huì)被平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中,第二代子細(xì)胞的CFSE濃度為原始濃度的一半,第三代子細(xì)胞只有1/4,第四代子細(xì)胞只有1/8,以此類推,所以通過分析增殖后細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來計(jì)算細(xì)胞增殖的活性。
人外周血單個(gè)核細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種到U型底96孔板,加入CFSE,終濃度為5μM。IMQ(5μM)或CpG685(1μnol/L)與不同序列的NOG1-3寡核苷酸按照摩爾濃度比例1:1、1:3、1:9、1:27加入PBMC中,孵育6天。CD19-APC-H7(BD公司)、CD3-APC(BD公司)、LSR Fortessa(BD公司)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FITC-CFSE,該指標(biāo)反映細(xì)胞增殖情況。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次均得到類似的結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1A~圖1C所示,與對(duì)照組相比,寡核苷酸NOG1-3的濃度從0μM增加至27μM,寡核苷酸NOG1-3抑制IMQ誘導(dǎo)的CD19+B細(xì)胞增殖,使細(xì)胞成活率由30.60%降低至近乎0%;寡核苷酸NOG1-3抑制CpG685誘導(dǎo)的CD19+B細(xì)胞增殖,使細(xì)胞成活率由28.50%降低至近乎0%。以上結(jié)果說明本發(fā)明的含有CCT重復(fù)序列[(CCT)n]的寡核苷酸可以明顯抑制IMQ或CpG685誘導(dǎo)的人外周血CD19+B細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例2.本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸NOG1-3(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)IMQ和CpG685刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分泌的細(xì)胞因子IL6和IL-10的抑制作用
用Ficoll–Hypaque密度梯度離心法從人外周血分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Ficoll試劑購自Pharmacia公司,血液樣品由吉林省血液中心提供)。用臺(tái)酚蘭染色法確定人外周血單個(gè)核細(xì)胞的成活率為95%-99%。用CBA(BD)檢測(cè)人外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌的情況。
“CBA(cytometric bead array)”:即微量樣本多重蛋白定量技術(shù),是基于流式細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)的多重蛋白定量檢測(cè)方法。利用人工微球代替細(xì)胞,在該微球上包被細(xì)胞因子抗體,當(dāng)待測(cè)樣本中含有相應(yīng)的細(xì)胞因子時(shí),人工微球上的抗體能夠與細(xì)胞因子結(jié)合,再加上PE偶聯(lián)的抗細(xì)胞因子抗體,形成“三明治夾心”結(jié)構(gòu),通過激發(fā)PE熒光素,根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來定量細(xì)胞因子。
人外周血單個(gè)核細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種到U型底96孔板。測(cè)定寡核苷酸NOG1-3抑制IMQ刺激PBMC分泌IL-6和IL-10:IMQ(5μM)和NOG1、NOG2和NOG3(濃度分別為0、0.3、1.5、7.5和37.5μM)按照不同比例,與人PBMC一同培養(yǎng)36h,收集上清,CBA(BD)測(cè)定IL-6的含量;IMQ(5μM)和NOG1、NOG2和NOG3(濃度分別為0、0.1、0.5、2.5和12.5μM)按照不同比例,與人PBMC一同培養(yǎng)36h,收集上清,CBA測(cè)定IL-10的含量。
NOG1-3抑制CpG685刺激人PBMC分泌IL-6和IL-10:CpG685(1μM)和NOG1、NOG2和NOG3(濃度分別為0、1、3、9和27μM)按照不同比例,與人PBMC一同培養(yǎng)36h,收集上清,CBA法測(cè)定IL-6的含量;CpG685(1μM)和NOG1、NOG2和NOG3(濃度分別為0、1、3、9和27μM)按照不同比例,與人PBMC一同培養(yǎng)36h,收集上清,CBA法測(cè)定IL-10的含量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果顯示為平均值±SD。
如圖2A和圖2B所示,將培養(yǎng)基組和寡核苷酸組進(jìn)行比較,隨著寡核苷酸NOG1-3的濃度的增加,不同序列的寡核苷酸NOG1-3對(duì)IMQ刺激人PBMC分泌IL-6和IL-10的抑制作用增強(qiáng);如圖2C和圖2D所示,將培養(yǎng)基組和寡核苷酸組進(jìn)行比較,隨著寡核苷酸NOG1-3濃度的增加,不同序列的寡核苷酸NOG1-3對(duì)CpG685刺激人PBMC分泌IL-6和IL-10的抑制作用增強(qiáng)。以上結(jié)果說明本發(fā) 明的包含CCT重復(fù)序列[(CCT)n]的寡核苷酸可以明顯抑制IMQ或CpG685誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-6和IL-10,隨著寡核苷酸的濃度增加,抑制效果增強(qiáng),表現(xiàn)出劑量依賴性。
實(shí)施例3.對(duì)GCB-DLBCL細(xì)胞株OCI-Ly19和ABC-DLBCL細(xì)胞株OCI-Ly3.3的DNA序列中MYD88突變位點(diǎn)的測(cè)定
為了確定OCI-Ly19或OCI-Ly3.3細(xì)胞中MYD88 L265P突變位點(diǎn),采用Sanger法DNA測(cè)序的方法。在37℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中,用補(bǔ)充有10%胎牛血清(GIBCO)和1%青霉素/鏈霉素(Hyclone)的IMDM培養(yǎng)基(GIBCO)培養(yǎng)OCI-Ly19和OCI-Ly3.3細(xì)胞。用臺(tái)酚蘭染色法確定細(xì)胞的成活率為95%-99%。OCI-Ly19或OCI-Ly3.3細(xì)胞數(shù)為(2~3)×106提取基因組DNA,DNA提取試劑盒(購自全氏金生物試劑公司),PCR擴(kuò)增MYD88片段,DNA聚酶(Takara),上游引物為5’-gttgaagactgggcttgtcc-3’,下游引物為5’-aggaggcagggcagaagta-3’。每株細(xì)胞測(cè)定2個(gè)克隆,委托金唯智生物技術(shù)(北京)有限公司測(cè)序。
Sanger法DNA測(cè)序結(jié)果如圖3顯示,細(xì)胞OCI-Ly19的MYD88序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中的MYD88序列一致,不存在突變位點(diǎn),屬于MYD88野生型。細(xì)胞OCI-Ly3.3的MYD88序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中的MYD88序列存在一個(gè)堿基的突變位點(diǎn)即T突變?yōu)镃,屬于MYD88 L265P突變。
實(shí)施例4.細(xì)胞株OCI-Ly19和OCI-Ly3.3的TLR7和TLR9的表達(dá)
在37℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中,用補(bǔ)充有10%胎牛血清(GIBCO)和1%青霉素/鏈霉素(Hyclone)的IMDM培養(yǎng)基(GIBCO)培養(yǎng)OCI-Ly19和OCI-Ly3.3細(xì)胞。用臺(tái)酚蘭染色法確定細(xì)胞的成活率為95%-99%。每種細(xì)胞按細(xì)胞密度為5×105個(gè)/孔接種于96孔U型板中,進(jìn)行胞內(nèi)染色。細(xì)胞內(nèi)染色試劑購自BD公司,200μl Fixation Perm Buffer懸浮細(xì)胞,4℃,孵育20min,用200ul Perm Wash Buffer洗滌1遍,以2700rpm進(jìn)行離心,持續(xù)5min,丟棄上清液,加入TLR7-PE和TLR9-APC抗體染色,室溫避光孵育30min,用Perm Wash Buffer洗滌2遍,用400μl Perm Wash Buffer重懸細(xì)胞,LSR Fortessa(BD公司)流式細(xì)胞儀檢測(cè)OCI-Ly19或OCI-Ly3.3的TLR7-PE和TLR9-APC的平均熒光強(qiáng)度(MIF)。
如圖4A和圖4B所示,OCI-Ly19和OCI-Ly3.3的TLR7-PE和TLR9-APC的平均熒光強(qiáng)度(MIF)明顯高于同型對(duì)照組,這表明OCI-Ly19或OCI-Ly3.3細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)TLR7和TLR9。
實(shí)施例5.本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸NOG1-3(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)于GCB-DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly19細(xì)胞增殖無抑制作用,但抑制ABC-DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly3.3細(xì)胞的增殖
在37℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中,在補(bǔ)充有10%胎牛血清(GIBCO)和1%青霉素/鏈霉素(Hyclone)的PRIM-1640(GIBCO)培養(yǎng)基中培養(yǎng)OCI-Ly19。在補(bǔ)充有10%胎牛血清(GIBCO)和1%青霉素/鏈霉素(Hyclone)的IMDM(GIBCO)培養(yǎng)基中培養(yǎng)OCI-Ly3.3細(xì)胞。用臺(tái)酚蘭染色法確定細(xì)胞的成活率為95%-99%,細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)方可做細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)。OCI-Ly19細(xì)胞以8×103/孔的密度接種到平底96孔板,OCI-Ly3.3細(xì)胞以3×103/孔的密度接種到平底96孔板,100uL/孔,將濃度分別為0、5、10、20和40μM的寡核苷酸NOG1、NOG2和NOG3與OCI-Ly19或OCI-Ly3.3共培養(yǎng)72小時(shí),加入WST-1試劑(中國碧云天生物技術(shù)研究所)10ul,孵育3h,測(cè)定OD450,計(jì)算細(xì)胞活力,該實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,重復(fù)進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),結(jié)果表示為平均值±SD。
圖5表明隨著寡核苷酸NOG1-3濃度的增加,OCI-Ly19的細(xì)胞活力在100%左右,而OCI-Ly3.3的細(xì)胞活力由100%逐漸下降,但寡核苷酸NOG1-3的濃度在40μM時(shí),OCI-Ly3.3細(xì)胞活力在20%左右。
細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)說明了本發(fā)明的包含CCT重復(fù)序列[(CCT)n]的寡核苷酸對(duì)于MYD88野生型的GCB-DLBCL的細(xì)胞株OCI-Ly19細(xì)胞增殖無抑制作用,但明顯抑制具有MYD88 L265P突變的ABC-DLBCL細(xì)胞株OCI-Ly3.3細(xì)胞的增殖,這種抑制作用呈劑量相關(guān)性。由此可見,本發(fā)明的包含CCT重復(fù)序列[(CCT)n]的寡核苷酸可有效用于治療具有MYD88 L265P突變的ABC型彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。
實(shí)施例6.本發(fā)明的不同序列的寡核苷酸NOG1-3(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)對(duì)OCI-Ly19和OCI-Ly3.3分泌的細(xì)胞因子IL-10的影響
在37℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中,用補(bǔ)充有10%胎牛血清(GIBCO)和1%青霉素/鏈霉素(Hyclone)的IMDM培養(yǎng)基(GIBCO)培養(yǎng)OCI-Ly19和OCI-Ly3.3細(xì)胞。用臺(tái)酚蘭染色法確定細(xì)胞的成活率為95%-99%。OCI-Ly19和OCI-Ly3.3細(xì)胞均以2×105/孔密度接種到96孔板,將濃度分別為0、2、4、8、10和20μM的寡核苷酸NOG1、NOG2和NOG3與OCI-Ly19或OCI-Ly3.3共培養(yǎng)36小時(shí)。CBA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-10。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次均得到類似的結(jié)果。
如圖6所示,本發(fā)明的寡核苷酸NOG1-3對(duì)OCI-Ly19細(xì)胞分泌的IL-10無抑制作用,但NOG1-3可以明顯抑制OCI-Ly3.3細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-10,并且這種抑制作用呈劑量相關(guān)性。
實(shí)施例7.NOG3(SEQ ID NO.6)對(duì)OCI-Ly19和OCI-Ly3.3細(xì)胞周期的影響
在37℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中,用補(bǔ)充有10%胎牛血清(GIBCO)和1%青霉素/鏈霉素(Hyclone)的IMDM培養(yǎng)基(GIBCO)培養(yǎng)OCI-Ly19和OCI-Ly3.3細(xì)胞。用臺(tái)酚蘭染色法確定細(xì)胞的成活率為95%-99%。細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)方可做細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。OCI-Ly19和OCI-Ly3.3細(xì)胞均以1.25×105/孔密度接種到96孔板,濃度分別為0、15和30μM寡核苷酸NOG3分別與OCI-Ly19或OCI-Ly3.3共培養(yǎng)72小時(shí),碘化丙啶PI(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)染色,LSR Fortessa(BD公司)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次均得到類似的結(jié)果。
如圖7A和圖7B所示,本發(fā)明的寡核苷酸NOG3對(duì)于OCI-Ly19細(xì)胞周期無影響作用;但影響OCI-Ly3.3的細(xì)胞周期,與對(duì)照組相比,OCI-Ly3.3細(xì)胞周期G1期細(xì)胞比例明顯增加,S期和G2,M期明顯減少,這說明本發(fā)明的寡核苷酸NOG3阻止OCI-Ly3.3細(xì)胞由G1期向S期和G2,M期轉(zhuǎn)變,使得細(xì)胞停留在G1期,導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢。
上文對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施例進(jìn)行了描述,但是,這些實(shí)施例僅僅用于 舉例說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)的前提下對(duì)這些實(shí)施例作出多種改變、修改和替換。本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求來限定,并且本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)的組合物及其應(yīng)用以及它們的等同物也被所附的權(quán)利要求涵蓋。