本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥及化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)化合物作為結(jié)核分枝桿菌抑制劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺結(jié)核疾病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis(MTB)引起的呼吸道傳染性疾病。我國現(xiàn)在是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。

多藥耐藥和廣泛藥耐藥是制約抗菌藥物臨床使用的關(guān)鍵因素?？菇Y(jié)核藥物也同樣存在這些現(xiàn)象。最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，在肺結(jié)核感染病例中有超過40％的結(jié)核菌對至少一種二線藥物耐藥。耐藥結(jié)核病的治療所需治療周期長于普通患者，治療費用是普通患者的100倍。因此，發(fā)現(xiàn)并研發(fā)新的抗結(jié)核藥物對患者及其家庭、社會都有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)化合物作為結(jié)核分枝桿菌抑制劑的應(yīng)用。

具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物在制備治療和/或預(yù)防因結(jié)核分枝桿菌感染引起的疾病(如肺結(jié)核)的藥物中的應(yīng)用屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

(a)制備能抑制結(jié)核分枝桿菌生長的制劑；

(b)制備能抑制哺乳動物細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌增殖的制劑；

(c)制備能提高結(jié)核分枝桿菌感染的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)一氧化氮誘導(dǎo)率的制劑。

在本發(fā)明的實施例中，所述具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物具體可為3-氟鄰苯二酚或其可藥用鹽。

本發(fā)明還請求保護(hù)一種治療和/或預(yù)防因結(jié)核分枝桿菌感染引起的疾病的藥物。

所述治療和/或預(yù)防因結(jié)核分枝桿菌感染引起的疾病(如肺結(jié)核)的藥物的有效成分具體為具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物(如3-氟鄰苯二酚或其可藥用鹽)。

本發(fā)明還請求保護(hù)具有如下功能中的至少一種的制劑；

(1)能抑制結(jié)核分枝桿菌生長；

(2)能抑制哺乳動物細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌增殖；

(3)能提高結(jié)核分枝桿菌感染的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)一氧化氮誘導(dǎo)率的制劑。

所述制劑的有效成分具體為具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物。

在本發(fā)明的實施例中，所述具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物具體可為3-氟鄰苯二酚或其可藥用鹽。

在本發(fā)明中，所述結(jié)核分枝桿菌為牛型結(jié)核分枝桿菌，具體為牛型結(jié)核分枝桿菌BCG 1173P2。

在本發(fā)明中，所述藥物或所述制劑的劑型可為乳劑、油劑、粉劑、水劑、懸浮劑、片劑、顆粒劑或膠囊劑。

在本發(fā)明中，所述哺乳動物細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，具體為THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞。

在本發(fā)明中，所述能抑制結(jié)核分枝桿菌生長具體體現(xiàn)為：所述具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物的濃度大于312.256μM(如312.256～624.512μM)時能抑制1.5×10⁵CFU/mL的所述結(jié)核分枝桿菌的生長。

在本發(fā)明中，所述能抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌增殖具體體現(xiàn)為：所述具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物的濃度大于4.879μM時能抑制所述巨噬細(xì)胞內(nèi)所述結(jié)核分枝桿菌的增殖。

在本發(fā)明中，所述提高結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)一氧化氮誘導(dǎo)率具體體現(xiàn)為：所述具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物的濃度大于5.0μM(如5.0-312μM)時能提高被所述結(jié)核分枝桿菌感染的所述巨噬細(xì)胞內(nèi)一氧化氮的誘導(dǎo)率。

藥理試驗表明，本發(fā)明所提供的具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物——3-氟鄰苯二酚具有以下藥效：對結(jié)核分枝桿菌的生長具有直接的抑制作用；能夠抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的增殖；能夠提高結(jié)核桿菌感染巨噬細(xì)胞內(nèi)一氧化氮的表達(dá)水平。另外，細(xì)胞毒性試驗還表明，本發(fā)明所提供的具有含氟鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物——3-氟鄰苯二酚未見明顯毒副作用，細(xì)胞藥效學(xué)試驗中，在有效劑量范圍內(nèi)，細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的毒性變化。因此，本發(fā)明將對于研發(fā)新的抗結(jié)核藥物具有重要意義。

附圖說明

圖1為供試藥對結(jié)核分枝桿菌的直接抑制作用。其中，1-12依次表示濃度為624.512μM、312.256μM、156.128μM、78.064μM、39.032μM、19.516μM、9.758μM、4.879μM、2.440μM、1.220μM、0.610μM、0.305μM的化合物作用于牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG 1173P2。圖中每個孔上的數(shù)值表示的是熒光值。

圖2為供試藥對巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的抑制作用。

圖3為供試藥對結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)一氧化氮誘導(dǎo)效應(yīng)的測試結(jié)果。3-FC表示3-氟鄰苯二酚。

圖4為供試藥對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性測試結(jié)果。3-FC表示3-氟鄰苯二酚。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG 1173P2：由哈佛醫(yī)學(xué)院Deborah Tan Hung饋贈，BCG 1173P2菌株中攜帶有pUV3583c-gfp質(zhì)粒，能夠表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)(參考文獻(xiàn)：Abdel-Mageed WM,Ren B,et al.Endophytic Streptomyces sp.Y3111from traditional Chinese medicine produced antitubercular pluramycins.Appl Microbiol Biotechnol,2014,98:1077-85.)。

THP-1細(xì)胞：ATCC編號為TIB-202。

改良型1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)。胎牛血清(Sera Pro，USA)。Middlebrook 7H9Broth(Becton,Dickinson and Company)。佛波酯(phorbol-12-myristate acetate，PMA，碧云天生物技術(shù)研究所)。MTT(Sigma-Aldrich，USA)。DMSO(Amersico公司)。3-氟鄰苯二酚(純度>99％，Sigma-Aldrich，USA)。DAF-FM DA(NO熒光探針，碧云天生物技術(shù)研究所)。Multilabel Reader(PerkinElmer，USA)。Multi-mode detection platform(SpectraMax Paradigm，Molecular Devices，USA)。

實施例1、供試藥對結(jié)核分枝桿菌的直接抑制作用

供試藥：3-氟鄰苯二酚，Sigma-Aldrich產(chǎn)品，貨號344656。

將牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG 1173P2調(diào)整菌液濃度至OD₆₀₀的讀值為0.05(對應(yīng)為1.5×10⁷CFU/mL)，接種于96孔板，每孔99μL。每孔加入供試藥的2倍濃度梯度稀釋液1.0μL，37℃共孵育72h，系列孵育體系中供試藥的終濃度由小到大依次為0.305μM、0.610μM、1.220μM、2.440μM、4.879μM、9.758μM、19.516μM、39.032μM、78.064μM、156.128μM、312.256μM、624.512μM；同時設(shè)置陽性對照利福平組(即孵育體系中有BCG 1173P2菌株，但是不加入供試藥，而是加入利福平)，陰性對照二甲基亞砜組(DMSO組，僅加入DMSO 1μL)。將各組于Multilabel Reader熒光酶標(biāo)儀下檢測GFP熒光值，激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為535nm。實驗重復(fù)三次。

結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，陰性對照二甲基亞砜組和0.305～156.128μM不同劑量的供試藥孔均具有明顯綠色熒光；而陽性對照利福平組和321.256μM及624.512μM的供試藥孔均未呈現(xiàn)顯著的綠色熒光?？梢?，供試藥對BCG 1173P2菌株在312.256～624.512μM范圍有直接抑制作用，且三次重復(fù)實驗結(jié)果一致。

實施例2、供試藥對巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的抑制作用

供試藥：3-氟鄰苯二酚，Sigma-Aldrich產(chǎn)品，貨號344656。

將THP-1細(xì)胞以5×10⁵個/mL的濃度接種于96孔板，每孔100μL，以終濃度100 ng/mL佛波酯(PMA)分化24h后細(xì)胞貼壁，得到THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞。采用牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG 1173P2以MOI＝10的侵染度侵染THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞4h。PBS洗去胞外BCG 1173P2，加入199μL含10％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的1640培養(yǎng)基，然后加入不同濃度供試藥各1μL，使其在體系中的終濃度分別為2.440μM、4.879μM、9.758μM、19.516μM、39.032μM、78.064μM、156.128μM、312.256μM、624.512μM，繼續(xù)孵育48h，檢測胞內(nèi)GFP熒光強度，每組設(shè)4個復(fù)孔。按照如下公式計算供試藥對巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的抑制率：

抑制率％＝(1-供試藥熒光強度/利福平熒光強度)×100％

同時設(shè)陽性對照利福平組(細(xì)胞+BCG+利福平，即以等量利福平替代供試藥)、模型組(DMSO組)(細(xì)胞+BCG+DMSO，即以等量DMSO替代供試藥)和空白對照組(THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞未感染BCG 1173P2菌株)。

以供試藥濃度的對數(shù)(Log₁₀[μM])為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，得到圖2，可見供試藥在所示劑量范圍內(nèi)具有良好的量效關(guān)系。可見，供試藥的濃度大于4.879μM時能抑制所述巨噬細(xì)胞內(nèi)所述結(jié)核分枝桿菌的增殖。

采用Graphpad Prism軟件Sigmoidal dose-response分析計算，得EC₅₀＝8.526μM，R²＝0.9208。

實施例3、供試藥對結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)一氧化氮誘導(dǎo)效應(yīng)的測試

供試藥：3-氟鄰苯二酚，Sigma-Aldrich產(chǎn)品，貨號344656。

將THP-1細(xì)胞以5×10⁵個/mL的濃度接種于96孔板，每孔100μL，以100ng/mL佛波酯(PMA)分化24h貼壁后，得到THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞。采用牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG 1173P2以MOI＝10的侵染度侵染THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞4h。PBS洗去胞外BCG 1173P2，加入199μL含10％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的1640培養(yǎng)基，然后加入不同濃度供試藥各1μL，使其在體系中的終濃度分別為5μM、20μM、78μM、312μM，分別繼續(xù)孵育3h、6h、12h及24h。于不同時間藥物作用后，棄去細(xì)胞上清，加入5μmol/L的DAF-FM DA(NO熒光探針)，每孔25μL，避光孵育30min。用PBS洗滌細(xì)胞，以去除胞外的DAF-FM DA。以495nm為激發(fā)波長，535nm為檢測波長，讀取每孔熒光值。每組設(shè)3～4個復(fù)孔。按照如下公式計算供試藥對結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)一氧化氮的誘導(dǎo)率：

誘導(dǎo)率％＝(供試藥熒光值/利福平熒光值-1)×100％

同時設(shè)陽性對照利福平組(細(xì)胞+BCG+利福平，即以等量利福平替代供試藥)。

結(jié)果如圖3所示，供試藥作用于BCG 1173P2感染的THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞6h時，NO誘導(dǎo)率達(dá)到峰值，以20μM劑量組最為顯著。陽性對照利福平于作用12h 時達(dá)到峰值，其對NO的誘導(dǎo)作用遲于供試藥，且作用強度不及供試藥。

實施例4、供試藥對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性測試

供試藥：3-氟鄰苯二酚，Sigma-Aldrich產(chǎn)品，貨號344656。

將THP-1細(xì)胞以5×10⁵個/mL的濃度接種于96孔板，每孔100μL，以100ng/mL佛波酯(PMA)分化24h貼壁后，得到THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞。加入不同濃度供試藥(2.440μM、4.879μM、9.758μM、19.516μM、39.032μM、78.064μM、156.128μM、312.256μM、624.512μM，各濃度均為供試藥在體系中的終濃度)，繼續(xù)孵育44h。加入5mg/mL MTT溶液10μL/孔，4h后加入DMSO溶液100μL/孔。置振蕩器上震蕩10min，于波長570nm處檢測吸光度。每組設(shè)3個復(fù)孔。

同時設(shè)模型組(DMSO組，以等體積DMSO替代供試藥，其余操作同藥物處理組)和空白對照組(以等體積培養(yǎng)基替代供試藥，其余操作同藥物處理組)。

結(jié)果如圖4所示，OD570值與細(xì)胞活性呈正比，即OD570值越大，細(xì)胞活性越強。從圖中可見，供試藥在2.44～624.512μM劑量范圍內(nèi)對THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞沒有顯示細(xì)胞毒性。