本發(fā)明屬于醫(yī)藥及日用化學(xué)品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于皮膚美白的藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
皮膚是人體健康的第一道防線，也是容顏靚麗的第一體現(xiàn)者，擁有健康、白皙、富有彈性的皮膚是所有人追求的目標(biāo)。東方女性對白暫美麗的皮膚尊愛有加，我國女性歷來崇尚“膚如雪、凝如脂”，白凈細嫩的肌膚一直是東方人來衡量女性的重要標(biāo)準(zhǔn)，在我國民間就有“一白遮九丑”的說法。近年來，美白類化妝品市場日趨活躍，產(chǎn)品銷售與日俱增，已成為護膚化妝品的主流品種之一。
人類因為皮膚內(nèi)黑素的數(shù)量及分布情況不同導(dǎo)致不同的顏色。人體皮肽的顏色主要決定于表皮內(nèi)黑色素含量的多少。黑色素是一種蛋白質(zhì)衍生物，里褐色或黑色，是由黑素細胞產(chǎn)生的。由于黑素的數(shù)量、大小、類型及分布情況不同，從而決定了不同的膚色。黃種人皮膚內(nèi)的黑素主要分布在表基底層，棘層內(nèi)較少；黑種人則在基底層、棘層及顆粒層都有大量黑素存在；白種人皮膚內(nèi)黑素分布情況與黃種人相同，只是黑素的數(shù)量比黃種人少。
黑素細胞是皮膚的重要組成細胞之一，呈樹狀突起，細胞內(nèi)形成的黑色素通過樹狀突起運輸?shù)浇琴|(zhì)層細胞內(nèi)。皮膚顏色的深淺是由黑素細胞合成黑素數(shù)量的多少決定。皮膚黑素的形成過程包括黑素細胞的遷移、黑素細胞的分裂成熟、黑素小體的形成、黑素顆粒的轉(zhuǎn)運以及黑素的排泄等一系列復(fù)雜的生理生化過程，從生物化學(xué)反應(yīng)的角度 來看，黑素的形成必須有三種基本物質(zhì)：酪氨酸為制造黑素的主要原料；酪氨酸酶是酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楹谒氐闹饕匏倜福瑸殂~及蛋白質(zhì)的組合物；酪氨酸在酪氨酸酶的作用下產(chǎn)生黑素。
目前公認(rèn)的黑素形成途徑為：酪氨酸-多巴-多巴醌-多巴色素-二羥基吲哚-酮式吲哚-黑素。影響黑素形成的因素很多，大體上可以分為細胞外、細胞內(nèi)以及外源性因素(如紫外線)的影響等幾個方面。
細胞外的影響因素：近年來，有關(guān)黑素形成的分子生物學(xué)研究證明，黑素細胞生成黑素的活性受到網(wǎng)絡(luò)控制。皮膚內(nèi)黑素細胞、角質(zhì)形成細胞、成纖細胞、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等組成“電訊”交互網(wǎng)絡(luò)(即胞質(zhì)網(wǎng)絡(luò))。在這一網(wǎng)絡(luò)中，許多細胞因子對黑素細胞的繁殖分化、樹突形成和黑素合成都有影響。能夠促進黑素細胞生長、存活的因子有；堿性成纖細胞生長因子、內(nèi)皮素、神經(jīng)細胞生長因子等；抑制黑素細胞增殖，使酪氨酸酶活性降低的有：白細胞介素-1、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子能促進黑素細胞分化及黑素合成；干擾素在一定條件下，能使黑素細胞形態(tài)改變，生長抑制；炎癥介質(zhì)是人黑素細胞的促分裂源，能引起黑素細胞快速增生，并對黑素細胞有趨化作用。
細胞內(nèi)的影響因素：黑素細胞中決定黑素合成速率的是細胞內(nèi)的多種酶。酪氨酸酶是黑素生物合成過程中所需的酶，隨著黑素合成研究的不斷進展，人們發(fā)現(xiàn)黑素細胞中還存在其他與黑素合成相關(guān)的物質(zhì)。與酪氨酸酶相關(guān)的兩種蛋白TPRl(DHICA氧化酶)和TRP2(多巴色素互變酶)在黑素的合成過程中發(fā)揮著重要的作用。它們除了對酪 氨酸酶合成黑素具有協(xié)助作用以外，還具有合成其他不同類型色素的重要作用。細胞內(nèi)許多細胞因子，如堿性成纖細胞生長因子、肝細胞生長因子/擴散因子、內(nèi)皮素等都能促進體外黑素細胞增殖，有些因子還能刺激酪氨酸酶活性，使黑素細胞高度色素化。
外源性因素的影響：紫外線是人體長期接觸的一個外界刺激因素，是人類黑素細胞增殖和皮膚色素沉著增多的主要生理性刺激。皮膚變黑主要是由中長波紫外線(UVB和INA)引起，紫外線能引起黑素細胞的增殖及促進黑素產(chǎn)生，出現(xiàn)皮膚色素沉著。
關(guān)于黑色素的生成抑制機理，歸納起來可分為細胞內(nèi)抑制、細胞外抑制以及外援因素控制等幾方面。
(一)黑色素細胞的胞內(nèi)抑制
黑色素的形成的生物化學(xué)過程現(xiàn)已研究比較清楚了，認(rèn)為它是由酪氨酸在含高價銅離子(Cu2+)的酪氨酸酶作用下，氧化生成3，4-二羥基苯丙氨酸(多巴)，再由酪氨酸酶氧化為多巴醌，進一步氧化為5，6-二羥基吲哚，聚合后生成黑色素。
從上面可以看出，在黑色素細胞內(nèi)抑制黑色素生成可以通過以下幾個途徑。
酪氨酸酶的抑制：
a、酪氨酸酶的破壞性抑制就是可以直接對酪氨酸酶進行修飾、改性的物質(zhì)，使酪氨酸酶失去對黑色素前體---酪氨酸的作用，從而達到抑制黑色素形成的目的。
b、酪氨酸酶的非破壞型抑制。所謂酪氨酸酶的非破壞性抑制，即 不對酪氨酸酶本身進行修飾、改性，而是通過抑制酪氨酸酶的生物合成或取代酪氨酸酶的作用底物，從而達到抑制黑色素形成的目的。
多巴色素互變酶的抑制：多巴色素互變酶是一種與酪氨酸酶有關(guān)的蛋白質(zhì)，其作用機理是促使所作用的底物發(fā)生重排，生成底物的某一同分異構(gòu)體，最終生成另一黑色素。即在由多巴色素自發(fā)脫羧、重排生成5，6-二羥基吲哚(DHI)的同時，黑色素細胞內(nèi)部分多巴色素正是由于多巴色素互變酶的存在而發(fā)生重排生成5，6-二羥基吲哚-2-羧酸(DHICA)。因此該酶主要調(diào)節(jié)5，6-二羥基吲哚-2羧酸的生成速率，從而影響所生成的黑色素分子的大小、結(jié)構(gòu)和種類。
(二)黑色素細胞的胞外抑制
黑色素的形成不僅是黑色素細胞的胞內(nèi)行為，同時也是胞外物質(zhì)作用的結(jié)果。內(nèi)皮素是黑色素形成信號傳導(dǎo)途徑中重要的信號分子，抑制內(nèi)皮素可抑制黑色素的形成。內(nèi)皮素是一類由21個氨基酸組成的多肽物質(zhì)，其中內(nèi)皮素-1(ET-1)、內(nèi)皮素-2(ET-2)和內(nèi)皮素-3(ET-3)均已被分離。
(三)環(huán)境因素的影響
1、干擾、控制黑色素的代謝途徑
美白活性物質(zhì)通過抑制黑色素顆粒轉(zhuǎn)移至角質(zhì)形成細胞或加速角質(zhì)形成細胞中黑色素向角質(zhì)層轉(zhuǎn)移，軟化角質(zhì)層和加速角質(zhì)層脫落等方式達到美白的效果。
2、防御紫外線、抵抗自由基
皮膚之所以會變黑，外源性原因是主要的。紫外線的刺激會使黑 色素細胞增殖、分化，激活酪氨酸酶的活性，氧化自由基，尤其以UVB紫外線作用更為強烈。
隨著人們對于美的追求，對于皮膚美白的研究日益升溫，從中醫(yī)藥中發(fā)掘皮膚美白的物質(zhì)，實現(xiàn)健康、快速的皮膚美白效果，為美白產(chǎn)品的研究開發(fā)提供了參考。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供一種用于皮膚美白的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物由以下重量份數(shù)的各原料提取混合制得：紅葡萄酒2-50份、熊果苷0.01-0.5份、人參莖葉總皂苷0.01-0.5份、維他命C0.01-0.5份、維他命E 0.01-0.5份、白茯苓1-20份、白芨1-20份、桑葉1-20份、當(dāng)歸1-20份、川芎1-20份、金銀花1-20份。
優(yōu)選的，所述各原料的重量份數(shù)配比如下：紅葡萄酒5-25份、熊果苷0.02-0.25份、人參莖葉總皂苷0.02-0.25份、維他命C 0.02-0.25份、維他命E 0.02-0.25份、白茯苓2-10份、白芨2-10份、桑葉2-10份、當(dāng)歸2-10份、川芎2-10份、金銀花2-10份。
本發(fā)明還提供這種藥物組合物的制備方法，方法選自：
A：處方中白茯苓、白芨、桑葉、當(dāng)歸、川芎、金銀花加水煎煮，濾過，濾液濃縮，干燥成粉。臨用時將上述粉末與紅葡萄酒、熊果苷、人參莖葉總皂苷合并；
B：處方中白茯苓、白芨、桑葉、當(dāng)歸、川芎、金銀花加乙醇回流提取，濾過，濾液濃縮，干燥成粉。臨用時將上述粉末與紅葡萄酒、熊果苷、人參莖葉總皂苷合并。
制備方法A所述水煎煮的操作中加水提取2次，每次用水量為藥材重量6-8倍，每次煎煮1小時。
濃縮操作為50℃-70℃減壓濃縮，干燥方式為40℃-60℃真空干燥或噴霧干燥。
制備方法B所述的乙醇水溶液回流提取操作中乙醇水溶液回流提取2次，每次乙醇水溶液的用量為藥材重量6-8倍，每次提取1小時；所述的乙醇水溶液濃度為10％-70％。
濃縮操作為同樣是50℃-70℃減壓濃縮，干燥方式為40℃-60℃真空干燥或噴霧干燥。
干燥后物料粉碎保存，臨用時與紅葡萄酒、熊果苷、人參莖葉總皂苷合并，作為藥物組合物。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物的用途，給用途是加入制劑學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑，用于制備美白皮膚的藥物、保健品、化妝品，如面膜、化妝水、霜、乳液、凝膠等。
制劑學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑選自羧甲基纖維素鈉、卡波姆、聚丙烯酸鈉、甘油、丙二醇、山梨醇、羥丙基-β-環(huán)糊精、聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40、聚氧乙烯氫化蓖麻油HS15中的一種或多種。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
分別稱取白茯苓10g、白芨200g、桑葉100g、當(dāng)歸50g、川芎50g、金銀花10g加3360ml水煎煮1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，藥渣加水2520ml煎煮1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，濾液合并，60℃減壓(-0.09MPa)成浸膏，浸膏60℃真空干燥，粉碎，得細粉58g，加入紅葡萄酒20g、熊果苷0.5g、人參莖葉提取物0.2g、維他命E 1g、維他命C 0.1g，混合均勻。
實施例2
分別稱取白茯苓150g、白芨50g、桑葉10g、當(dāng)歸150g、川芎200g、金銀花100g加5280ml水煎煮1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，藥渣加水3960ml煎煮1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，濾液合并，50℃減壓(-0.09MPa)成浸膏，浸膏40℃真空干燥，粉碎，得細粉81g，加入紅葡萄酒300g、熊果苷1g、人參莖葉提取物0.4g、維他命E 0.2g、維他命C 1g，混合均勻。
實施例3
分別稱取白茯苓200g、白芨150g、桑葉50g、當(dāng)歸10g、川芎100g、金銀花200g加5680ml 10％乙醇水溶液回流提取1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，藥渣加4260ml 10％乙醇水溶液回流提取1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，濾液合并，70℃減壓(-0.09MPa)成浸膏，浸膏50℃真空干燥，粉碎，得細粉95g，加入紅葡萄酒500g、熊果苷0.4g、人參莖葉提取物0.1g、維他命E 0.1g、維他命C 0.5g， 混合均勻。
實施例4
分別稱取白茯苓50g、白芨100g、桑葉200g、當(dāng)歸200g、川芎10g、金銀花150g加5680ml 30％乙醇水溶液回流提取1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，藥渣加4260ml 30％乙醇水溶液回流提取1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，濾液合并，60℃減壓(-0.09MPa)成浸膏，浸膏60℃真空干燥，粉碎，得細粉86g，加入紅葡萄酒200g、熊果苷0.1g、人參莖葉提取物0.5g、維他命E 0.5g、維他命C 0.2g，混合均勻。
實施例5
分別稱取白茯苓100g、白芨10g、桑葉150g、當(dāng)歸100g、川芎150g、金銀花50g加4480ml 50％乙醇水溶液回流提取1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，藥渣加3360ml 50％乙醇水溶液回流提取1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，濾液合并，50℃減壓(-0.09MPa)成浸膏，浸膏50℃真空干燥，粉碎，得細粉67g，加入紅葡萄酒400g、熊果苷0.3g、人參莖葉提取物1g、維他命E 0.3g、維他命C 0.4g，混合均勻。
實施例6
分別稱取白茯苓100g、白芨100g、桑葉100g、當(dāng)歸100g、川 芎100g、金銀花100g加4800ml 70％乙醇水溶液回流提取1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，藥渣加3600ml 70％乙醇水溶液回流提取1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，濾液合并，60℃減壓(-0.09MPa)成浸膏，浸膏60℃真空干燥，粉碎，得細粉75g，加入紅葡萄酒100g、熊果苷3g、人參莖葉提取物3g、維他命E 2g、維他命C 2g，混合均勻。
實施例7
分別稱取白茯苓100g、白芨100g、桑葉100g、當(dāng)歸50g、川芎50g、金銀花50g加3600ml水煎煮1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，藥渣加水2700ml煎煮1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，濾液合并，70℃減壓(-0.09MPa)成浸膏，浸膏50℃真空干燥，粉碎，得細粉55g，加入紅葡萄酒100g、熊果苷5g、人參莖葉提取物5g、維他命E 4g、維他命C 4g，混合均勻。
實施例8
分別稱取白茯苓200g、白芨100g、桑葉100g、當(dāng)歸10g、川芎10g、金銀花100g加4160ml水煎煮1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，藥渣加水3120ml煎煮1小時，120目不銹鋼網(wǎng)自然濾過，濾液合并，50℃減壓(-0.09MPa)成浸膏，浸膏40℃真空干燥，粉碎，得細粉76g，加入紅葡萄酒300g、熊果苷2g、人參莖葉提取物2g、維他命E 5g、維他命C 5g，混合均勻。
實施例9
取實施例1制備的藥物混合物10g，加甘油10g，卡波姆0.1g，水80g，混合均勻，200轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，等分為5份，分別加入到面膜紙內(nèi)，裝袋密封，得美白面膜。
實施例10
取實施例2制備的藥物混合物40g，加水40g，混合均勻，200轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，再加入丙二醇20g，卡波姆1g，混合均勻，得美白凝膠。
實施例11
取實施例3制備的藥物混合物60g，50℃減壓(-0.09MPa)濃縮至30g，加山梨醇10g，水100g混合均勻，加熱至70℃；另取聚氧乙烯氫化蓖麻油HS152g，羊毛脂50g，凡士林10g加入至融化，繼續(xù)加熱至70℃；將水相緩緩倒入油相中，邊加邊攪拌，至乳化完全，放冷，得美白軟膏。
實施例12
取實施例4制備的藥物混合物30g，加甘油10g，水100g混合均勻，加熱至70℃；另取聚氧乙烯氫化蓖麻油RH402g，羊毛脂50g，凡士林10g加入至融化，繼續(xù)加熱至70℃；將水相緩緩倒入油相中，邊加邊攪拌，至乳化完全，放冷，得美白軟膏。
實施例13
取實施例5制備的藥物混合物50g，加水200g，混合均勻，200轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，再加入山梨醇20g，卡波姆1g，混合均勻，得美白凝膠。
實施例14
取實施例6制備的藥物混合物10g，加丙二醇20g，卡波姆0.2g，水170g，混合均勻，200轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，等分為5份，分別加入到面膜紙內(nèi)，裝袋密封，得美白面膜。
實施例15
取實施例7制備的藥物混合物20g，加甘油10g，水100g混合均勻，加熱至70℃；另取聚氧乙烯氫化蓖麻油RH405g，單硬脂酸甘油酯50g，羊毛脂50g，凡士林10g加入至融化，繼續(xù)加熱至70℃；將水相緩緩倒入油相中，邊加邊攪拌，至乳化完全，放冷，得美白霜。
實施例16
取實施例8制備的藥物混合物20g，加丙二醇50g，水200g混合均勻，加熱至70℃；另取聚氧乙烯氫化蓖麻油RH4010g，羊毛脂50g，凡士林20g加入至融化，繼續(xù)加熱至70℃；將水相緩緩倒入油相中，邊加邊攪拌，至乳化完全，放冷，得美白乳。
本發(fā)明采用以下試驗證明藥物組合物的美白作用，說明該藥物組合物用于皮膚美白的依據(jù)。
試劑：0.5％脫氧膽酸鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，蒸餾水配制；0.1％L-DOPA溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，每次用0.1mol/L磷酸緩沖液新鮮配制；0.25％胰酶溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；l mol/L氫氧化鈉溶液；RPMI 1640培養(yǎng)液；0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)。
儀器：普通離心機(轉(zhuǎn)速為1000r/min-10000r/min)；7230G分光光度計(上海分析儀器廣)；電熱恒溫水浴鍋。
細胞培養(yǎng)：B-16黑色素瘤細胞株(上海市中科院細胞所)，待細胞生長至亞融合狀態(tài)，經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化，用含有10％牛血清的RPMI l 640培養(yǎng)液傳代，置于CO2培養(yǎng)箱37℃、5％CO2飽和濕度環(huán)境進行培養(yǎng)。每一次實驗取自同一傳代細胞，初始接種濃度為5000個/cm2左右。細胞接種24小時后，用添加藥物組合物(藥物組合物濃度為100ug/ml)的新鮮培養(yǎng)液換液一次。繼續(xù)孵育72小時后收獲細胞。將培養(yǎng)到期的各組細胞經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化離心后，用PBS緩沖液清洗2次，再用PBS緩沖液將沉淀細胞吹打成懸液計數(shù)后備用。
實施例17
藥物組合物對B-16細胞酪氨酸酶活性的影響
酪氨酸酶活性是根據(jù)多巴向多巴醌氧化的速度確定的。取備用細胞懸液加PBS緩沖液調(diào)節(jié)細胞密度在105/ml左右，各吸取1ml細胞懸液分別置于5個平行試管中，離心后棄去上清液，加人1ml質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為0.5％脫氧膽酸鈉溶液，并充分振搖使細胞溶解，制成含有活性酪氨酸酶的細胞裂解物。將試管置于0℃15分鐘，再置于37℃10分鐘，加入0.1％L-DOPA溶液，振搖后在分光光度計475nm處，分別于0分鐘和10分鐘時讀取吸光度值，計算兩個時段的吸光度值的差值，用各給藥組吸光度值與空白組的對比，作為評價酪氨酸酶活性高低的指標(biāo)。
表1藥物組合物對B-16細胞酪氨酸酶活性的影響(％)
與對照組相比，*(P<0.05),**(P<0.01),***(P<0.001)
實施例18
藥物組合物對B-16細胞黑色素合成的影響
取備用細胞懸液加PBS緩沖液調(diào)節(jié)細胞密度在105/ml左右，各吸取1ml細胞懸液分別置于5個平行試管中，離心后棄去上清液，
先加入200ul蒸餾水使細胞重新懸浮，然后加入1ml l:1乙醇:乙醚 液以溶解非黑色素的不透明顆粒，在室溫下放置15min，離心并棄去上清液，加入l ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)由1O％二甲基亞砜、lmol/L NaOH溶液.置于80℃水浴30min，使細胞團塊完全溶解，于470nm處測定吸光度值，各藥物組合物組與對照組吸光度比值，作為評價黑色素含量大小的指標(biāo)。
表2藥物組合物對B-16細胞黑色素含量的影響(％)
與對照組相比，*(P<0.05),**(P<0.01),***(P<0.001)
實施例19
藥物組合物對小鼠耳廓微循環(huán)的影響
試驗選用60只小鼠，體重18-22g，按體重隨機分為6組，每組10只，雌雄各半。按表11所示劑量每日皮膚給藥1次，連續(xù)給藥7天，對照組皮膚涂抹同體積的空白溶劑。于末次給藥后1h，腹腔注射40mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，在SZ-ST實體顯微鏡下計數(shù)小鼠右耳廓同一部位與1mm直線交點的毛細血管數(shù)。
表3藥物組合物對小鼠耳廓微循環(huán)的影響
與對照組相比，*(P<0.05),**(P<0.01),***(P<0.001)