本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及發(fā)酵大豆提取物在制備防治老年癡呆有關(guān)疾病藥物和保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
老年性癡呆是指發(fā)生在老年期的各種癡呆綜合征，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、血管性癡呆(Vascular dementia，VD)、混合性癡呆及其他癡呆，前兩種為其主要類型，占所有癡呆的90％。截止2013年底，全球癡呆患者已超過4400萬，預(yù)計到2050年將突破1.35億人，其中發(fā)展中國家的患者占到總?cè)藬?shù)的62％。我國已經(jīng)進入到老齡化社會，預(yù)計到2050年患者人數(shù)將超過2000萬，成為世界上AD患病人口最多、增長速度最快的地區(qū)。世界衛(wèi)生組織和阿爾茨海默病協(xié)會已經(jīng)呼吁全球?qū)D視為重要的公眾健康問題。
目前，老年癡呆的病因尚未明確，針對其已提出眾多假說，誕生許多新的治療策略，然而臨床上用于治療老年癡呆的一線藥物仍然是以多奈哌齊為代表的膽堿酯酶抑制劑和美金剛為代表的NMDA受體拮抗劑，新防治藥物或保健品的研發(fā)成為老年癡呆研究的重點。
發(fā)酵大豆是以大豆為發(fā)酵基質(zhì)經(jīng)微生物作用而制成，釀造醬油、豆醬、豆豉、腐乳、納豆、味噌和丹貝等都是耳熟能詳?shù)陌l(fā)酵大豆食品。在我國發(fā)酵大豆藥食兼用的歷史悠久，作為功能性食品已經(jīng)成為研究熱點。發(fā)酵大豆豐富的生理功能體現(xiàn)在抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、降血壓、溶血栓、抗菌等方面(范俊峰，李里特，張艷艷等.傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品的生理功能.食品科學(xué)，2005，26(1)：250-254.)，這與大豆通過發(fā)酵產(chǎn)生的活性成分，特別是新生成的二次代 謝產(chǎn)物密切相關(guān)。其中，大豆異黃酮、大豆多肽、類黑精、大豆低聚糖、納豆激酶和豆豉纖溶酶都是發(fā)酵大豆中備受關(guān)注的功能性成分(Chang TS.Isolation，Bioactivity，and Production of ortho-Hydroxydaidzein and ortho-Hydroxygenistein.Int J Mol Sci，2014，15：5699-5716.邵偉，熊澤，何曉文.發(fā)酵大豆多肽及其功能研究.中國釀造，2005，6：23-25.唐傳核，彭志英.淺析大豆發(fā)酵食品的功能性成分.2000，5：8-10.熊駿，李海燕，柳陳堅.傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品中大豆低聚糖的生理功能研究.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22(1)：77-80.Dabbagh F，Negahdaripour M，Berenjian A et al.Nattokinase：production and application.Appl Microbiol Biotechnol，2014，98：9199-9206.)。
本發(fā)明公開的發(fā)酵大豆提取物在老年癡呆有關(guān)疾病預(yù)防和治療方面的應(yīng)用未見相關(guān)報道。該提取物呈棕黃色油狀物，采用超臨界CO2萃取技術(shù)制備得到，含有含量達到70％以上的甘油酯類成分，與已申請的發(fā)明專利(申請?zhí)?01510007348.8)中提到的發(fā)酵大豆提取物相同。本發(fā)明提供了該發(fā)酵大豆提取物的新用途，擴大其應(yīng)用范圍，有望為老年癡呆有關(guān)疾病的防治提供藥物和保健品候選。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵大豆提取物在預(yù)防或治療與老年癡呆有關(guān)疾病中的應(yīng)用，主要涉及阿爾茨海默病、血管性癡呆或以阿爾茨海默病或血管性癡呆為主的混合性癡呆。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于預(yù)防或治療與老年癡呆有關(guān)疾病的藥物和保健品。
本發(fā)明的第三個目的是提供發(fā)酵大豆提取物的新用途，擴大其應(yīng)用范圍。發(fā)明中涉及的發(fā)酵大豆提取物與已申請的發(fā)明專利(申請?zhí)?01510007348.8) 保護的提取物相同，通過下述方法制備得到：①將發(fā)酵大豆粉碎，得到發(fā)酵大豆粉；②將步驟①得到的發(fā)酵大豆粉通過超臨界CO2萃取，制備得發(fā)酵大豆提取物。
實驗證明，本發(fā)明提供的發(fā)酵大豆提取物在β淀粉樣多肽轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲模型上能顯著抑制其致癱率，具有抗老年癡呆，特別是阿爾茨海默病的作用。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點：在已申請專利的基礎(chǔ)上，增加受保護發(fā)酵大豆提取物的新用途，擴大其應(yīng)用范圍。該發(fā)酵大豆提取物在轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲模型上在體證明了其具有抗老年癡呆的作用，可能成為預(yù)防或治療與老年癡呆有關(guān)疾病的藥物和保健品。
附圖說明
圖1顯示發(fā)酵大豆提取物對β淀粉樣多肽轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲致癱率的影響。
具體實施方式
現(xiàn)結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。
本發(fā)明中使用的發(fā)酵大豆為市售產(chǎn)品豆味噌，購自大連松井味噌有限公司，超臨界CO2萃取儀的型號為HA120-50-02。
實施例1、發(fā)酵大豆提取物的制備
①將豆味噌300g置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥至水分含量8％，然后用粉碎機粉碎豆味噌粉可過20目篩。
②將步驟①得到的豆味噌粉100g置于CO2超臨界萃取儀中，萃取溫度為55℃，萃取壓力為35MPa，萃取時間為0.5h，制備得發(fā)酵大豆提取物13g。
③HPLC-APCI/MS分析確定該方法制備得到的發(fā)酵大豆提取物主要為甘油酯類成分，GC確定甘油酯類成分含量為80％，HPLC-ELSD檢測，面積歸一化法確定甘油二酯類成分含量為18％。
實施例2、發(fā)酵大豆提取物的制備
①將豆味噌300g置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥至水分含量11％，然后用粉碎機粉碎豆味噌粉可過20目篩。
②將步驟①得到的豆味噌粉100g置于超臨界CO2萃取儀中，萃取溫度為35℃，萃取壓力為25MPa，萃取時間為1.5h，制備得發(fā)酵大豆提取物14g。
③HPLC-APCI/MS分析確定該方法制備得到的發(fā)酵大豆提取物主要為甘油酯類成分，GC確定甘油酯類成分含量為85％，HPLC-ELSD檢測，面積歸一化法確定甘油二酯類成分含量為12％。
實施例3、發(fā)酵大豆提取物的制備
①將豆味噌300g置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥至水分含量15％，然后用粉碎機粉碎豆味噌粉可過20目篩。
②將步驟①得到的豆味噌粉100g置于超臨界CO2萃取儀中，萃取溫度為45℃，萃取壓力為30MPa，萃取時間為1h，制備得發(fā)酵大豆提取物15g。
③HPLC-APCI/MS分析確定該方法制備得到的發(fā)酵大豆提取物主要為甘油酯類成分，GC確定甘油酯類成分含量為75％，HPLC-ELSD檢測，面積歸一化法確定甘油二酯類成分含量為15％。
實施例4、發(fā)酵大豆提取物對轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲模型抗老年癡呆的作用
(一)實驗動物
β淀粉樣多肽轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲株系(CL2006)。
(二)實驗藥物
實施例2中描述的方法制備得到的發(fā)酵大豆提取物。
(三)實驗方法
1、實驗分組及給藥
實驗分為1個對照組，低(15tg/ml)、中(30μg/ml)、高(60tg/ml)3個劑量給藥組，置于20℃生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。
將藥物母液不同濃度稀釋后滴加在NGM培養(yǎng)基表面，超凈臺內(nèi)吹干后即可涂OP50菌，供后續(xù)飼養(yǎng)線蟲及藥物篩選使用。
2、秀麗線蟲的同步化處理
將食物充足的成蟲(約500只)收集在離心管中，用M9Buffer洗滌后，加入蟲體裂解緩沖液(0.5M NaOH，0.5％NaClO，M9Buffer)獲得蟲卵，將卵移入不含有OP50的M9緩沖液中20℃培養(yǎng)16小時以上，使轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲在饑餓狀態(tài)下同步發(fā)育到幼蟲1期(L1)，將L1期秀麗線蟲移入到含有OP50的NGM培養(yǎng)皿中20℃培養(yǎng)，即可以獲得不同日齡的線蟲。
3、觀察指標(biāo)
將L1期線蟲接種于相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，置于20℃生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，在第8天統(tǒng)計線蟲的累積非癱瘓率，以致癱抑制率為考察指標(biāo)，評價藥物抗老年癡呆的作用。
4、實驗結(jié)果
結(jié)果顯示發(fā)酵大豆提取物給藥組能顯著地抑制β淀粉樣多肽轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲的致癱率(圖1)，其中中劑量(30μg/ml)給藥組對轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲的致癱抑制率即可達52％，并且顯示出劑量依賴關(guān)系，由此說明該發(fā)酵大豆提取物具有潛在的抗老年癡呆作用。