一種豬支原體肺炎疫苗株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬支原體肺炎疫苗株，其分類命名為豬肺炎支原體（ Mycoplasma hyopneumoniae ），菌株號(hào)為CJ，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO：9909，保藏日期為2014年11月06日。本發(fā)明的豬肺炎支原體CJ株在制備改良Friis液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速且含菌量高，并具有良好的免疫原性，可用于制備成預(yù)防用獸用生物制品或獸藥中的應(yīng)用。CGMCC No.990920141106
【專利說(shuō)明】-種豬支原體肺炎疫苗株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種新的豬支原體肺炎疫苗株，屬于獸醫(yī)生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[000引 豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MP巧又稱豬喘氣病，主要是由 豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一種豬的接觸性、慢性、非致死性 的呼吸道疾病。主要臨床癥狀為咳嗽和氣喘，病變特征是肺的尖葉、屯、葉、中間葉和隔葉前 緣呈"肉樣"或"郵肉樣"實(shí)變。容易繼發(fā)其他致病菌（如多殺性己氏桿菌、副豬嗜血桿菌、 豬胸膜肺炎放線桿菌等）的感染，使死亡率升高，且嚴(yán)重影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育和飼料轉(zhuǎn)化率， 因而給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前豬支原體肺炎的主要防治措施是疫苗和藥物，但 長(zhǎng)期用藥易產(chǎn)生耐藥性，從而需要大劑量反復(fù)用藥，又會(huì)造成肉品中藥物殘留等食品安全 問(wèn)題。故進(jìn)行該病的疫苗研發(fā)對(duì)本病的預(yù)防和控制具有重要的意義。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)自主研發(fā)上市的豬支原體肺炎疫苗只有弱毒疫苗，但該疫苗需要胸腔 接種，不易于推廣普及，而國(guó)外獸藥公司研發(fā)生產(chǎn)的豬支原體肺炎滅活疫苗價(jià)格較為昂貴。 因此，分離出一株免疫原性好、且可用于制備滅活疫苗的菌株，將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)無(wú)自主研發(fā)豬支 原體肺炎滅活疫苗的空白。但豬肺炎支原體體外培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高且生長(zhǎng)速度緩慢，分離 過(guò)程中易受豬鼻支原體等的影響，導(dǎo)致豬肺炎支原體分離難度較大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種豬支原體肺炎疫苗株，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏編號(hào)為CGMCC NO ;9909,保藏日期為2014年11月06日， 分類命名為豬肺炎支原體Mycoplasma hyopneumoniae，菌株號(hào)為CJ，該疫苗株在制備的無(wú) 細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2-3日含菌量即可達(dá)到1.0X109-wcCU/ml，并具有良好的免疫原性。
[0005] 本發(fā)明所述的一種豬支原體肺炎疫苗株，該疫苗株已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏編號(hào)為CGMCC NO ;9909,保藏日期為2014年11月06日， 分類命名為豬肺炎支原體Mycoplasma hyopneumoniae，菌株號(hào)為CJ。該疫苗株用于制備豬 肺炎支原體感染引發(fā)疾病的預(yù)防用獸用生物制品或獸藥。
[0006] 本發(fā)明所述的一種豬支原體肺炎疫苗株中的改良化iis液體培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培 養(yǎng)基為PPL0肉湯粉3. 0-5. Og、腦屯、浸液粉2. 0-4. Og、去離子水660-740. 0ml，輔助培養(yǎng)基為 10 X漢克氏平衡鹽溶液20-40. 0ml、酵母浸出液20-40. 0ml、青霉素100-300U/ml、桿菌膚粉 5-20U/ml、0. 25 %酪紅5-10. 0ml和滅活的豬血清100-250. 0ml混合制成；
[0007] 本發(fā)明所述的改良化iis固體培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PPL0肉湯粉3. 0-5. Og、腦 屯、浸液粉2. 0-4. Og、去離子水660-740. 0ml和瓊脂粉10-15. Og，輔助培養(yǎng)基為10 X漢克氏 平衡鹽溶液20-40. 0ml、酵母浸出液20-40. 0ml、青霉素100-300U/ml、桿菌膚粉5-20U/ml、 0. 25 %酪紅5-10. 0ml和滅活的豬血清100-250. 0ml混合制成。
[000引本發(fā)明所述的一種豬支原體肺炎疫苗株的有益效果：
[0009] (1)新菌株培養(yǎng)時(shí)間短；該菌株接種我公司研發(fā)的改良化iis液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí) 間短，含菌量高，培養(yǎng)2-3日含菌量即可達(dá)到1.0Xl〇w°CCU/ml，而有報(bào)道的其他菌株的培 養(yǎng)時(shí)間為5-10日，含菌量可達(dá)到1. 0X l〇s-9CCU/ml ;
[0010] (2)新菌株免疫原性好；本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗株是從國(guó)內(nèi)商品豬上分離得 到的新菌株，對(duì)于商品豬具有良好的免疫原性，保證了疫苗的免疫效力，避開(kāi)了豬肺炎支原 體只對(duì)地方品種豬具有易感性的缺陷；
[0011] (3)新菌株生產(chǎn)疫苗簡(jiǎn)便：該菌株含菌量高，制備疫苗無(wú)需濃縮；可用甲醒滅活， 且滅活時(shí)間短，只需2小時(shí)，很大程度上減少了滅活劑對(duì)抗原的影響，且甲醒本身是一種防 腐劑，用其來(lái)滅活兼顧了滅活和防腐，減少了用量W及對(duì)動(dòng)物的不良反應(yīng)；使用侶鹽佐劑 (氨氧化侶膠）作為佐劑，安全有效；制備工藝簡(jiǎn)單，抗原經(jīng)甲醒滅活后，與侶膠混合1小時(shí) 即成，沒(méi)有繁瑣的乳化工藝。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[001引圖1和圖2為本發(fā)明PCR鑒定結(jié)果圖，其中圖1M為化2000 為陰性對(duì)照；+為陽(yáng) 性對(duì)照（J株）；1-18為病料樣品；圖2M為化2000 ;-為陰性對(duì)照；+為陽(yáng)性對(duì)照（J株）； 19-30為病料樣品；
[001引圖3為本發(fā)明多重PCR鑒定結(jié)果圖，其中M為化2000 為陰性對(duì)照；Mhp為豬 肺炎支原體（J株）陽(yáng)性對(duì)照；M虹為豬鼻支原體陽(yáng)性對(duì)照；Mfl為豬絮狀支原體陽(yáng)性對(duì)照； 1-19為病料樣品；
[0014] 圖4和圖5為本發(fā)明豬肺炎支原體CJ株P(guān)CR產(chǎn)物及菌液PCR結(jié)果圖，其中圖4PCR 產(chǎn)物M為化2000 ;-為陰性對(duì)照J(rèn)為J株擴(kuò)增產(chǎn)物；CJ為CJ株擴(kuò)增產(chǎn)物；圖5菌液PCRM 為化2000 為陰性對(duì)照J(rèn)為J株擴(kuò)增產(chǎn)物；CJ為CJ株擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015] 圖6為本發(fā)明豬肺炎支原體CJ株與其他菌株P(guān)36基因相似度比較圖；
[0016] 圖7為本發(fā)明豬肺炎支原體CJ株與其他菌株P(guān)36基因進(jìn)化樹(shù)圖；
[0017] 圖8為本發(fā)明豬支原體肺炎滅活疫苗（CJ株）制備流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[001引通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的范圍；
[0019] 本發(fā)明所述的一種豬支原體肺炎疫苗株，其分類命名為豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae)，菌株號(hào)為CJ，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中屯、，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC NO ;9909， 保藏日期為2014年11月06日；該菌株于2010年2月從新疆昌吉某豬場(chǎng)采集疑似豬肺炎 支原體感染的病變肺臟，經(jīng)無(wú)菌處理，接種改良化iis液體培養(yǎng)基篩選鑒定獲得一株豬支 原體肺炎疫苗株；
[0020] 實(shí)施例1 ;
[0021] 豬肺炎支原體CJ株的分離鑒定；
[0022] 肺組織懸液的制備；將新疆昌吉某豬場(chǎng)采集的30份疑似豬支原體肺炎病變肺組 織分別用每毫升含1000個(gè)單位的青霉素浸泡后，其病變處使用燙板燙燒表面，無(wú)菌手術(shù)剪 將表面組織去除，并取0. 5g肺組織，剪碎置于研鉢內(nèi)，加入5ml改良化iis液體培養(yǎng)基，作 成肺組織懸液；
[002引肺組織懸液的PCR鑒定；
[0024] 按照化kara核酸提取試劑盒（Takara Code ;DV819A)說(shuō)明書提取肺組織懸液的核 酸，進(jìn)行PCR及多重PCR鑒定；
[002引 PCR鑒定；
[0026] 引物設(shè)計(jì)與合成；豬肺炎支原體PCR引物按江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所劉茂軍 等發(fā)表的"豬肺炎支原體PCR鑒定方法的建立"文章中的引物序列進(jìn)行合成：
[0027] P1 ;5, -TTACAGCGGGAAGACC-3,；
[0028] P2 ;5' -CGGCGAGAAACTGGATA-3' ；
[0029] 預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為42化P ;
[0030] PCR 反應(yīng)；
[003U PCR 擴(kuò)增體系為；模板 DM 2yl，10mmol/L dNTP 2yl，10Xbuffer 2. 5yl， 10 ymol/L 引物 PIO. 5 y 1，10 ymol/L 引物 R20. 5 y 1，Ex Tag 聚合酶 0. 5 y 1，加入雙蒸水 17 y 1，PCR反應(yīng)條件為；溫度95°C預(yù)變性5分鐘；溫度94°C變性1分鐘，溫度62°C退火1分 鐘，溫度72°C延伸1分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；溫度72°C延伸10分鐘；溫度2-8°C保存，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳；
[003引將收集的肺組織懸液提取的DNA按照上述2. 1. 2項(xiàng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果有19份肺 組織懸液的核酸擴(kuò)增出約42化P的目的片段（見(jiàn)圖1);
[003引 多重PCR鑒定；
[0034]引物設(shè)計(jì)與合成；多重PCR(豬肺炎支原體、豬絮狀支原體和豬鼻支原體）按 T. stakenbory等發(fā)表的"A multiplex PCR to Identify Porcine Mycoplasma Present in Broth化Itures"文章中的引物進(jìn)行合成；
[00巧]mhp-f ;5' -TTCAAAGGAGCCTTCAAGCTTC-3';
[003d mhr-f ;5, -GGGAAGAAAAAAATTAGGTAGGG-3,；
[0037] mfl-f ;5, -CGGGATGTAGCAATACATTCAG-3,；
[00%] m-r ;5' -AGAGGCATGATGATTTGACGTC-3' ；
[0039] 預(yù)計(jì)豬肺炎支原體擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為lOOObp，豬鼻支原體擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1129bp， 豬絮狀支原體擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為754bp ;
[0040] 多重 PCR 反應(yīng)；PCR 擴(kuò)增體系為；模板 DM 2 y 1，dNTP lOnmol/l，10 Xbuffer 5. Oyl，上游引物均為8pmol，下游引物為12pmol，Ex Tag聚合酶0. 5yl，加入雙蒸水至 50 y 1 ;PCR反應(yīng)條件為；溫度95°C預(yù)變性5分鐘；溫度94°C變性30秒，溫度55 °C退火30 秒，溫度72°C延伸1分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；溫度72°C延伸10分鐘；溫度2-8°C保存，PCR產(chǎn) 物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳；結(jié)果見(jiàn)圖2,篩選出6份無(wú)豬鼻支原體、豬絮狀支原體污染的 豬肺炎支原體菌株；
[0041] 菌株的分離與培養(yǎng)；取PCR鑒定為豬肺炎支原體陽(yáng)性且無(wú)豬鼻支原體、豬絮狀 支原體污染的肺組織懸液上清液接種于含50%豬鼻支原體特異性血清的改良化i is液 體培養(yǎng)基中，置溫度37°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每間隔5日盲傳1次，每日觀察培養(yǎng)基 抑值變化，前3代均加入50 %豬鼻支原體特異性血清，在傳至6-8代時(shí)，有2個(gè)菌株培養(yǎng) 基顏色變化時(shí)間穩(wěn)定，將收獲的培養(yǎng)物分別取出0. 1ml接種于固體培養(yǎng)基平板上，置溫度 36-38°C 5% C〇2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10日，均可見(jiàn)針尖大小菌落，在顯微鏡下挑取邊緣整齊、外周質(zhì) 地疏松、中央致密的單個(gè)菌落，接種改良化iis液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌種在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)間 穩(wěn)定在2-3日，含菌量可達(dá)1. 0X109-wcCU/ml，重復(fù)S次后保存菌株，并進(jìn)行如下鑒定；
[0042] 培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)特性：在改良化iis液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3日，培養(yǎng)物呈輕度渾 濁；用液體培養(yǎng)物涂片，經(jīng)姬母薩氏染色，在高倍鏡下可見(jiàn)環(huán)狀、短鏈狀和兩極狀等典型的 多形態(tài)；在改良化iis固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10日，肉眼可見(jiàn)針尖大小的菌落，顯微鏡下觀察 為外周質(zhì)地疏松、中央致密的圓形菌落，表面粗趟帶有顆粒狀；
[0043] 生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)：吸取獲得的2株菌株各0. 5ml，分別涂布于改良化iis固體培養(yǎng)基 上，置溫度36-38°C使瓊脂表面稍干燥，夾取浸豬肺炎支原體抗血清紙片貼于瓊脂表面，培 養(yǎng)14日后，分離菌株均出現(xiàn)大于2. 0mm的抑菌圈；
[0044] 生理、生化試驗(yàn)；分離的2個(gè)菌株生化反應(yīng)和豬肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株（J株）相同， 符合支原體生化特性，生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1 ;
[0045] 表1 CJ株豬肺炎支原體生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一種新的豬支原體肺炎疫苗株，其特征在于該疫苗株已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNO:9909,保藏日期為2014年11月06日， 它分類命名為豬肺炎支原體菌株號(hào)為CJ。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK104513804SQ201510042592
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2015年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月27日
【發(fā)明者】李新蘋, 候鳳, 王鋼, 賀筍, 李延濤 申請(qǐng)人:新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司