一株豬肺炎支原體菌株的制作方法
【專利摘要】一株豬肺炎支原體菌株，它涉及一株豬肺炎支原體菌株。它已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8096，保藏日期為2013年8月15日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰路1號(hào)院3號(hào)，它命名為豬肺炎支原體（Mycopasma?hyopneumoniae）HDZK-Mhp57。本發(fā)明中豬肺炎支原體HDZK-Mhp57，制備的無細(xì)胞培養(yǎng)基中活菌滴度高達(dá)1012CCU/mL；免疫原性好，肺炎病變減少率可達(dá)90%以上，可大大降低獸用生物制品的生成成本，可用于制備成預(yù)防用獸用生物制品或獸藥，為研制豬支原體肺炎滅活疫苗、基因工程疫苗和豬肺炎支原體診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一株豬肺炎支原體菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株豬肺炎支原體菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS),又稱豬氣喘病或豬地方流行性肺炎，MPS是一種慢性、接觸性、非致命性的呼吸系統(tǒng)疾病，國(guó)內(nèi)發(fā)病率達(dá)80%以上，該病即可影響豬群生產(chǎn)性能和增重及飼料報(bào)酬，又可繼發(fā)感染其它傳染病，是養(yǎng)豬業(yè)重點(diǎn)控制的傳染病之一。豬支原體肺炎的病原體是豬肺炎支原體(Mycopasma hyopneumoniae,Mhp)，可通過病豬與健康豬直接接觸或通過氣溶膠傳播，一般傳播距離可達(dá)到4.7km，最新研究發(fā)現(xiàn)其傳播距離可遠(yuǎn)至9.2km,因此，Mhp極難防控。豬感染Mhp后會(huì)出現(xiàn)呼吸困難、機(jī)體消瘦、免疫抑制等。
[0003]豬肺炎支原體是軟皮綱、支原體目、支原體科、支原體屬、豬肺炎支原體種。Mhp無細(xì)胞壁，具有高度多形性，大小不等，在液體培養(yǎng)物和肺觸片中常呈球狀，直徑約
0.2-0.5 μ m,并由小球狀串連成環(huán)狀,直徑約0.8-20 μ m,偶有新月狀、長(zhǎng)鏈狀和絲狀。豬肺炎支原體體外培養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)條件要求苛刻，營(yíng)養(yǎng)要求高且生長(zhǎng)速度緩慢，分離過程中受豬的其他支原體(如豬鼻支原體)的影響，導(dǎo)致豬肺炎支原體分離篩選難度較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一株豬肺炎支原體菌株。
[0005]一株豬肺炎支`原體菌株，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8096，保藏日期為2013年8月15日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)，它命名為豬肺炎支原體(Mycopasma hyopneumoniae) HDZK_Mhp57。
[0006]豬肺炎支原體(Mycopasma hyopneumoniae) HDZK_Mhp57,它的菌落形態(tài)為典型的支原體煎荷包蛋形菌落；生理生化特征:葡萄糖反應(yīng)陽(yáng)性、甘露糖反應(yīng)陽(yáng)性、精氨酸反應(yīng)陰性、尿素酶反應(yīng)陰性、抗血清抑制生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、熒光抗體實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性。
[0007]豬肺炎支原體(Mycopasma hyopneumoniae) HDZK_Mhp57的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果:其16S rRNA序列與NCBI中公布的相近種屬的豬肺炎支原體HN0613的同源性為98%，為一新支原體菌株。
[0008]本發(fā)明一株豬肺炎支原體菌株，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8096，保藏日期為2013年8月15日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)，它命名為豬肺炎支原體(Mycopasma hyopneumoniae)HDZK_Mhp57。
[0009]本發(fā)明中豬肺炎支原體(Mycopasma hyopneumoniae) HDZK_Mhp57,制備的無細(xì)胞培養(yǎng)基中活菌滴度高達(dá)1012(XU/mL ;免疫原性好，肺炎病變減少率可達(dá)90%以上，可大大降低獸用生物制品的生成成本。豬肺炎支原體(Mycopasma hyopneumoniae)HDZK_Mhp57可用于制備成預(yù)防用獸用生物制品或獸藥，為研制豬支原體肺炎滅活疫苗、基因工程疫苗和豬肺炎支原體診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0010]圖1為【具體實(shí)施方式】中的熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式一株豬肺炎支原體菌株，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8096，保藏日期為2013年8月15日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)，它命名為豬肺炎支原體(Mycopasmahyopneumoniae) HDZK_Mhp570
[0012]本實(shí)施方式中一株豬肺炎支原體菌株，它的分離過程如下:
[0013]一、取支原體肺炎病變肺臟，在超凈臺(tái)內(nèi)用無菌手術(shù)剪刀剪取發(fā)病部位邊緣組織，放入無菌平皿，將病變肺臟組織剪成小塊，接種Friis肉湯，37°C培養(yǎng)至培養(yǎng)液變色；
[0014]二、培養(yǎng)液變色后，取0.5mL經(jīng)0.45 μ m濾器過濾的培養(yǎng)物加入到1.5mL加了青霉素的Friis肉湯培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)；
[0015]三、每隔一周傳代一次，前兩周要在培養(yǎng)液中加入50%的豬鼻支原體特異性血清，傳至第九周對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋涂板，篩選單落，重復(fù)三次后保存菌株。
[0016]鑒定按以下步驟:
[0017]一、鏡檢
[0018]Friis平板接種培養(yǎng)物，37°C培養(yǎng)；挑取單菌落涂片，分別進(jìn)行革蘭氏染色和瑞氏染色，鏡檢；
`[0019]結(jié)果:
[0020]病變組織接種到Friis培養(yǎng)液中，6d后培養(yǎng)液變色；過濾接種后在5_6d后培養(yǎng)液變?yōu)辄S色；接種到平板37°C培養(yǎng)6-7d后出現(xiàn)典型的支原體煎荷包蛋形菌落。
[0021]革蘭氏染色未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，瑞氏染色法發(fā)現(xiàn)支原體菌體。
[0022]二、生化試驗(yàn)
[0023]尿素酶試驗(yàn):從Friis平板中挑取菌株，接種到尿素培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，24h后觀察，如為陰性則繼續(xù)培養(yǎng)至四日做最終判斷。
[0024]葡萄糖分解試驗(yàn):從Friis平板中挑取菌株，接種于含葡萄糖的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察顏色變化。
[0025]精氨酸水解試驗(yàn):從Friis平板中挑取菌株，接種于含精氨酸及酚紅指示劑的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察顏色變化。
[0026]甘露糖分解試驗(yàn):從Friis平板中挑取菌株，接種于含甘露糖的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察顏色變化。
[0027]結(jié)果:
[0028]葡萄糖反應(yīng)陽(yáng)性、甘露糖反應(yīng)陽(yáng)性、精氨酸反應(yīng)陰性、尿素酶反應(yīng)陰性。
[0029]三、生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)
[0030]Friis平板接種培養(yǎng)物，將未稀釋的抗血清吸附于滅菌的濾紙片，將吸有血清的濾紙片貼附于平板表面，37°C培養(yǎng)至菌落可見；同時(shí)，以正常血清處理的濾紙片做對(duì)照。
[0031]結(jié)果:[0032]在吸有抗血清的濾紙片周圍形成了直徑約為200mm的抑菌圈，而正常血清處理的濾紙片無抑菌圈。
[0033]四、熒光抗體試驗(yàn)
[0034]取培養(yǎng)液涂片，自然干燥后丙酮固定IOmin ;之后，用PBS輕輕漂洗數(shù)次，滴加豬肺炎支原體熒光抗體，放入濕盒中37°C感作30min，PBS沖洗，半干時(shí)在熒光顯微鏡下觀察。
[0035]結(jié)果:如圖1所示，熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。
[0036]分子生物學(xué)鑒定結(jié)果:其16S rRNA序列與NCBI中公布的相近種屬的豬肺炎支原體HN0613的同源性為98%，為一新支原體菌株，命名為豬肺炎支原體(Mycopasmahyopneumoniae) HDZK_Mhp570
[0037]豬肺炎支原體(Mycopasma hyopneumoniae) HDZK_Mhp57,制備的無細(xì)胞培養(yǎng)基中活菌滴度高達(dá)1012(XU/mL ;免疫原性好，肺炎病變減少率可達(dá)90%以上，可大大降低獸用生物制品的生成成本。豬肺炎支原體(Mycopasma hyopneumoniae)HDZK_Mhp57可用于制備成預(yù)防用獸用生物制品或獸 藥。
【權(quán)利要求】
1.一株豬肺炎支原體菌株，其特征在于它已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8096，保藏日期為2013年8月15日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)，它命名為豬肺炎支原體(Mycopasma hyopneumoniae)HDZK- Mhp57。
【文檔編號(hào)】C12R1/35GK103484414SQ201310498958
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】趙凱, 劉洪斌, 張鳳強(qiáng), 毛春玲 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)