一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，步驟如下：取牛瘟弱毒疫苗或小反芻獸疫弱毒疫苗作抗原，多次免疫健康豬；從免疫豬中提取抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子。經(jīng)過上述步驟所制成的轉(zhuǎn)移因子是一種純天然生物活性小分子多肽核苷酸復(fù)合物，對由小反芻獸疫病毒引起的小反芻獸疫起到預(yù)防和輔助治療作用，從根本上保證機體不受病毒的入侵和保護正常機能細胞不受小反芻獸疫病毒感染和侵害，從而降低小反芻獸疫病的發(fā)生，減少經(jīng)濟損失。
【專利說明】一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于預(yù)防獸醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]小反會獸疫(pestedes petits r μ minants, PPR)俗稱羊痕,又名小反會獸假性牛痕(pseudorinderpest)、肺腸炎(pne μ moent- eritis)、口炎肺腸炎復(fù)合癥(stomatitispne μ moenteritis comp 1- ex),是由小反會獸疫病毒引起的一種急性病毒性傳染病,主要感染小反芻動物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征。
[0003]轉(zhuǎn)移因子(TF，Transfer Factor)又稱傳輸因子，可以作為細胞免疫促進劑，是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸復(fù)合物，這種物質(zhì)將供體的某種特定的細胞免疫功能特異地轉(zhuǎn)移給受體正常的淋巴細胞，參與機體的免疫反應(yīng)，提高受體的細胞免疫功能；同時促進B淋巴細胞分泌作用，能夠誘導(dǎo)免疫細胞釋放干擾素和白介素，從而增強受體的抵抗力，這種轉(zhuǎn)移因子分子量小、無毒、無抗原性、不起過敏反應(yīng)等優(yōu)點。轉(zhuǎn)移因子是一種小分子生物活性物質(zhì)，不含蛋白質(zhì)、可溶性好，具有純度高，免疫活性強，作用時間長，療效良好，安全無毒副作用等優(yōu)點。
[0004]脾臟、胸腺、淋巴組織等都是免疫器官，是產(chǎn)生免疫反應(yīng)的場所，從這些組織中提取的多肽核酸復(fù)合物具有重要作用、特異性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種抗小反芻獸疫轉(zhuǎn)移因子的制備方法，提取的天然純生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移因子對由小反芻獸疫病毒引起的小反芻獸疫起到預(yù)防和輔助治療作用，從根本上保證機體不受病毒的入侵和保護正常機能細胞不受小反芻獸疫病毒感染和侵害。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體制備步驟如下:
1)選用對小反芻獸疫有免疫效果的抗原；
2)免疫健康豬:首先隨機選取健康的豬群，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點注射接種方式，免疫3-5次，每次間隔6天，根據(jù)免疫學的方法檢測抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價，然后從宰殺豬中無菌條件取脾臟、胸腺、淋巴組織，放置_20°C保存；
3)從被免疫豬中提取抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子:
①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過無菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用PBS緩沖液清洗干凈；
②將沖洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機中，再加入2-3倍預(yù)冷的0.85%生理鹽水，1500-2500r/min轉(zhuǎn)速，每次2 min,經(jīng)過組織勻漿，制得勻漿液；
③勻漿液經(jīng)過-60_-80°C快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過4-5次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細胞破碎儀中破碎，工作時間3s/3s，經(jīng)過20min破碎，得到精細的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過低溫7000-8000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)過濾處理，留濾液備用；
④用稀鹽酸將濾液PH值調(diào)至6.5-7.6之間,凈化濾液,將凈化后的濾液用0.22 μ m濾膜過濾，濾液即為抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子提取液；
⑤分裝，4°C保存，即為成品。
[0007]步驟I)中對小反芻獸疫有免疫效果的抗原為牛瘟弱毒疫苗或小反芻獸疫弱毒疫苗。
[0008]本發(fā)明制備的抗小反芻獸疫轉(zhuǎn)移因子是天然純生物活性物質(zhì)，對由小反芻獸疫病毒引起的小反芻獸疫起到預(yù)防和輔助治療作用，從根本上保證機體不受病毒的入侵和保護正常機能細胞不受小反芻獸疫病毒感染和侵害。
[0009]本發(fā)明公開的一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法簡單、操作行強、生產(chǎn)原料充足，可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)完成，主要技術(shù)包括健康豬的免疫和特異性抗體效價的檢測、轉(zhuǎn)移因子的提取、轉(zhuǎn)移因子的除菌處理和保存等，這種方法生產(chǎn)成本低，主要具有良好的應(yīng)用前景。

【具體實施方式】
[0010]根據(jù)具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0011]實施例1
一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體制備步驟如下:
1)選用對小反芻獸疫有免疫效果的抗原，對小反芻獸疫有免疫效果的抗原為牛瘟弱毒疫苗或小反芻獸疫弱毒疫苗；
2)免疫健康豬:首先隨機選取健康的豬群，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點注射接種方式，免疫3-5次，每次間隔6天，根據(jù)免疫學的方法檢測抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價，然后從宰殺豬中無菌條件取脾臟、胸腺、淋巴組織，放置_20°C保存；
3)從被免疫豬中提取抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子:
①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過無菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用PBS緩沖液清洗干凈；
②將沖洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機中，再加入2-3倍預(yù)冷的0.85%生理鹽水，1500-2500r/min轉(zhuǎn)速，每次2 min,經(jīng)過組織勻漿，制得勻漿液；
③勻漿液經(jīng)過-60_-80°C快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過4-5次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細胞破碎儀中破碎，工作時間3s/3s，經(jīng)過20min破碎，得到精細的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過低溫7000-8000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)過濾處理，留濾液備用；
④用稀鹽酸將濾液PH值調(diào)至6.5-7.6之間，凈化濾液,將凈化后的濾液用0.22 μ m濾膜過濾，濾液即為抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子提取液；
⑤分裝，4°C保存，即為成品。
[0012]本發(fā)明公開的一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法簡單、操作行強、生產(chǎn)原料充足，可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)完成，主要技術(shù)包括健康豬的免疫和特異性抗體效價的檢測、轉(zhuǎn)移因子的提取、轉(zhuǎn)移因子的除菌處理和保存等，這種方法生產(chǎn)成本低，主要具有良好的應(yīng)用前景。
[0013]實施例2
一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體制備步驟如下:
1)選用對小反芻獸疫有免疫效果的小反芻獸疫弱毒疫苗作為抗原；
2)免疫健康豬:首先隨機選取健康的豬群，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點注射接種方式，免疫3次，每次間隔6天，根據(jù)免疫學的方法檢測抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價，然后從宰殺豬中無菌條件取脾臟、胸腺、淋巴組織，放置_20°C保存；
3)從被免疫豬中提取抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子:
①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過無菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用PBS緩沖液清洗干凈；
②將沖洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機中，再加入2倍預(yù)冷的0.85%生理鹽水，1500r/min轉(zhuǎn)速，每次2 min,經(jīng)過組織勻漿，制得勻漿液；
③勻漿液經(jīng)過_60°C快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過4次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細胞破碎儀中破碎，工作時間3s/3s，即破碎3s停3s，經(jīng)過20min破碎，得到精細的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過低溫7000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)過濾處理，留濾液備用；
④用稀鹽酸將濾液PH值調(diào)至6.5之間，凈化濾液，將凈化后的濾液用0.22 μ m濾膜過濾，濾液即為抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子提取液；
⑤分裝，4°C保存，即為成品。
[0014]實施例3
一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體制備步驟如下:
1)選用對小反芻獸疫有免疫效果的牛瘟弱毒疫苗作為抗原；
2)免疫健康豬:首先隨機選取健康的豬群，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點注射接種方式，免疫5次，每次間隔6天，根據(jù)免疫學的方法檢測抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價，然后從宰殺豬中無菌條件取脾臟、胸腺、淋巴組織，放置_20°C保存；
3)從被免疫豬中提取抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子:
①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過無菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用PBS緩沖液清洗干凈；
②將沖洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機中，再加入3倍預(yù)冷的0.85%生理鹽水，2000r/min轉(zhuǎn)速，每次2 min,經(jīng)過組織勻漿，制得勻漿液；
③勻漿液經(jīng)過_70°C快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過5次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細胞破碎儀中破碎，工作時間3s/3s，即破碎3s停3s，經(jīng)過20min破碎，得到精細的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過低溫7500r/min離心20min，取上清液，經(jīng)過濾處理，留濾液備用；
④用稀鹽酸將濾液PH值調(diào)至7.0之間，凈化濾液，將凈化后的濾液用0.22 μ m濾膜過濾，濾液即為抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子提取液；
⑤分裝，4°C保存，即為成品。
[0015]實施例4
一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體制備步驟如下: 1)選用對小反芻獸疫有免疫效果的牛瘟弱毒疫苗或小反芻獸疫弱毒疫苗作為抗原；
2)免疫健康豬:首先隨機選取健康的豬群，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點注射接種方式，免疫5次，每次間隔6天，根據(jù)免疫學的方法檢測抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價，然后從宰殺豬中無菌條件取脾臟、胸腺、淋巴組織，放置_20°C保存；
3)從被免疫豬中提取抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子:
①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過無菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用PBS緩沖液清洗干凈；
②將沖洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機中，再加入3倍預(yù)冷的0.85%生理鹽水，2500r/min轉(zhuǎn)速，每次2 min,經(jīng)過組織勻漿，制得勻漿液；
③勻漿液經(jīng)過_80°C快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過4次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細胞破碎儀中破碎，破碎3s停3s，，經(jīng)過20min破碎，得到精細的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過低溫8000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)過濾處理，留濾液備用；
④用稀鹽酸將濾液PH值調(diào)至7.6之間，凈化濾液，將凈化后的濾液用0.22 μ m濾膜過濾，濾液即為抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子提取液；
⑤分裝，4°C保存，即為成品。
[0016]對本發(fā)明公開的一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法提取抗小反芻獸疫轉(zhuǎn)移因子的指標檢測:
I)蛋白質(zhì)含量測定:采用20%磺基水楊酸方法，提取液沒有發(fā)生渾濁和沉淀現(xiàn)象，呈陰性，不含蛋白質(zhì)。
[0017]2)細菌檢測:通過固體、液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀察無渾濁現(xiàn)象。
[0018]3)支原體檢測:根據(jù)《2011版中華人民共和國獸藥典》操作，檢測無支原體。4)多肽含量檢測:經(jīng)過雙縮脲法測定含量為2.422mg/ml。
[0019]5) E-玫瑰花結(jié)形成率比較:小反芻獸外周血淋巴細胞表面有鼠紅細胞受體，并能與之結(jié)合形成E-玫瑰花結(jié)，轉(zhuǎn)移因子對淋巴細胞和大鼠紅細胞的結(jié)合有一定的促進作用，本品的花結(jié)形成率平均為35.2%。
[0020]6)皮膚刺激性試驗
取30只小白兔，分成對照、皮下注射、皮內(nèi)注射3組，采用脫毛劑對家兔脊柱兩側(cè)被毛脫去，保證皮膚的完整性，然后注射本品0.5 ml/只，對照組注射生理鹽水，分成單次給藥、多次給藥觀察皮膚的變化。結(jié)果顯示，注射生理鹽水的10只中，有5只發(fā)生紅腫，一天消腫，試驗組中各有5只發(fā)生，12小時內(nèi)全部消腫。
[0021]試驗例1:動物保護試驗
取30只滿月齡健康羔羊，隨機分成對照、試驗、空白三組，每組10只，在新環(huán)境中適應(yīng)三天，自由采食，攻毒劑量為1.0*108CFU/只，攻毒后第三天試驗組開始接種抗小反芻獸疫轉(zhuǎn)移因子，每只肌注0.5ml/只，每天一次，對照組注射生理鹽，空白全程生理鹽水，觀察臨床癥狀和死亡率作為指標反應(yīng)本品的臨床應(yīng)用效果。
[0022]結(jié)果顯示:對照組發(fā)病率100%和死亡率100%，空白組沒有變化，試驗組發(fā)病率40%,而死亡率1%。
[0023]試驗例2:動物安全試驗取健康小白鼠210只，隨機分成空白、注射組、口服三組，每組70只，空白口服和注射蒸餾水5 ml/只，注射組注射本品5 ml/只，口服組灌服本品1ml/只，觀察小白鼠的變化。結(jié)果顯示三組都無異常變化，說明本品安全，無不良反應(yīng)。
[0024]通過以上試驗例可得出本發(fā)明公開的抗小反芻獸疫轉(zhuǎn)移因子的制備方法對由小反芻獸疫病毒引起的小反芻獸疫起到預(yù)防和輔助治療作用，從根本上保證機體不受病毒的入侵和保護正常機能細胞不受小反芻獸疫病毒感染和侵害，可在臨床上廣泛推廣。
【權(quán)利要求】
1.一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于，具體制備步驟如下: 1)選用對小反芻獸疫有免疫效果的抗原； 2)免疫健康豬:首先隨機選取健康的豬群，按病毒抗原病毒滴度制定接種劑量，采用皮下多點注射接種方式，免疫3-5次，每次間隔6天，根據(jù)免疫學的方法檢測抗原在體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體效價，然后從宰殺豬中無菌條件取脾臟、胸腺、淋巴組織，放置-201保存； 3)從被免疫豬中提取抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子: ①將所取的脾臟、胸腺、淋巴組織經(jīng)過無菌去離子水清洗干凈，然后剔凈臟器表面的筋膜及脂肪組織，再用緩沖液清洗干凈； ②將沖洗干凈的組織剪成小塊之后放入到組織勻漿機中，再加入2-3倍預(yù)冷的0.85%生理鹽水，1500-25001-/111111轉(zhuǎn)速，每次2 111111,經(jīng)過組織勻漿，制得勻漿液； ③勻漿液經(jīng)過-60—-801快速冷凍，再快速解凍，經(jīng)過4-5次的凍融，然后將凍融后的溶液放到低溫超聲波細胞破碎儀中破碎，工作時間38/38，經(jīng)過20111111破碎，得到精細的勻漿液，再加3倍的冷生理鹽水，混勻，經(jīng)過低溫7000-800017^111離心20-11,取上清液，經(jīng)過濾處理，留濾液備用； ④用稀鹽酸將濾液四值調(diào)至6.5-7.6之間，凈化濾液，將凈化后的濾液用0.22 ^ III濾膜過濾，濾液即為抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子提取液； ⑤分裝，41保存，即為成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗小反芻獸疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于:步驟1)中對小反芻獸疫有免疫效果的抗原為牛瘟弱毒疫苗或小反芻獸疫弱毒疫苗。
【文檔編號】A61P31/14GK104398535SQ201410744945
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】徐進, 劉應(yīng)鵬, 郭俊清 申請人:鄭州后羿制藥有限公司