一種與psma膜外區(qū)靶向性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與PSMA膜外區(qū)靶向性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用。該多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，該多肽通過偶聯(lián)劑來介導(dǎo)放射性核素進行標記，可用于制備治療或診斷前列腺癌的靶向性藥物。
【專利說明】-種與PSMA膜外區(qū)祀向性結(jié)合的多化及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與PSMA膜外區(qū)祀向性結(jié)合的多膚及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌（P化）已成為目前危害全球男性健康的主要惡性腫瘤，早期主要通過 外科手術(shù)和放射治療，但早期發(fā)現(xiàn)困難，就診時多數(shù)已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。未經(jīng)治療的rca細 胞多為雄激素依賴性，即通過阻斷雄激素促使雄激素依賴性癌細胞調(diào)亡，但雄激素依賴 性rca經(jīng)過一段時間（平均14-30月）內(nèi)分泌治療后，大多數(shù)轉(zhuǎn)為非激素依賴性前列腺 癌（an化ogen independent prostate cancer, AIPC),最終轉(zhuǎn)化為激素難治性前列腺癌 (Hormone refractoiy prostate cancer, HRPC),目前對于HRPC及其轉(zhuǎn)移灶尚無有效的治 療方法，臨床統(tǒng)稱為難治性前列腺癌，是導(dǎo)致rca預(yù)后差、死亡率高的主要原因。
[0003] i25I、iwpd粒子近距離放射治療及外放療是HRPC的治療手段，但主要限于局部病 灶。針對多發(fā)病灶的祀向內(nèi)放射性治療近年來備受關(guān)注，i"Lu是理想祀向內(nèi)放射治療性核 素，常用于抗體、多膚及其類似物等的標記，且i"Lu通過反應(yīng)堆福射產(chǎn)生，具有低成本和易 得性，具有適宜的物理半衰期化7d)，發(fā)射的目-粒子傳能線密度及生物學(xué)效應(yīng)高于1 251， 組織平均射程小于200ym，適合殺死癌細胞，發(fā)射的Y射線可用于SPECT顯像，W監(jiān)測和指 導(dǎo)治療過程，因此，如何增加理想治療性核素i"Lu在HRPC及轉(zhuǎn)移灶的祀向性聚集和滯留是 改善其預(yù)后亟待解決的難題，其中受體和配體的選擇尤為重要。
[0004] 前列腺特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen,PSMA)是一種 II 型 跨膜糖蛋白，其大小約為100-120kD。它由3部分構(gòu)成；短的胞內(nèi)段（氨基酸1-18)，跨膜段 (氨基酸19-43)和較長的胞外段（氨基酸44-750)，在高度惡性原發(fā)性PCa、HRPC及其轉(zhuǎn) 移灶的腫瘤細胞表面呈高豐度表達，且隨rca惡性進展而升高，而在前列腺、腎臟、肺臟、肝 臟等正常組織、炎性增生性組織及其它良性病變細胞表面表達水平極低、甚至不表達，成為 HRPC及其轉(zhuǎn)移灶祀向治療的主要祀蛋白。
[0005] 作為配體，多膚較抗體分子量小，穩(wěn)定性好，無免疫源性，不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非特 異性攝取，可通過化學(xué)修飾連接N0TA、CB-TE2A、PCTA、D0TA等偶聯(lián)物，進行放射性核素標 記，體外類合成（如固相法）過程簡單、經(jīng)濟，為廣泛臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。更重要的是，多 膚作為放射性核素載體，通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化可獲得體內(nèi)藥代動力學(xué)良好如血清除快、祀向特異 性好、結(jié)合穩(wěn)定的多膚。
[0006] 另外，如果多膚片斷較短也能具有較好的結(jié)合效果則更易于修飾和體外合成，更 利于量化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。若能夠研制出一種能與PSMA胞外區(qū)特異性結(jié)合特性和具有祀向 功能的片斷較短易于合成的多膚，對于PCa的診斷和治療及產(chǎn)業(yè)化具有較好的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題提供一種與PSMA膜外區(qū)祀向性結(jié)合的多膚。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的是提供由上述多膚制備的放射性核素標記多膚。
[0009] 本發(fā)明還有一個目的是提供上述多膚制備治療或診斷前列腺癌的祀向性藥物中 的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0011] 一種與PSMA膜外區(qū)祀向性結(jié)合的多膚，該多膚的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所 /J、- 〇
[0012] 一種放射性核素標記多膚，該放射性核素標記多膚是上述多膚通過偶聯(lián)劑來介導(dǎo) 放射性核素進行標記。
[0013] 所述的放射性核素標記多膚，其中偶聯(lián)劑為D0TA、N0TA、CB-TE2A或Hynic。
[0014] 所述的放射性核素標記多膚，其中該PSMA膜外區(qū)祀向性結(jié)合的多膚與偶聯(lián)劑通 過聚己二醇（PEG。，n = 1，2, 3)連接。
[0015] 所述的放射性核素標記多膚，其中放射性核素為顯像性放射性核素或治療性放射 性核素。顯像性放射性核素如64Cu、 68Ga、uiln、"mTc，治療性放射性核素如WY、i"Lu、89Sr。
[0016] 所述的與PSMA膜外區(qū)祀向性結(jié)合的多膚在制備治療或診斷前列腺癌的祀向性藥 物中的應(yīng)用。
[0017] 所述的放射性核素標記多膚在制備治療或診斷前列腺癌的祀向性藥物中的應(yīng)用。
[0018] 本課題組首次通過體外固相法合成PSMA膜外區(qū)祀向性結(jié)合的小分子直線多膚， 其結(jié)構(gòu)為多膚序列為Ser-His-Phe-Ser-Val-Gly-Ser(SEQ ID No:l)，即絲氨酸-組氨 酸-苯丙氨酸-絲氨酸-額氨酸-甘氨酸-絲氨酸（W下簡稱PT巧，可與PSMA胞外段（氨 基酸44-750)祀向結(jié)合，并與偶聯(lián)劑（如D0TA、N0TA、CB-TE2A、Hynic等）通過聚己二醇 (PEG。，n = 1，2,如連接，偶聯(lián)劑介導(dǎo)多膚的放射性核素（如68Ga、64Cu、iiiln、i"Lu和 99-Tc) 的標記。體外實驗考查其體外穩(wěn)定性，體內(nèi)實驗考察其體內(nèi)藥代動力學(xué)和生物學(xué)分布，并通 過Micro陽T/CT (或micros陽CT/CT)顯像評價其在前列腺癌腫瘤部位的放射性攝取。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明制備的小分子多膚PTP，能與PSMA膜外區(qū)祀向性結(jié)合，利用該多膚制備的 放射性核素標記多膚，可作為診斷或治療前列腺癌的祀向性藥物，具有較好的效果。
[0021] 同抗體不同，該多膚無免疫源性，分子量小，血液清除快，肝脾等富網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) 攝取少且清除快，在前列腺等組織中分布少，而在前列腺癌（及其轉(zhuǎn)移）病灶部位濃聚多， 且滯留時間長，可有效作為診斷和治療用放射性核素的載體。
[0022] PSMA膜外區(qū)長，高特異性結(jié)合的多膚序列的篩選和獲得困難，本小分子多膚核巧 酸序列通過瞻菌體展示技術(shù)獲得（瞻菌體展示技術(shù)是公知技術(shù)，篩選過程不再費述），本多 膚比較短，更易于修飾和體外合成，可通過體外固相合成法制備，利于量化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖 1 是 D0TA-PTP 的 HPLC 檢查圖。
[0024] 圖 2 是 D0TA-PTP 質(zhì)譜圖。
[00巧]圖3是68Ga-D0TA-PTP的HPLC分析的放射性峰。
[0026] 圖4是68Ga-D0TA-PTP的HPLC分析的紫外峰。
[0027] 圖5是前列腺癌（LNCAP)荷瘤鼠尾靜脈注射68Ga-D0TA-PTP 60min后行microPET/ CT顯像（上排為冠狀位，下排為橫斷位，左、中、右分別為CT、S陽CT和SPECT-CT融合圖像， 細箭頭所示為皮下腫瘤影，粗箭頭為腎臟和膀脫影）。
[002引圖6是荷瘤鼠（前列腺癌LNCAP和膜腺癌PC-：3)尾靜脈注射i"Lu-D0TA-PTP前后 不同時間的腫瘤體積變化比較。
[0029] 圖7是前列腺癌（LNCAP)荷瘤鼠尾靜脈注射i"Lu-D0TA-PTP后3d，5山15d腫瘤組 織病理檢查結(jié)果（肥染色；X 10)。

【具體實施方式】
[0030] W下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
[00引]實施例1
[003引一、多膚D0TA-PTP的合成及其質(zhì)控
[0033] 1、固相法直線多膚PTP的合成及與1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二焼-1,4, 7, 10-四己 酸值0TA)的偶聯(lián)
[0034] ①多膚從C端到N端方向合成，先在樹脂上掛第一個氨基酸，稱取2. Og樹脂于潔 凈干燥的反應(yīng)管中，加入適量二甲基甲醜胺值MF)，活化30min左右，然后稱取第一個氨基 酸 Fmoc-Ser 炬 ut)-〇H 0.5mmol，4-二甲氨基化巧（DMAP)75mg, N,N'-二異丙基碳二亞胺 值1C) 1ml加入到反應(yīng)管中，DMF做溶劑反應(yīng)化。反應(yīng)完畢用DMF洗4?6次，加入適量化 巧和甲醇，體積比為1: 1，反應(yīng)30min。反應(yīng)完畢用DMF洗4?6次。然后用脈巧溶液脫掉 氨基酸的Fmoc，脫兩次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量樹脂 用巧H麗檢測試劑檢測，檢測為藍色，即可進行下一步反應(yīng)；
[00巧]②稱取第二個氨基酸Fmoc-Gly-OH 1. 5mmol，苯并H氮哇-N，N，N'，N' -四甲基脈 六氣磯酸醋（皿TU)1.5mmol于反應(yīng)管中，加入DIEA 0. 5ml，反應(yīng)40min，用DMF洗4?6次， 取少量樹脂用巧H麗檢測試劑檢測，顯無色，然后加入脈巧溶液脫Fmoc，lOmin巧min,然后 用DMF洗4次，甲醇洗兩次，取出少量樹脂用巧H麗檢測試劑檢測，檢測為藍色，即可進行下 一步反應(yīng)；
[0036] ③W下氨基酸反應(yīng)方法同②；氨基酸種類按SEQ ID No: 1所示反向逐步增加，最終 得到 SEQ ID No:l 所示多膚，即 Ser-His-Phe-Ser-Val-Gly-Ser。
[0037] ④稱取0. 75mmol D0TA，皿TU 1. 5mmol于反應(yīng)管中，加入N，N-二異丙基己胺 值IEA)0. 25ml，經(jīng)過用巧H麗檢測試劑檢測，檢測為無色；
[0038] ⑥最后用H氣己酸切割液切割化，反應(yīng)液抽濾，得多膚的H氣己酸溶液，用己離沉 淀，離也，然后再用己離洗3?5次，得白色固體，經(jīng)HPLC純化，凍干，取少量進行質(zhì)量分析。
[0039] 2、質(zhì)量分析：
[0040] 使用高效液相色譜儀（HPLC)和質(zhì)譜儀（M巧對目標化合物進行膚序、分子量和化 學(xué)純度進行質(zhì)量分析
[00川 HPLC分析；參數(shù)；C18柱，（4.6X250mm)，流動相：溶劑A為含0. 1%H氣醋酸的己 膳（Acetonitrile)，溶劑B為含0. 1%H氣醋酸的超純水，流動相梯度如下：
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種與PSMA膜外區(qū)靶向性結(jié)合的多肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示。
2. -種放射性核素標記多肽，其特征在于該放射性核素標記多肽是權(quán)利要求1所述多 肽通過偶聯(lián)劑來介導(dǎo)放射性核素進行標記。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的放射性核素標記多肽，其特征在于偶聯(lián)劑為DOTA、N0TA、 CB-TE2A 或 Hynic。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的放射性核素標記多肽，其特征在于權(quán)利要求1所述多肽與偶 聯(lián)劑通過聚乙二醇（PEGn，n = 1，2, 3)連接。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的放射性核素標記多肽，其特征在于放射性核素為顯像性放射 性核素或治療性放射性核素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的放射性核素標記多肽，其特征在于顯像性放射性核素如64Cu、68Ga、mIn、99mTc，治療性放射性核素 90Y、177Lu、89Sr。
7. 權(quán)利要求1所述的多肽在制備治療或診斷前列腺癌的靶向性藥物中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求2所述的多肽在制備治療或診斷前列腺癌的靶向性藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K51/08GK104447955SQ201410677787
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月23日
【發(fā)明者】邵國強, 王自正, 劉現(xiàn)忠, 賈瑞鵬, 梁凱, 曹紅勇, 劉子君, 洪靈芝 申請人:南京市第一醫(yī)院