一種輻照滅菌條件下維持骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2活性的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用射線輻照維持BMP-2活性的方法。將BMP-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用60Co、137Cs、192Ir源射線輻照，設(shè)定劑量為0.01-100kGy；實(shí)現(xiàn)對(duì)BMP-2的輻照過程。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于有效解決了BMP-2輻照過程中失活問題，推動(dòng)了負(fù)載BMP-2的醫(yī)療器械的研究發(fā)展，大大提高了其應(yīng)用前景。
【專利說明】—種輻照滅菌條件下維持骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2活性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(819-2)輻照滅菌過程中的活性保持，其輻照對(duì)象為冊(cè)?-2，采用發(fā)射源，輻照劑量為0.01-100^670

【背景技術(shù)】
[0002]骨形態(tài)發(fā)生蛋白(819)被廣泛應(yīng)用，主要是因?yàn)樗梢哉T導(dǎo)骨和軟骨的形成，可作為治療骨折和牙周缺陷的治療劑，并能夠在植入物和人工假體周圍誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)。傳統(tǒng)的基因剔除實(shí)驗(yàn)表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白擁有著多種多樣的生物活性，比如在早期的胚胎發(fā)生、多方位的器官形成等方面都能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡來實(shí)現(xiàn)功能。通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)，一系列人骨形態(tài)發(fā)生蛋白已經(jīng)被證實(shí)可以刺激骨形成，同時(shí)重組人骨形成蛋白也被應(yīng)用。至今，已經(jīng)有超過20種冊(cè)？被鑒定和表征，他們都是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子0 (16^- 3 )超家族的成員。其中，81？-2具有幾乎和自體骨相當(dāng)?shù)墓切迯?fù)能力，被認(rèn)為具有最強(qiáng)的骨誘導(dǎo)活性。
[0003]滅菌是81？-2及負(fù)載81？-2醫(yī)療器械臨床使用前必需的操作。但是現(xiàn)行的幾種常規(guī)滅菌方式都會(huì)使81？-2失去活性。環(huán)氧乙烷可與蛋白類物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而使81？-2失活；高壓蒸汽滅菌使81？-2變性而失活。
[0004]輻照滅菌是通過放射性物質(zhì)發(fā)出輻射線殺死大多數(shù)物質(zhì)上的微生物的一種有效方法，在整個(gè)滅菌過程中，溫度并不明顯升高，對(duì)于熱敏性化合物是很好的滅菌方式。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于射線輻照有效地對(duì)81？-2滅菌同時(shí)維持其活性。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明將81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用6000^13708^19211~源射線輻照，設(shè)定劑量為0.01-1001^7，優(yōu)選設(shè)定劑量為15-501^7 ；實(shí)現(xiàn)對(duì)81？~2的輻照過程。
[0008]然后將細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？~2組，細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八…含量。通過八…含量的高低來確定81？-2的活性高低，實(shí)現(xiàn)對(duì)81？-2活性的檢測(cè)。
[0009]本發(fā)明檢測(cè)冊(cè)?-2活性的原理是41？是細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要指標(biāo)，冊(cè)?-2活性高，細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的趨勢(shì)明顯，則八I？表達(dá)量高，通過八I？的含量高低可以檢測(cè)81？~2活性的高低。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于有效解決了 81？-2輻照滅菌過程中失活問題，提高了其應(yīng)用前旦
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【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1:6°?射線25成7輻照后細(xì)胞中從？含量變化；
[0012]圖2:6000射線50成7輻照后細(xì)胞中從？含量變化；
[0013]圖3:6000射線35成7輻照后細(xì)胞中從？含量變化。
[0014]具體實(shí)施方法
[0015]下面通過例子對(duì)本發(fā)明專利進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
[0016]實(shí)施例1:
[0017]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用6%0源射線輻照，設(shè)定劑量為0.01成7。
[0018]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0019]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
[0020]實(shí)施例2:
[0021]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用⑶化源射線輻照，設(shè)定劑量為0.01成7。
[0022]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0023]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
[0024]實(shí)施例3:
[0025]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用19211~源射線輻照，設(shè)定劑量為0.01成7。
[0026]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0027]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
[0028]實(shí)施例4:
[0029]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用6%0源射線輻照，設(shè)定劑量為100成7。
[0030]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0031]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
[0032]實(shí)施例5:
[0033]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用137?:8源射線輻照，設(shè)定劑量為100成7。
[0034]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0035]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
[0036]實(shí)施例6:
[0037]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用19211~源射線輻照，設(shè)定劑量為100成7。
[0038]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0039]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
[0040]實(shí)施例7:
[0041〕 1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用6%0源射線輻照，設(shè)定劑量為25成7。
[0042]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0043]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖1所示。
[0044]實(shí)施例8:
[0045]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用6%0源射線輻照，設(shè)定劑量為50成7。
[0046]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0047]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示。
[0048]實(shí)施例9:
[0049]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用6%0源射線輻照，設(shè)定劑量為35成7。
[0050]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0051]3.通過對(duì)八I？含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八I？表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖3所示。
[0052]實(shí)施例10:
[0053]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用⑶化源射線輻照，設(shè)定劑量為25成7。
[0054]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0055]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
[0056]實(shí)施例11:
[0057]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用19211~源射線輻照，設(shè)定劑量為50成7。
[0058]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0059]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
[0060]實(shí)施例11:
[0061]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用19211~源射線輻照，設(shè)定劑量為28成7。
[0062]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0063]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
[0064]實(shí)施例12:
[0065]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用6%0源射線輻照，設(shè)定劑量為15成7。
[0066]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0067]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
[0068]實(shí)施例13:
[0069]1.準(zhǔn)備81？-2溶液加入離心管中，用封口膜封好，放入保溫瓶中，裝滿冰，用137?:8源射線輻照，設(shè)定劑量為15成7。
[0070]2.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在0？12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，分別設(shè)立未輻照的冊(cè)?-2組、輻照的81？-2組。細(xì)胞培養(yǎng)7天后檢測(cè)每個(gè)孔八I？含量。
[0071]3.通過對(duì)八…含量的分析，我們可以看到，81？~2輻照之后，其八…表達(dá)量與未輻照的81？-2的八…表達(dá)量相近，并沒有顯著性差異，從而證明輻照之后81？-2活性得到維持。
【權(quán)利要求】
1.利用射線輻照維持BMP-2活性的方法，其特征在于:射線發(fā)射源為6°Co、137Cs或192Ir,輻照劑量為0.01-1OOkGy。
2.如權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于:輻照劑量為25-50kGy。
【文檔編號(hào)】A61L2/08GK104307005SQ201410583411
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】亓洪昭, 楊賢金, 盧云峰, 李朝陽, 李雪, 崔振鐸, 原續(xù)波, 王思穎, 汪亞運(yùn) 申請(qǐng)人:天津大學(xué)