一種用于抑制和治療細粒棘球蚴病的干擾rna及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于抑制和治療細粒棘球蚴病的干擾RNA，其靶向細粒棘球絳蟲的GRP78基因，所述干擾RNA的靶序列為CCTCGTGGTTTACCTCAAA。本發(fā)明提供的siRNA-GRP78，通過電穿孔方法轉(zhuǎn)染細粒棘球蚴原頭節(jié)，siRNA-GRP78具有破壞囊型包蟲原頭節(jié)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)原頭節(jié)凋亡，降低原頭節(jié)的活力，從而抑制和殺傷細粒棘球蚴原頭節(jié)。
【專利說明】-種用于抑制和治療細粒棘球蜘病的干擾RNA及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種干擾RNA及其用來抑制和治療細粒棘球蠟J病的應(yīng)用，屬于生物醫(yī) 藥工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 棘球蠟J?。╡chinococcosis)俗稱包蟲病化ydatid disease)，是棘球蠟J緣蟲的中 緣期幼蟲寄生于人及其他一些動物體內(nèi)所引起的一種嚴重危害人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展的 人畜共患寄生蟲病。棘球緣蟲的種類較多，目前在我國主要有細粒棘球蝴病（囊型包蟲病 巧Stic echinococcosis, CE)和多房棘球蠟J?。ㄅ菪桶x病 alveolar echinococcosis, AE)兩種，其分別由細粒棘球緣蟲巧chinococcus granulosus, E.g)和多房棘球緣蟲 巧chinococcus multilo州laris，E.m)寄生于人及某些動物體內(nèi)所致。細粒棘球蠟J病呈全 球性分布，在我國主要流行于新疆、青海、內(nèi)蒙古、西藏等畜牧業(yè)發(fā)達的省區(qū)。
[0003] 細粒棘球蠟J可寄生于人體任何部位，其中肝臟最為常見巧0-70% )，其次為肺臟 (占20%?30% )，在脾，腎，骨，腦及其他器官中較少見到。目前，對于肝細粒棘球蠟J病的 治療，仍然W外科手術(shù)為主，藥物治療為輔。對于手術(shù)治療方式而言，一個嚴重的缺陷是穿 刺內(nèi)囊摘除過程中易引起內(nèi)囊里的原頭節(jié)外溢，復(fù)發(fā)率較高。即使近些年出現(xiàn)的肝包蟲外 膜內(nèi)外囊完整摘除術(shù)可完整摘除肝包蟲外囊，降低包蟲病的復(fù)發(fā)率，但是當(dāng)包蟲囊腫體積 較大或緊貼重要臟器或管道（肝口或膽管）時，則需要選擇開放式外膜內(nèi)完整摘除術(shù)。此種 術(shù)式有兩種情況：一是開放式外膜內(nèi)外囊完全切除術(shù)，二是開放式外膜內(nèi)外囊次全切除術(shù)， 該兩種情況都可能有頭節(jié)的外漏和殘留，增加術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險。因此本領(lǐng)域近年來已經(jīng)開 始嘗試使用藥物制劑來降低復(fù)發(fā)率。
[0004] 迄今為止，國內(nèi)外已經(jīng)在體外、動物及臨床上對95%己醇，高滲鹽水，5%的福爾馬 林，硝酸銀及阿苯達哇等藥物及其聯(lián)合作用效果方面進行了廣泛的研究，它們雖然可W起 到一定的療效，但都不盡理想且副作用較大；95%的己醇可導(dǎo)致機體出現(xiàn)嚴重的肝膽并發(fā) 癥，20%的高滲鹽水會使病人出現(xiàn)嚴重的肝膽并發(fā)癥，10% &〇2會致使機體出現(xiàn)空氣栓賽 甚至?xí)l(fā)生過敏性休克，福爾馬林使用后會產(chǎn)生嚴重的肝膽并發(fā)癥，20 %的硝酸銀可致使 病人出現(xiàn)術(shù)中休克，也血管功能衰竭，腎功能衰竭，肝功能不全等副作用，術(shù)后發(fā)生呼吸困 難，紫巧，低血壓等一系列副作用，阿苯達哇（AB幻臨床上病人使用后，肝酶水平會因此而 上升，高濃度酸性和堿性溶液盡管能有效殺滅，但是無法在人體內(nèi)應(yīng)用，而低濃度的酸性和 堿性溶液殺滅效果不理想。
[0005] 根據(jù)制藥領(lǐng)域的認知，理想的局部化療藥物應(yīng)具有快速，完整的藥物作用效果 (沒有局限性和副作用），從該個角度來看，目前還沒有發(fā)現(xiàn)理想的局部化療藥物。因此，尋 找理想的局部輔助用藥的化療藥物對于肝包蟲病的治療具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 申請人:多年來致力于研究細粒棘球蠟J病在細胞和基因?qū)用娴闹虏C理，發(fā)現(xiàn) 在細粒棘球蠟J病中細粒棘球蠟J原頭節(jié)存在GRP78蛋白（分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78， glucose-regulated protein78/binding immunoglobulin protein, GRP78)的高表達，從 而確定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與細粒棘球蠟J發(fā)病。基于該致病機理， 申請人:研究了通過抑制 GRP78表達從而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制來抑制和殺滅細粒棘球蠟J原頭節(jié)的生長，從而有效治 療細粒棘球蠟J病。
[0007] 基于上述，本發(fā)明首先公開了一種干擾RNA(可簡稱為SiRNA或RNAi),能夠特異性 的祀向細粒棘球緣蟲的GRP78基因從而使其沉默從而特異性下調(diào)GRP78的表達，用于抑制 和治療細粒棘球蠟J病，所述干擾RNA的祀序列為CCTCGTGGTTTACCTCAAA。
[0008] 由于上述作用機制的存在，在另一面，本發(fā)明還公開了干擾RNA在制備治療細粒 棘球蠟J病的藥物中的應(yīng)用，所述干擾RNA的祀序列CCTCGTGGTTTACCTCAAA。
[0009] 具體到臨床應(yīng)用，可W將干擾RNA作為藥物活性成分直接進入病灶來防治細粒棘 球蝴病，例如在手術(shù)過程中注射的方式，通常的，干擾RNA通過浸泡或轉(zhuǎn)染的方式進入細粒 棘球緣蟲，從而消滅其生長過程。
[0010] 優(yōu)選的，通過電穿孔轉(zhuǎn)染的方法將干擾RNA對細粒棘球蠟J原頭節(jié)進行轉(zhuǎn)染，上述 電轉(zhuǎn)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所廣泛了解的，例如通過電轉(zhuǎn)儀進行。
[0011] 考慮到實際使用的需要，本發(fā)明所涉及的藥物還可W是將含有上述干擾RNA序列 的病毒載體或質(zhì)粒載體作為活性成分，該在分子生物學(xué)上是廣泛可用的，即通過對載體進 行酶切，然后將干擾RNA與酶切后的載體連接得到連接產(chǎn)物，將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受 態(tài)細胞中篩選出陽性克隆，上述操作為本領(lǐng)域的公知技術(shù)，例如在分子克隆實驗指南教材 中即記載了標準操作過程。
[0012] 申請人:進行的實驗顯示，本發(fā)明所公開的RNA干擾序列轉(zhuǎn)染細粒棘球蝴原頭節(jié)， siRNA-GRP78具有破壞細粒棘球蠟J原頭節(jié)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)原頭節(jié)調(diào)亡，降低原頭節(jié)的活力，從而 抑制和殺傷細粒棘球蝴原頭節(jié)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1細粒棘球蠟J原頭節(jié)（A ;綿羊肝包蟲；B ;培養(yǎng)細粒棘球蠟J原頭節(jié)）
[0014] 圖2轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78對細粒棘球蠟J原頭節(jié)形態(tài)的影響（A ;空白組3d原頭節(jié)；B : 空白組5d原頭節(jié)；C ;對照組3d原頭節(jié)；D ;;對照組5d原頭節(jié)；E ;siRNA-GRP783d原頭節(jié)； F ;siRNA-GRP785d 原頭節(jié)）
[0015] 圖3轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78對細粒棘球蠟J原頭節(jié)活力的影響
[0016] 圖4轉(zhuǎn)染siRNA-GRP782化對體外細粒棘球蠟J原頭節(jié)表面超微結(jié)構(gòu)的影響（A ;空 白組原頭節(jié)；B ;對照組原頭節(jié)；C，D ;轉(zhuǎn)染siRNA-GRP782化原頭節(jié)）
[0017] 圖5轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78不同時間對細粒棘球蠟J原頭節(jié)內(nèi)Caspase-3酶活性的影響
[0018] 圖6轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78不同時間對細粒棘球蠟J原頭節(jié)內(nèi)化spase-12酶活性的影 響
[0019] 圖7轉(zhuǎn)染siRNA-GRP784她后細粒棘球蠟J原頭節(jié)TraEL檢測（A ;空白組原頭節(jié)；B : 對照組原頭節(jié)；C，D ;轉(zhuǎn)染siRNA-GRP784她原頭節(jié)）

【具體實施方式】
[0020] 為了說明本發(fā)明干擾RNA的效果， 申請人:進行了體外的細粒棘球蠟J殺滅實驗，具 體的實驗過程如下所述：
[0021] 實驗1 ;細粒棘球蠟J原頭節(jié)的采集和培養(yǎng)
[0022] 取新鮮的自然感染囊性肝包蟲病的綿羊肝臟，清洗羊肝表面多次至清潔，然后用 75%酒精消毒，無菌條件下抽取含有原頭節(jié)的囊液，于無菌瓶中。用PBS(PH = 7. 2)洗濯原 頭節(jié)多次至澄清，用0. 1%伊紅染液做染色排斥反應(yīng)，98% W上拒染。肉眼觀察原頭節(jié)呈白 色細沙樣均勻顆粒，活性好的原頭節(jié)沉降速度較快，相反活性不好的或者已死亡的原頭節(jié) 沉降速度相對比較緩慢。倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)蟲體呈凹陷型，散在密集分布，蟲體呈楠 圓形且其內(nèi)部結(jié)構(gòu)飽滿、清晰完整，里面充滿許多清亮而明顯的巧顆粒。依據(jù)頭節(jié)量的多少 將原頭節(jié)分裝至大小不等的已添加10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中（IOOU/ 血青霉素，鏈霉素IOOU/血)，在37C、5% C〇2恒溫賠育箱內(nèi)培養(yǎng)備用。
[0023] 實驗2 ;設(shè)計和合成干擾RNA序列片段
[0024] 合成與鑒定siRNA-GRP78有效序列；根據(jù)GRP78基因序列（GenBank:M63605. 1)， 設(shè)計siRNA-GRP78的序列，由廣州銳博生物公司合成小分子的siRNA-GRP78,并篩選得到本 發(fā)明所用的SiRNA(小分子干擾RNA)分子，祀序列為（SiRNA反義鏈與祀序列堿基配對）： CCTCGTGGTTTACCTCAAA。
[00巧]實驗3 ;細粒棘球蠟J原頭節(jié)電穿孔方法轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78
[0026] 實驗分組；siRNAGRP78、空白組（未加SiRNA進行轉(zhuǎn)染）及對照組（非特異性 SiRNA)。
[0027] 實驗方法：設(shè)120 y L體系，將在體外培養(yǎng)3天后的細粒棘球蠟J原頭節(jié)用磯酸鹽緩 沖液（PH7. 2)清洗3次，按W上各組，將大約2000個原頭節(jié)加入上述組的培養(yǎng)液中、電轉(zhuǎn)緩 沖液及所加SiRNA(濃度設(shè)為Sy mol/L)于電極杯中。然后用Amaxa 2型電轉(zhuǎn)儀采用最優(yōu) 電轉(zhuǎn)程序分別對細粒棘球蠟J原頭節(jié)進行轉(zhuǎn)染。最后置37C，5% C〇2賠育箱內(nèi)培養(yǎng)。
[002引實驗4 ;siRNA-GRP78對細粒棘球蠟J原頭節(jié)形態(tài)的影響
[0029] 1) siRNA-GRP78對細粒棘球蠟J原頭節(jié)光鏡結(jié)構(gòu)的影響
[0030] 應(yīng)用電穿孔方法將siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染囊型包蟲原頭節(jié)，處理不同時間，在倒置 顯微鏡下仔細觀察蟲體的存活、運動、生長發(fā)育W及形態(tài)變化，將原頭節(jié)息液定量稀釋 后，取加L均勻的混息液用伊紅染色，觀察頭節(jié)活力并計數(shù)，繪制原頭節(jié)活力曲線，觀察 S iRNA-GRP78對細粒棘球蠟J原頭節(jié)生長的影響。
[0031] 2) siRNA-GRP78對細粒棘球蠟J原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)的影響
[0032] 應(yīng)用電穿孔方法將siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染細粒棘球蠟J原頭節(jié)，處理不同時間，將原頭 節(jié)置于4C 3%戊二酵固定2化，己醇梯度脫水后，將標本置于二氧化碳臨界點干燥儀中干 燥，在真空涂膜儀內(nèi)噴金，掃描電鏡觀察原頭節(jié)表面結(jié)構(gòu)。
[003引實驗5 ;siRNA-GRP78對細粒棘球蠟J原頭節(jié)調(diào)亡的影響
[0034] Caspase-3活性檢測；應(yīng)用電穿孔方法將siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染細粒棘球蠟J原頭 節(jié)，處理不同時間，用caspase-3試劑盒檢測caspase-3活性。caspase-3可W催化底物 Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA，從而可W通過測定吸光度來檢測caspase-3的活性，依據(jù)底 物被蛋白水解酶分解后的吸光度值而測定。在測得A405值和作出標準曲線的基礎(chǔ)上，計算 出樣品中已生成的對硝基苯胺（PM)濃度。采用單因素方差分析對化spase-3活性檢測 出來的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間兩兩比較采用SM法。
[0035] TraEL檢測；應(yīng)用電穿孔方法將siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染細粒棘球蠟J原頭節(jié)，處理不同時 間，TU肥L法檢測細胞調(diào)亡。用甲酵固定，瓊脂糖包埋原頭節(jié)，將包埋原頭節(jié)的瓊脂糖塊作 為組織塊進行石蠟包埋，切片，TUNEL染片。調(diào)亡細胞的細胞核被TU肥L試劑染成蹤黃色， 正常細胞不著色。
[0036] 化spase-12蛋白表達；應(yīng)用電穿孔方法將siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染囊型包蟲原頭節(jié)，處 理不同時間，Western blot檢測原頭節(jié)內(nèi)化spase-12蛋白表達水平。提取原頭節(jié)的總蛋 白，SDS-PAGE分離蛋白樣品，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，NC膜用5%脫脂牛奶封閉，一抗賠育 過夜，5 %脫脂牛奶漂洗3次，辣根過氧化物酶標記的IgG室溫賠育，PBS漂洗，E化滴加到 NC膜上，膠片曝光，X光沖片機沖洗膠片。實驗結(jié)果如下所示：
[0037] 肉眼觀察原頭節(jié)呈細白沙樣均勻顆粒，活性好的原頭節(jié)沉降速率快，活性不好的 或者死亡的原頭節(jié)沉降速率相對比較慢。倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)蟲體呈內(nèi)陷型，散在密 布，蟲體結(jié)構(gòu)飽滿，呈楠圓形，結(jié)構(gòu)清晰完整，巧顆粒清亮而明顯。有些外翻型的原頭節(jié)，可 見到背腹左右四個吸盤，少量原頭節(jié)的口器仍然吸附在生發(fā)層表面（圖1)。
[0038] 倒置顯微鏡下觀察，電轉(zhuǎn)siRNA-GRP787化后，原頭節(jié)活動度逐漸減弱，并出現(xiàn)蟲 體邊緣不規(guī)整，且有大量空泡產(chǎn)生，巧顆粒顯著減少，原頭節(jié)頂突上的小鉤排列奈亂，部分 脫落，吸盤開始變型，12化后，頭節(jié)活動度較正常及對照組明顯減弱，活力減弱的原頭節(jié)蟲 體開始皺縮、體積變小且邊緣空泡量增多，伊紅染液做染色排斥實驗，可見大部分頭節(jié)內(nèi)部 結(jié)構(gòu)破壞并被紅色著染?？瞻捉M和非特異性SiRNA組原頭節(jié)有的頂突凸出，有的凹陷，頭節(jié) 的體積也比實驗組大，存活良好，可見活動的原頭節(jié)（圖2)。
[0039] siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染細粒棘球蠟J原頭節(jié)，經(jīng)倒置顯微鏡下觀察，繪制活力曲線，從 圖中亦可W看出，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，S i RNA-GRP 7 8對原頭節(jié)活力的抑制率增加，證實 siRNA-GRP78體外作用于細粒棘球蠟J原頭節(jié)，有抑制原頭節(jié)生長的作用（圖3)。
[0040] 掃描電鏡觀察空白對照組原頭節(jié)多呈內(nèi)陷型，蟲體呈球形或楠圓形，且表面光 滑，。非特異性SiRNA作用于原頭節(jié)，未見頭節(jié)結(jié)構(gòu)變化。應(yīng)用siRNA-GRP78作用于細粒 棘球蠟J原頭節(jié)Id后在SEM下觀察發(fā)現(xiàn)，原頭節(jié)吸盤發(fā)生變型，頭鉤奈亂，微毛排列奈亂或消 失，蟲體表層呈現(xiàn)蟲蝕樣的改變或出現(xiàn)指狀突起，部分頭節(jié)蟲體凹陷且結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞， 甚至開始崩解。當(dāng)siRNA-GRP78作用2d后，原頭節(jié)體表破壞加重，頂突界面嚴重缺損，吸盤 變型，頭鉤排列奈亂并出現(xiàn)部分缺損（圖4)。
[0041] 采用單因素方差分析對化spase-3活性檢測出來的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，從 結(jié)果看出細粒棘球蠟J原頭節(jié)內(nèi)Caspase-3的活性表達，轉(zhuǎn)染siRNA-GRP782化、4她時， siRNA-GRP78組Caspase-3的活性表達最強（圖5)。
[0042] 用Western blot檢測原頭節(jié)內(nèi)（^ispase-12蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)siRNA-GRP78轉(zhuǎn) 染于細粒棘球蠟J原頭節(jié)，Caspase-12蛋白表達水平升高（P<0. 05)，由此證實，siRNA-GRP78 可W激活細粒棘球蠟J原頭節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)亡通路（圖6)。
[0043] siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染于細粒棘球蠟J原頭節(jié)，TUNEL檢測siRNA-GRP78對細粒棘球蠟J原 頭節(jié)的調(diào)亡狀況。結(jié)果顯示，siRNA-GRP78組原頭節(jié)結(jié)構(gòu)尚完整，原頭節(jié)中可見被染成黃色 和藍色兩種顏色的細胞核，細胞核黃染者為調(diào)亡細胞，調(diào)亡細胞呈散在分布或集中靠近皮 層處。而對照組和空白組原頭節(jié)細胞核大多數(shù)呈藍色。證實siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染于細粒棘球 蠟J原頭節(jié)，可W激活原頭節(jié)調(diào)亡（圖7)。
[0044] 綜合上述結(jié)果我們可W看到，本發(fā)明的技術(shù)方案基于RNAi技術(shù)，針對GRP-78目的 基因，設(shè)計干擾序列，采用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)，特異性下調(diào)GRP-78的表達。實驗結(jié)果顯示，應(yīng) 用siRNA-GRP78后，siRNA-GRP78具有破壞細粒棘球蠟J原頭節(jié)光鏡和超微結(jié)構(gòu)，降低原頭節(jié) 的活力；激活細粒棘球蠟J原頭節(jié)化spase-3活性，激活細粒棘球蠟J原頭節(jié)化spase-12活性， 激活細粒棘球蠟J原頭節(jié)TU肥L活性，誘導(dǎo)調(diào)亡?；谏鲜鰧嶒灲Y(jié)果可W發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的干擾 RNA能成功抑制GRP78表達，并對體外培養(yǎng)的細粒棘球蠟J原頭節(jié)有抑制和殺傷作用，此作用 具時間依賴性，即隨著作用時間的延長，原頭節(jié)的抑制率增加。倒置顯微鏡下可見原頭節(jié)體 內(nèi)的巧顆粒減少，頭節(jié)活動度明顯下降。通過伊紅染色反應(yīng)，可觀察到隨著時間的延長被著 色的原頭節(jié)數(shù)量也越來越多，說明抑制GRP78表達對體外培養(yǎng)得細粒棘球蠟J原頭節(jié)有抑制 和殺傷作用。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于抑制和治療細粒棘球蚴病的干擾RNA，其靶向細粒棘球絳蟲的GRP78基因， 所述干擾RNA的靶序列為CCTCGTGGITTACCTCAAA。
2. 干擾RNA在制備治療細粒棘球蚴病的藥物中的應(yīng)用，所述干擾RNA的靶序列為 CCTCGTGGTTTACCTCAAA。
3. 抑制細粒棘球蚴生長的方法，其特征在于轉(zhuǎn)染干擾RNA到細粒棘球絳蟲細 粒棘球蚴原頭節(jié)，其靶向細粒棘球絳蟲的GRP78基因，所述干擾RNA的靶序列為 CCTCGTGGTTTACCTCAAA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)染的方法為電穿孔。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于還包括評價抑制效果的步驟，包括通過光鏡和 電鏡觀察siRNA-GRP78對細粒棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)的影響、應(yīng)用Caspase-3活性檢測，TUNEL 檢測和Caspase-12蛋白表達，獲得siRNA_GRP78對細粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡的影響。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于caspase-3試劑盒檢測caspase-3活性， Western blot檢測原頭節(jié)內(nèi)Caspase-12蛋白表達水平，TUNEL法檢測細胞凋亡。
【文檔編號】A61P33/10GK104357445SQ201410571940
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】呂海龍, 姜玉峰, 裴學(xué)蓮 申請人:呂海龍