一種環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物及其制備方法與應用。具有結(jié)構(gòu)通式如下或者其游離形式：其中，n為0至9，m為1至9；n＝m，R為氫基，甲基，乙基，丙基，鹵素等單取代集團；當n≠m，R為氫基。該類化合物作為生物發(fā)光底物的應用，能利用生物發(fā)光檢測螢光素酶的存在和數(shù)量(包括酶水平、細胞水平和動物水平)，檢測螢光素酶在體外，細胞和體內(nèi)分布成像的應用；檢測ATP的存在和數(shù)量(包括酶水平、細胞水平和動物水平)，檢測ATP在體外，細胞和體內(nèi)分布成像的應用；能夠在螢光素酶、ATP、Mg2+的存在下作為報告信號檢測藥物在酶水平、細胞水平、動物水平的藥理作用。
【專利說明】一種環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物及其制備方法與應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物及其制 備方法與應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物發(fā)光（Bioluminescence)是生物體內(nèi)的化學物質(zhì)在酶的催化下將化學能轉(zhuǎn) 化為光能的一種過程，這是一種特殊類型的化學發(fā)光，不依賴于機體對光的吸收，化學能轉(zhuǎn) 化為光能的效率很高，接近1〇〇%。
[0003] 不同的生物發(fā)光體系的螢光素酶和螢光素結(jié)構(gòu)也各有差別，目前只完成為數(shù)不多 的幾個物種的活性物質(zhì)分離和分子結(jié)構(gòu)確定，并被應用于哺乳動物的成像研究.雖然每種 發(fā)光體系的發(fā)光底物不盡相同，但其生物發(fā)光的機制確大致相同：底物被螢光素酶催化氧 化，產(chǎn)生含有激發(fā)態(tài)的電子中間體，當該電子由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時將化學能轉(zhuǎn)化為光能，釋 放出光子。
[0004] 生物發(fā)光成像是通過靈敏的光學檢測儀器監(jiān)控螢光素酶標記的細胞或基因在活 體生物內(nèi)的活動和行為過程的一種新興的成像技術(shù).生物發(fā)光成像技術(shù)具有操作簡便快 速、靈敏度高、能夠?qū)崿F(xiàn)實時動態(tài)觀測以及非侵襲性等優(yōu)點。隨著理論研究的深入，該技術(shù) 已經(jīng)逐步地應用到微生物學、生物化學、環(huán)境科學、分子生物學、醫(yī)學等多個學科和領(lǐng)域，成 為了一種重要的成像手段.生物發(fā)光成像技術(shù)在腫瘤生長監(jiān)測和轉(zhuǎn)移示蹤、目標基因表達 的檢測、蛋白-蛋白相互作用、藥物高通量篩選、細胞內(nèi)ATP水平探測和研究細菌病毒感染 宿主過程等領(lǐng)域有著不可替代的技術(shù)優(yōu)勢。
[0005] 生物發(fā)光信號的實時檢測與螢光素的半衰期和組織的滲入量緊密相關(guān).但是 生物發(fā)光是一種爆發(fā)型的發(fā)光現(xiàn)象，半衰期較短，這些原因限制了螢光素在體內(nèi)實驗的 應用。為了解決這些問題，Piwnica-Worms等人用微滲透泵來保證組織中螢光素的濃度 (Gross, S., et al., Continuous delivery of D-Iuciferin by implanted micro-osmotic pumps enables true real-time bioluminescence imaging of luciferase activity in vivo. Mol Imaging, 2007. 6(2) :p. 121-30.)，而 Denmeade 等人則利用聚乙二醇與 D-螢光 素的類似物氨基螢光素連接來延長螢光素的半衰期（Chandran，S. S.，S. A. Williams，and S. R. Denmeadej Extended-release PEG-Iuciferin allows for long-term imaging of firefly luciferase activity in vivo. Luminescence，2009. 24(I) :p. 35-8.) 〇
[0006] 除此之外，生物發(fā)光的發(fā)光波長只在可見光范圍，與部分生物分子（例如，血紅 素）吸收光譜的重疊限制了其在深組織的應用，將生物發(fā)光的波長范圍擴展到近紅外區(qū) 域是一個較為理想的目標.Yasuteru Urano等人利用生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移（BRET)的 方法，將一系列Cy5熒光團鏈接在氨基螢光素上，得到近紅外的發(fā)光范圍（Kojima，R.，et al., Rational Design and Development of Near-Infrared-Emitting Firefly Luciferins Available In Vivo. Angew. Chem. Int. Ed，2013. 52:p. 1175-1179) 〇
[0007] 在某種程度上，以上研究解決了限制生物發(fā)光應用的問題，但是以上前期材料合 成繁瑣，花費較高，發(fā)光強度較弱，這也使得這些方法不能大范圍推廣。
[0008] 螢火蟲螢光素酶和螢光素酶底物有著較高的特異性。對螢光素結(jié)構(gòu)的改造可能會 使其發(fā)光性質(zhì)受到影響。氨基螢光素的生物發(fā)光發(fā)射光波長紅移（557nm紅移至593nm)，且 與螢光素酶具有更強的親和力。D-螢光素的類似物以及具有新骨架的螢光素酶底物的發(fā)現(xiàn) 能夠拓展生物發(fā)光成像在生命科學領(lǐng)域的應用，對于整個成像領(lǐng)域的進步有著較大的推動 作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對以上問題，我們在氨基螢光素的基礎上，對其氨基進行簡單的環(huán)烷基取代，得 到了能延長體內(nèi)半衰期，提高組織滲透性和增強近紅外區(qū)域發(fā)光強度的生物發(fā)光底物.該 底物合成方法簡單，經(jīng)濟適用，對于生物發(fā)光在體內(nèi)的應用有著較大的推進作用。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0011] 一種環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物，具有通式（I )的結(jié)構(gòu)：
[0012]

【權(quán)利要求】
1. 一種環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物，具有通式（I)的結(jié)構(gòu)：
其中，η為O至9自然數(shù)，m為1至9自然數(shù)；n=m，R為氫基，甲基，乙基，正丙基，正丁 基，氟，氯，溴，碘；當n#m，R為氫基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物，其特征在于，所述η尹m，R為氫基時，m，η之和為 2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,10,11，12,13,14,15,16,17,18。
3. 如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，包括表1所示的化合物，其名稱如下： (S)-4-((2-(4-羧基-4, 5-二氫噻唑-2-基）苯并噻唑-6-(環(huán)己烷基）氨基（LI), (S) -4- ((2- (4-羧基-4, 5-二氫噻唑-2-基）苯并噻唑-6-(環(huán)戊烷基）氨基（L2)， (S) -4- ((2- (4-羧基-4, 5-二氫噻唑-2-基）苯并噻唑-6-(環(huán)丁烷基）氨基（L3)， (S)-4-((2-(4-羧基-4, 5-二氫噻唑-2-基）苯并噻唑-6-(4-甲基-環(huán)己烷基）氨基 (L4), (S)-4-((2-(4-羧基-4, 5-二氫噻唑-2-基）苯并噻唑-6-(3-甲基-環(huán)丁烷基）氨基 (L5), (S)-4-((2-(4-羧基-4, 5-二氫噻唑-2-基）苯并噻唑-6-(4-乙基-環(huán)已烷基）氨基 (L6), (S) -4- ((2- (4-羧基-4, 5-二氫噻唑-2-基）苯并噻唑-6- (3-乙基-環(huán)丁烷基）氨基 (L7), (S)-4-((2-(4-羧基-4, 5-二氫噻唑-2-基）苯并噻唑-6-(4-丙基-環(huán)己烷基）氨基 (L8), (S) -4- ((2- (4-羧基-4, 5-二氫噻唑-2-基）苯并噻唑-6- (3-丙基-環(huán)丁烷基）氨基 (L9), (S)-4-((2-(4-羧基-4, 5-二氫噻唑-2-基）苯并噻唑-6-(4-溴-環(huán)已烷基）氨基 (LlO)， 化合物名稱后的括號中為其對應的代號。
4. 權(quán)利要求1所述的環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物作為生物發(fā)光底物的應用。
5. 權(quán)利要求1所述的環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物在檢測螢光素酶在體外，細胞和 體內(nèi)分布成像方面的應用。
6. 權(quán)利要求1所述的環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物在檢測ATP的存在和數(shù)量以及檢 測ATP在體外，細胞和體內(nèi)分布成像方面的應用。
7. 權(quán)利要求1所述的環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物在檢測藥物在酶水平、細胞水 平、動物水平的藥理作用方面的應用。
8. 根權(quán)利要求1?5中任一項所述的環(huán)烷基單取代氨基螢光素化合物的制備方法，其 特征在于，具體制備步驟如下： 1)將2-氰基6-氨基苯并噻唑溶于醋酸中，攪拌5分鐘，再加入環(huán)烷酮或環(huán)戊酮或環(huán)丁 酮，攪拌，攪拌結(jié)束后，加入氰基硼氫化鈉，待反應液呈現(xiàn)澄清的橙紅色溶液時，加入乙酸乙 酯，攪拌，再分次加入飽和碳酸鈉溶液，直至反應液中無氣泡生成；反應液用飽和碳酸鈉溶 液洗滌后，用乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥、過濾、過硅膠柱純化，即 得中間體化合物； 2)將中間體化合物溶于體積比為1:1的甲醇和二氯甲烷的混合溶液中，將無水碳酸鉀 與一水合半胱氨酸鹽酸鹽溶于質(zhì)量濃度為40 %的甲醇水溶液中，將上述兩液混合，反應15 分鐘后，將反應液中的有機溶劑蒸除，調(diào)節(jié)反應液的PH值為5. 5?6. 5,待大量固體析出后， 過濾，即得目標化合物； 步驟1)中所述2-氰基6-氨基苯并噻唑的加入量為所述醋酸重量的1 %?5%，所述 環(huán)烷酮或環(huán)戊酮或環(huán)丁酮的加入量為所述醋酸重量的8?10% ;所述氰基硼氫化鈉的加入 量為所述醋酸重量的3%?8% ; 步驟2)中所述中間體化合物的加入量為所述甲醇和二氯甲烷的混合溶液重量的 1%?3%，所述無水碳酸鉀和一水合半胱氨酸鹽酸鹽的加入量分別為所述甲醇水溶液重量 的1%?2%和L5?2. 5%。
【文檔編號】A61K49/00GK104311504SQ201410567425
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】李敏勇, 杜呂佩, 吳文曉 申請人:山東大學