一種富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，包括：將活化的桑黃和靈芝菌種接種于添加黃連木提取物的液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)制得桑黃和靈芝液體菌種；先將桑黃液體菌種接入添加有胡蘿卜、大麥的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)產(chǎn)物干燥粉碎后得固體培養(yǎng)物Ⅰ；再將靈芝液體菌種接入添加有固體培養(yǎng)物Ⅰ和甘藍(lán)酶解物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間再接入乳酸菌菌種進(jìn)行培養(yǎng)得到發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明根據(jù)胡蘿卜、甘藍(lán)傳統(tǒng)富含葉酸果蔬原料特點(diǎn)及食藥真菌桑黃、靈芝的發(fā)酵特性，通過采用先食藥真菌發(fā)酵，后乳酸菌發(fā)酵的兩階段發(fā)酵，提高了最終發(fā)酵產(chǎn)物中葉酸的含量，是一種極具工業(yè)化前景的生產(chǎn)方法。
【專利說明】一種富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 桑黃（Phellinus igniarius)屬擔(dān)子菌亞門，層孔菌綱，銹革孔菌科，針層孔菌屬。 桑黃菌提取物在抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和防止癌癥手術(shù)后復(fù)發(fā)等的臨床應(yīng)用中具有顯著效果，是 目前國(guó)際公認(rèn)的生物治癌藥劑中有效率最高的一種食藥真菌。
[0003] 由于受生理狀態(tài)的特殊性和復(fù)雜性以及外部環(huán)境的制約，造成桑黃在自然界中形 成子實(shí)體稀少，特別是形成可用子實(shí)體需要多年。而且人工栽培極其困難，培養(yǎng)條件苛刻， 且生長(zhǎng)周期長(zhǎng)達(dá)3-4年，難以滿足日益膨脹的市場(chǎng)需要。采用桑黃液體發(fā)酵的方法生產(chǎn)桑 黃藥用活性成分因?yàn)榫哂猩a(chǎn)周期短、勞動(dòng)力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是一 種有效的方法。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)桑黃菌絲體培養(yǎng)生產(chǎn)活性藥用成分研究和工藝應(yīng)用主要集 中在發(fā)酵條件及產(chǎn)物提取分離等層面上，整體發(fā)酵水平不高。
[0004] 葉酸（folate)屬于水溶性維生素 B族，是具有蝶酰谷氨酸分子結(jié)構(gòu)的一類化合物 的總稱，又名蝶酰谷氨酸，維生素 Be、維生素 M、維生素 B11。葉酸的重要生理功用是作為一 碳化合物的載體參加代謝活動(dòng)。葉酸轉(zhuǎn)化為四氫葉酸衍生物以輔酶形式作為一碳單位的載 體，對(duì)轉(zhuǎn)移甲基和利用甲酸基及甲醛都有重要功用。葉酸在核酸和蛋白質(zhì)生物合成過程中 也具有重要作用。由于人體內(nèi)無法自主合成葉酸，幾乎完全依賴于食物攝入，因此當(dāng)攝入量 不足或利用率降低時(shí)，體內(nèi)便會(huì)出現(xiàn)葉酸缺乏的癥狀。近年的研究表明，葉酸缺乏與巨幼紅 細(xì)胞性貧血有關(guān)，還與兒童智力低下、神經(jīng)管畸形、心腦血管疾病、某些癌癥（如子宮頸癌、 結(jié)腸癌、支氣管癌和食管癌）等有關(guān)。葉酸缺乏可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管畸形、巨幼紅細(xì)胞性貧 血，且與心血管疾病、老年性癡呆、直腸癌及子宮頸癌密切相關(guān)。膳食葉酸對(duì)人類至關(guān)重要， 這是因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞不能合成葉酸，但組織的生長(zhǎng)需要大量葉酸。植物和微生物可以合 成葉酸，是膳食葉酸的重要來源，如植物中的甘藍(lán)、柑橘、大麥、扁豆等。
[0005] 基于葉酸對(duì)人體健康的重要程度不斷增加，葉酸的開發(fā)與應(yīng)用成為當(dāng)今世界強(qiáng)化 食品研究與開發(fā)的新熱點(diǎn)。天然葉酸的主要來源是綠色植物的葉子、動(dòng)物肝臟、蛋黃、大豆、 小麥和以葉酸發(fā)酵產(chǎn)生的早餐谷物類及酵母當(dāng)中。市售的葉酸以化學(xué)合成為主，但化學(xué)合 成的葉酸和天然葉酸在人體內(nèi)的代謝不盡相同，攝入過多的人工葉酸，會(huì)引起不良作用，t匕 如減弱巨噬細(xì)胞的吞噬作用，甚至?xí)龠M(jìn)部分癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。而微生物發(fā)酵產(chǎn)生的葉酸質(zhì) 量安全，不會(huì)給人體帶來副作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，該方法操作容易，轉(zhuǎn) 化率高,可明顯提高發(fā)酵產(chǎn)物中葉酸含量。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] -種富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，包括步驟：
[0009] (1)食藥真菌液體種子液制備：取活化后的桑黃菌種接種于添加黃連木提取物的 桑黃液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-10天，得到桑黃液體菌種；取活化后的靈芝菌種接種于添 加黃連木提取物的靈芝液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-10天，得到靈芝液體菌種；
[0010] (2)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基體 積8% -20%的用量接入胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在22°C -30°C下培養(yǎng)3天-15天后，將 培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養(yǎng)物I ;所述的胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基中 含有胡蘿卜和大麥；
[0011] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積 4% -15 %的用量先接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在22°C -28°C下培養(yǎng)1天-6天后，調(diào)pH值為 4. 0-6. 8,升溫至35°C -37°C并保持在該溫度下2h-2. 5h后，再接入占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體 積2% -12%的乳酸菌液體菌種培養(yǎng)6h-48h，終止發(fā)酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發(fā)酵產(chǎn) 物；所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有胡蘿卜固體培養(yǎng)物I和甘藍(lán)酶解物。
[0012] 本發(fā)明根據(jù)胡蘿卜、甘藍(lán)傳統(tǒng)富含葉酸果蔬原料特點(diǎn)及食藥真菌桑黃、靈芝的發(fā) 酵特性，利用食藥真菌具有降解纖維素、果膠、淀粉等物質(zhì)的酶系，可將纖維素、果膠等分解 為更易被微生物利用的小分子碳源，提高了最終發(fā)酵產(chǎn)物中葉酸的含量。
[0013] 所述的桑黃菌種可采用任意一種桑黃菌種，可采用市售產(chǎn)品。例如桑黃 (Phellinus linteus)ACCC51181菌種，來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0014] 所述的靈芝菌種可采用任意一種靈芝菌種，可采用市售產(chǎn)品。例如靈芝 (Ganoderma lucidium)ACCC 51515菌種，來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0015] 為了達(dá)到更好的發(fā)明效果，進(jìn)行以下優(yōu)選：
[0016] 步驟（1)中，每升桑黃液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加量為Ig-IOg ;每升 靈芝液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加量為lg-10g。
[0017] 所述的黃連木提取物可以選用市售產(chǎn)品，也可以采用現(xiàn)有方法制備；優(yōu)選以黃連 木樹葉為原料制備的黃連木提取物，進(jìn)一步優(yōu)選由黃連木樹葉乙醇提取物和黃連木樹葉水 提取物組成的黃連木提取物，可采用以下制備方法制備的黃連木提取物，包括：稱取一定量 的黃連木樹葉，粉碎（優(yōu)選過40目-100目），先加占黃連木樹葉重量10倍量-16倍量的質(zhì) 量百分濃度為60% -80%的乙醇水溶液在60°C -80°C浸提lh-2h，過濾后得到上清液，上清 液濃縮后真空冷凍干燥得提取物II ;上述醇提后的黃連木樹葉殘?jiān)尤胝键S連木樹葉重量 10倍量-20倍量的水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4 體積后加入濃縮物體積2倍量-5倍量的無水乙醇，離心收集沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥 后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黃連木提取物。
[0018] 步驟（1)中，所述的活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種在添加黃連木提取物 的液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的溫度為自然環(huán)境溫度，優(yōu)選為20°C -30°C。一般IL添加黃連木 提取物的液體種子培養(yǎng)基中接入lcm2-4cm2大小的活化后的桑黃菌種菌塊或活化后的靈芝 囷種囷塊。
[0019] 步驟（1)中，桑黃菌種、靈芝菌種的活化方法為本領(lǐng)域常規(guī)的菌種活化方法，包 括：將斜面保藏的桑黃菌種、靈芝菌種分別接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度22°C _30°C，培養(yǎng)時(shí)間3天-10天，分別得到活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種。
[0020] 所述的PDA平板培養(yǎng)基和液體種子培養(yǎng)基均采用本領(lǐng)域種子培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基， 可采用市售產(chǎn)品。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂 15g-20g，用水定容至1000mL。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的桑黃液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5g-20g、酵 母粉4g、蛋白胨3g、KH 2PO4Ig和MgSO4O. 5g，用水定容至1000mL。所述的靈芝液體種子培養(yǎng) 基：葡萄糖8g-25g、酵母粉6g、蛋白胨6g、KH2PO 4Ig和MgSO4O. 5g，用水定容至1000mL。
[0021] 步驟（2)中，所述的胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選由以下質(zhì)量百分比的組分組成： K2HPO4O. 1% -0. 2%、MgS040 . 05% -0. 1 %、水40% -65%和余量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。所述的營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)優(yōu)選由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜70% -90%和大麥10% -30%。
[0022] 所述的胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括：將新鮮胡蘿卜在自來水下沖洗 干凈，晾干，切分為lcm-2cm長(zhǎng)的片狀或小塊；將1( 2即04、1%504和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分?jǐn)嚢杈鶆?，力?水，使固體培養(yǎng)基中水的質(zhì)量百分比達(dá)到40% -65%，pH值自然，得到胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng) 基。
[0023] 步驟（2)中，所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為自然環(huán)境溫度，優(yōu)選為22°C -28°C。
[0024] 步驟（3)中，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有2% -6%的胡蘿卜固體培養(yǎng)物I和 0.05%-0.4%的甘藍(lán)酶解物，％為質(zhì)量百分比。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基由 以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養(yǎng)物I 2% -6%、葡萄糖1% -2%、甘藍(lán)酶解物 0· 05% -0· 4%、Κ2ΗΡ040· 1% -0· 2%、MgS040 . 05% -0· 1%和余量的水。
[0025] 所述的甘藍(lán)酶解物優(yōu)選甘藍(lán)葉酶解物。所述的甘藍(lán)葉酶解物的制備方法，包括：將 甘藍(lán)葉加水磨成漿液，滅酶；調(diào)節(jié)漿液pH至4. 0-6. 5,加入纖維素酶在45°C -55°C進(jìn)行酶解 反應(yīng)0. 5小時(shí)-1. 5小時(shí)，滅酶后調(diào)節(jié)漿液pH至5. 5-7. 5,加入果膠酶在45°C -65°C進(jìn)行酶 解反應(yīng)0. 5小時(shí)-1. 5小時(shí)，滅酶后離心，上清液經(jīng)過濾、濃縮和干燥，得到甘藍(lán)葉酶解物。
[0026] 所述的纖維素酶與甘藍(lán)葉的質(zhì)量比優(yōu)選為1 :30-100。
[0027] 所述的果膠酶與甘藍(lán)葉的質(zhì)量比優(yōu)選為1 :25_70。
[0028] 所述的果膠酶的酶活力優(yōu)選為3. 0萬U/g-5. 0萬U/g、纖維素酶的酶活力優(yōu)選為 2. 0 萬 U/g-3. 0 萬 U/g。
[0029] 將甘藍(lán)葉加水磨成漿液的步驟中，甘藍(lán)葉與水的重量比優(yōu)選為1:8至1:15。所述 的甘藍(lán)葉可選用采摘后經(jīng)清洗、真空冷凍干燥后的甘藍(lán)葉，也可直接選用市售的干燥甘藍(lán) 葉。
[0030] 所述的滅酶的條件依據(jù)酶失活的條件，一般為：90°C -95°c下滅酶5分鐘-8分鐘。
[0031] 所述的甘藍(lán)葉酶解物的制備方法中，優(yōu)選：上清液用截留分子量為lkDa-3. 5kDa 的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，得到甘藍(lán)葉酶解物。
[0032] 所述的乳酸菌液體菌種可采用乳酸菌菌種在液體MRS培養(yǎng)基中于35°C _37°C靜置 培養(yǎng)6h-15h獲得。所述的乳酸菌菌種可采用任意一種乳酸菌菌種，可采用市售產(chǎn)品；優(yōu)選 乳酸乳球菌乳亞種，如乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactis) ACCC10535菌種，購于中國(guó) 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0033] 所述的液體MRS培養(yǎng)基為乳酸菌培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基，可采用市售產(chǎn)品，也可采用 現(xiàn)有配制方法配制。一般液體MRS培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨10. 0g、牛肉浸膏10. 0g、酵母浸 膏5. 0g、葡萄糖20. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸氫二銨2. 0g、吐溫-801. 0ml、磷酸氫二鉀2. 0g、 硫酸鎂0. 2g、硫酸錳0. 05g和蒸餾水1. 0升。
[0034] 本發(fā)明，調(diào)節(jié)pH值所用的pH值調(diào)節(jié)劑采用本領(lǐng)域常用的pH值調(diào)節(jié)劑，如lmol/L 的HCl水溶液或Imol/L的磷酸水溶液。
[0035] 本發(fā)明，所述的富含葉酸的食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過后續(xù)的分離處理后可以測(cè)定葉 酸含量。所述的分離處理為本領(lǐng)域常規(guī)的分離方法，例如離心或者過濾等分離方法。
[0036] 本發(fā)明所用的培養(yǎng)基均需滅菌后使用，滅菌的條件采用本領(lǐng)域的常規(guī)條件，例如 可在 120°C _125°C下滅菌 20min-30min。
[0037] 黃連木（Pistacia chinensis Bunge)屬于漆樹科黃連木屬落葉喬木，是一種兼具 藥用、材用、綠化及觀賞價(jià)值的優(yōu)良樹種，也是一種極具開發(fā)潛力的能源植物。黃連木中的 活性成分主要分為單寧、黃酮類、萜類、留醇類及多不飽和脂肪酸等，這些成分多具有藥用 和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。本發(fā)明優(yōu)選黃連木的樹葉。
[0038] 胡蘿卜（Daucus carota)是傘形科二年生草本植物的呈肉質(zhì)的根，另Ij名黃蘿卜、丁 香蘿卜、葫蘆菔金，又被稱為胡蘆菔、紅菜頭、黃蘿卜等。
[0039] 大麥（Hordeum vulgare L.)別名牟麥、飯麥、赤膊麥，為禾本科植物大麥的果實(shí)。
[0040] 甘藍(lán)（Brassica oleracea L.)為十字花科蕓苔屬的一年生或兩年生草本植物。
[0041] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0042] 1.通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)葉酸，生產(chǎn)過程安全，有利于保護(hù)環(huán)境，且不受季節(jié)限制， 可規(guī)?；a(chǎn)；制成的葉酸產(chǎn)品，吸收利用率高，其生物效價(jià)高，可開發(fā)成葉酸功能食品 (如口服液）等，營(yíng)養(yǎng)豐富。
[0043] 2.本發(fā)明根據(jù)胡蘿卜、甘藍(lán)傳統(tǒng)富含葉酸果蔬原料特點(diǎn)及食藥真菌桑黃、靈芝的 發(fā)酵特性，利用食藥真菌具有降解纖維素、果膠、淀粉等物質(zhì)的酶系，可將纖維素、果膠等分 解為更易被微生物利用的小分子碳源，通過采用先食藥真菌發(fā)酵，后乳酸菌發(fā)酵的兩階段 發(fā)酵，提高了最終發(fā)酵產(chǎn)物中葉酸的含量和活性。
[0044] 3.本發(fā)明以來源廣泛、價(jià)廉且富含葉酸的胡蘿卜、甘藍(lán)為主要培養(yǎng)原料，使其中的 有益成分得到較好的轉(zhuǎn)化，有利于葉酸的生成，是一種極具工業(yè)化前景的生產(chǎn)方法。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面結(jié)合部分具體實(shí)施例對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
進(jìn)行進(jìn)一步闡明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅 限于下面的實(shí)施例。
[0046] 桑黃（Phellinus linteus)ACCC51181菌種購于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中 心。
[0047] 靈芝（Ganoderma lucidium) ACCC 51515菌種購于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理 中心。
[0048] 乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactis)ACCC10535菌種購于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌 種保藏管理中心。
[0049] 實(shí)施例1
[0050] 一、材料準(zhǔn)備
[0051] 果膠酶（酶活力為5. 0萬U/g)、纖維素酶（酶活力為3. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0052] PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0053] 乳酸菌液體菌種采用乳酸乳球菌乳亞種菌種在液體MRS培養(yǎng)基中于37°C靜置培 養(yǎng)15h獲得。
[0054] 液體MRS培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨10. 0g、牛肉浸膏10. 0g、酵母浸膏5. 0g、葡萄糖 20. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸氫二銨2. 0g、吐溫-801. 0ml、磷酸氫二鉀2. 0g、硫酸鎂0· 2g、硫 酸錳0.05g和蒸餾水1.0升。
[0055] IL桑黃液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0056] IL靈芝液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖15g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0057] a.甘藍(lán)葉酶解物的制備，包括：將甘藍(lán)葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量IOOg加 800mL水，磨成漿液，95°C滅酶5min，使各種酶失活；調(diào)節(jié)漿液pH5. 5,加入Ig纖維素酶在 50°C進(jìn)行酶解反應(yīng)1. 5小時(shí)，在95°C下滅酶5分鐘；然后調(diào)節(jié)漿液pH6. 5,加入I. 5g果膠酶 于55°C進(jìn)行酶解反應(yīng)I. 5h，在95°C下滅酶5min，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留 分子量為2kDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，獲得甘藍(lán)葉酶解物。
[0058] b.黃連木提取物的制備，包括：稱取一定量的黃連木樹葉，粉碎過100目，先加占 黃連木樹葉重量13倍量的質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇水溶液在60°C浸提I. 0h，過濾后得 到上清液，上清液濃縮后真空冷凍干燥得提取物II ;上述醇提后的黃連木樹葉殘?jiān)尤胝?黃連木樹葉重量10倍量的蒸餾水在85°C下浸提lh，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4 體積后加入濃縮物體積2倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷 凍干燥后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黃連木提取物。
[0059] c.將斜面保藏的桑黃菌種、靈芝菌種分別接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培 養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，培養(yǎng)時(shí)間8天，分別得到活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種。
[0060] 二、富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法
[0061] (1)食藥真菌液體種子液制備：取2cm2大小活化后的桑黃菌種菌塊接種于IL添加 黃連木提取物的桑黃液體種子培養(yǎng)基中，每升桑黃液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加 量為8g，25°C培養(yǎng)4天，制備桑黃液體菌種。
[0062] 取2cm2大小活化后的靈芝菌種菌塊接種于IL添加黃連木提取物的靈芝液體種子 培養(yǎng)基中，每升靈芝液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加量為6g，26°C培養(yǎng)5天，制備靈 芝液體菌種。
[0063] (2)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基體 積15%的用量接入胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25°C下培養(yǎng)12天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍 干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養(yǎng)物I ;
[0064] 胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：K2HP040.15 %、 MgSO4O. 05%、水55%和余量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜 80 %和大麥20%。
[0065] 胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括：將新鮮胡蘿卜在自來水下沖洗干凈，晾 干，切分為lcm-2cm長(zhǎng)的片狀或小塊；將K2HPO4JgSO4和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分?jǐn)嚢杈鶆?，加水，使?體培養(yǎng)基中水的質(zhì)量百分比達(dá)到55%，pH值自然，得到胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0066] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積10% 的用量先接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C下培養(yǎng)3天后，用lmol/L的HCl水溶液將pH值調(diào)為 5. 5,升溫至37 °C并保持在該溫度下2h后，再接入占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積8%的乳酸菌液體 菌種培養(yǎng)24h，終止發(fā)酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物；
[0067] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養(yǎng)物I 4%、葡萄 糖1.5%、甘藍(lán)葉酶解物0.2%、K2HPO4O. HMgSO4O. 05%和余量的水。
[0068] 三、測(cè)定
[0069] 葉酸含量的測(cè)定（高效液相色譜法）：將步驟（3)獲得的食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng) 8000r/min離心IOmin得到上層澄清的發(fā)酵液，取上述IOmL澄清的發(fā)酵液加入0. 5mL緩沖 液（濃度為〇. 〇5mol/L磷酸緩沖液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %抗壞血酸鈉），50°C，攪拌提取Ih ; 8000r/min離心IOmin ;取上清液經(jīng)0. 45 μ m膜過濾，進(jìn)行高效液相色譜分析。對(duì)照葉酸純 品的高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算葉酸含量。
[0070] HPLC 色譜條件：C18 柱（4. 6mmX 250mm);流動(dòng)相：甲醇：水（Na2HPO4-NaH2PO 4 緩 沖液，pH 7. 6) = 10:90,體積比；流速：I. 5mL/min ;柱溫：25°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm ;進(jìn)樣 量：20 μ L。
[0071] 檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0072] 實(shí)施例2
[0073] 一、材料準(zhǔn)備
[0074] 果膠酶（酶活力為4. 0萬U/g)、纖維素酶（酶活力為2. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0075] PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂20g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0076] 乳酸菌液體菌種同實(shí)施例1。
[0077] IL桑黃液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖15g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0078] IL靈芝液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0079] a.甘藍(lán)葉酶解物的制備，包括：將甘藍(lán)葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量IOOg加 IOOOmL水，磨成漿液，90°C滅酶8min，使各種酶失活；調(diào)節(jié)漿液pH6. 0,加入2g纖維素酶在 55°C進(jìn)行酶解反應(yīng)1小時(shí)，在90°C下滅酶8分鐘；然后調(diào)節(jié)漿液pH7.0,加入2g果膠酶于 60°C進(jìn)行酶解反應(yīng)lh，在90°C下滅酶8min，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留分子 量為3kDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，獲得甘藍(lán)葉酶解物。
[0080] b.黃連木提取物的制備，包括：稱取一定量的黃連木樹葉，粉碎過60目，先加占黃 連木樹葉重量16倍量的質(zhì)量百分濃度為80%的乙醇水溶液在80°C浸提2h，過濾后得到上 清液，上清液濃縮后真空冷凍干燥得提取物II ;上述醇提后的黃連木樹葉殘?jiān)尤胝键S連 木樹葉重量20倍量的蒸餾水在95°C下浸提2. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4體 積后加入濃縮物體積5倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷凍 干燥后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黃連木提取物。
[0081] C.將斜面保藏的桑黃菌種、靈芝菌種分別接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培 養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時(shí)間6天，分別得到活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種。
[0082] 二、富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法
[0083] (1)食藥真菌液體種子液制備：取3cm2大小活化后的桑黃菌種菌塊接種于IL添加 黃連木提取物的桑黃液體種子培養(yǎng)基中，每升桑黃液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加 量為7g，28°C培養(yǎng)8天，制備桑黃液體菌種。
[0084] 取3cm2大小活化后的靈芝菌種菌塊接種于IL添加黃連木提取物的靈芝液體種子 培養(yǎng)基中，每升靈芝液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加量為7g，28°C培養(yǎng)8天，制備靈 芝液體菌種。
[0085] (2)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基體 積12%的用量接入胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C下培養(yǎng)10天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍 干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養(yǎng)物I ;
[0086] 胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：K2HP040.15 %、 MgSO4O. 08%、水50%和余量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜 80 %和大麥20%。
[0087] 胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括：將新鮮胡蘿卜在自來水下沖洗干凈，晾 干，切分為lcm-2cm長(zhǎng)的片狀或小塊；將K2HPO4JgSO4和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分?jǐn)嚢杈鶆颍铀?，使?體培養(yǎng)基中水的質(zhì)量百分比達(dá)到50%，pH值自然，得到胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0088] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積8% 的用量先接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C下培養(yǎng)5天后，用lmol/L的HCl水溶液將pH值調(diào)為 6. 0，升溫至36 °C并保持在該溫度下2h后，再接入占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積6 %的乳酸菌液體 菌種培養(yǎng)30h，終止發(fā)酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物；
[0089] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養(yǎng)物I 5%、葡萄 糖1. 5%、甘藍(lán)葉酶解物0· 3%、K2HPO4O. 15%、MgSO4O. 08%和余量的水。
[0090] 三、測(cè)定，同實(shí)施例1。
[0091] 檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0092] 實(shí)施例3
[0093] 一、材料準(zhǔn)備
[0094] 果膠酶（酶活力為3. 0萬U/g)、纖維素酶（酶活力為3. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0095] PDA平板培養(yǎng)基：同實(shí)施例1。
[0096] 乳酸菌液體菌種采用乳酸乳球菌乳亞種菌種在液體MRS培養(yǎng)基中于35°C靜置培 養(yǎng)IOh獲得。液體MRS培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
[0097] IL桑黃液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0098] IL靈芝液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖25g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0099] a.甘藍(lán)葉酶解物的制備，包括：將甘藍(lán)葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量IOOg加 1200mL水，磨成漿液，95°C滅酶8min，使各種酶失活；調(diào)節(jié)漿液pH5. 0,加入I. 5g纖維素酶 在45°C進(jìn)行酶解反應(yīng)0. 5小時(shí)，在90°C下滅酶8分鐘；然后調(diào)節(jié)漿液pH6. 0,加入3g果膠 酶于45°C進(jìn)行酶解反應(yīng)0. 5h，在90°C下滅酶8min，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截 留分子量為3. 5kDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，獲得甘藍(lán)葉酶解物。 [0100] b.黃連木提取物的制備，包括：稱取一定量的黃連木樹葉，粉碎過40目，先加占黃 連木樹葉重量10倍量的質(zhì)量百分濃度為60%的乙醇水溶液在70°C浸提I. 5h，過濾后得到 上清液，上清液濃縮后真空冷凍干燥得提取物II ;上述醇提后的黃連木樹葉殘?jiān)尤胝键S 連木樹葉重量15倍量的蒸餾水在90°C下浸提I. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4 體積后加入濃縮物體積4倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷 凍干燥后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黃連木提取物。
[0101] c.將斜面保藏的桑黃菌種、靈芝菌種分別接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培 養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22°C，培養(yǎng)時(shí)間10天，分別得到活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種。
[0102] 二、富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法
[0103] (1)食藥真菌液體種子液制備：取4cm2大小活化后的桑黃菌種菌塊接種于IL添加 黃連木提取物的桑黃液體種子培養(yǎng)基中，每升桑黃液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加 量為10g，22 °C培養(yǎng)10天，制備桑黃液體菌種。
[0104] 取4cm2大小活化后的靈芝菌種菌塊接種于IL添加黃連木提取物的靈芝液體種子 培養(yǎng)基中，每升靈芝液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加量為lg，30°C培養(yǎng)3天，制備靈 芝液體菌種。
[0105] (2)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基體 積18%的用量接入胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在22°C下培養(yǎng)7天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍 干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養(yǎng)物I ;
[0106] 胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成=K2HPO4O. 2%、MgSO4O. 1%、 水40%和余量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜90%和大麥 10%。
[0107] 胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括：將新鮮胡蘿卜在自來水下沖洗干凈，晾 干，切分為lcm-2cm長(zhǎng)的片狀或小塊；將K 2HPO4JgSO4和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分?jǐn)嚢杈鶆?，加水，使?體培養(yǎng)基中水的質(zhì)量百分比達(dá)到40%，pH值自然，得到胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0108] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積12% 的用量先接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，22°C下培養(yǎng)6天后，用lmol/L的HCl水溶液將pH值調(diào)為 5. 0,升溫至35°C并保持在該溫度下2. 5h后，再接入占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的乳酸菌 液體菌種培養(yǎng)40h，終止發(fā)酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物；
[0109] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養(yǎng)物I 6%、葡萄 糖1 %、甘藍(lán)葉酶解物0.4%、K2HPO4O. 2%、MgSO4O. 1 %和余量的水。
[0110] 三、測(cè)定，同實(shí)施例1。
[0111] 檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0112] 實(shí)施例4
[0113] 一、材料準(zhǔn)備
[0114] 果膠酶、纖維素酶和PDA平板培養(yǎng)基，均同實(shí)施例1。
[0115] 乳酸菌液體菌種采用乳酸乳球菌乳亞種菌種在液體MRS培養(yǎng)基中于36°C靜置培 養(yǎng)6h獲得。液體MRS培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
[0116] IL桑黃液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/ UMgSO4O. 5g/L和余量的水，pH自然。
[0117] IL靈芝液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖8g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、KH2P04lg/ UMgSO4O. 5g/L和余量的水，pH自然。
[0118] a.甘藍(lán)葉酶解物的制備，包括：將甘藍(lán)葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量IOOg加 1500mL水，磨成漿液，95°C滅酶8min，使各種酶失活；調(diào)節(jié)漿液pH6. 5,加入2. 5g纖維素酶 在50°C進(jìn)行酶解反應(yīng)1小時(shí)，在90°C下滅酶8分鐘；然后調(diào)節(jié)漿液pH7. 5,加入4g果膠酶 于65°C進(jìn)行酶解反應(yīng)lh，在90°C下滅酶8min，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留分 子量為IkDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，獲得甘藍(lán)葉酶解物。
[0119] b.黃連木提取物同實(shí)施例1。
[0120] c.將斜面保藏的桑黃菌種、靈芝菌種分別接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培 養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間3天，分別得到活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種。
[0121] 二、富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法
[0122] (1)食藥真菌液體種子液制備：取Icm2大小活化后的桑黃菌種菌塊接種于IL添加 黃連木提取物的桑黃液體種子培養(yǎng)基中，每升桑黃液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加 量為lg，30°C培養(yǎng)3天，制備桑黃液體菌種。
[0123] 取Icm2大小活化后的靈芝菌種菌塊接種于IL添加黃連木提取物的靈芝液體種子 培養(yǎng)基中，每升靈芝液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加量為l〇g，22°C培養(yǎng)10天，制備 靈芝液體菌種。
[0124] (2)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基體 積20%的用量接入胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍 干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養(yǎng)物I ;
[0125] 胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成=K2HPO4O. 1%、MgSO4O. 1%、 水65%和余量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜70%和大麥 30%。
[0126] 胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括：將新鮮胡蘿卜在自來水下沖洗干凈，晾 干，切分為lcm-2cm長(zhǎng)的片狀或小塊；將K 2HPO4JgSO4和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分?jǐn)嚢杈鶆?，加水，使?體培養(yǎng)基中水的質(zhì)量百分比達(dá)到65%，pH值自然，得到胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0127] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟⑴中的靈芝液體菌種按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積15% 的用量先接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C下培養(yǎng)1天后，用lmol/L的HCl水溶液將pH值調(diào)為 6. 8,升溫至37°C并保持在該溫度下2. 5h后，再接入占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積12%的乳酸菌 液體菌種培養(yǎng)48h，終止發(fā)酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物；
[0128] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養(yǎng)物I 2%、葡萄 糖2%、甘藍(lán)葉酶解物0. HK2HPO4O. 2%、MgSO4O. 1%和余量的水。
[0129] 三、測(cè)定，同實(shí)施例1。
[0130] 檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0131] 實(shí)施例5
[0132] 一、材料準(zhǔn)備
[0133] 果膠酶、纖維素酶、PDA平板培養(yǎng)基、乳酸菌液體菌種、桑黃液體種子培養(yǎng)基和靈芝 液體種子培養(yǎng)基，均同實(shí)施例4。
[0134] a.甘藍(lán)葉酶解物的制備，包括：將甘藍(lán)葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量IOOg加 1500mL水，磨成漿液，95°C滅酶8min，使各種酶失活；調(diào)節(jié)漿液pH4. 0,加入3. 3g纖維素酶 在50°C進(jìn)行酶解反應(yīng)1小時(shí)，在90°C下滅酶8分鐘；然后調(diào)節(jié)漿液pH5. 5,加入4g果膠酶 于50°C進(jìn)行酶解反應(yīng)lh，在90°C下滅酶8min，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留分 子量為2kDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，獲得甘藍(lán)葉酶解物。
[0135] b.黃連木提取物同實(shí)施例1。
[0136] c.活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種，同實(shí)施例4。
[0137] 二、富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法
[0138] (1)食藥真菌液體種子液制備：取2cm2大小活化后的桑黃菌種菌塊接種于IL添加 黃連木提取物的桑黃液體種子培養(yǎng)基中，每升桑黃液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加 量為2g，20°C培養(yǎng)9天，制備桑黃液體菌種。
[0139] 取3cm2大小活化后的靈芝菌種菌塊接種于IL添加黃連木提取物的靈芝液體種子 培養(yǎng)基中，每升靈芝液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加量為9g，20°C培養(yǎng)6天，制備靈 芝液體菌種。
[0140] (2)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基體 積8%的用量接入胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在22°C下培養(yǎng)15天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍 干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養(yǎng)物I ;
[0141] 胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基，同實(shí)施例4。
[0142] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積4% 的用量先接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C下培養(yǎng)2天后，用lmol/L的磷酸水溶液將pH值調(diào)為 4. 0，升溫至37 °C并保持在該溫度下2h后，再接入占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積2 %的乳酸菌液體 菌種培養(yǎng)6h，終止發(fā)酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物；
[0143] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養(yǎng)物I 2%、葡萄 糖2 %、甘藍(lán)葉酶解物0· 05 %、K2HPO4O. 2 %、MgSO4O. 1 %和余量的水。
[0144] 三、測(cè)定，同實(shí)施例1。
[0145] 檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0146] 對(duì)照例
[0147] 乳酸菌液體菌種同實(shí)施例1。
[0148] (1)搖瓶種子培養(yǎng)
[0149] IL液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖15g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、KH2P04lg/L、 MgS04(X5g/L和余量為水。pH自然，在121°C下滅菌20min。
[0150] 將實(shí)施例1中活化后的靈芝菌種取2cm2大小的菌塊接入滅菌后IL液體種子培養(yǎng) 基中，26°C，120r/min下?lián)u床培養(yǎng)5天，得到培養(yǎng)好的靈芝液體菌種。
[0151] (2)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積 1〇%的接種量接入靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在251：，12〇1'/1^11搖床中培養(yǎng)3天后，用1111 〇1/ L的HCl水溶液將pH值調(diào)為5. 5,升溫至37°C并保持在該溫度下2h后，接入占靈芝液體發(fā) 酵培養(yǎng)基體積8%的乳酸菌液體菌種培養(yǎng)24h，終止發(fā)酵后，得到食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物；
[0152] IL靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、 KH2P04lg/L、MgS040. 5g/L 和余量的水，pH 自然，在 121°C下滅菌 20min。
[0153] 檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0154] 表1發(fā)酵液中葉酸含量檢測(cè)結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種富含葉酸食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，包括步驟： (1) 食藥真菌液體種子液制備：取活化后的桑黃菌種接種于添加黃連木提取物的桑黃 液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-10天，得到桑黃液體菌種；取活化后的靈芝菌種接種于添加黃 連木提取物的靈芝液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-10天，得到靈芝液體菌種； (2) 固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基體積 8% -20%的用量接入胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在22°C _30°C下培養(yǎng)3天-15天后，將培養(yǎng) 產(chǎn)物真空冷凍干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養(yǎng)物I ;所述的胡蘿卜固體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有 胡蘿卜和大麥； (3) 液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積4% -15% 的用量先接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在22°C -28°C下培養(yǎng)1天-6天后，調(diào)pH值為4. 0-6. 8,升 溫至35 °C -37 °C并保持在該溫度下2h-2. 5h后，再接入占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積2% -12 %的 乳酸菌液體菌種培養(yǎng)6h-48h，終止發(fā)酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發(fā)酵產(chǎn)物；所述的液 體發(fā)酵培養(yǎng)基含有胡蘿卜固體培養(yǎng)物I和甘藍(lán)酶解物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟⑴中，每升桑黃液體種子培養(yǎng) 基中黃連木提取物的添加量為lg-l〇g ;每升靈芝液體種子培養(yǎng)基中黃連木提取物的添加 量為 lg-l〇g。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的黃連木提取物為以黃連木樹 葉為原料制備的黃連木提取物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的黃連木提取物由黃連木樹葉 醇提取物和黃連木樹葉水提取物組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的制備方法，其特征在于，所述的黃連木提取物的制備方 法，包括：稱取一定量的黃連木樹葉，粉碎，先加占黃連木樹葉重量10倍量-16倍量的質(zhì)量 百分濃度為60% -80%的乙醇水溶液在60°C -80°C浸提lh-2h，過濾后得到上清液，上清 液濃縮后真空冷凍干燥得提取物II ;上述醇提后的黃連木樹葉殘?jiān)尤胝键S連木樹葉重量 10倍量-20倍量的水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4 體積后加入濃縮物體積2倍量-5倍量的無水乙醇，離心收集沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥 后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黃連木提取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中，所述的胡蘿卜固體 發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：K2HP0 40. 1 % -0. 2%、MgS040. 05% -0. 1%、水 40% -65%和余量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；所述的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜 70% -90 %和大麥 10% -30%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基 中含有2% -6%的胡蘿卜固體培養(yǎng)物I和0. 05% -0. 4%的甘藍(lán)酶解物，％為質(zhì)量百分比。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基 由以下質(zhì)量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養(yǎng)物I 2% -6%、葡萄糖1% -2%、甘藍(lán)酶解 物 0· 05% -0· 4%、Κ2ΗΡ040· 1% -0· 2%、MgS040. 05% -0· 1%和余量的水。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的制備方法，其特征在于，所述的甘藍(lán)酶解物為甘藍(lán)葉酶解 物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的制備方法，其特征在于，所述的甘藍(lán)酶解物的制備方法， 包括：將甘藍(lán)葉加水磨成漿液，滅酶；調(diào)節(jié)漿液pH至4. 0-6. 5,加入纖維素酶在45°C -55°C 進(jìn)行酶解反應(yīng)〇. 5小時(shí)-1. 5小時(shí)，滅酶后調(diào)節(jié)漿液pH至5. 5-7. 5,加入果膠酶在45°C_65°C 進(jìn)行酶解反應(yīng)〇. 5小時(shí)-1. 5小時(shí)，滅酶后離心，上清液經(jīng)過濾、濃縮和干燥，得到甘藍(lán)葉酶 解物。
【文檔編號(hào)】A61K36/074GK104256575SQ201410562582
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】程俊文, 賀亮, 胡傳久, 魏海龍, 付立忠, 李海波 申請(qǐng)人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院