miR-1914*和miR-1915的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及miR-1914*和/或miR-1915作為大腸癌化療藥物的耐藥性標(biāo)示物的應(yīng)用，以及其在制備具有抑制大腸癌轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡、增值功能的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中的miR-1914*和miR-1915是存在于血漿中，可以檢測，并且它們在大腸癌耐藥患者血漿中成下調(diào)趨勢，其具有相對的組織特異性，既與大腸癌一線化療耐藥有關(guān)，同時(shí)還影響患者預(yù)后。miR-1914*和miR-1915單獨(dú)使用或聯(lián)合使用在大腸癌一線化療耐藥中起較為重要的作用，尤其是聯(lián)合使用效果更好。
【專利說明】miR-1914* 和 miR-1915 的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)計(jì)涉及一種microRNA的用途，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌（colorectal cancer, CRC)為結(jié)腸癌和直腸癌的總稱，大腸癌是指大腸粘 膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性病變，預(yù)后不良，死亡率較高。全世 界范圍內(nèi)大腸癌的發(fā)病率男性處于惡性腫瘤的第三位。據(jù)國際癌癥研究組織（IARc)提供 的數(shù)據(jù)顯示，亞洲地區(qū)，東亞死亡率為120. 1/100, 000。我國隨著生活水平提高，飲食習(xí)慣改 變，總體發(fā)病率也呈現(xiàn)上升趨勢。上海地區(qū)近年來大腸癌發(fā)生率每年上升4. 2%，由原來占惡 性腫瘤的第7位上升至第3位。研究表明，腫瘤的發(fā)展程度是影響生存期的重要因素，隨著 腫瘤分期的不斷進(jìn)展，患者的5年生存率大幅的下降。然而，在我國僅有10%的患者初診時(shí) 處于Tl期，大部分患者就診時(shí)已經(jīng)處于進(jìn)展期，故其5年生存率徘徊在20%-50%之間。目 前在我國臨床大腸癌患者T3、T4晚期期患者較多，預(yù)后更差，因此尤其需要引起我國臨床 腫瘤醫(yī)生的注意。
[0003] 大腸癌治療主要為以手術(shù)+化療為主的綜合性治療。而手術(shù)患者中約50%的患者 在術(shù)后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。術(shù)前新輔助化療可降低大腸癌分期、改善術(shù)式選擇、提高近 期療效；術(shù)后化療可抑制大腸癌復(fù)發(fā)、治療腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌輔助化療始于20世紀(jì)50年 代，經(jīng)歷探索、爭論近30年，直至1988年Buyse等發(fā)表了第一個(gè)結(jié)直腸癌輔助化療有效的 薈萃（meta)分析報(bào)告，大家對結(jié)直腸癌輔助化療的有效性才達(dá)成共識(shí)。10多年來，眾多學(xué) 者致力于結(jié)直腸癌輔助化療的新藥開發(fā)和新方案設(shè)計(jì)，其中較為常用的一線化療為XELOX ，F(xiàn)0LF0X方案?？赏档头制?，創(chuàng)造手術(shù)機(jī)會(huì)，提高術(shù)后生存率?；煰熜Q于腫瘤對化 療藥物的敏感程度，這由腫瘤自身的生物學(xué)特性決定。究其原因可能是由于腫瘤的多藥耐 藥。隨著近年來對結(jié)直腸癌多藥耐藥研究，給我們展示了結(jié)直腸癌治療的新突破點(diǎn)，對于結(jié) 直腸癌多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的開發(fā)應(yīng)用，將使結(jié)直腸癌的治療出現(xiàn)質(zhì)的飛躍。
[0004] 腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的分子網(wǎng)絡(luò)異常有密切的關(guān)系，細(xì)胞從癌變到腫瘤的快速 生長、侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素作用、多基因參與，經(jīng)過多階段變化累積起來的、極其復(fù)雜 的病變過程。通過研究基因的改變以尋找腫瘤的發(fā)病原因和診斷及其預(yù)后方法是研究腫瘤 的重要途徑，而最近幾年，作為非編碼的microRNA對癌癥的研究已成為焦點(diǎn)。
[0005] microRNAs在1993年首次被發(fā)現(xiàn)，長度18 - 25nt，具有較好的穩(wěn)定性和易于檢 測的特點(diǎn)。microRNA在發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種細(xì)胞徑中都起了重要的調(diào)節(jié)作 用。據(jù)推測microRNA可能調(diào)控至少30%的基因的表達(dá)況。microRNA在進(jìn)化上高度保守，它 們廣泛存在于植物、線蟲以及人類的細(xì)胞中它們能有效地抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致靶 mRNA的降解，或者以其他形式調(diào)節(jié)機(jī)制來抑制靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生基因沉默。microRNA主 要通過和靶基因 mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯。microRNA 組織特異性和時(shí)序性，決定組織和細(xì)胞的功能特異性。最近的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA表達(dá) 與多癌癥相關(guān)，大約50%得到注解的microRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性點(diǎn) (fragile site)，這說明microRNAs在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用，這些microRNAs 所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能。目前在許多腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了比較特異性的 microRNAs。正因?yàn)檫@些microRNA和臨床結(jié)果、癌癥預(yù)后密切相關(guān)，它們有望成為腫瘤診 斷、靶向治療及預(yù)后預(yù)測的新的生物標(biāo)記物。
[0006] 目前microRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的生物學(xué)作用的研究已取得長足進(jìn)步， 但是還有許多問題有待于進(jìn)一步解決，許多研究目前尚處于初步階段。當(dāng)前microRNAs已 成為腫瘤研究中的又一個(gè)熱點(diǎn)吸引了眾多學(xué)者的關(guān)注。既往對microRNAs的研究主要集 中于它們在細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)。2008年，Mitchell等通過分離健康人血漿中的18?24個(gè) 核苷酸的RNA，并發(fā)現(xiàn)microRNAs能以一種非常穩(wěn)定的形式存在于人體血楽中，以保護(hù)其 免受內(nèi)源性RNase的降解。當(dāng)前種種研究表明microRNA，瘤細(xì)胞基因表達(dá)模式與正常組織 有明顯的不同，可以通過檢測腫瘤病人循環(huán)RNA中的腫瘤特異的mRNA來進(jìn)行腫瘤的診 斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種大腸癌化療藥物的耐藥性標(biāo)示物。
[0008] 本發(fā)明為解決第一個(gè)技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是:miR-1914*和/或 miR-1915作為大腸癌化療藥物的耐藥性標(biāo)示物的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種具有抑制大腸癌轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡、增 值功能的藥物。
[0010] 本發(fā)明為解決第二個(gè)技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是:miR-1914*和/或 miR-1915、含有miR-1914*的編碼基因和/或miR-1915的編碼基因的重組載體、含有 miR-1914*的編碼基因和/或miR-1915的編碼基因的重組病毒或含有miR-1914*的編碼基 因和/或miR-1915的編碼基因的重組病毒載體在制備具有抑制大腸癌轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡、增 值功能的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種新的大腸癌耐藥蛋白。
[0012] 本發(fā)明為解決第二個(gè)技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：NFIX作為大腸癌耐藥蛋 白的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明具有積極的效果： (1)本發(fā)明使用基因芯片技術(shù)篩選出miR-1914*和miR-1915兩個(gè)microRNA。經(jīng)過多 組大量的驗(yàn)證，表明miR-1914*和miR-1915是存在于血漿中，可以檢測，并且它們在大腸癌 耐藥患者血漿中成下調(diào)趨勢，從而可以作為大腸癌化療藥物的耐藥性標(biāo)示物，可以制成試 劑盒，用于區(qū)分耐藥大腸癌與化療敏感大腸癌。
[0014] (2)本發(fā)明證實(shí)了 miR-1914*和miR-1915能夠影響耐藥大腸癌細(xì)胞的耐藥性， 使其對化療藥物敏感。且miR-1914*和miR-1915共同作用于耐藥大腸癌細(xì)胞要強(qiáng)于單個(gè) microRNA對耐藥大腸癌細(xì)胞的影響。
[0015] (3)本發(fā)明證實(shí)了 miR-1914*和miR-1915在體內(nèi)也能影響耐藥大腸癌的耐藥性， 且對大腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，侵襲，凋亡，增值產(chǎn)生影響。從而miR-1914*和/或miR-1915,或者 含有miR-1914*的編碼基因和/或miR-1915的編碼基因的重組載體、重組病毒、重組病毒 載體可以制備具有抑制大腸癌轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡、增值功能的藥物。
[0016] (4)本發(fā)明證實(shí)了 miR-1914*和miR-1915具有相對的組織特異性，既與大腸癌一 線化療耐藥有關(guān)，同時(shí)還影響患者預(yù)后。miR-1914*和miR-1915單獨(dú)使用或聯(lián)合使用在大 腸癌一線化療耐藥中起較為重要的作用，尤其是聯(lián)合使用效果更好。
[0017] (5)本發(fā)明證實(shí)了 miR-1914*和miR-1915的共同靶基因?yàn)镹FIX，miR-1914*和 miR-1915主要通過NFIX影響耐藥大腸癌中的耐藥蛋白，NFIX是新的大腸癌耐藥蛋白。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是實(shí)施例1中的某個(gè)樣本取RNA水溶液行1%的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖2是實(shí)施例1中血漿miR-1914*在四期大腸癌一線化療有效組、四期大腸癌一線化 療耐藥組中表達(dá)的散點(diǎn)圖； 圖3是實(shí)施例1中血漿miR-1915在四期大腸癌一線化療有效組、四期大腸癌一線化療 耐藥組中表達(dá)的散點(diǎn)圖； 圖4是實(shí)施例2中對質(zhì)粒表達(dá)載體（pcDNA-copGFP vector)進(jìn)行酶切線性化處理的原 理示意圖； 圖5是實(shí)施例2中對質(zhì)粒表達(dá)載體（pGL3_promoter vector, E1761, Promega)進(jìn)行 酶切線性化處理的原理示意圖； 圖6是實(shí)施例2中轉(zhuǎn)染miR-1914*和miR-1915后對耐藥細(xì)胞凋亡的各組比較圖表； 圖7是實(shí)施例2中NFIX、Pgp、BCL-2、MDRl、Beta actin在五組細(xì)胞組中的表達(dá)水平電 泳圖； 圖8是實(shí)施例2中NFIX、Pgp、BCL-2、MDRl、Beta actin在九組細(xì)胞組中的表達(dá)水平電 泳圖； 圖9是實(shí)施例3中各組瘤體的照片； 圖10是實(shí)施例3中各組裸鼠成瘤，注射藥物后腫瘤比較抑制率分析圖表； 圖11是實(shí)施例3中裸鼠瘤體內(nèi)的NFIX、CyclinDl、VEGFC，P53、Survivin蛋白的改變 影響電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用 于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可 以根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特意 表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆 實(shí)驗(yàn)指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的 所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似 或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。統(tǒng)計(jì)結(jié)果中的表示P < 〇. 05, "**"表示 p < 0. 01。一個(gè)RNA前體的雙臂分別加工產(chǎn)生miRNA，則根據(jù)克隆實(shí)驗(yàn)，在表達(dá)水平較低的 miRNA命名時(shí)在末尾加"
[0020] 實(shí)施例1 (人結(jié)直腸癌化療耐藥與敏感血漿microRNA的差異表達(dá)） 一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。
[0021] I、研究對象。
[0022] 選取復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科進(jìn)行原發(fā)病灶切除術(shù)IV期大腸癌患者，患者 術(shù)前未進(jìn)行放化療，術(shù)后進(jìn)行了規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的一線XELOX方案化療。結(jié)直腸癌組織參照全國 結(jié)直腸癌協(xié)作組結(jié)直腸癌診治規(guī)范以及AJCC/nCC的--!分期標(biāo)準(zhǔn)行診斷、分級(jí)和分 期。研究對象共100例，共分為2組：四期大腸癌耐藥組（n=57)、四期大腸癌有效組（n=43)， 具體情況如表1所示。
[0023] 表1大腸癌患者臨床資料

【權(quán)利要求】
1. miR-1914*作為大腸癌化療藥物的耐藥性標(biāo)示物的應(yīng)用。 2. miR-1915作為大腸癌化療藥物的耐藥性標(biāo)示物的應(yīng)用。 3. miR-1914*和miR-1915聯(lián)合使用作為大腸癌化療藥物的耐藥性標(biāo)示物的應(yīng)用。 4. miR-1914*、含有miR-1914*的編碼基因的重組載體、含有miR-1914*的編碼基因 的重組病毒或含有miR-1914*的編碼基因的重組病毒載體在制備具有抑制大腸癌轉(zhuǎn)移、侵 襲、凋亡、增值功能的藥物中的應(yīng)用。 5. miR-1915、含有miR-1915的編碼基因的重組載體、含有miR-1915的編碼基因的重 組病毒或含有miR-1915的編碼基因的重組病毒載體在制備具有抑制大腸癌轉(zhuǎn)移、侵襲、凋 亡、增值功能的藥物中的應(yīng)用。 6. miR-1914*和miR-1915、含有miR-1914*的編碼基因和miR-1915的編碼基因的重 組載體、含有miR-1914*的編碼基因和miR-1915的編碼基因的重組病毒或含有miR-1914* 的編碼基因和miR-1915的編碼基因的重組病毒載體在制備具有抑制大腸癌轉(zhuǎn)移、侵襲、凋 亡、增值功能的藥物中的應(yīng)用。 7. NFIX作為大腸癌耐藥蛋白的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104388541SQ201410562511
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】胡勁松, 蔡三軍 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院