抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了三對(duì)可抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA，經(jīng)QRT-PCR、Westernblotting及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，證明其可以有效抑制CYP4A11基因表達(dá)，CYP4A11-siRNA2的抑制效果更是高達(dá)99.73%，為進(jìn)一步研究CYP4A11基因的功能提供了可靠的技術(shù)方案。本發(fā)明提供的抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA可用于制備降低內(nèi)源性20-HETE分泌的藥物，也可用于制備治療心血管疾病尤其是高血壓的藥物，為心血管疾病的治療做出貢獻(xiàn)。
【專利說(shuō)明】抑制0丫「4八11基因表達(dá)的5丨[^^及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] RNA干擾（RNA interference, RNAi)是在生物進(jìn)化過(guò)程中一種保守的抵御外來(lái) 基因(包括轉(zhuǎn)基因或外來(lái)病毒）侵犯的機(jī)制，是一種基因序列特異性很高的轉(zhuǎn)錄后基因沉默 (post-transcriptional gene silencing, PTGS)。其已在多個(gè)種屬的生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，可在 生物體細(xì)胞之間進(jìn)行傳遞，維持自身基因組穩(wěn)定。RNAi技術(shù)發(fā)展為加快高通量篩選診斷或 藥物靶基因研究，促進(jìn)基因診斷與新型藥物的開發(fā)，為早期診斷、癌癥及遺傳性疾病治療等 提供了新思路。
[0003] 近幾年，RNAi作為一種新基因療法被廣泛應(yīng)用于病毒感染、癌癥、顯性遺傳病等醫(yī) 學(xué)研究中，小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)甚至被稱為"治病藥物"。目前，人 們已經(jīng)開始利用RNAi技術(shù)使我們可以更好地研究生物體內(nèi)基因調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，而且利 用RNAi技術(shù)成功治愈哺乳動(dòng)物細(xì)胞、器官及活體的病變，在不久的將來(lái)，RNAi將成功用于 人類疾病的治療。
[0004] 在過(guò)去的十年中，包括中國(guó)和印度在內(nèi)的人口眾多的發(fā)展中國(guó)家中，高血壓、動(dòng) 脈粥樣硬化性心血管病等疾病的患病率越來(lái)越高，隨之而來(lái)的是冠狀動(dòng)脈事件和腦血管 事件的發(fā)生率增加。預(yù)計(jì)到2020年，心血管疾病將是絕大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家疾病發(fā)病和死 亡的主要原因。最近有報(bào)道稱體內(nèi)花生四烯酸（Arachidonic acid，AA)的代謝物20-羥 二十燒四烯酸（20-HETE)可激活內(nèi)皮細(xì)胞煙酰胺腺噪呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶系統(tǒng)和核因子-KB (Nuclearfactor-xB，NF-xB) 通路發(fā)揮氧化應(yīng)激和促炎作用；且20-HETE可介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的解離、降低NO的生物利用度及誘導(dǎo)血管 緊張素轉(zhuǎn)換酶，調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮；20-HETE還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生而促進(jìn)血管新 生。據(jù)多項(xiàng)研究報(bào)道，CYP4A11是將AA代謝為20-HETE的一種重要的CYP羥化酶，其分布 在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，該酶廣泛分布于人體各器官組織，包括肝、腎、腸道、肺、腦及皮膚等，其 中以肝中最為豐富，還有流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人的該酶基因多態(tài)性與多種心血管病存在顯著 相關(guān)性等。如果能應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性地阻抑CYP羥化酶相關(guān)基因的表達(dá)及其蛋白質(zhì) 水平，有效沉默CYP羥化酶相關(guān)基因，將可以減少心血管相關(guān)部位氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，調(diào) 節(jié)血管收縮或舒張功能。因此，對(duì)CYP羥化酶基因的RNA干擾的研究與應(yīng)用具有極其重要 的理論和實(shí)際意義，能有效地篩選藥物靶基因，促進(jìn)基因治療、新藥開發(fā)等，為治療心血管 相關(guān)疾病開辟新的途徑。
[0005] 尋找最適宜的siRNA序列，對(duì)于RNA干擾的應(yīng)用至關(guān)重要，作用于CYP4A11基因， 即靶基因不同位點(diǎn)的siRNA的作用效果差異很大，可能與siRNA的堿基分布、兩端自由能大 小等有關(guān)。目前為止，尚無(wú)適宜的抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供可商效抑制CYP4A11基因表達(dá)的 siRNA序列。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 抑制 CYP4A11 基因表達(dá)的 siRNA，為 CYP4All-siRNAl、CYP4All-siRNA2 和 CYP4All-siRNA3中的至少一種，其序列為： CYP4All-siRNAl :正義鏈 5'- GAUAUCCUCCUCUUGGCCA -3'（SEQ ID NO. 1)，反義鏈5'_ UGGCCAAGAGGAGGAUAUC -3，（SEQ ID N0.2); CYP4All-siRNA2:正義鏈 5'- GGUGUUUGACCCUUUCCGU -3'（SEQ ID N0.3)，反義鏈5'_ ACGGAAAGGGUCAAACACC -3' （SEQ ID N0.4); CYP4All-siRNA3:正義鏈 5'- CUUGCAUGUCUGACAUAAU -3'（SEQ ID N0.5)，反義鏈5'_ AUUAUGUCAGACAUGCAAG _3' （SEQ ID N0.6)。
[0009] 優(yōu)選的，抑制 CYP4A11 基因表達(dá)的 siRNA 為 CYP4All-siRNA2。
[0010] 優(yōu)選的，所述siRNA序列的3'端垂懸有dTdT。
[0011] 上述抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA在制備治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用。
[0012] 優(yōu)選的，所述心血管疾病藥物為降血壓藥物。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明提供了三對(duì)可抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA (CYP4All-siRNAl、 CYP4All-siRNA2 和 CYP4All-siRNA3)，經(jīng) QRT-PCR、Western blotting 及免疫組織化學(xué)法 檢測(cè)，證明其可以有效抑制CYP4A11基因表達(dá)，尤其是在MG63細(xì)胞株中，CYP4All-siRNA2的 抑制效果更是高達(dá)99. 73%，為進(jìn)一步研究CYP4A11基因的功能提供了可靠的技術(shù)方案。
[0014] 本發(fā)明提供的抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA可用于制備降低內(nèi)源性20-HETE分 泌的藥物，也可用于制備治療心血管疾病尤其是高血壓的藥物，為心血管疾病的治療做出 貝獻(xiàn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NCsiRNA-FAM顯微照片（X 100)-視野1-明視野； 圖2為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NCsiRNA-FAM熒光顯微照片（X 100)-視野1-熒光照片； 圖3為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NCsiRNA-FAM熒光顯微照片（X 100)-視野1-明視野與熒 光重疊； 圖4為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NCsiRNA-FAM顯微照片（X 100)-視野2-明視野； 圖5為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NCsiRNA-FAM熒光顯微照片（X 100)-視野2-熒光照片； 圖6為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NCsiRNA-FAM熒光照片（X 100)-視野2-明視野與熒光重 疊； 圖7為EA. hy 926細(xì)胞中CYP4A11在不同轉(zhuǎn)染濃度下轉(zhuǎn)染后的RNA電泳圖； 圖8為EA. hy 926細(xì)胞中三對(duì)siRNA與NC siRNA抑制CYP4A11基因表達(dá)擴(kuò)增曲線； 圖9為EA. hy 926細(xì)胞中三對(duì)siRNA與NC siRNA抑制CYP4A11基因熔解曲線； 圖10為EA. hy 926細(xì)胞中18srRNA的基因表達(dá)擴(kuò)增曲線； 圖11為EA. hy 926細(xì)胞中18srRNA的基因熔解曲線； 圖12為12種樣品中CYP4A11的基因表達(dá)水平； 圖13為143B、MG63細(xì)胞抽提RNA的電泳圖； 圖14為143B、MG63細(xì)胞的CYP4A11基因表達(dá)擴(kuò)增曲線； 圖15為143B、MG63細(xì)胞的CYP4A11基因熔解曲線； 圖16為143B、MG63細(xì)胞的18srRNA的基因表達(dá)擴(kuò)增曲線； 圖17為143B、MG63細(xì)胞的18srRNA的基因熔解曲線； 圖18為143B、MG63細(xì)胞的QPCR數(shù)據(jù)的基因表達(dá)水平； 圖19為MG63細(xì)胞的RNA電泳圖； 圖20為MG63細(xì)胞的CYP4A11基因表達(dá)擴(kuò)增曲線； 圖21為MG63細(xì)胞的CYP4A11基因熔解曲線； 圖22為MG63細(xì)胞的18srRNA的基因表達(dá)擴(kuò)增曲線； 圖23為MG63細(xì)胞的18srRNA的基因熔解曲線； 圖24為MG63細(xì)胞三對(duì)siRNA以不同濃度沉默時(shí)QPCR的表達(dá)水平； 圖 25 為 MG63 細(xì)胞的 Anti-CYP4A11 western blotting 檢測(cè)電泳圖； 圖26為MG63細(xì)胞Anti_CYP4All western blotting檢測(cè)灰度分析柱形圖； 圖 27 為 CYP4A11 siRNA2 轉(zhuǎn)染對(duì) EA. hy 926 細(xì)胞株的 CYP 4八11、6勵(lì)541'11?與41'11?蛋 白表達(dá)的影響結(jié)果； 圖28為CYP4A11 siRNA2抑制CYP4A11蛋白以及影響eNOS、ETlR與ATlR蛋白表達(dá)量 灰度值分析結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA的合成 設(shè)計(jì)、合成抑制CYP4A11基因表達(dá)的三對(duì)siRNA序列，其序列如下： CYP4All-siRNAl (簡(jiǎn)稱 sil):正義鏈 5' - GAUAUCCUCCUCUUGGCCA-3'（SEQ ID NO. 1); 反義鏈 5' - UGGCCAAGAGGAGGAUAUC-3'（SEQ ID N0.2)。
[0017] CYP4All-siRNA2 (簡(jiǎn)稱 si2):正義鏈 5'- GGUGUUUGACCCUUUCCGU-3'（SEQ ID NO. 3)； 反義鏈 5' - ACGGAAAGGGUCAAACACC -3'（SEQ ID N0.4)。
[0018] CYP4All-siRNA3 (簡(jiǎn)稱 si3):正義鏈 5' - CUUGCAUGUCUGACAUAAU-3，（SEQ ID NO. 5)； 反義鏈 5' - AUUAUGUCAGACAUGCAAG -3'（SEQ ID N0.6)。
[0019] siRNAl、siRNA2、siRNA3 序列的 3' 端垂懸有 dTdT。
[0020] 陰性對(duì)照（NC s iRNA )購(gòu)自Si gma公司。
[0021] 實(shí)施例2 CYP4A11 siRNA在EA. hy926細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果 使用Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所有操作均按Invitrogen公司提供的操 作規(guī)程。具體步驟為：將實(shí)施例1的三對(duì)siRNA及陰性對(duì)照粉末分別溶于RNAase-free無(wú) 菌水中，配成終濃度為20 μ mol/L的濃縮液，使用時(shí)稀釋為2 μ mol/L的應(yīng)用液。轉(zhuǎn)染前一天 對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行傳代，使其匯合度為30%-50%，轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen， Cat. No. 11668019)或 Lipofectamine ? RNAiMAX (Invitrogen，Cat. No. 13778075)轉(zhuǎn)染試 齊[J，NC siRNA 工作濃度為 50nM，轉(zhuǎn)染時(shí)使用 Opti-MEM (invitrogen，Cat. No. 31985070)培 養(yǎng)基。孵育4小時(shí)后換為細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染帶FAM標(biāo)記的NC siRNA后6小時(shí)，在熒光 顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并拍照，見圖1?6。
[0022] 圖1、圖2、圖3、圖4、圖5與圖6中顯示了 EA. hy 926 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的不同視野下 光鏡及熒光照片，F(xiàn)AM熒光標(biāo)記后轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效 率的計(jì)算公式為：轉(zhuǎn)染效率=FAM突光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量/相同視野下的細(xì)胞數(shù)量X 100%。 其中，圖1為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC siRNA-FAM的顯微照片（X 100)-視野1-明視野；圖 2為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC siRNA-FAM的熒光顯微照片（X 100)-視野1-熒光照片；圖3 為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC siRNA-FAM的熒光顯微照片（X 100)-視野1-明視野與熒光重 疊；圖4為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC siRNA-FAM的顯微照片（X 100)-視野2-明視野；圖5 為EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC siRNA-FAM的熒光顯微照片（XlOO)-視野2-熒光照片；圖6為 EA. hy 926細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC siRNA-FAM的熒光照片（X 100)-視野2-明視野與熒光重疊。結(jié)果 表明，轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)多于細(xì)胞總數(shù)的90%。說(shuō)明三對(duì)NC siRNA序列的轉(zhuǎn)染效率均大于90%。
[0023] 基因水平檢測(cè)為24-36小時(shí)后收樣，蛋白水平檢測(cè)為36-48小時(shí)后收樣，細(xì)胞功 能細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、Edu檢測(cè)、黏附、遷移、侵襲、劃痕、線粒體電位JC-1、細(xì) 胞表面抗原檢測(cè)等為48小時(shí)后檢測(cè)組。每個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染組依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的濃度（25、50、 IOOnM)分為低、中、高轉(zhuǎn)染劑量組，每組5孔。按分組在轉(zhuǎn)染后，吸去上清，加入5μ1 CCK-8 試劑及100 μ 1新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C孵育4小時(shí)，450nm酶標(biāo)儀讀取吸光度值，細(xì)胞抑制率 =(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值-I) X 100%，結(jié)果見圖7至圖12。EA. hy 926細(xì)胞 中CYP4A11在不同轉(zhuǎn)染濃度下轉(zhuǎn)染后的RNA電泳見圖7,其中，第1列為NC siRNA-25nM， 第 2 列為 NC siRNA-50nM，第 3 列為 NC siRNA-lOOnM，第 4 列為 CYP4All-siRNAl-25nM， 第 5 列為 CYP4All-siRNAl-50nM，第 6 列為 CYP4All-siRNAl_100nM，第 7 列為 CYP4All-siRNA2-25nM，第 8 列為 CYP4All-siRNA2-50nM，第 9 列為 CYP4All-siRNA2-100nM， 第 10 列為 CYP4All-siRNA3-25nM，第 11 列為 CYP4All-siRNA3-50nM，第 12 列為 CYP4All-siRNA3-100nM (nM :納摩爾每升）;EA. hy 926 細(xì)胞中三對(duì) siRNA 與 NC siRNA 抑制 CYP4A11基因表達(dá)擴(kuò)增曲線見圖8;EA.hy 926細(xì)胞中三對(duì)siRNA與NC siRNA抑制CYP4A11 基因熔解曲線見圖9 ;EA. hy 926細(xì)胞中18srRNA的基因表達(dá)擴(kuò)增曲線見圖10 ;EA. hy 926 細(xì)胞中18srRNA的基因熔解曲線見圖11 ;12種樣品中CYP4A11的基因表達(dá)水平見圖12,其 中，第1列為143B細(xì)胞株，第2列為MG63細(xì)胞株。
[0024] 實(shí)施例3 CYP4A11 siRNA抑制細(xì)胞篩選以及CYP4A11基因表達(dá)效率檢測(cè)及最佳序 列的篩選 siRNA篩選轉(zhuǎn)染方案：鋪板以密度5XlO4個(gè)/孔種細(xì)胞，充分搖勻。
[0025] (1)樣品設(shè)置： 板1 :

【權(quán)利要求】
1. 抑制 CYP4A11 基因表達(dá)的 siRNA，為 CYP4All-siRNAl、CYP4All-siRNA2 和 CYP4All-siRNA3中的至少一種，其序列為： CYP4All-siRNAl :正義鏈 5'- GAUAUCCUCCUCUUGGCCA -3'（SEQ ID NO. 1)，反義鏈5'_ UGGCCAAGAGGAGGAUAUC -3，（SEQ ID N0.2); CYP4All-siRNA2:正義鏈 5'- GGUGUUUGACCCUUUCCGU -3'（SEQ ID N0.3)，反義鏈5'_ ACGGAAAGGGUCAAACACC-3, (SEQ ID NO. 4)； CYP4All-siRNA3:正義鏈 5'- CUUGCAUGUCUGACAUAAU -3'（SEQ ID N0.5)，反義鏈5'_ AUUAUGUCAGACAUGCAAG -3, (SEQ ID NO. 6)〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA，為CYP4All-siRNA2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA，其特征在于：所述 siRNA序列的3'端垂懸有dTdT。
4. 權(quán)利要求1?3任意一項(xiàng)所述的抑制CYP4A11基因表達(dá)的siRNA在制備治療心血管 疾病藥物中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述心血管疾病藥物為降血壓藥物。
【文檔編號(hào)】A61P9/12GK104278034SQ201410503876
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】李晉, 趙樹進(jìn), 石磊, 李健, 嚴(yán)華成 申請(qǐng)人:廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院