一種組織工程骨及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開的一種組織工程骨為具有三維毛細(xì)血管網(wǎng)的多層細(xì)胞片疊層化物，所述的多層細(xì)胞片疊層化物由n片疊置的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片及填充于各骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片層間的血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，n=3~8。其制備方法為：先在細(xì)胞培養(yǎng)器皿表面上制備光敏半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)層，獲得光敏的細(xì)胞培養(yǎng)皿；再用光敏的細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片；最后構(gòu)建由多層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片及血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的多層細(xì)胞片疊層化物，經(jīng)培養(yǎng)獲得組織工程骨。本發(fā)明的組織工程骨單純由同源細(xì)胞構(gòu)成，降低了免疫排斥及支架降解造成的污染，對(duì)骨缺損的修復(fù)及其早期血管化具有重要意義，且本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，便于推廣。
【專利說明】
一種組織工程骨及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組織工程骨及其制備方法，具體涉及一種由多層細(xì)胞片構(gòu)成的組織工程骨及其制備方法，屬于組織工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]由于先天畸形、外傷、腫瘤等造成的骨組織缺損和缺失是臨床常見的疾病，因此對(duì)骨組織缺損的功能性重建修復(fù)一直是再生醫(yī)學(xué)的重要課題。傳統(tǒng)的治療方法常采用自體或異體骨移植，但往往因供源有限或免疫排斥反應(yīng)等而限制了其臨床應(yīng)用。組織工程技術(shù)作為目前人工骨替代材料中應(yīng)用最為廣泛的一種，通過其生物可降解性被逐漸替換。如CN103285427A公開的《一種人工骨材料及其制備方法》，即采用適宜比例羥基磷灰石、膠原和納米纖維素合成人工骨，具有良好的強(qiáng)度及降解性能。CN103157138A公開的《一種組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法》，則采用可注射型殼聚糖-β -磷酸三鈣復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為組織工程骨，可任意塑形且完全降解吸收，誘導(dǎo)成骨效應(yīng)明顯。然而，常規(guī)組織工程技術(shù)的細(xì)胞粘附主要通過修復(fù)區(qū)周邊細(xì)胞的爬行或?qū)⑾鄳?yīng)細(xì)胞懸液滴定于材料表面或缺損區(qū)，細(xì)胞粘附利用率低、修復(fù)周期長(zhǎng)，其大小、形狀及定位也很難控制；同時(shí)，滴定細(xì)胞懸液往往形成散在島狀修復(fù)區(qū)，對(duì)于大片組織缺損并不適用；另外，應(yīng)用傳統(tǒng)組織工程所構(gòu)建的生物骨組織植入宿主后其內(nèi)毛細(xì)血管生長(zhǎng)緩慢，不利于骨組織的生長(zhǎng)、改建及支架材料降解，故構(gòu)建具有初期血管化的新型組織工程骨對(duì)于骨組織的修復(fù)及重建具有重要的意義。
[0003]細(xì)胞薄層培養(yǎng)技術(shù)(TangZ, Akiyama Y, Yamato M, Okano T.Comb-typegrafted poly(N-1sopropylacrylamide) gel modified surfaces for rapid detachmentof cell sheet.B1materials (2010) ; 31 (29):7435-43.Nagase K, KobayashiJ, Kikuchi A, Akiyama Y, Kanazawa H, Okano T.Thermally-modulated on/off-adsorpt1n materials for pharmaceutical protein purificat1n.B1materials.(2011) ;32(2):619-27.)作為一種新型組織工程方法，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其通過相應(yīng)中介物質(zhì)或控制貼壁細(xì)胞所生長(zhǎng)培養(yǎng)皿底部疏水-親水轉(zhuǎn)換從而控制細(xì)胞成片粘附生長(zhǎng)和剝離，此“細(xì)胞片”多層疊加或復(fù)合培養(yǎng)后，無需包裹材料，本身即可作為一種“生物支架”植入缺損部位。相較胰酶作用獲得的細(xì)胞，其并未破壞細(xì)胞間的蛋白連接及細(xì)胞同底部基質(zhì)間的連接，細(xì)胞活性更好；同時(shí)，細(xì)胞薄層培養(yǎng)技術(shù)還可避免降低在組織修復(fù)時(shí)因使用生物降解支架材料而造成高污染的問題。CN103097518A和CN103180437A公開的《細(xì)胞片疊層化物的制造方法、由該方法得到的具有血管網(wǎng)的細(xì)胞片疊層化物及其利用方法》，即通過溫敏細(xì)胞培養(yǎng)皿獲得細(xì)胞片，將多層細(xì)胞片疊加形成復(fù)層細(xì)胞片疊層化物，并將其整體培養(yǎng)于含流路凝膠或動(dòng)靜脈袢構(gòu)成的血管床上，得到了含血管網(wǎng)的心肌組織。然而，溫控的條件相對(duì)復(fù)雜，對(duì)于設(shè)備要求較高，溫度的間或改變亦影響細(xì)胞的活性，加速部分細(xì)胞老化，對(duì)于溫度更為敏感的人成骨類細(xì)胞并不適用(Fukumori K, Akiyama Y, Yamato M, KobayashiJ, Sakai K, Okano T.Temperatureresponsive glass coverslips with an ultrathinpoly(N-1sopropylacrylamide) layer.Acta B1mater 2009;5:470-476)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種具有血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的由多層細(xì)胞片構(gòu)成的組織工程骨及其制備方法。
[0005]本發(fā)明的組織工程骨為具有三維毛細(xì)血管網(wǎng)的多層細(xì)胞片疊層化物，所述的多層細(xì)胞片疊層化物由η片疊置的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片及填充于各骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片間的血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，η=3?8。
[0006]制備上述組織工程骨的方法，包括如下步驟:
1)制備光敏的細(xì)胞培養(yǎng)皿
將光響應(yīng)納米顆粒分散于去離子水中配成質(zhì)量濃度為1(Γ20%的分散液，再將分散液與醇和有機(jī)溶劑按摩爾比為0.02、.06:6^9:Γ3的比例配制成前驅(qū)體溶液，將前驅(qū)體溶液滴至聚苯乙烯培養(yǎng)皿至其鋪滿，烘干并消毒，得到光敏的細(xì)胞培養(yǎng)皿；所述的光響應(yīng)納米顆粒為納米氧化鈦、納米氧化鋅或納米氧化鐵，醇為甲醇或乙醇，有機(jī)溶劑為四氫呋喃、三氯甲烷或二氯甲烷；
2)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片
取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以5X 14IX 15個(gè)/cm2的密度植入步驟I)的光敏的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)4?10天后，采用波長(zhǎng)32(T450nm、強(qiáng)度f 4mW/cm2的光從培養(yǎng)皿底部射入，照射至光敏的細(xì)胞培養(yǎng)皿中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成片脫落，獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片；
3)構(gòu)建組織工程骨
將步驟2)得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待其貼壁后，加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h后，以5X 10，2X 15個(gè)/cm2的密度在其上植入血管內(nèi)皮細(xì)胞，再在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，吸除骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基后，在上述結(jié)構(gòu)上再轉(zhuǎn)移一片骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片，力口入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h ；
在上述結(jié)構(gòu)上再以5 X 10^2 X 15個(gè)/cm2的密度在其上植入血管內(nèi)皮細(xì)胞，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，吸除骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基后，再次轉(zhuǎn)移骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片，并加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，重復(fù)上述的過程直至該結(jié)構(gòu)具有η層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片，η=3^8,獲得多層細(xì)胞片疊層化物，向細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中添加成骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子及成血管細(xì)胞誘導(dǎo)因子，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下再培養(yǎng)Γ10天，得到組織工程骨。
所述的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子為抗壞血酸、β_甘油磷酸鈉和地塞米松中的一種或多種，其添加量分別可以為抗壞血酸5(Tl00Ug/ml、β -甘油磷酸鈉5?1mM及地塞米松
IX ΙΟΛΓ?ιιΜ ;所述的成血管細(xì)胞誘導(dǎo)因子為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子中的一種或兩種，其添加量分別可以為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5?10ng/ml及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子l(T20ng/ml。
[0007]本發(fā)明中所涉及的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可由胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化或提取于骨髓、脂肪組織、外周血、胎兒血液或肝臟，血管內(nèi)皮細(xì)胞可由胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化或提取于骨髓、外周血或臍帶血。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源不同，其所需的基礎(chǔ)培養(yǎng)基也不相同，因此本發(fā)明中所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基是指與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的來源相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，具體可參考如下文獻(xiàn):Small diameter vascular graft engineered usinghuman embryonic stem cell-derived mesenchymal cells (Tissue Eng Part A.2014Feb;20(3-4):740-50)^Differentiat1n of human embryonic stem cells into bipotentmesenchymal stem cells (Olivier E, et al., Stem Cells 2006 24: 1914-1922)及人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)(龐永剛陳文弦崔鵬程，《中國(guó)修復(fù)重建外科雜志》2004 (3)220-224)。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
1.本發(fā)明通過光敏細(xì)胞培養(yǎng)皿獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片，即通過紫外光或可見光照射引起光響應(yīng)薄膜表面帶電性及基團(tuán)發(fā)生變化，從而使生長(zhǎng)于其上的細(xì)胞從相應(yīng)器皿表面整體脫附得到細(xì)胞片，相較于現(xiàn)有的細(xì)胞薄層技術(shù)，本發(fā)明的方法更為便捷，效率更高，同時(shí)，避免了對(duì)溫度更為敏感的人成骨類細(xì)胞因溫度改變而產(chǎn)生的老化、壞死等現(xiàn)象。
[0009]2.本發(fā)明的具有血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由多層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片疊層化物構(gòu)成的組織工程骨，相較于現(xiàn)有的人工骨材料，無需生物材料作為支架承載，單純由同源細(xì)胞構(gòu)成，降低了免疫排斥及支架降解造成的污染，并于體外形成了具有三維血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的新型組織工程骨，對(duì)骨缺損的修復(fù)及其早期血管化具有重要意義。
[0010]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是多層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片疊層化物的宏觀圖
圖2是多層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片疊層化物的倒置顯微鏡下圖其中a:多片細(xì)胞片周邊區(qū)域b:多片細(xì)胞片中間區(qū)域圖3是組織工程骨中血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性熒光標(biāo)記圖其中a:血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物CD31 b:血管內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)志物UEA-1 c:細(xì)胞核標(biāo)記物。

【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地說明，但本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方式并不局限于此。
[0013]實(shí)施例一
1)制備光敏細(xì)胞培養(yǎng)皿
將氧化鈦納米顆粒均勻分散于水中形成質(zhì)量濃度為20%的分散液，將分散液與甲醇和四氫呋喃按0.06:9:3的比例配成前驅(qū)體溶液；再將上述前驅(qū)體溶液按48 μ L/cm2均勻滴加到聚苯乙烯培養(yǎng)皿上，放入65°C烘箱中干燥，干燥后即可獲得包含晶粒尺寸為2(T30nm，厚度為60nm?10nm的光響應(yīng)納米氧化鈦薄膜的細(xì)胞培養(yǎng)皿；
2)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片
取3飛代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以2X 15個(gè)/cm2的密度植入直徑為5cm的含納米氧化鈦的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)10天后，采用波長(zhǎng)450nm、強(qiáng)度4mW/cm2的紫外照射5min，即得成片脫落的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片；
3)構(gòu)建組織工程骨
采用新型細(xì)胞片轉(zhuǎn)移聯(lián)動(dòng)儀將步驟2)制得的單層人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片轉(zhuǎn)移至常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待其貼壁后，加入干細(xì)胞專用培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml)，置于37°C、5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)48h后，以
2X 15個(gè)/cm2的密度在其上植入人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，在上述培養(yǎng)條件下放置2h，吸除培養(yǎng)基后，用新型細(xì)胞片轉(zhuǎn)移聯(lián)動(dòng)儀將第二層人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片轉(zhuǎn)移至其上，相同條件下靜置培養(yǎng)2h。隨后，再以2X 15個(gè)/cm2的密度在其上植入一層人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，并相同條件下培養(yǎng)2h，最后將第三層人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片轉(zhuǎn)移至其上，即得包含三層人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片及雙層夾心人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的多層細(xì)胞片疊層化物，圖一即為多層細(xì)胞片疊層化物的宏觀圖，圖二則為相應(yīng)多層細(xì)胞片疊層化物的倒置顯微鏡圖(a、b分別表示多層細(xì)胞片的周邊及中間區(qū)域)，顯示多層細(xì)胞間粘附良好，未見明顯漂浮死細(xì)胞。于上述干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中額外添加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10ng/ml及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子20ng/ml,并添加成骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子抗壞血酸100ug/ml、β-甘油磷酸鈉1mM及地塞米松luM，體外培養(yǎng)4天后即得具有血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的組織工程骨，圖三即為組織工程骨中血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性熒光標(biāo)記圖(a、b分別表示血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物CD31及UEA-1染色)，顯示疊層化物間血管內(nèi)皮細(xì)胞已逐漸形成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
[0014]對(duì)本例中使用的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的具體來源說明:
征得年輕植骨患者同意，髂骨取骨，用注射器吸取1ml骨髓液，注射器內(nèi)含稀釋的肝素鈉2500U/ml約0.5ml，將細(xì)胞懸液貼壁緩慢注入到預(yù)置有等體積密度為1.077kg/L的人淋巴細(xì)胞分離液的試管內(nèi)，使兩者間形成清晰的界面。以2500r/min離心20min，吸取中間的乳白色云霧狀單核細(xì)胞層，PBS漂洗，1500r/min離心lOmin，棄上清，加入含10%小牛血清的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)液(江蘇賽揚(yáng)生物)10ml，制成單細(xì)胞懸液，以適當(dāng)密度接種于底面積為25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置入37°C、5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)，4天后首次半量換液，將未貼壁的細(xì)胞全部棄掉，以后每2?3天全量換液一次。待細(xì)胞匯合成單層后，以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化，即得到原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液。待細(xì)胞融合達(dá)80%以上，按1: 3或1: 4傳代培養(yǎng)，取第3代生長(zhǎng)達(dá)80%融合的貼壁細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)后取2 X 16個(gè)細(xì)胞，分裝6管，每管加入10 μ I熒光標(biāo)記抗體CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、CD166-PE，另設(shè)I管為空白對(duì)照，室溫避光30min，用PBS反復(fù)洗2_3次，加入200 μ I PBS混勻細(xì)胞，并以1%多聚甲醛固定，4°C保存，24h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)⑶73、⑶105及⑶166，⑶34及⑶45則呈陰性。
[0015]對(duì)本例中使用的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的具體來源說明:
無菌獲取新生J L臍帶,立即用生理鹽水沖洗血跡,剪去鉗痕和血腫部位,找出臍靜脈(2根管腔較小的是臍動(dòng)脈，I根管腔較粗的是臍靜脈)，用帶平針頭的注射器從一段插入臍靜脈，用血管鉗固定，再用PBS液沖凈臍靜脈內(nèi)血跡，為防止臍動(dòng)脈殘留的血液混入，可將動(dòng)脈分離少許用消毒線結(jié)扎，用血管鉗鉗夾另一端，從沖洗的針頭中注入0.1%的膠原酶液使其充盈，放入37°C水浴鍋內(nèi)孵育15min。取出臍帶松開血管鉗釋放酶細(xì)胞混合液于離心管中，再用PBS液沖洗臍靜脈后一并收集于離心管中，1000r/min,離心5min，棄上清，加DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10ng/ml，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子20ng/ml)，置于37°C、5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)，24h后首次換液，以后每2?3天換液一次。待細(xì)胞融合達(dá)80%以上，按1: 3或I: 4傳代培養(yǎng)，取第3代生長(zhǎng)達(dá)80%融合的貼壁細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶(含0.0296EDTA)消化，經(jīng)PBS清洗數(shù)次后，加入20 μ I熒光標(biāo)記抗體⑶31-ΡΕ，另設(shè)空白對(duì)照，室溫避光30min后行流式細(xì)胞儀鑒定，正常人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)CD31。
[0016]實(shí)施例二
I)制備光敏細(xì)胞培養(yǎng)皿的
將氧化鋅納米顆粒均勻分散于水中形成質(zhì)量濃度為10%的分散液，將分散液與乙醇和三氯甲烷按0.02:6:1的比例配成前驅(qū)體溶液，再將上述前驅(qū)體溶液按25 μ L/cm2均勻滴加到聚苯乙烯培養(yǎng)皿上，放入65°C烘箱中干燥，干燥后即可獲得包含晶粒尺寸為l(T20nm，厚度為40nm?80nm的光響應(yīng)納米氧化鋅薄膜的細(xì)胞培養(yǎng)皿。
[0017]2)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
取培養(yǎng)數(shù)代后的同源人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以5X 14個(gè)/cm2的密度植入直徑為5cm的含納米氧化鋅的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)4天后，采用波長(zhǎng)320nm、強(qiáng)度lmW/cm2的紫外照射30min，即得成片脫落的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片。
[0018]3)構(gòu)建組織工程骨
采用新型細(xì)胞片轉(zhuǎn)移聯(lián)動(dòng)儀將單層同源人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片轉(zhuǎn)移至常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待其貼壁后，加入干細(xì)胞專用培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml)，置于37°C、5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)2h后，以5 X 14個(gè)/cm2的密度在其上植入同源人血管內(nèi)皮細(xì)胞，在上述培養(yǎng)條件下放置48h，吸除培養(yǎng)基后，用新型細(xì)胞片轉(zhuǎn)移聯(lián)動(dòng)儀將第二層同源人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片轉(zhuǎn)移至其上，相同條件下靜置培養(yǎng)48h。隨后，重復(fù)依次植入同源人血管內(nèi)皮細(xì)胞并培養(yǎng)及轉(zhuǎn)移人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片并培養(yǎng)，直至該結(jié)構(gòu)具有8層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片，獲得多層細(xì)胞片疊層化物，在上述培養(yǎng)基中額外添加5ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及10ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，并添加成骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子抗壞血酸50ug/ml、β -甘油磷酸鈉5mM及地塞米松I X 10_8M,體外培養(yǎng)10天后即得組織工程骨。
[0019]對(duì)本例中使用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的具體來源說明:
將人胚胎干細(xì)胞定植培養(yǎng)于失活鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層之上，加DMEM/F12培養(yǎng)液(含20%血清替代物，ImM L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，10mM^-巰基乙醇，4ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，待其周邊出現(xiàn)呈碎屑狀的自分化細(xì)胞團(tuán)，取此零碎細(xì)胞片于含10%小牛血清的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)液(江蘇賽揚(yáng)生物)中培養(yǎng)數(shù)周，用包含胰酶、IV型膠原酶及中性蛋白酶的混合液解離、再培養(yǎng),并通過流式細(xì)胞儀分選出CD45、CD34陰性，而SH2、SH3、SH4呈陽(yáng)性的同源人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。(人胚胎干細(xì)胞受贈(zèng)于新加坡國(guó)立大學(xué))對(duì)本例中使用的血管內(nèi)皮細(xì)胞的具體來源說明:
將人胚胎干細(xì)胞定植培養(yǎng)于失活鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層之上，加DMEM/F12培養(yǎng)液(含20%血清替代物，ImM L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，10mM β -巰基乙醇，4ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，并通過20ng/ml BMP-4促分化作用2天后，形成擬胚體。隨后，將其定植于基質(zhì)膠表面，加DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml,堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5ng/ml,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子10ng/ml)另促分化10余日后，以CD31為標(biāo)志物篩選出人胚干細(xì)胞來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞。(人胚胎干細(xì)胞受贈(zèng)于新加坡國(guó)立大學(xué))
【權(quán)利要求】
1.一種組織工程骨，其特征在于所述的組織工程骨為具有三維毛細(xì)血管網(wǎng)的多層細(xì)胞片疊層化物，所述的多層細(xì)胞片疊層化物由η片疊置的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片及填充于各骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片間的血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，η=3?8。
2.制備如權(quán)利要求1所述的組織工程骨的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)制備光敏的細(xì)胞培養(yǎng)皿 將光響應(yīng)納米顆粒分散于去離子水中配成質(zhì)量濃度為1(Γ20%的分散液，再將分散液與醇和有機(jī)溶劑按摩爾比為0.02、.06:6^9:Γ3的比例配制成前驅(qū)體溶液，將前驅(qū)體溶液滴至聚苯乙烯培養(yǎng)皿至其鋪滿，烘干并消毒，得到光敏的細(xì)胞培養(yǎng)皿；所述的光響應(yīng)納米顆粒為納米氧化鈦、納米氧化鋅或納米氧化鐵，醇為甲醇或乙醇，有機(jī)溶劑為四氫呋喃、三氯甲烷或二氯甲烷； 2)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片 取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以5X 14IX 15個(gè)/cm2的密度植入步驟I)的光敏的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)4?10天后，采用波長(zhǎng)32(T450nm、強(qiáng)度f 4mW/cm2的光從培養(yǎng)皿底部射入，照射至光敏的細(xì)胞培養(yǎng)皿中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成片脫落，獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片； 3)構(gòu)建組織工程骨 將步驟2)得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待其貼壁后，加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h后，以5X 10，2X 15個(gè)/cm2的密度在其上植入血管內(nèi)皮細(xì)胞，再在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，吸除骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基后，在上述結(jié)構(gòu)上再轉(zhuǎn)移一片骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片，力口入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h ； 在上述結(jié)構(gòu)上再以5 X 10^2 X 15個(gè)/cm2的密度在其上植入血管內(nèi)皮細(xì)胞，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，吸除骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基后，再次轉(zhuǎn)移骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片，并加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，重復(fù)上述的過程直至該結(jié)構(gòu)具有η層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片，η=3^8,獲得多層細(xì)胞片疊層化物，向細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中添加成骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子及成血管細(xì)胞誘導(dǎo)因子，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下再培養(yǎng)Γ10天，得到組織工程骨。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組織工程骨的制備方法，其特征在于所述的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子為抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松中的一種或多種，所述的成血管細(xì)胞誘導(dǎo)因子為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子中的一種或兩種。
【文檔編號(hào)】A61L27/58GK104225681SQ201410480554
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】王慧明, 俞夢(mèng)飛, 洪逸, 董靈慶 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)