專(zhuān)利名稱：一種生物活性骨組織工程材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，涉及骨組織修復(fù)材料，特別涉及一種生物活性骨組織工程材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)80年代Robert Langer和Joseph P Vacanti首次提出“組織工程學(xué)”概念后，為眾多的組織缺損、器官功能衰竭病人帶來(lái)希望，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。骨組織工程材料的發(fā)展，從機(jī)體對(duì)材料的反應(yīng)性來(lái)看，經(jīng)歷了 20世紀(jì)60 70年代的生物惰性材料、上個(gè)世紀(jì)末的生物反應(yīng)性材料、以及促進(jìn)組織再生性的生物活性材料三個(gè)階段。對(duì)于骨組織工程材料的研究，目前主要集中在生物反應(yīng)性材料以及其制備方法學(xué)的研究，而對(duì)于促進(jìn)組織再生的生物活性材料的研究較少。生物活性材料是指具有可降解和高度生物活性，能夠激活預(yù)修復(fù)組織細(xì)胞基因的表達(dá)，提高細(xì)胞的增殖和分化；主動(dòng)誘導(dǎo)、激發(fā)組織 器官再生，實(shí)現(xiàn)人體缺損組織器官的再生和重現(xiàn)的生物材料。骨組織工程材料由無(wú)機(jī)和有機(jī)材料兩部分組成，本發(fā)明無(wú)機(jī)材料采用生物陶瓷類(lèi)，有機(jī)材料采用修飾后的天然高分子類(lèi)材料。絲素蛋白由蠶繭或蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析及冷凍干燥獲得，具有較好的組織相容性、可控的生物降解性、優(yōu)良的機(jī)械性能、較少的免疫原性以及特定的化學(xué)組成，被廣泛應(yīng)用于眼角膜、血管、人造皮膚、韌帶及骨等組織工程領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)磺酸化絲素蛋白有高度的生物學(xué)活性，能夠激活預(yù)修復(fù)組織細(xì)胞的基因表達(dá)，提高細(xì)胞的增值和分化。羥基磷灰石是一種生物活性陶瓷，與人體骨的Ca/P比與其極為相似，具有良好的骨傳導(dǎo)性和生物活性，并且相態(tài)比較穩(wěn)定，無(wú)毒副作用，而非晶態(tài)的羥基磷灰石具有一定的溶解性，可以提高材料及組織周?chē)}、磷的含量，促進(jìn)骨細(xì)胞及組織生成。根據(jù)以上研究結(jié)果，本發(fā)明采用磺酸化絲素蛋白和非晶態(tài)的羥基磷灰石為原料，制備骨修復(fù)多孔支架材料。目前，2009年我國(guó)專(zhuān)利CN101502672A公開(kāi)了羥基磷灰石/絲素蛋白多孔支架的制備方法，采用的是戊二醛交聯(lián)絲素蛋白和羥基磷灰石，然后凍融兩次并干燥獲得多孔支架材料，對(duì)骨組織修復(fù)材料的性能有所改善。2011年專(zhuān)利CN102302804A公開(kāi)了羥基磷灰石基生物復(fù)合支架及組織工程骨，采用粒子浙濾結(jié)合冷凍干燥制備了生物反應(yīng)性骨修復(fù)材料，制備出可降解的骨修復(fù)材料。然而，骨修復(fù)材料的研究主要集中在第二代骨修復(fù)材料中制備方法學(xué)的研究，生物活性材料的研究報(bào)道甚少。因此，以具有生物活性的磺酸化絲素蛋白為基材制備組織工程多孔支架材料，提高軟骨修復(fù)材料的生物活性，對(duì)骨組織工程材料的開(kāi)發(fā)具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
解解決的技術(shù)問(wèn)題針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)不足，為了提高骨組織工程材料自身的生物活性，本發(fā)明擬采用添加少量羥基磷灰石作為晶核，與磺酸化絲素蛋白進(jìn)行混合，通過(guò)冷凍干燥方法制備多孔骨修復(fù)材料，進(jìn)一步促進(jìn)骨組織的再生，主動(dòng)誘導(dǎo)、激發(fā)組織器官再生，實(shí)現(xiàn)人體缺損組織器官的再生和重現(xiàn)的生物材料。技術(shù)方案一種生物活性骨組織工程材料的制備方法，制備步驟為移取10 100mg/mL的非晶形納米輕基磷灰石溶液，超聲波分散30min Ih,將絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白溶解在羥基磷灰石溶液中，混勻，使溶液中總蛋白的質(zhì)量百分比濃度為I 20%，無(wú)機(jī)非結(jié)晶羥基磷灰石的質(zhì)量百分比濃度為O. 01 5% ;0 4°C預(yù)冷I 5h，混勻；-20 -70°C預(yù)凍6h 24h，-40 -80°C冷凍干燥，獲得生物活性骨組織工程材料。所述絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白的質(zhì)量比為I : (7 O. 25)。有益效果(I)本發(fā)明制備生物活性軟骨組織修復(fù)多孔復(fù)合支架，以無(wú)晶形的羥基磷灰石為核可以更好促進(jìn)新骨細(xì)胞及組織的再生。·(2)本發(fā)明制備生物活性軟骨組織修復(fù)多孔復(fù)合支架過(guò)程簡(jiǎn)單，無(wú)毒害物質(zhì)殘留，易于操作，孔與孔之間連接性較好，孔隙率較高，滿足骨修復(fù)材料的要求。(3)本發(fā)明制備生物活性軟骨組織修復(fù)多孔復(fù)合支架，通過(guò)磺酸化絲素蛋白的引入，獲得具有可降解和高度生物活性，能夠激活預(yù)修復(fù)組織細(xì)胞的基因表達(dá)，提高細(xì)胞的增殖和分化；主動(dòng)誘導(dǎo)、激發(fā)組織器官再生，實(shí)現(xiàn)人體缺損組織器官的再生和重現(xiàn)的生物材料，引入生物活性骨修復(fù)材料的概念。


圖I磺酸化絲素蛋白的分子結(jié)構(gòu)特征；圖2多孔復(fù)合支架材料照片；圖3多孔復(fù)合支架材料SEM分析；圖4多孔復(fù)合支架材料FTIR分析。
具體實(shí)施例方式以下具體實(shí)施方式
不以任何形式限制本發(fā)明的技術(shù)方案，凡是采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述實(shí)施例中涉及孔隙率，采用排液法進(jìn)行測(cè)量，孔徑及孔與孔之間的連接性通過(guò)SEM進(jìn)行表征。(I)孔隙率的測(cè)定方法采用正己烷作為替代液體(正己烷的滲透力強(qiáng)，且在滲透過(guò)程中對(duì)支架無(wú)膨脹和收縮作用)。恒溫條件下，將三個(gè)比重瓶中裝滿正己烷，并抽真空脫氣，至無(wú)氣泡溢出，分別稱重M0，樣品剪成大致相等的三塊分別稱重為Ms，將樣品放入比重瓶?jī)?nèi)抽真空脫氣，充分浸泡并裝滿正己烷，稱重M1，迅速取出樣品，并稱剩余正己烷及比重瓶重M2,計(jì)算得孔隙率，求平均值即得到多孔支架的孔隙率。復(fù)合支架孔障率的計(jì)算公式
M _ Μ _ Μ^(%) = 1 V * 100%
Ma-M2(2)表征的條件分別為FTIR測(cè)試條件為稱取樣品與KBr混合研磨，壓片得透明薄片，壓力為15 20MPa，TENS0R27型FTIR紅外光譜儀，掃描次數(shù)32次，分辨率4cm—1，掃描速度ΙΟΚΗζ，掃描范圍4000 ^OcnT1 ;SEM條件為將干燥后的多孔復(fù)合支架，用鋒利刀片切取獲得橫截面的切片，用離子濺射儀(MSP1S，Japan)將橫截面切片進(jìn)行噴金處理，于15KV條件下，觀察支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)和孔徑大小。以下實(shí)施例中Ca(NO3)2、(NH4)2ΗΡ04和氨水均為分析純AR，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。絲素蛋白的提取將分揀好的蠶苗殼剪成Imm2的小塊,料液比l:50(w/v, g/ml)浸入98±2°C，O. 5wt%Na2C0jK溶液中，浸提30min，2次，蒸餾水充分洗滌、漂洗，除去絲膠蛋白后室溫干燥。獲得的絲素蛋白浸入60°C,9. 3M LiBr水溶液，溶解4h。絲素蛋白溶液利用截留分子量為3500透析袋透析2-3d,8000rpm離心除去沉淀。10wt%聚乙二醇(分子量為20000)濃縮至10%左右，4°C保存待用?；撬峄z素蛋白的制備將68mg對(duì)氨基苯磺酸溶解在2mL水中與ImLl. 6M對(duì)甲·苯磺酸水溶液混合冰浴冷卻，向混合液中添加ImLO. SM冰浴的亞硝酸鈉水溶液，混勻，冰浴15min得到偶氮鹽反應(yīng)液，儲(chǔ)存待用。向4mL (約10%)的絲素硼酸鹽緩溶液(O. 2M pH9. O)添加ImL的偶氮鹽反應(yīng)液，反應(yīng)20min，透析2 3d，冷凍干燥，獲得磺酸化絲素蛋白。納米羥基磷灰石制備過(guò)程如下0. IM等濃度的Ca (NO3) 2和(NH4) 2ΗΡ04溶液體積比5:3,采用流加方式將反應(yīng)液進(jìn)行混合(流加速度100ml/h),并機(jī)械攪拌300rad/min,以氨水調(diào)節(jié)pH為10 11，反應(yīng)溫度為70°C。流加結(jié)束后繼續(xù)攪拌3h，將懸濁液加熱至沸騰，除去大量氨氣。將反應(yīng)液在50°C恒溫靜置48h，每靜置6h倒掉上清液加水到原體積繼續(xù)靜置陳化。然后抽濾，用蒸餾水清洗4次，冷凍干燥得到納米羥基磷灰石。實(shí)施例I準(zhǔn)確移取O. 268mL40mg/mL輕基磷灰石衆(zhòng)料,超聲波分散30min,加入140mg質(zhì)量比I : I的絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白，溶解，補(bǔ)水至2mL,混合均勻,超聲波分散30min分散。2°C預(yù)冷5h，混勻；-20°C預(yù)凍12h，_40°C冷凍干燥3天，獲得生物活性骨組織工程材料，測(cè)得孔隙率為90. 3%。實(shí)施例2準(zhǔn)確移取O. 02mL10mg/mL羥基磷灰石漿料，超聲波分散30min，加入20mg質(zhì)量比I : I的絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白，溶解，補(bǔ)水至2mL混合均勻,超聲波分散30min分散。4°C預(yù)冷5h，混勻；_40°C預(yù)凍6h，_45°C冷凍干燥2. 5天，獲得孔隙率為95. I %生物活性骨組織工程材料。實(shí)施例3準(zhǔn)確移取O. 055mL100mg/mL輕基磷灰石衆(zhòng)料,超聲波分散30min,加入IOOmg質(zhì)量比4 I的絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白，溶解,補(bǔ)水至2mL混合均勻,超聲波分散30min分散。(TC預(yù)冷lh，混勻；-20°C預(yù)凍12h，_50°C冷凍干燥2天，獲得孔隙率為91. 2%生物活性骨組織工程材料。實(shí)施例4準(zhǔn)確移取I. OmLlOOmg/mL輕基磷灰石衆(zhòng)料,超聲波分散30min,加入400mg質(zhì)量比I : 7的絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白溶解,補(bǔ)水至2mL混合均勻,超聲波分散30min分散。
4°C預(yù)冷5h，混勻；-20°C預(yù)凍24h，_45°C冷凍干燥2天，獲得孔隙率為79. 3%生物活性骨組織工程材料。實(shí)施例5準(zhǔn)確移取O. 5mL20mg/mL羥基磷灰石漿料，超聲波分散30min，加入400mg質(zhì)量比I : 3的絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白溶解,補(bǔ)水至2mL混合均勻,超聲波分散30min分散。4°C預(yù)冷4h，混勻；-20°C預(yù)凍12h，_60°C冷凍干燥2天，獲得孔隙率為75. 6%生物活性骨組織工程材料。實(shí)施例6
準(zhǔn)確移取O. 04mL75mg/mL羥基磷灰石漿料，超聲波分散30min，加入240mg質(zhì)量比I : 7的絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白溶解,補(bǔ)水至2mL混合均勻,超聲波分散30min分散。4°C預(yù)冷24h，混勻；-70°C預(yù)凍12h，_80°C冷凍干燥2天，獲得孔隙率為85. 6%生物活性骨組織工程材料。實(shí)施例2制備的生物活性骨組織工程材料基本性質(zhì)所制備的骨組織工程材料如附圖2 ;骨組織工程材料的孔與孔之間連接性較好，如附圖3 ;紅外表征結(jié)果如圖4，從譜圖可以看出復(fù)合材料中包含羥基磷灰石及絲素蛋白的特征吸收峰。
權(quán)利要求
1.一種生物活性骨組織工程材料的制備方法，其特征在于制備步驟為移取10 100mg/mL的非晶形納米輕基磷灰石溶液，超聲波分散30min Ih,將絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白溶解在羥基磷灰石溶液中，混勻，使溶液中總蛋白的質(zhì)量百分比濃度為I 20%，無(wú)機(jī)非結(jié)晶羥基磷灰石的質(zhì)量百分比濃度為O. 01 5% ;0 4°C預(yù)冷I 5h，混勻；-20 -70°C預(yù)凍6h 24h，-40 _80°C冷凍干燥，獲得生物活性骨組織工程材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物活性骨組織工程材料的制備方法，其特征在于所述絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白的質(zhì)量比為I :(7 O. 25)。
全文摘要
一種生物活性骨組織工程材料的制備方法，制備步驟為移取非晶形納米羥基磷灰石溶液，超聲波分散，將絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白溶解在羥基磷灰石溶液中，混勻；0～4℃預(yù)冷1～5h，混勻；-20～-70℃預(yù)凍6h～24h，-40～-80℃冷凍干燥，獲得生物活性骨組織工程材料。本發(fā)明制備生物活性軟骨組織修復(fù)多孔復(fù)合支架，通過(guò)磺酸化絲素蛋白的引入，獲得具有可降解和高度生物活性，能夠激活預(yù)修復(fù)組織細(xì)胞的基因表達(dá)，提高細(xì)胞的增殖和分化；主動(dòng)誘導(dǎo)、激發(fā)組織器官再生，實(shí)現(xiàn)人體缺損組織器官的再生和重現(xiàn)的生物材料，引入生物活性骨修復(fù)材料的概念。
文檔編號(hào)A61L27/22GK102940906SQ20121055130
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者顏輝, 李紹群, 唐玉斌, 賈俊強(qiáng), 吳瓊英, 江明珠 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)