抑制性寡核苷酸對(duì)tlr9的調(diào)控對(duì)急性胰腺炎的改善作用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了抑制性寡核苷酸對(duì)TLR9的調(diào)控對(duì)急性胰腺炎的改善作用。本發(fā)明根據(jù)CpG0DN的序列特點(diǎn)構(gòu)建多條抑制性的寡核苷酸序列，以小鼠巨噬細(xì)胞作為抑制性寡核苷酸的篩選平臺(tái)，篩選出最具有抑制活性的寡核苷酸序列，運(yùn)用寡核苷酸抑制TLR9受體，并根據(jù)相關(guān)指標(biāo)評(píng)估寡核苷酸的安全性和作用機(jī)制，為SAP的治療提供新方法，同時(shí)也為Toll受體介導(dǎo)的其他自身免疫性疾病的治療提供新思路。
【專利說(shuō)明】抑制性寡核苷酸對(duì)TLR9的調(diào)控對(duì)急性胰腺炎的改善作用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物制備【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及抑制性寡核苷酸對(duì)TLR9的調(diào)控對(duì)急性胰腺 炎的改善作用。

【背景技術(shù)】
[0002] 重癥急性胰腺炎（SAP)屬于急性胰腺炎的特殊類型，是一種病情險(xiǎn)惡、并發(fā)癥多、 病死率較高的急腹癥，占整個(gè)急性胰腺炎的10%?20%。20世紀(jì)80年代，多數(shù)病例死于疾 病早期，直至近10年來(lái)，隨著SAP外科治療的進(jìn)展，治愈率有所提高，但總體死亡率仍高達(dá) 17 %左右，仍是本世紀(jì)的醫(yī)學(xué)難題。
[0003] SAP的發(fā)病機(jī)制主要是胰液對(duì)胰腺及其周圍組織自身消化的結(jié)果與獲得性免疫失 調(diào)有關(guān)。過(guò)去研究認(rèn)為，白細(xì)胞的過(guò)度激活以及炎性細(xì)胞因子在重癥胰腺炎導(dǎo)致的全身性 炎癥中起重要作用，在SAP中這些炎性細(xì)胞因子互相關(guān)聯(lián)和累積作用，可導(dǎo)致血管滲漏、低 血容量、多系統(tǒng)器官衰竭等危象的發(fā)生。最近，國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體9在SAP的發(fā) 生進(jìn)展中起著重要的作用，TLR9識(shí)別CpG DNA激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化轉(zhuǎn)錄因子從而引 起炎癥因子的大量釋放，引起急性胰腺炎從局部病變。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 抑制性寡核苷酸對(duì)TLR9的調(diào)控對(duì)急性胰腺炎的改善作用。
[0005] CpG 0DN與TLR9結(jié)合以后，誘導(dǎo)TLR9二聚化的形成，TLR9通過(guò)TIR結(jié)構(gòu)域募 集Myd-88。Myd-88含2個(gè)蛋白反應(yīng)結(jié)構(gòu)域，即羧基末端的TIR結(jié)構(gòu)域和氨基末端的死亡 結(jié)構(gòu)域（death domain, DD)，所以，Myd88又可以吸引具有相同DD的IL-1受體相關(guān)激酶 (IL-lreceptor associated kinase，IRAK)至受體復(fù)合物。IRAK自動(dòng)憐酸化后從受體復(fù)合 物上解離，與接轉(zhuǎn)蛋白了即受體相關(guān)因子6(1即-代06口1：01'-3880(^3七6(1€3(31：016，1狀?6)相 互作用，TRAF6能夠活化NF- κ B誘導(dǎo)激酶，誘導(dǎo)I- κ B的降解，從而使NF- κ B得以游離并 遷移到細(xì)胞核中，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明，樹(shù)突狀細(xì)胞在CpG-ODN刺激的最初6h 可以觀察到IFN調(diào)節(jié)因子7基因表達(dá)的上調(diào)和IFN-α的分泌。目前認(rèn)為CpG 0DN的這一 作用是P38MAPK和STAT1依賴的。P38MAPK信號(hào)途徑是MAPK家族中的重要組成部分，又稱 為MAPK應(yīng)急信號(hào)通路，在炎性反應(yīng)中具有十分重要的作用。Myd88依賴的信號(hào)途徑中活化 的TRAF6可通過(guò)接轉(zhuǎn)蛋白ECSIT作用于MAPK-1，經(jīng)p38MAPK進(jìn)一步活化c-Jun/Fos，最終均 可激活免疫應(yīng)答基因。另有研究發(fā)現(xiàn)TRAF6還可激活TGF-β活化激酶-1，繼而刺激MAPK， 激活JNK，表明CpG 0DN可通過(guò)激活不同的MAPK途徑而發(fā)揮作用。為臨床防治感染性疾病、 變態(tài)反應(yīng)性疾病，特別是惡性腫瘤這一人類難題提供了有益療效。
[0006] Toll樣受體9在SAP的發(fā)生進(jìn)展中起著重要的作用，TLR9識(shí)別CpG DNA激活細(xì)胞 內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化轉(zhuǎn)錄因子引起炎癥因子的大量釋放，引起急性胰腺炎從局部病變迅速進(jìn) 展為全身炎癥。TLR9受體的過(guò)強(qiáng)激活，給機(jī)體產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)從而帶來(lái)內(nèi)毒素性的休 克以及自身免疫性疾病等。因此以TLR9為靶點(diǎn)，可能成為重癥急性胰腺炎新治療途徑。抑 制性O(shè)DN是一種靶向性、特異性的治療手段，可以針對(duì)TLR9進(jìn)行特異性的抑制，但其抑制性 強(qiáng)弱與0DN骨架的硫代修飾、0DN的長(zhǎng)度和核苷酸序列特異性等相關(guān)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0007] 圖1所示為免疫熒光染色顯示TLR9主要表達(dá)在Panc-Ι細(xì)胞胞漿中（x200)。
[0008] 圖2為TLR9蛋白在胰腺癌組織（A)、癌旁胰腺組織（B)及正常胰腺組織（C)中的 表達(dá)（x200)。
[0009] 圖3為不同濃度CPG 0DN2216對(duì)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-Ι增殖的影響。
[0010] 圖4為0h、48h各組Panc-Ι細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（x400)。
[0011] 圖5為小室測(cè)定Panc-Ι細(xì)胞侵襲力（x200)。其中A.對(duì)照組較多Panc-Ι細(xì)胞穿過(guò) 濾膜；B. CPG 0DN1 μ g/ml 組過(guò)膜 Panc-Ι 細(xì)胞顯著減少。C. CPG 0DN10 μ g/ml 組過(guò)膜 Panc-1 細(xì)胞進(jìn)一步減少。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0013] 抑制性寡核苷酸對(duì)TLR9的調(diào)控對(duì)急性胰腺炎的改善作用；
[0014] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示為各組Panc-Ι細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)劃痕的寬度(?士幻。
[0015] 表 1
[0016]

【權(quán)利要求】
1.抑制性寡核苷酸對(duì)TLR9的調(diào)控對(duì)急性胰腺炎的改善作用。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104208722SQ201410445774
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】吳漢青 申請(qǐng)人:吳漢青