專利名稱：骨膜素誘導的胰腺再生的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及骨膜素在胰腺組織的再生中的應用。
背景技術：
胰腺產生消化酶，以及幾種重要的激素，包括胰島素、胰高血糖素和生長抑素。產生激素的細胞集中在構成胰腺的大約1^-2%的郎格罕氏島(胰島)內。在健康的胰腺中， 響應于升高水平的血糖，郎格罕氏島內的β-細胞產生胰島素。存在許多起因于胰腺組織損失或導致胰腺組織損失的疾病。這些疾病包括糖尿病(1型和2型)以及胰腺外分泌功能不全。1型糖尿病(胰島素依賴性糖尿病)是一種自身免疫性障礙，其中身體的免疫系統(tǒng)攻擊細胞、破壞它們或足以損傷它們使得產生很少或者不產生胰島素。雖然胰島素替代療法、嚴格的飲食控制和小心的血糖監(jiān)測能夠限制與糖尿病相關的并發(fā)癥，但替換或再生胰腺是合乎需要的。2型糖尿病(非胰島素依賴性糖尿病)是一種代謝障礙，其最初的特征在于胰島素抗性，而最終的特征在于胰腺β-細胞不能使胰島素的產生與胰島素的需求相適應。由于缺少由胰腺產生的消化酶，胰腺外分泌功能不全(EPI)不能完全消化食物。 EPI是從患有囊性纖維化和舒-戴二氏綜合征(Stiwachman-Diamond Syndrome)的人中發(fā)現(xiàn)的。其是由產生消化酶的胰腺細胞的進行性損失引起的。慢性胰腺炎是人類中EPI的最常見起因。消化酶的損失導致營養(yǎng)物質的消化不良和吸收不良。本領域中對開發(fā)用于再生胰腺組織的方法和藥物存在需要。胰島的外科手術移植還未被證實是有效的，但已知胰腺細胞具有再生的能力。已經研究了胰腺再生促進因子，例如HIP、INGAP, GLP-1、艾塞那肽-4(Exendin-4)(例如，WO 2006/096565、US6, 114，307、和 USRE39299)。骨膜素(Periostin)是一種約90kDa的分泌蛋白，在骨組織的骨膜中優(yōu)先表達。(Takeshita et al. (1993). Biochem. J, 294 271-8 ；Horiuchi et al. (1999). J. Bone Miner. Res.，14 :1239-49)。骨膜素包括NH2-末端分泌信號肽，接著是富含半胱氨酸的結構域，4個內部同源重復，和COOH-末端親水結構域。在每個重復結構域中，兩個區(qū)域是高度保守的。骨膜素已經在各種癌癥中被識別，并且它的存在已被認為是癌癥的標記和治療靶標 (Kanno et al. (2008) int. J. Cancer 122 1707-18)。骨膜素還已經表明由胰腺星狀細胞分泌(PSC)的，并保存PSC纖維發(fā)生活性，同時在應力條件下支持胰腺腫瘤細胞生長(Erkan， et al. (2007)Gastroenterology 132 :1447-64)

發(fā)明內容
在第一方面，本發(fā)明提供了一種通過給予骨膜素來再生胰腺組織的方法。再生的組織可以包括細胞。本發(fā)明的方法能夠被用于治療由胰腺組織損失引起的或導致胰腺組織損失的疾病，諸如1型糖尿病、2型糖尿病、和ΕΡΙ。
在另一方面，給予的可以是編碼骨膜素蛋白的核苷酸序列。在另外的方面，本發(fā)明提供了一種編碼骨膜素蛋白的核苷酸序列，該序列包括序列pane (圖1)；與序列pane同源的核苷酸序列；或與序列pane的補體雜交的核苷酸序列。對于本領域普通技術人員來說，在結合附圖閱讀了本發(fā)明的具體實施方式
的以下描述后，本發(fā)明的其他方面和特征將變得顯而易見。


現(xiàn)在，將僅通過舉例的方式參照附圖來描述本發(fā)明的實施方式，其中圖IA-圖IC示出了由5個不同核苷酸序列編碼的骨膜素蛋白的示意圖。圖ID示出了圖IA-圖IC中所示的編碼骨膜素蛋白同種型的可變異部分的5個骨膜素核苷酸序列的核苷酸序列比對。圖2示出了圖ID的另一示圖。圖3示出了重組人骨膜素蛋白的氨基酸序列。圖4A-圖4B總結了 15個實驗，其中用鏈脲佐菌素和骨膜素(以不同濃度)處理， 或者單獨用鏈脲佐菌素處理成對的小鼠。在圖4A中，菱形表示在骨膜素處理的小鼠中具有正常血糖水平的小鼠對，但是在未經骨膜素處理的小鼠中具有STZ誘導的糖尿??；三角形表示在用骨膜素處理和未經骨膜素處理的小鼠對中具有STZ誘導的糖尿病的小鼠對。圖4B示出了來自圖4A的用骨膜素處理的小鼠對的血糖水平(mmol/L)為40到 60μ g/kg體重之間。圖5A示出了編碼圖IB所示的骨膜素蛋白的同種型的核苷酸序列。圖5B示出了圖IB所示的和由圖5A所示的序列編碼的骨膜素蛋白的同種型的氨基酸序列。圖6示出了具有移植的胰腺星形細胞的胰腺的組織形態(tài)。圖6A和圖6C示出了在注射后3天和1周表達GFP的野生型供體細胞的浸潤。圖6A是圖6B中的箭頭所指的區(qū)域的放大圖。圖6D-圖6F表明注射有間充質細胞的胰腺呈現(xiàn)出(D)形成表達上皮鈣粘附蛋白(E-Cadherin)和Ngn3的管狀復合物；(E)表達GFP的細胞包圍表達細胞角蛋白_7管狀結構；以及(F)表達GFP的細胞不表達Pdx-I。圖7示出了直接注射的骨膜素對胰腺再生和胰島素表達的影響。圖7A-圖7G示出了 (A)注射骨膜素一周后，在注射部位附近發(fā)現(xiàn)Ngn3+細胞；(B)在細胞角蛋白-7+管狀復合物結構中觀察到胰島素表達；(C)在注射鹽水后沒有檢測到胰島素表達；(D和E)注射四周后，在管狀結構內和管狀結構周圍觀察到胰島素表達；(F)胰島素+簇(cluster)包含表達胰高血糖素的細胞；(G)胰島素+簇包含表達Ngn3的細胞。
具體實施例方式總體上，本發(fā)明提供了一種利用骨膜素來再生胰腺組織的方法。在一種具體實施方式
中，本發(fā)明提供了一種使用骨膜素來再生郎格罕氏島內的各種胰腺細胞的方法。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了一種利用骨膜素來再生郎格罕氏島內的細胞的方法。 在另一實施方式中，本發(fā)明涵蓋骨膜素的新同種型，包括編碼該新同種型的核酸。骨膜素存在于各種同種型中。如本文所使用的，“同種型”被定義為“兩種或多種來自其中不同的外顯子已被去除的具有類似的但不完全相同的氨基酸序列并且由不同的基因或RNA轉錄物編碼的功能上類似的蛋白質中的任一種”(Merriam-Webster' s Medical Dictionary OnLine)。如圖1所示，編碼骨膜素的核酸序列由保守的EMI結構域(約75個氨基酸的小的富含半胱氨酸的模塊，在發(fā)現(xiàn)其存在于EMILIN家族的蛋白中后而被首次命名)和4個成束蛋白重復(fasciclin repeats)構成。羧基末端包括多個外顯子。如何剪切除去(splice out)這些外顯子的變化導致骨膜素的各種同種型。圖1和圖2示出了編碼鼠類骨膜素的4個已知同種型的核苷酸序列。雖然這些序列是由從小鼠分離的核酸確定的，但可以認為其它哺乳動物物種也會包含基本上相似的骨膜素基因。同種型#1是骨膜素的最長的已知同種型，并且包括所有23個外顯子(由核苷酸序列Pm編碼，圖幻。同種型#2(由核苷酸序列PN2編碼，圖幻是最先被鑒定的骨膜素蛋白的同種型，并且起初被命名為成骨細胞特異性因子2(0steOblast Specific Factor-2, 0SF-2)；它不包括外顯子17。同種型#3最近被命名為骨膜素樣因子 (Periostin-Like-Factor, PLF)并且包括外顯子17而不包括外顯子21 (由核苷酸序列PN3 編碼，圖2)。同種型#4目前是最近公開的骨膜素同種型，并且其不包括外顯子20和21 (由核苷酸序列PN4編碼，圖2)。本發(fā)明涵蓋作為骨膜素的第5個新的同種型，此處被稱為PANC(由所有大寫字母標識的蛋白)。PANC是胰腺再生期間最經常表達的骨膜素的同種型。PANC的尺寸類似于同種型#4，但是不包括外顯子17和21，如通過直接測序所示出的。圖1示出了編碼PANC (SEQ ID似1，圖幻的核苷酸序列的可變部分和骨膜素的上述4個鼠類同種型的比對。因此，本發(fā)明涵蓋pane的核酸序列(由所有小寫字母標識的DNA)，和PANC蛋白，以及分離的pane 核酸和PANC蛋白。圖3示出了重組人骨膜素蛋白的氨基酸序列。圖5A示出了編碼由圖IB所示的骨膜素蛋白的鼠類同種型的核苷酸序列(SEQ ID No:3)。圖5B示出了圖IB所示的并且由圖 5A所示的序列編碼的骨膜素蛋白的鼠類同種型的氨基酸序列(SEQ ID No 2) 0在1型糖尿病中，免疫系統(tǒng)攻擊胰腺；因此，在一個方面，骨膜素分子可以與免疫抑制劑組合給予。定義術語“治療病癥或疾病”在本發(fā)明的上下文中是指預防、阻止病癥或疾病的發(fā)展或延緩病癥或疾病的進展。術語“再生”在本發(fā)明的上下文中涵蓋使細胞的數(shù)目增加(增殖)以及使干細胞分化成新細胞。胰腺組織的再生包括新胰腺細胞的增殖、星形細胞增殖的誘導、和/或管狀復合物形成。骨膜素核酸分子本發(fā)明的骨膜素核酸分子可以是cDNA、基因組DNA、合成DNA或 RNA,并且可以是雙鏈或單鏈的(即，正義鏈或反義鏈)。這些分子的鏈段也可以被認為在本發(fā)明的范圍內，并且可以通過例如聚合酶鏈反應(PCR)產生或通過用一種或多種限制性內切酶處理來生成。核糖核酸(RNA)分子可以通過體外轉錄而產生。優(yōu)選地，核酸分子編碼在正常生理條件下是可溶的多肽，而與多肽的長度無關。本發(fā)明的核酸分子可以包含天然存在的序列，或者與那些天然存在的序列不同但由于遺傳密碼的簡并而編碼相同多肽的序列。此外，這些核酸分子不限于編碼序列，例如，它們可以包括位于編碼序列的上游或下游的非編碼序列中的一些或全部。本發(fā)明的核酸分子可以由生物細胞合成(例如，通過基于亞磷酰胺的合成)或獲自生物細胞，諸如哺乳動物的細胞。該核酸可以是人類、非人類靈長類(例如，猴子)、小鼠、 大鼠、豚鼠、牛、羊、馬、豬、兔、狗或貓的核酸。還涵蓋了這些類型的核酸內的核苷酸的組合或修飾。此外，本發(fā)明的分離的核酸分子涵蓋未發(fā)現(xiàn)像這樣的天然狀態(tài)的鏈段。因此，本發(fā)明涵蓋重組核酸分子(例如，編碼結合到載體(例如，質粒或病毒載體)中或結合到異源細胞的基因組(或同源細胞的基因組，在不同于天然染色體位置的位置處的骨膜素的分離的核酸分子)。骨膜素家族基因或蛋白能夠分別基于其與相關的骨膜素基因或蛋白的相似性而被識別。例如，該識別可基于序列同一性。本發(fā)明的特征在于分離的核酸分子，其至少50% (或55%，65%，75%，85%，95%，或98%)相同于(a)panc的核苷酸序列(圖2)；以及(b) 包括 pane 的至少 30 (例如，至少 50，100，150，150，200，250，300，350，400，500，700，900， 1100，1400，1700，2000，2200，2250，2300 或 2310)個核苷酸的鏈段的核酸分子(圖 2)。兩個序列之間的百分比同一性的確定利用Karlin和Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :587；35877的數(shù)學算法來完成。將這樣的算法結合于Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215,403410 的 BLASTN 和 BLASTP 程序中。BLAST 核苷酸研究利用 BLASTN程序來進行，得分=100，字長=12，以獲得與編碼骨膜素的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白研究利用BLASTP程序來進行，得分=50，字長=3，以獲得與骨膜素多肽同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的間隙比對，如在Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res. 25 :33893402 中所描述的利用 GappedBLAST。當利用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序時，使用各自程序的缺省參數(shù)(例如，XBLAST和NBLAST)。也可以使用雜交作為兩個核酸序列之間的同源性的度量。根據(jù)標準雜交技術，編碼骨膜素的核酸序列，或其一部分可以被用作雜交探針。骨膜素探針與來自測試來源(例如，哺乳動物細胞)的DNA或RNA的雜交是測試來源中存在骨膜素DNA或RNA的指征。雜交條件對于本領域技術人員來說是已知的，并且可在Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N. Y.，6. 3. 16. 3. 6，1991中找到。適度的雜交條件被定義為相當于在30°C下在2X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著在50°C下在1XSSC，0. SDS 中洗滌。高度嚴格的條件被定義為相當于在45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著在65°C下在0. 2XSSC，0. 1% SDS中洗滌。本發(fā)明還涵蓋(a)包含任何前述骨膜素相關的編碼序列和/或它們的補體(即， “反義”序列)的載體；(b)包含任何前述骨膜素相關的編碼序列的表達載體，該序列可操作性地連接于編碼序列的直接表達所需的任何轉錄/翻譯調控元件；(c)編碼除了骨膜素多肽之外的與骨膜素無關的序列的表達載體，諸如報告子、標記物、或融合于骨膜素的信號肽；以及(d)包含任何前述表達載體以及由此表達本發(fā)明的核酸分子的基因工程宿主細胞 (參見下文)。 重組核酸分子可以包含編碼骨膜素或具有異源信號序列的骨膜素的序列。全長骨膜素多肽、或其片段可以被融合于這樣的異源信號序列或另外的多肽。類似地，本發(fā)明的核酸分子能夠編碼骨膜素的成熟形式或包括促進分泌的外源性多肽的形式。
上文中提及的以及下文中進一步描述的轉錄/翻譯調控元件包括但不限于可誘導的和不可誘導的啟動子、增強子、操縱基因(operator)和本領域技術人員已知并且驅動或以其他方式調控基因表達的其他元件。這樣的調控元件包括但不限于巨細胞病毒hCMV 即刻早期基因、SV40腺病毒的早期或晚期啟動子、Iac系統(tǒng)、trt系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、 噬菌體A的主要操縱基因和啟動區(qū)、fd外殼蛋白的調控區(qū)(control region)、3_磷酸甘油酸酯激酶的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子、和酵母α-交配因子(a-mating factor)的啟動子。類似地，核酸可以形成編碼另外的多肽序列的部分雜合基因，例如，起標記物或報告子作用的序列。標記物和報告基因的實例包括內酰胺酶、氯霉素乙?；D移酶 (CAT)、腺苷脫氨酶(ADA)、氨基葡糖苷磷酸轉移酶(nec/，G4181)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、 潮霉素-B-磷酸轉移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)UacZ (編碼β -半乳糖苷酶)、和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(XGPRT)。與本發(fā)明的實踐相關的許多標準程序一樣，普通技術人員知曉其他有用的試劑，例如，能夠起到標記物或報告子功能的其他序列。通常，雜合多肽包括第一部分和第二部分；第一部分是骨膜素多肽，而第二部分是例如上文中所述的報告子或Ig 恒定區(qū)或Ig恒定區(qū)的一部分，例如，IgG^i重鏈的CH2和CH3結構域。其他的雜種可以包括促進純化的抗原標簽或His標簽?？梢杂糜诒景l(fā)明的目的的表達系統(tǒng)包括但不限于用包含本發(fā)明的核酸分子的重組噬菌體DNA、質粒DNA、或粘粒DNA表達載體轉染的微生物，如細菌(例如，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)；用包含本發(fā)明的核酸分子的重組酵母表達載體轉染的酵母(例如，酵母菌屬和畢赤酵母)；用包含本發(fā)明的核酸分子的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用包含骨膜素核苷酸序列的重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒 (CaMV)或煙草花葉病毒(TMV))感染或用包含骨膜素核苷酸序列的重組質粒表達載體(例如，Ti質粒)轉染的植物細胞系統(tǒng)；或包含含有衍生自哺乳動物細胞(例如，金屬硫蛋白啟動子)的基因組或衍生自哺乳動物病毒(例如，腺病毒晚期啟動子和痘苗病毒7. 啟動子)的啟動子的重組表達構建物的哺乳動物細胞系統(tǒng)(例如，COS、CH0、BHK、293、VERO, HeLa、MDCK、WI38和NIH 3T3細胞)。直接獲自哺乳動物和用質粒載體轉染或用病毒載體感染的原代或次代細胞也可用作宿主細胞。于是，用本發(fā)明的表達載體轉染或轉導的細胞可以通過本領域中已知的方法被用于例如大規(guī)?；蛐∫?guī)模地體外生產骨膜素多肽或其抗原片段。本質上，這樣的方法涉及在使多肽或抗原片段的生產最大化的條件下培養(yǎng)細胞并且從細胞或培養(yǎng)基中將其分離出來。骨膜素蛋白/多肽本發(fā)明的以及用于本發(fā)明的骨膜素蛋白/多肽包括具有和沒有信號肽的骨膜素。它們還包括重組形式和同種型。骨膜素分子的氨基酸序列可以與骨膜素分子的野生型序列相同。還涵蓋與骨膜素的野生型序列基本上相同的多肽。當應用于蛋白質時，術語“基本上同一(性) (substantial identity) ”可以意指兩個序列，當它們最佳比對時，例如通過使用缺省空位權重的GAP或BESTFIT程序，通常共有至少約70 %的序列同一性，可替換地至少約80 %、 85% ,90^^95%的序列同一性或更高。可替換地，多肽中的任一種可以包含諸如缺失、加入、或置換的突變。其所有要求是突變體骨膜素分子具有至少5% (例如，lO^JO^JO^、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%、甚至更高)的野生型骨膜素分子結合于特異于野生型骨膜素的抗體的能力。對于氨基酸序列，不相同的氨基酸殘基可由于保守氨基酸置換而不同。術語“保守置換”是指用另一個氨基酸來替代一個氨基酸，其中兩個氨基酸是具有某些共同性質的氨基酸基團(組)的成員。確定單獨的氨基酸之間的共同性質的有用途徑是分析同源生物體的相應蛋白之間的氨基酸變化的歸一化頻率(Schulz，G. E.和R. H. khirmer. ,Principles of Protein Mructure，Springer-Verlag)。根據(jù)這樣的分析，組內的氨基酸優(yōu)先彼此交換的氨基酸的組可以被確定，因此在它們對整個蛋白結構的影響方面彼此最為相似(Schulz， G. Ε.合 R. H. Schirmer. , Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。以這禾中方式限定的一組氨基酸基團的一個實例包括(i)帶電基團，由Glu和ASp、LyS、Arg和His 構成，( )帶正電荷的基團，由Lys、Arg和His構成，(iii)帶負電荷的基團，由Glu和Asp 構成，(iv)芳香基，由Wie、Tyr和Trp構成，(ν)氮環(huán)基團，由His和Trp構成，(vi)大的脂肪族非極性基團，由Val、Leu和Ile構成，(vii)極性較小的基團，由Met和Cys構成， (viii)小的殘基基團，由 kr、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 構成，(ix)脂肪族基團，由Val、Leu、Ile、Met和Cys構成，以及(χ)小的羥基基團，由Ser和Thr構成。多肽可以從天然來源(例如，血液，血清，血漿，諸如胰腺、肺、胎盤、或結腸組織的組織或細胞，或在癌性細胞或正常細胞中天然產生骨膜素多肽的任何細胞)純化。骨膜素分子可以是人類、非人靈長類(例如，猴)、小鼠、大鼠、豚鼠、牛、羊、馬、豬、兔、狗、或貓的那些分子。也可以通過標準化學方法來方便地合成更小的肽(長度小于100個氨基酸)。另外， 多肽和肽均可以通過標準的體外重組DNA技術和使用編碼適當?shù)亩嚯幕螂牡暮塑账嵝蛄械捏w內基因轉移(transgenesis)來生產。本領域技術人員公知的方法可以用來構建包含相關編碼序列和適當?shù)霓D錄/翻譯控制信號的表達載體。參見，例如，在Sambrook et al., Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第二版)[Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. ,1989]禾口 Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology [Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. , 1989]中描述的技術。重組骨膜素可以用于本發(fā)明的方法中。在圖3中提供了可用于本發(fā)明中的重組骨膜素的實例。本發(fā)明的蛋白和多肽還可以通過本領域已知技術由上文中討論的核酸分子中的
任一種來生產。本發(fā)明的多肽包括全長骨膜素的片段，其中這樣的片段還能夠再生胰腺組織。這樣的多肽片段可以包含至少15個(或30、50、100或150個)骨膜素蛋白的保守氨基酸的序列。該多肽片段包含在不存在蛋白的其他部分的情況下具有生物學活性的骨膜素的一部分。如本領域中已知的，經常的情況是，可以從蛋白的末端去除相對少量的氨基酸而不破壞活性。多肽或多肽片段可以是較大的蛋白的部分，諸如與第二蛋白或多肽的基因融合。 可替換地，該多肽或多肽片段可以例如借助于交聯(lián)劑而與第二蛋白結合。骨膜素或其多肽部分可以通過與聚合物的共價結合而被化學修飾。例如，可以這樣做以增加其循環(huán)半衰期。聚合物以及將它們連接于肽的方法示于美國專利號第 4，766，106號、第4，179，337號、第4，495，285號和第4，609，546號中。聚合物的實例是聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫下可溶于水并且具有通式R(0-CH2-CH2)n0-R，其中R可以是氫，或諸如烷基或鏈烷醇基之類的保護基團。該保護基團可以具有1至8個碳，并且可以是甲基。符號η是正整數(shù)，通常在1到1，000之間，并且可以在2到500之間。 PEG具有在1000到40，000之間的典型平均分子量，并且可以在2000到20，000之間，或在 3000到12，000之間。PEG可以具有至少一個羥基，并且可以具有末端羥基。藥物配方和給藥途徑包含骨膜素蛋白或其片段的藥物組合物可以用于治療胰腺功能不全。在另一方面，該藥物組合物可以包含根據(jù)本發(fā)明的骨膜素核苷酸序列。本發(fā)明的組合物可以利用一種或多種藥用載體以常規(guī)方式配制，例如口服、含服、 鼻內、腸胃外(例如，靜脈注射、肌肉注射或皮下注射)、局部或直腸給藥或以適合于通過吸入劑給藥的形式配制。該組合物可以直接被注射到胰腺、循環(huán)系統(tǒng)、或腹膜內空間中。給藥可以是外科插入包含該組合物的凝膠或基質。當使用液體配方時，多肽或核酸可以以不同的濃度或使用不同的配制劑進行配制。例如，這些配制劑可以包括油、聚合物；維生素、碳水化合物、氨基酸、鹽、緩沖劑、白蛋白、表面活性劑、或填充劑。碳水化合物包括糖或糖醇，諸如單糖、二糖、或多糖，或水溶性葡聚糖類。糖類或葡聚糖類可以包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、芽霉菌糖、糊精、α-和β-環(huán)糊精、可溶淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素、或它們的混合物。蔗糖是一個實例。糖醇被定義為具有-OH基團的(4至(8碳氫化合物， 并且包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨糖醇、丙三醇、和阿拉伯糖醇。甘露醇是一個實例。上文中提到的這些糖或糖醇可以單獨使用或組合使用。對于用量沒有固定的限制， 只要該糖或糖醇可溶于含水型制劑即可。糖或糖醇濃度通常在1. 0w/V%到7. 0w/V%之間， 并且可以在2.0W/v%到6.0W/v%之間。氨基酸包括卡尼汀、精氨酸和甜菜堿的左旋(L)形式；然而，可以加入其他氨基酸。聚合物包括平均分子量為2，000到3，000之間的聚乙烯砒咯烷酮(PVP)或平均分子量為3，000到5，000之間的聚乙二醇(PEG)。如果使用它們，則通常在凍干之前或重新配制(或復原，reconstitution)之后在組合物中使用緩沖劑以使溶液的PH變化最小?？梢允褂么蠖鄶?shù)任何生理緩沖劑，但檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、和谷氨酸鹽緩沖液或它們的混合物是典型的緩沖劑。濃度可以為0.01到0.3摩爾。也可以向配方中加入表面活性劑。在制備液體藥物組合物后，可以進行凍干以防止降解和保持無菌性。用于凍干液體組合物的方法對于本領域普通技術人員來說是已知的。，可在使用前用無菌稀釋劑(例如，林格氏溶液、蒸餾水或無菌鹽水)重新配制該組合物。重新配制后，優(yōu)選使用本領域技術人員已知的方法將組合物給予受試者。如本文中使用的“藥用賦形劑”是指可用于制備通常是安全、無毒并且不具有生物學性質或其他不期望性質的藥物組合物的賦形劑，并且包括獸醫(yī)應用以及人類藥物應用可接受的賦形劑。如在說明書和權利要求書中所使用的“藥用賦形劑”包括一種和多于一種這樣的賦形劑。實施例外科手術。在所有外科手術中，在手術45分鐘至1小時前，以0. 05mg/kg的劑量皮下給予手術小鼠稀釋的丁丙諾啡(0.03mg/ml)。用逐漸增加至5%的異氟烷在麻醉劑盒中誘導小鼠。通過Ohio Forane蒸發(fā)器(誘導盒)和異氟烷蒸發(fā)器(面罩)來遞送麻醉劑。 麻醉完成后，將小鼠轉移到具有1.5%的異氟烷面罩。剃掉手術區(qū)域的毛并且用Endure皂清洗，用無菌水沖洗并用葡萄糖酸氯己定溶液進行外科手術準備。BNP眼藥膏點在動物眼睛中以防止它們在麻醉期間脫水。在手術前皮下給予Iml的無菌鹽水。在手術期間，將小鼠保持在1.5%的異氟烷水平(如果有必要增加或減小)。完成手術后，將小鼠置于氧氣中約 1分鐘，然后看到它們一開始動就將它們放回到籠子中。為了除去胰腺組織，通過實施正中切口以進入腹腔。首先，使用10號手術刀片在腹部正中通過皮膚切開1至1. 5cm的切口。使用鑷子小心地將皮膚與腹壁分離以露出腹部的正中線。用鼠齒鉗提起該正中線并且用剪刀通過體壁制作小于Icm的小切口。定位后用鑷子通過切口提起脾胰葉(splenic pancreatic lobe)。用鑷子和卷棉子(cotton applicator)通過輕柔剝離(abrasion)來移開整個脾葉以及胃和十二指腸胰葉的遠端部分從而確保不損傷主靜脈或動脈。如果觀察到過度出血，則夾緊出血的部位幾分鐘以促進凝固。切除后，在十二指腸周圍僅保留一小部分(約30%)胰腺。外科手術切除的胰腺為總胰腺的大約70%，如通過在初步研究期間稱重切除的部分和剩余的部分所證實的。用外科縫合線(Johnson & Johnson)以兩或三次間斷縫合來閉合體壁。用兩根或三根外科U形釘(Fisher)來閉合皮膚。外科手術完成后，將小鼠置于氧氣中大約1分鐘，然后看到它們一開始動就將它們放回到籠子中。每隔一天分析血糖水平，檢查增加的葡萄糖的血糖水平。 此外，在手術一周后，每天向小鼠皮下給予0. 05mg/kg的丁丙諾啡。實施例1.利用重組骨膜素的胰腺再生為了說明骨膜素在胰腺再生中所起的作用，將重組骨膜素蛋白注射到胰腺中。將 BioVendor (RD172045100)提供的重組骨膜素蛋白重懸浮于鹽水中并用鹽水以IOng/μ 1的濃度稀釋。重組骨膜素蛋白(圖3所示的671個氨基酸序列)是在C末端處截短的人骨膜素蛋白，并且是所有四種已知同種型共有的序列的代表。將lOyldOOng或5yg/kg)直接注射到胰腺中。如上面所概述的，通過用中正切口暴露胰腺并且用Hamilton注射器將 10 μ 1重組骨膜素溶液(50ng/y 1)直接注射到胰腺中來實施直接注射。載體處理的動物接受相同量的在鹽水中稀釋的緩沖劑。在注射到胰腺中后，用縫合線來閉合體壁，并且用傷口夾來閉合皮膚，如在胰腺切除術之后進行的。在外科手術一周后，每天監(jiān)測小鼠并且皮下給予0.05mg/kg 丁丙諾啡。在外科手術后，以0.8mg/ml在飲用水中給予BrdU(Sigma)以連續(xù)地標記分裂細胞。在注射M小時后與鹽水注射相比時，骨膜素誘導廣泛的增殖。組織學研究表明該增殖在胰島、胰腺管和腺細胞之外發(fā)生并且定位于表達波形蛋白的細胞。在再生期間，骨膜素位于包圍細胞角蛋白7+、和Ecad+管狀復合物的胰腺的再生尖端。這些復合物是胰腺增殖的來源，如通過Ki67免疫染色所示出的。相對于其他的(resting)胰腺骨膜素mRNA，在胰腺切除術3天后骨膜素mRNA增加接近10倍。這可與胎兒發(fā)育期間僅三倍的增加相比。骨膜素注射3天后，表達波形蛋白的細胞數(shù)目實質上增加。這種增加局限于具有管狀復合物的區(qū)域，而在表達正常水平的波形蛋白的胰腺其他區(qū)域則不增加。然而，在骨膜素注射3天后，在表達波形蛋白的細胞內不再發(fā)生增殖，而在表達細胞角蛋白7的管狀復合物中則發(fā)生增殖。管狀復合物如在胰腺管、胰島和腺細胞中一樣表達上皮鈣粘附蛋白，但表現(xiàn)出增殖增加，如由增加的Ki67免疫染色所示出的。管狀復合物還表達胰腺先祖標記物 Pdx-I和Ngn3。還在管狀復合物之外而不是在緊鄰管狀復合物的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)Ngn3+細胞。 在管狀復合物的遠端區(qū)域中，不存在Ngn3+細胞的形成。
在注射骨膜素1周后，基質(stroma)增加，如通過相對于注射了鹽水胰腺的上皮鈣粘附蛋白陰性細胞的積累所注意到的。雖然在骨膜素注射的胰腺中僅保留少數(shù)管狀復合物，但是與注射鹽水的對照相比增殖是廣泛的。然而，現(xiàn)在增殖處于表達上皮鈣粘附蛋白的細胞中，而不是只在管狀復合物中。增殖在表達淀粉酶的腺細胞內發(fā)生，而在周圍基質中不存在。周圍基質呈現(xiàn)出BrdU的積累以及尺寸變化，其寬度在10 μ m至300 μ m之間變化。 基質的最大積累仍包含一些上皮鈣粘附蛋白陽性管狀復合物，然而，它們沒有骨膜素注射3 天后那么多。對于小鼠而言，大于500μ g/kg體重的劑量導致胰腺細胞的死亡增加，尤其是在分泌淀粉酶的外分泌細胞中。實施例2.使用腹膜內注射的胰腺再生。為了確定是否能夠以更小侵襲性途徑給予骨膜素而仍能夠誘導胰腺再生，與直接注射到胰腺中不同，以50 μ g/kg體重腹膜內注射來注射重組蛋白(BioVendor ；RD172045100)。骨膜素注射一周后，相對于注射鹽水的對照， 呈現(xiàn)出胰島細胞攝取的BrdU增加。此外，與注射鹽水的對照相比，如通過Ki67染色所示出的，胰島中的增殖增加。利用注射有骨膜素或鹽水的MIP-GFP小鼠的FACS分析觀察到了分泌胰島素的細胞的數(shù)量增加約2倍(η = 3)。與注射鹽水的同胞崽對照相比，注射了骨膜素的小鼠表現(xiàn)出胰腺β-細胞的數(shù)目增加超過兩倍。實施例3.利用重組骨膜素在STZ誘導的糖尿病中的胰腺再生。鏈脲霉素(STZ) 選擇性靶向并破壞哺乳動物體內的胰腺β-細胞。它可以被用來生產用于1型糖尿病的動物模型。為了在小鼠中誘導糖尿病，每隔一天腹膜內注射100mg/kg的STZ直到小鼠患上糖尿病，如在 Gross (Gross, J. R. et al. (2002) Diabetes, 51 :2227-32)和在 Craven (Craven， P.A.et al. (2001) Diabetes, 50 :2114-25)中描述的 C57BL/6J 背景中描述的。在首次 STZ 注射(第0天)后，每天獲得血糖水平以確定小鼠的糖尿病狀況。在一種可替換的方案中， 通過持續(xù)5天每天向小鼠注射50mg/kg的STZ來誘導糖尿病，其中每隔一天分析血糖水平。 用改善健康和壽命所需的胰島素來治療糖尿病小鼠。為了確定骨膜素是否能夠防止STZ誘導的糖尿病，在STZ處理后在小鼠中注射重組骨膜素(BioVendor ；RD172045100)。在如上所述的STZ注射后，以10mg/kg至90mg/kg 小鼠體重的不同濃度向STZ處理的小鼠腹膜內(IP)注射重組骨膜素。每隔一天分析血糖水平。如果骨膜素處理的小鼠保持正常的血糖水平，而它們的非骨膜素處理的同胞仔對照小鼠患上糖尿病，則確定骨膜素能夠防止STZ誘導的糖尿病。當注射有STZ和骨膜素時，15 只動物中的11只能夠保持正常血糖水平(圖4)。改實驗還建議在小鼠中IP注射的骨膜素的最佳劑量似乎在30-70mg/kg體重之間。在小鼠中IP注射的骨膜素的優(yōu)選劑量似乎在 40-60mg/kg體重之間。實施例4.編碼骨膜素同種型PANC的DNA的分離。在液氮中對胰腺組織實施快速冷凍，并且用冷凍研缽和研杵進行快速研磨。在解凍之前，使經研磨的胰腺組織與Iml的 TRIZOL試劑(Invitrogen cat#15596-018)混合。然后按照制造商的說明分離來自胰腺組織的RNA。按照制造商的說明使用RNA PCR Core Kit (Applied Biosystem cat#N808-0143) 對RNA樣品實施逆轉錄。試劑盒中提供的寡聚d(T)和隨機六聚體引物用來引發(fā)逆轉錄(RT) 反應以產生cDNA。用于擴增來自上面產生的cDNA的骨膜素的羧基末端的PCR反應包括以下試劑5 μ 1 cDNA、50nM 的正向 PCR 引物 AAACTCCTCTATCCAGCAGA(SEQ ID NO 4)、50nM 反向 PCR 弓丨物AACGGCCTTCTCTTGATCGTCT(SEQ ID N0:5)、500nM dNTP、lmMMgCl2、5 μ 1 的 IOx 反應緩沖液以及0.25μ1 TAQ聚合酶(Invitrogencat#10342-020)。將反應稀釋至50μ1。用于進行 PCR反應的條件如下25次循環(huán)(在95°C下60秒，在60°C下60秒，以及在72°C下60秒)。 然后在2%的瓊脂糖凝膠上進行反應，并使用干凈的手術刀從凝膠中切取在462bp處觀察到的顯著條帶。使用QIAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagencat把8706)并按照制造商的說明從凝膠中提取DNA片段。在凝膠提取后，在2個單獨的反應中使用上述的正向和反向PCR引物對DNA片段進行測序。更具體地，使用Memcore (0HRI，渥太華，ON)的Applied Biosystem3730DNA分析儀，利用2 μ M的引物對IOng的PCR模板進行測序。實施例5.注射的骨膜素的安全性。為了確定骨膜素是否可以被安全地給予，向小鼠注射重組蛋白(BioVendor ；RD172045100)，從八周齡開始，對于六周中的每一周，通過以 0、2、4或10yg/kg體重腹膜內注射一次。13周前沒有檢測到可見的腫瘤。每周監(jiān)測每只小鼠的血糖水平。在下面的表1中示出了每組小鼠(每組6只)的平均血糖水平，單位是 mM/L0標準偏差的范圍為0. 31到2. 06mM/L。
權利要求
1.一種通過給予骨膜素來再生胰腺組織的方法。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述骨膜素是具有圖3中給出的序列、或具有由具有核苷酸序列pane的核苷酸編碼的序列的重組骨膜素。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述再生的胰腺組織包含β-細胞。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，用于治療胰島素依賴性糖尿病。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，通過注射進行給藥。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，所述注射是注射到腹膜內空間中、注射到循環(huán)系統(tǒng)中、或者直接注射到胰腺中。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述給藥是外科插入包含所述骨膜素的凝膠或基質。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述再生的組織釋放胰島素。
9.一種通過給予編碼骨膜素蛋白的核苷酸序列來再生胰腺組織的方法。
10.一種編碼骨膜素蛋白的核苷酸序列，所述序列包括 pane ；與pane同源的核苷酸序列；或與pane的補體雜交的核苷酸序列。
11.一種通過給予權利要求10所述的核苷酸序列來再生胰腺組織的方法。
12.—種具有由權利要求10所述的核苷酸序列編碼的序列的肽。
13.—種通過給予權利要求12所述的肽來再生胰腺組織的方法。
14.一種載體，包括 pane ；與pane同源的核苷酸序列；或與pane的補體雜交的核苷酸序列。
15.一種宿主細胞，包括權利要求14所述的載體。
16.一種通過給予骨膜素、權利要求10所述的核苷酸序列、或權利要求12所述的肽來治療、或預防糖尿病或外分泌胰腺功能不全的發(fā)作的方法。
17.骨膜素、權利要求10所述的核苷酸序列、或權利要求12所述的肽在治療、或預防糖尿病或外分泌胰腺功能不全的發(fā)作中的應用。
18.骨膜素、權利要求10所述的核苷酸序列、或權利要求12所述的肽在制備用于治療、 或預防糖尿病或外分泌胰腺功能不全的發(fā)作的藥物中的應用。本發(fā)明如上所述。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種使用重組骨膜素蛋白來再生胰腺組織的方法、編碼所述骨膜素的核酸以及包括所述骨膜素的藥物組合物。本發(fā)明還教導了編碼骨膜素同種型(panc)的核酸的分離。
文檔編號C12N5/071GK102209784SQ200980144398
公開日2011年10月5日 申請日期2009年9月8日 優(yōu)先權日2008年9月8日
發(fā)明者喬納森·斯米特, 邁克爾·魯?shù)履峄?申請人:渥太華醫(yī)院研究所