專利名稱：用于乙醇生產(chǎn)的孢子形成缺陷嗜熱微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于生產(chǎn)乙醇的微生物的生產(chǎn)。本發(fā)明具體地涉及為用于防止孢子形成的微生物修飾。
背景技術(shù)：
孢子形成是一個(gè)多階段的發(fā)育過程，負(fù)責(zé)使生長細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸环Q作孢子或內(nèi)生孢子的休眠細(xì)胞類型。孢子適于在不利條件下散布并且生存很長時(shí)間，還構(gòu)成很多植物、藻類和細(xì)菌(如芽孢桿菌屬種)生活周期的一部分。進(jìn)入孢子形成過程的主要調(diào)節(jié)蛋白是DNA結(jié)合蛋白SpoOA(階段0的孢子形成蛋白A)，它是轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白家族(response regulator family)的成員。各種其他基因——包括編碼5種組氨酸自身激酶(KinA、KinB, KinC, KinD和KinE) 和2種反應(yīng)蛋白(SpoOB和SpoOF)的基因——也參與控制孢子形成的啟動(Molle et al. ；Mol. Microbiol. ；2003，50 (5) 1683-1701)。SpoOA 的活性由多組分磷酸接力傳遞 (phosphorelay)控制，所述磷酸接力傳遞識別并且整合環(huán)境信號以啟動孢子形成(Trach KA, et al ；Mol. Microbiol. 1993 ；8(1) :69_79)。當(dāng) SpoOA-P 的調(diào)節(jié) N-末端結(jié)構(gòu)域磷酸化時(shí)，SpoOA-P與被稱為“OA-盒”的DNA序列元件結(jié)合，所述OA-盒激活參與孢子形成的基因。SpoOA的C-末端結(jié)構(gòu)域的缺失(沒有活性，直到N-末端被磷酸化)已被證明導(dǎo)致孢子形成陰性表型(Rowe-Magnus DA, et al J. Bacteriol. ；2000 ；182 (15) :4352_4355)。還已發(fā)現(xiàn)SpoOA會直接或間接地影響枯草芽孢桿菌(B. subtilis)中超過500個(gè)基因的表達(dá)的活化或抑制，并且因此通過受它控制的調(diào)節(jié)基因間接介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的整體模式(Molle et al. ；Mol. Microbiol. ；2003，50(5) :1683_1701)。孢子形成受分解代謝物的抑制，由此葡萄糖或其他易代謝的碳源的存在會抑制野生型細(xì)胞的孢子形成。具體地，已知葡萄糖會抑制spoOA和spoOF的轉(zhuǎn)錄(MyseliwiecJH et al J.Bacterial. ；1991 ；173(6) :1911_1919)。在商業(yè)發(fā)酵過程中，由于兩個(gè)主要原因孢子是不合需要的，所述原因?yàn)?.孢子形成暫停了生物的活性代謝(active metabolism)，導(dǎo)致所需代謝產(chǎn)物的形成的減少或終止；并且2.形成孢子的微生物更難處理和控制防范，因此需要因環(huán)境原因(包括健康和安全)避免商業(yè)過程微生物的存活，并且還需要防止商業(yè)菌株不受控地釋放。細(xì)菌代謝合適底物的一般過程是糖酵解，所述糖酵解是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸并且產(chǎn)生ATP的一系列反應(yīng)。代謝能量產(chǎn)生過程中丙酮酸的歸宿因微生物和環(huán)境條件而不同。丙酮酸的4個(gè)主要反應(yīng)在圖5中顯示。首先，在有氧條件下，很多微生物會利用檸檬酸循環(huán)以及丙酮酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化(由丙酮酸脫氫酶(PDH)催化)產(chǎn)生能量。第二，在厭氧條件下，一些產(chǎn)乙醇生物能通過將丙酮酸脫羧轉(zhuǎn)化為乙醛(由丙酮酸脫羧酶(PDC)催化)并且隨后通過用NADH將乙醛還原為乙醇(由醇脫氫酶(ADH)催化)來進(jìn)行成醇發(fā)酵(alcoholic fermentation)。第三個(gè)反應(yīng)也發(fā)生在厭氧條件下，是將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，由丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)催化。乙酰輔酶A隨后被乙醛脫氫酶(AcDH)轉(zhuǎn)化為乙醛，乙醇是通過還原乙醛 (由ADH催化)產(chǎn)生。第四個(gè)過程是丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗幔@通過乳酸脫氫酶(LDH)的催化發(fā)生。將微生物用于生產(chǎn)乙醇備受關(guān)注，其中使用在自然條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵的微生物或使用整合了丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶基因的重組微生物。W02008/038019公開了包含使天然LDH和PFL基因失活并且上調(diào)PDC、PDH和ADH 基因以促進(jìn)乙醇形成的修飾的微生物。需要進(jìn)一步改善用微生物進(jìn)行的乙醇生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于這樣一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)，即對孢子形成嗜熱微生物中spoOA基因的抑制導(dǎo)致所述微生物的乙醇耐受性增強(qiáng)，并且代謝也增強(qiáng)，這致使代謝終產(chǎn)物(如乙醇)的生產(chǎn)
率提高。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，嗜熱微生物包含與野生型相比使孢子形成減少的修飾，其中第一個(gè)修飾使天然spoOA基因失活。所述微生物還可以通過失活天然乳酸脫氫酶和任選的丙酮酸甲酸裂解酶來進(jìn)一步加以修飾以提高乙醇生產(chǎn)?？蛇M(jìn)行進(jìn)一步修飾以上調(diào)天然丙酮酸脫氫酶基因或引入活性丙酮酸脫羧酶基因。所述微生物可被進(jìn)一步修飾以通過提高淀粉酶的表達(dá)來增強(qiáng)從淀粉生產(chǎn)乙醇。與野生型相比，本發(fā)明的微生物表現(xiàn)出提高的乙醇生產(chǎn)和增強(qiáng)的乙醇耐受性。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括在合適的條件下，在C3、C5、C6 糖或它們的寡聚物存在的情況下培養(yǎng)根據(jù)上文定義的微生物。


參考附圖來說明本發(fā)明，其中圖 1 是 SpoOA 核苷酸序歹Ij (SEQ ID No. 1)；圖2 是 SpoOA 氨基酸序列(SEQ ID No. 2)；圖 3 圖示了質(zhì)粒 pTM014(SEQ ID No. 4)；圖4圖示了 PDH復(fù)合體的假定啟動子區(qū)域和基因；圖5圖示了丙酮酸的4個(gè)主要反應(yīng)；圖 6 圖示了 pGEM -T Easy 載體；圖 7 圖示了質(zhì)粒 pTM031 (SEQ ID No. 3)；圖8圖解闡述了來自從熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(G. thermoglucosidasius)中分離的基因組DNA的4480bp短序列(sequence read)的spoOA和周圍基因的排布；圖9描繪了破壞spoOA基因的兩種方法；圖10圖示了與原始spoOA基因相比，spoOA敲除的預(yù)期PCR產(chǎn)物大?。粓D11是示出TM242在包含8% w/v纖維二糖和2%酵母提取物的培養(yǎng)基中發(fā)酵特征變化的曲線圖，其中條件是將乙醇蒸汽從發(fā)酵培養(yǎng)液中分隔開來(“脫氣”)和未將它從所述培養(yǎng)液中分隔開來；以及圖12a是示出TM242在包含8% w/v纖維二糖和2% w/v酵母提取物的培養(yǎng)基中發(fā)酵特征的曲線圖，而圖12b示出TM444在相同培養(yǎng)基中的發(fā)酵特征。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及用于防止孢子形成的對嗜熱微生物的修飾。本發(fā)明基于這樣的意外發(fā)現(xiàn)，即對孢子形成的抑制與增強(qiáng)的乙醇耐受性有關(guān)，能夠使微生物在分批發(fā)酵過程中生產(chǎn)的乙醇產(chǎn)量更大。非孢子形成微生物還有處理優(yōu)勢，因?yàn)榕c孢子產(chǎn)生微生物相比它們更容易處理和控制。此外，由于代謝增強(qiáng)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)孢子形成被防止時(shí)發(fā)酵以更快的速度進(jìn)行至完成?？赏ㄟ^修飾微生物以使天然spoOA基因失活，優(yōu)選通過缺失spoOA基因的至少一部分或通過定向破壞所述基因來防止孢子形成。優(yōu)選地，由于所述修飾，所述微生物是完全地孢子形成缺陷的。spoOA基因的編碼序列(SEQ ID No. 1)在圖1中示出。由spoOA基因編碼的多肽的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)在圖2中示出。使用該編碼序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)?spoOA作為目標(biāo)，通過不同機(jī)制來使所述基因失活。優(yōu)選通過使spoOA基因序列或它的一部分(優(yōu)選C-末端結(jié)構(gòu)域)缺失來使所述基因失活?；谌绫疚墓嫉年P(guān)于所述基因序列的知識，使所述基因失活的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的?？梢允顾龌蛐蛄腥笔Щ蛘咄ㄟ^額外DNA的插入來使其失活以破壞基因表達(dá)。定向基因破壞的方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括例如將溫度敏感質(zhì)粒整合至染色體上的目標(biāo)基因中。質(zhì)粒的整合可使所述目標(biāo)基因完全缺失，或者可用所述基因的無功能部分代替所述完整基因。這能夠通過以下方式來實(shí)現(xiàn)分離包含目的基因的序列，切除所述基因的一部分，擴(kuò)增剩余片段，將這些片段克隆至溫度敏感質(zhì)粒，然后用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化目標(biāo)微生物。本發(fā)明不局限于使spoOA基因失活的具體方法，但是在“實(shí)施例”部分提供了對使用質(zhì)粒PTM031的合適技術(shù)的詳細(xì)描述。所述微生物可以是任一嗜熱微生物，但是所述微生物優(yōu)選是芽孢桿菌屬種。具體地，所述微生物優(yōu)選是地芽孢桿菌屬(Geobacillus)種的野生型微生物，特別是熱葡糖苷酶地芽抱桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所選用于進(jìn)行修飾的微生物被稱作“野生型”，即它們除了不含本文描述的變異之外，還不含任何其他的實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的變異。所述微生物可從預(yù)計(jì)含有嗜熱生物的環(huán)境樣本中分離得到。分離的野生型微生物會有孢子形成能力。此外， 分離的野生型微生物具有從丙酮酸產(chǎn)生乙醇的能力，但是未被修飾，乳酸可能是主要的發(fā)酵產(chǎn)物。所述分離物因其能在高溫下依靠己糖和/或戊糖及其寡聚物生長的能力而被篩選出ο本發(fā)明的微生物優(yōu)選具有使其能被用于發(fā)酵過程的某些合乎需要的特征。優(yōu)選地，所述微生物應(yīng)不具有限制性系統(tǒng)，由此不需要進(jìn)行體內(nèi)甲基化。此外，所述微生物應(yīng)對至少3% w/v乙醇、優(yōu)選5-10% w/v乙醇和最優(yōu)選最多達(dá)20% w/v乙醇穩(wěn)定。所述微生物應(yīng)具有利用(3丄5和(；糖(或它們的寡聚物)——包括纖維素、纖維二糖、半纖維素、淀粉和木聚糖——作為底物的能力。所述微生物優(yōu)選是可高頻轉(zhuǎn)化的。此外，所述微生物應(yīng)該在連續(xù)培養(yǎng)中具有能支持0. ^T1及以上稀釋速率的生長速率。所述微生物是嗜熱生物并且會在40°C _85°C的溫度范圍內(nèi)生長。所述微生物優(yōu)選在50°C-70°C的溫度范圍內(nèi)生長。此外，需要所述微生物在pH 8或更低的pH下、特別pH 4. 5-pH 6. 9 下生長。本發(fā)明的優(yōu)選微生物在本文中確定為TM443和TM444，每種都保藏在NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate,Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA，NCIMB另I」 為 No. 41591 和 41588。本發(fā)明所述的嗜熱微生物還可被進(jìn)一步修飾以破壞乳酸脫氫酶基因(LDH)的表達(dá)。使乳酸脫氫酶基因失活有助于防止丙酮酸分解為乳酸，并且因此促進(jìn)(在合適的條件下)丙酮酸分解為乙醇，其中使用丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶。優(yōu)選地，通過在乳酸脫氫酶基因內(nèi)的缺失或所述基因的缺失破壞該基因。乳酸脫氫酶的核酸序列現(xiàn)在是已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用該序列來以乳酸脫氫酶基因?yàn)槟繕?biāo)以通過不同的機(jī)制使所述基因失活?？赡芡ㄟ^轉(zhuǎn)座子插入來使乳酸脫氫酶基因失活。但是，優(yōu)選通過缺失所述基因序列或所述基因序列的部分來使乳酸脫氫酶基因失活。優(yōu)選缺失，因?yàn)檫@避免了所述基因序列再活化的難題，所述難題是使用轉(zhuǎn)座子滅活時(shí)經(jīng)常遇到的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，乳酸脫氫酶基因是通過溫度敏感質(zhì)粒的整合而失活，所述整合實(shí)現(xiàn)了所述質(zhì)粒和所述微生物染色體之間的天然同源重組或整合。所述質(zhì)粒優(yōu)選是pTM014(SEQ ID No. 4)，它在圖3中示出。染色體整合體可根據(jù)它們對抗菌劑的抗性而被篩選出來。向所述乳酸脫氫酶基因內(nèi)的整合可通過單交換重組事件或通過雙(或多) 交換重組事件發(fā)生。所述微生物還可被修飾以上調(diào)丙酮酸脫氫酶基因(PDH)。上調(diào)丙酮酸脫氫酶基因促進(jìn)丙酮酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，乙酰CoA隨后可被用于在合適的條件下生產(chǎn)乙醛并且最終產(chǎn)生乙醇(使用乙醛脫氫酶)。上調(diào)PDH的另一個(gè)益處是降低了對葡萄糖攝取和糖酵解有抑制作用的丙酮酸水平。這會進(jìn)一步促進(jìn)乙醇生產(chǎn)。PDH是大的酶復(fù)合體，包含3 個(gè)單元——El 丙酮酸脫羧酶(EC 1.2.4. 1，不是EC 4. 1. 1. 1) ；E2 二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙酰酶；和E3 二氫硫辛酰胺脫氫酶。所述復(fù)合體需要一些輔因子，包括NAD、FAD、輔酶A硫辛酸和焦磷酸硫胺素(TPP)。四個(gè)基因編碼所述復(fù)合體，因?yàn)镋l單元是α和β亞基的異二聚體，并且這四個(gè)基因通常被描述為pdhA、pdhB、pdhC和pdhD (分別對應(yīng)El α、ΕΙ、Ε2β 和Ε3)。PDH的El單元以如同PDC (EC4. 1. 1. 1)需要TPP —樣需要ΤΡΡ，并且催化類似的脫羧反應(yīng)，但是是在輔酶A和硫辛酸——由其他酶單元攜帶的——存在的條件下，產(chǎn)物是乙酰輔酶A而不是乙醛。但是，已測量了 El單元未與PDH中的其他單元復(fù)合時(shí)的PDC活性 (Lessard&Perham ；The Journal of Biological Chemistry ； 1994,269 ； 14,10378-10383 ； Tomar et al ；Applied Microbiology and Biotechnology ；2003,62,76-82 ；Frank et al ； Science ；2004，306 ；Oct 29，872-876，supplementary data)。因此，EC 1. 2. 4. 1 的 PDC 活性可通過上調(diào)PDH來加以增強(qiáng)，這樣使得除了乙酰輔酶A外還產(chǎn)生乙醛。還試圖增強(qiáng)PDH活性以除去在LDH失活菌株中觀察到的丙酮酸瓶頸，以使得可以產(chǎn)生更多的乙醇并且使得作為副產(chǎn)物的乙酸和甲酸更少。為此目的，使用標(biāo)準(zhǔn)的“基因組步移”(genome walking)技術(shù)分離PDH基因和周圍序列。大約8. Skb的DNA被分離、測序并且發(fā)現(xiàn)包含圖4和表1中所示的以下基因。表 1
基因位置(bp)提出的功能框(5，和3’的象基酸)大小(氛基酸)Pdft746-192肽去曱?；?3 (MIT - IER)184ονβ868-1497未知定的蛋白質(zhì)+1 (MQR - IWK)209pdhA(a)1875-2984丙酮酸脫氫酶的α-亞基+3 (MGA - ESK)369ρΜΑ(β)3003-3965丙酮酸脫氫酶的β-亞基+3 (MIQ - INF)320pdhB4058-5368二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙酰酶+2 (VAF - MEA)436Ipd5373-6785硫辛酰胺脫氫酶+3 (MW - ISK)470orp7432-6833未知-假定的蛋白質(zhì)-1 (MNK-CTE)199οτβ7964-8647轉(zhuǎn)座·+2 (MDL -SPP)227假定的啟動子區(qū)域在圖4中示出(箭頭)——一個(gè)是PdhA起點(diǎn)的上游，第二個(gè)可能的啟動子在PdhB前面?？莶菅挎邨U菌中PDH簇中的第二啟動子的在前實(shí)例已有報(bào)道(Gao et al Journal of Bacteriology，2002，184 10，2780-2788)，但是大部分被描述的PDH基因簇僅有在所述簇上游的一個(gè)啟動子(Neveling et al ；Biochimica Acta ； 1998 1385.367-372)。上調(diào)可使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)進(jìn)行。具體地，可通過在PDH復(fù)合體上游引入合適的啟動子或增強(qiáng)子序列來進(jìn)行上調(diào)。已知所述酶復(fù)合體可在有氧和厭氧條件下工作(Carlsson et al ；Infection and Immunity ； 1985,49 (3) :674-678)，但是它一般被認(rèn)為是需氧酶(Ch 15 ；Principles of Biochemistry ;Lehninger, Nelson&Cox ;2ndEd, Worth Publishers, New York,1993, P447)，丙酮酸甲酸裂解酶(PEL)是它的厭氧對應(yīng)物。這兩種酶都將在糖酵解中產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A以進(jìn)入TCA循環(huán)，但是所述循環(huán)僅在有氧條件下徹底地進(jìn)行。但是，由于需要使用厭氧條件，本發(fā)明優(yōu)選使用在厭氧條件下起作用的啟動子。因此，可使用被認(rèn)為在厭氧條件下起作用的酶啟動子，實(shí)例是LDH啟動子(來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌 (G. stearothermophilus) NCA1503 的 P_ldh)、PFL 啟動子(來自蠟狀芽孢桿菌 ATCC14579 和熱葡糖苷酶地芽孢桿菌NCIMBl 1955的P_pf 1)和鐵氧還蛋白啟動子(來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌DSM13M0的P_ferrA)，如以引用方式納入本文的PCT/GB2007/03699所述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，引入另一個(gè)修飾以增強(qiáng)PDC活性，從而促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛。這可以通過使E2(EC 2.3.1.1 失活進(jìn)行。失活可以類似使LDH失活的方式進(jìn)行，但以E2基因作為破壞目標(biāo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物包含使丙酮酸甲酸裂解酶失活的修飾，從而防止/減少丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A和甲酸。丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)是丙酮酸脫氫酶 (PDH)的“厭氧對應(yīng)物”并且將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A和甲酸(參見圖6)。盡管乙酰輔酶A可通過乙醛脫氫酶(AcHD)轉(zhuǎn)化為乙醇，但是甲酸是不需要的副產(chǎn)物，它可能抑制產(chǎn)乙醇生物的生長。選擇PFL作為敲除的目標(biāo)以促進(jìn)向乙醇產(chǎn)生方向的代謝流，并且改善其余乙醇合成路線的氧化還原平衡。此工作的另一個(gè)益處是消除甲酸的產(chǎn)生。PFL活性可通過轉(zhuǎn)座子插入、基因缺失或部分基因缺失而失活，以產(chǎn)生不依賴于針對所述改變表型的持續(xù)進(jìn)行抗生素選擇的突變體。但是，丙酮酸甲酸裂解酶基因優(yōu)選通過缺失所述基因序列或所述基因序列的部分而失活。優(yōu)選缺失，因?yàn)檫@避免了所述基因序列再活化的難題，所述難題是使用轉(zhuǎn)座子滅活時(shí)經(jīng)常遇到的。在該實(shí)施方案中，所述微生物優(yōu)選包含乳酸脫氫酶失活和丙酮酸脫氫酶上調(diào)，這樣使得乙醇生產(chǎn)在厭氧條件下得到提高。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述微生物還包含上調(diào)的丙酮酸脫羧酶和/或醇脫氫酶基因。這些基因的表達(dá)致使酶的產(chǎn)生，所述酶使代謝改向從而使得乙醇成為主要發(fā)酵產(chǎn)物。如果PDC基因是EC4. 1. 1. 1，則所述基因?qū)⑹钱愒吹牟⑶铱杀徊迦氡磉_(dá)盒中，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的。如果PDC基因是ECl. 2.4. 1，則它可以是上調(diào)的同源基因。ADH基因可以是同源或異源的。如果使用天然基因，則可通過本領(lǐng)域已知的方法使其上調(diào)。優(yōu)選PDC 和ADH都在所述微生物中表達(dá)。所述基因可從通常進(jìn)行厭氧發(fā)酵的微生物——包括發(fā)酵單孢菌屬(Zymomonas)種，包括運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)——中獲得。基因制備和摻入微生物的方法是本領(lǐng)域已知的，例如在hgram等， Biotech&BioEng, 198 ；58 (2 and 3) :204-214 和 US5916787 中，每份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以引用的方式納入本文。所述基因可被引入質(zhì)粒或被整合進(jìn)入染色體，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的。本發(fā)明的嗜熱微生物可被進(jìn)一步修飾以與野生型相比增加淀粉酶基因的表達(dá)。這樣的修飾在W02009/022158(其內(nèi)容以引用的方式納入本文)中有詳細(xì)描述。這使得所述微生物可水解淀粉為葡萄糖單元單元，所述葡萄糖單體單元隨后可被用作糖酵解底物，用于形成丙酮酸，隨后形成乙醇。因此該修飾使得可提高乙醇從便宜、豐富、粗制植物材料中的生產(chǎn)。增強(qiáng)淀粉酶表達(dá)和酶活性的方法包括使用強(qiáng)上游啟動子以調(diào)節(jié)所述基因的轉(zhuǎn)錄、 摻入額外的比天然淀粉酶基因更高頻表達(dá)的淀粉酶基因或者表達(dá)更活躍的淀粉酶基因。術(shù)語“強(qiáng)啟動子”在本文中被定義為表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)至超過細(xì)胞內(nèi)可溶蛋白0. 5%的水平的啟動子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，異源淀粉酶基因編碼α-淀粉酶(α-1，4_葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3. 2. 1. 1)。優(yōu)選地，所述淀粉酶基因是來自地芽胞桿菌屬種，特別是嗜熱脂肪地芽孢桿菌。已經(jīng)闡明了 α -淀粉酶基因的編碼序列，并且分離和擴(kuò)增所述基因的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。為了使本發(fā)明的微生物能夠表現(xiàn)出比野生型更高的淀粉酶表達(dá)，優(yōu)選將所述淀粉酶基因置于強(qiáng)啟動子的控制之下，所述強(qiáng)啟動子在利于嗜熱微生物生產(chǎn)乙醇的低程度充氣或厭氧條件下起作用。所述啟動子優(yōu)選地是Idh啟動子并且可以是自體同源的，但是優(yōu)選地是異源的，并且最優(yōu)選地來自與所述淀粉酶基因相同的種。合適啟動子的實(shí)例包括但不局限于來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌NCA1503的P_ldh、來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌DSM13M0 的P_ferrA和來自蠟狀芽孢桿菌(B. cereus) ATCC14579的P_pfl。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一系列不同的強(qiáng)啟動子被置于所述淀粉酶基因的上游以進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)。合適的強(qiáng)啟動子的實(shí)例包括但不局限于甘油醛-3-磷酸啟動子 (P_GAPDH)和來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(G. stearothermophilus)NCA 1503的淀粉酶啟動子。P_ldh的核酸序列也是已知的，并且克隆和裝配所述啟動子序列至淀粉酶基因上游的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述啟動子/淀粉酶序列可被克隆至合適的包含多個(gè)限制性位點(diǎn)的質(zhì)?；虮磉_(dá)載體中。有很多市售的合適表達(dá)載體，如PGEM -T fesy載體(圖6)?？墒褂孟拗菩詢?nèi)切酶將P_ldh/淀粉酶構(gòu)建體切割成特定片段，所述片段可被連接至如pTM031 (圖7，SEQ ID No. 3)的溫度敏感質(zhì)粒的相應(yīng)限制性位點(diǎn)中，可使用丙酮酸甲酸裂解酶敲除質(zhì)粒。隨后包含所述淀粉酶基因/Idh啟動子的質(zhì)粒構(gòu)建體可被電穿孔至本發(fā)明的微生物中，隨后與基因組DNA同源重組。染色體整合體可基于它們對抗菌劑——如氨芐青霉素或卡那霉素的抗性而被選出。淀粉酶活性還可從淀粉空斑區(qū)(zone of starch clearing)看出，例如在平板分析中。所述培養(yǎng)基可優(yōu)選地包含至少 Λ淀粉，優(yōu)選至少10% w/v淀粉，最優(yōu)選至少 20%W/v淀粉。所述淀粉可以是可溶的或不可溶的(例如谷物淀粉)。現(xiàn)在參考附圖，在以下實(shí)施例中描述本發(fā)明的實(shí)施方案。通過實(shí)施例描述本發(fā)明但本發(fā)明不局限于實(shí)施例。實(shí)施例構(gòu)建兩個(gè)不同的SpoOA敲除構(gòu)建體以考慮目標(biāo)spoOA鄰近的其他孢子形成基因， 所述其他孢子形成基因可在框外spoOA破壞時(shí)在轉(zhuǎn)錄方面受到影響，如圖8所示。因此如圖9所示，制造了框外和框內(nèi)敲除盒。所述框外盒是通過以下方式產(chǎn)生的 除去所述spoOA基因的一段區(qū)域并代之以經(jīng)工程改造的NotI限制性位點(diǎn)，以使得能夠雜交用于對包含spoOA缺失的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物；而所述框內(nèi)盒是通過除去天然存在的150bp MscI-MscI片段來構(gòu)建的。將得到的片段克隆至pTM031，pTM031是來自插入pUC19中的EcoRI/SnaBI pUBllO 片段的5. Ikb質(zhì)粒。pTM031的質(zhì)粒圖譜在圖3中示出，pTM031的核酸序列與SEQ ID No. 7 對應(yīng)。核苷酸1-239、洸；34-2791和沘48_5082來自pUC19，核苷酸對0_洸33來自pUBllO， 剩余的核苷酸07924848)與多克隆位點(diǎn)(MCS)對應(yīng)。然后將得到的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化含有下文描述的其他修飾的地芽孢桿菌微生物。在如下所述的多種菌株背景中使用通過篩選雙交換突變體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化、初步整合和穩(wěn)定的方
法。
熱葡糖苷酶:地芽孢桿菌菌株背景
權(quán)利要求
1.一種嗜熱微生物，包含與野生型相比孢子形成減少的修飾。
2.權(quán)利要求1的微生物，其中所述修飾使天然spoOA基因失活。
3.權(quán)利要求2的微生物，其中所述修飾包括缺失所述spoOA基因的至少一部分。
4.權(quán)利要求3的微生物，其中所述修飾還包括用編碼限制性位點(diǎn)的DNA代替所述 spoOA基因的缺失部分。
5.權(quán)利要求4的微生物，其中所述限制性位點(diǎn)是NotI限制性位點(diǎn)。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物是地芽孢桿菌屬(Geobacillus)種。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物是熱葡糖苷酶地芽孢桿菌 (Geobacillus thermoglucosidasius)0
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，還包含使天然乳酸脫氫酶基因失活的修飾。
9.權(quán)利要求8的微生物，其中所述乳酸脫氫酶基因或其一部分已缺失。
10.權(quán)利要求8或9的微生物，其中所述微生物在所述乳酸脫氫酶基因中不包含整合元件。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，還包含使天然丙酮酸甲酸裂解酶基因失活的修飾。
12.權(quán)利要求11的微生物，其中所述丙酮酸甲酸裂解酶基因或其一部分已缺失。
13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，還包含上調(diào)所述丙酮酸脫氫酶基因的修飾。
14.權(quán)利要求13的微生物，其中將基因啟動子插入到所述丙酮酸脫氫酶基因的上游， 并且其中所述啟動子在厭氧條件下起作用。
15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，還包含增強(qiáng)丙酮酸脫羧酶活性的修飾。
16.權(quán)利要求15的微生物，其中所述修飾使二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙酰酶基因(EC 2. 3. 1. 12)失活。
17.權(quán)利要求15或16的微生物，其中所述二氫硫氫酰胺轉(zhuǎn)乙酰酶基因或其部分缺失。
18.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物包含異源丙酮酸脫羧酶基因。
19.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物包含異源醇脫氫酶基因。
20.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物在包含至少3%w/v乙醇的培養(yǎng)基中是穩(wěn)定的。
21.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物在包含至少10%w/v乙醇的培養(yǎng)基中是穩(wěn)定的。
22.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物在包含最高達(dá)20%w/v乙醇的培養(yǎng)基中是穩(wěn)定的。
23.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物可被高頻轉(zhuǎn)化。
24.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物在40°C-85°C、優(yōu)選在50°C -70°C 的溫度下生長。
25.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物被鑒定為TM443(登記號41591)或 TM444(登記號 41588)。
26.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的微生物，其中所述微生物包含受控于在厭氧條件下起作用的啟動子的異源淀粉酶基因。
27.權(quán)利要求26的微生物，其中所述啟動子是Idh啟動子。
28.權(quán)利要求27的微生物，其中所述Idh啟動子是異源的。
29.權(quán)利要求28的微生物，其中所述Idh啟動子來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌 (Geobacillus stearothermophilus)0
30.權(quán)利要求26的微生物，其中所述淀粉酶基因受控于一系列強(qiáng)啟動子。
31.權(quán)利要求30的微生物，其中所述強(qiáng)啟動子是異源的。
32.權(quán)利要求31的微生物，其中所述強(qiáng)啟動子包括淀粉酶啟動子。
33.權(quán)利要求31或32的微生物，其中所述啟動子來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌。
34.權(quán)利要求26至33任一項(xiàng)的微生物，其中所述淀粉酶基因來自地芽孢桿菌屬 (Geobacillus)禾中。
35.權(quán)利要求26至34任一項(xiàng)的微生物，其中所述淀粉酶基因來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌。
36.權(quán)利要求26至35任一項(xiàng)的微生物，其中所述淀粉酶基因編碼α淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)。
37.一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括在合適的條件下，在C3、C5或C6糖或它們的寡聚物存在的情況下培養(yǎng)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的微生物。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述方法在40°C_70°C的溫度下進(jìn)行。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述溫度是52°C-65°C。
40.權(quán)利要求37至39任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物被保持在pH為4.0至8. 0的培養(yǎng)基中。
41.一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括在包含至少淀粉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求26 至36任一項(xiàng)的微生物。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少10%w/v淀粉。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少20%w/v淀粉。
全文摘要
包含防止孢子形成的修飾的嗜熱微生物，其中所述修飾使天然spo0A基因失活。
文檔編號C12P7/06GK102203237SQ200980144253
公開日2011年9月28日 申請日期2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日
發(fā)明者A·阿特金森, K·埃利, 羅杰·克里普斯 申請人:Tmo可再生能源有限公司