銅在制備鈣化抑制劑中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了銅在制備鈣化抑制劑或成骨抑制劑中的新用途。本發(fā)明還公開了以銅作為活性成分的鈣化抑制劑和成骨抑制劑。銅具有抑制細(xì)胞鈣化和抑制細(xì)胞成骨的作用，可用于治療肌腱鈣化和骨化病等疾病，臨床應(yīng)用前景良好。
【專利說明】銅在制備鈣化抑制劑中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及銅在制備鈣化抑制劑中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 銅作為一種必需的微量元素，人們發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)血管新生的作用。在數(shù)十年前， 研究者就發(fā)現(xiàn)銅離子可以促進(jìn)血管新生和刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。目前已有不少組織工程研 究將銅離子作為一種促血管化試劑，用于增進(jìn)新生組織的血管新生。另一方面，銅離子螯合 劑也被證明能夠抑制血管生成，并作為藥物用于抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
[0003] 未見文獻(xiàn)報(bào)道銅是否有抑制鈣化或者抑制成骨的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了銅的新用途。
[0005] 首先，銅在制備鈣化抑制劑中的用途。
[0006] 鈣化抑制劑：能抑制鈣鹽在生物體內(nèi)或組織內(nèi)的積累的物質(zhì)。
[0007] 其中，所述的銅是銅離子或含銅絡(luò)合物。優(yōu)選地，所述銅離子的濃度不低于5 μ M。 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述銅離子的濃度為5 μ Μ。
[0008] 本發(fā)明提供了一種鈣化抑制劑，它是以銅為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料 或輔助性成分制備而成的藥劑。其中，所述鈣化抑制劑是肌腱鈣化、軟骨鈣化、血管鈣化抑 制劑。
[0009] 其中，所述的銅是銅離子或含銅絡(luò)合物。優(yōu)選地，所述銅離子的濃度不低于5 μ Μ。 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述銅離子的濃度為5 μ Μ。
[0010] 其中，所述輔助性成分是小腸粘膜下層。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種抗鈣化修飾方法，它是以銅為活性成分，對(duì)材料或器械進(jìn)行 修飾。
[0012] 所述材料為植入材料、人工器官、醫(yī)用衛(wèi)生材料、醫(yī)用衛(wèi)生敷料、醫(yī)用縫合材料或 醫(yī)用縫合粘合劑。
[0013] 所述材料是小腸粘膜下層、脫細(xì)胞豬心包、脫細(xì)胞牛心包、殼聚糖、聚乳酸或聚乙 二醇。
[0014] 其中，所述的銅是銅離子或含銅絡(luò)合物。優(yōu)選地，所述銅離子的濃度不低于5 μ Μ。 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述銅離子的濃度為5 μ Μ。
[0015] 本發(fā)明還提供了銅在制備成骨抑制劑中的用途。優(yōu)選地，所述成骨抑制劑是抑制 干細(xì)胞分化為骨細(xì)胞的試劑。
[0016] 所述的銅是銅離子或含銅絡(luò)合物。
[0017] 所述銅離子的濃度不低于0. 5 μ Μ。
[0018] 所述銅離子的濃度為0. 5?5 μ Μ。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種成骨抑制劑，它是以銅為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔 料或輔助性成分制備而成的藥劑。
[0020] 成骨抑制劑：能抑制成骨細(xì)胞生成或骨組織形成的物質(zhì)。
[0021] 所述的銅是銅離子或含銅絡(luò)合物。
[0022] 所述銅離子的濃度不低于0. 5 μ M。
[0023] 所述銅離子的濃度為0· 5?5 μ Μ。
[0024] 所述輔助性成分是小腸粘膜下層。
[0025] 本發(fā)明首次公開了銅具有抑制細(xì)胞鈣化和成骨的作用，可作為鈣化抑制劑以及成 骨抑制劑，治療肌腱鈣化和骨化?。i椎后縱韌帶骨化癥），臨床應(yīng)用前景良好。
[0026] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1 (Α)接種3天后原代rBMSCs的形態(tài)特征；⑶第3代rBMSCs的形態(tài)特征
[0028] 圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rBMSCs表面標(biāo)記物
[0029] 圖3成骨誘導(dǎo)21天后茜素紅S染色。㈧對(duì)照組；(B)誘導(dǎo)組
[0030] 圖4成脂誘導(dǎo)10天后油紅0染色。㈧對(duì)照組；(B)誘導(dǎo)組
[0031] 圖5成軟骨誘導(dǎo)21天后甲苯胺藍(lán)染色。㈧對(duì)照組；(B)誘導(dǎo)組
[0032] 圖6不同濃度的CuS04處理rBMSCs48小時(shí)后，使用MTT法檢測(cè)其細(xì)胞增殖活性。 值以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示（*，表示與〇 μ M CuS04組有顯著性差異P〈0. 05)
[0033] 圖 75 μ Μ 的 CuS04 處理 rBMSCs48 小時(shí)后，使用 Roche's CASY Cell Counter 檢測(cè) 其細(xì)胞活力。值以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示（#，表示與對(duì)照組無顯著性差異P>〇. 05)
[0034] 圖 85 μ Μ 的 CuS04 處理 rBMSCs48 小時(shí)后，使用 Roche's CASY Cell Counter 檢測(cè) 其細(xì)胞大小。值以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示（#，表示與對(duì)照組無顯著性差異P>〇. 05)
[0035] 圖95 μ Μ的CuS04處理rBMSCs48小時(shí)后鈣黃綠素-碘化丙啶活死細(xì)胞染色（A)對(duì) 照組；(B) 5 μ M CuS04添加組。（綠色鈣黃綠素，紅色碘化丙啶）
[0036] 圖10培養(yǎng)21天后細(xì)胞倒置相差顯微鏡成像。（A)對(duì)照組；(B)加 Cu組；（C)成骨 誘導(dǎo)組；(D)成骨誘導(dǎo)加 Cu組
[0037] 圖11培養(yǎng)21天后茜素紅S染色。㈧對(duì)照組；(B)加 Cu組；(C)成骨誘導(dǎo)組；(D) 成骨誘導(dǎo)加 Cu組
[0038] 圖12培養(yǎng)21天后|丐含量。Con表示對(duì)照組；Cu表示加 Cu組；Osteo表示成骨誘 導(dǎo)組；0steo+Cu表示成骨誘導(dǎo)加 Cu組。*，表示與0 μ M CuS04組有顯著性差異P〈0. 05 ;#， 表示與成骨誘導(dǎo)組有顯著性差異P〈〇. 05
[0039] 圖13細(xì)胞培養(yǎng)7、14、21天后倒置相差顯微鏡成像與茜素紅染色。（A-C)銅離子濃 度為0 μ Μ ; (D-F)銅離子濃度為0. 5 μ Μ ; (G-I)銅離子濃度為5 μ M。（C、F、I)為茜素紅染 色倒置相差顯微鏡成像。
[0040] 圖14real time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中成骨相關(guān)基因 mRNA表達(dá)水平的改變。（*，表 示與Control組有顯著性差異P〈0. 05 ;#表示與成骨誘導(dǎo)組有顯著性差異P〈0. 05)
[0041] 圖15免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞中成骨相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的改變。
[0042] 圖16培養(yǎng)7天后ALP染色。（A)對(duì)照組；(B)成骨誘導(dǎo)組；（C)加 Cu組；(D)成骨 誘導(dǎo)加 Cu組。
[0043] 圖17細(xì)胞中ALP活力的改變。（*，表示與Control組有顯著性差異Ρ〈0· 05 ;#表 示與成骨誘導(dǎo)組有顯著性差異Ρ〈〇. 05)
[0044] 圖18細(xì)胞培養(yǎng)過程中倒置相差顯微鏡采圖。（Con)對(duì)照組；（Cu)加 Cu組；（Osteo) 成骨誘導(dǎo)組；（〇steo+Cu)成骨誘導(dǎo)加 Cu組
[0045] 圖19細(xì)胞培養(yǎng)過程中激光共聚焦顯微鏡采圖。（Control)對(duì)照組；（Cu)加 Cu組； (Osteo)成骨誘導(dǎo)組；（0steo+Cu)成骨誘導(dǎo)加 Cu組。（綠色，鬼筆環(huán)肽；藍(lán)色，DAPI)
[0046] 圖20real time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞骨架相關(guān)基因 mRNA表達(dá)水平的改變。（*， 表示與Control組有顯著性差異P〈0. 05 ;#表示與成骨誘導(dǎo)組有顯著性差異P〈0. 05)
[0047] 圖21大鼠異位成骨模型構(gòu)建及含銅細(xì)胞支架植入
[0048] 圖22植入后2周H&E染色
[0049] 圖23植入后2個(gè)月H&E染色
[0050] 圖24植入后2個(gè)月Masson染色
[0051] 圖25植入后2個(gè)月天狼星紅染色，偏振光觀察

【具體實(shí)施方式】
[0052] 實(shí)施例1銅抑制細(xì)胞鈣化的體外實(shí)驗(yàn)
[0053] 1主要材料與儀器
[0054] 1. 1主要試劑
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 銅在制備鈣化抑制劑中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述的銅是銅離子或含銅絡(luò)合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：所述銅離子的濃度不低于5 μ Μ ; 優(yōu)選地，所述銅離子的濃度為5 μ Μ。
4. 一種鈣化抑制劑，其特征在于：它是以銅為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或 輔助性成分制備而成的藥劑； 優(yōu)選地，所述鈣化抑制劑是肌腱鈣化、軟骨鈣化、血管鈣化抑制劑； 優(yōu)選地，所述銅是銅離子或含銅絡(luò)合物；優(yōu)選地，所述銅離子的濃度不低于5 μ Μ ;進(jìn)一 步優(yōu)選地，所述銅離子的濃度為5 μ Μ ; 優(yōu)選地，所述輔助性成分是小腸粘膜下層。
5. -種抗鈣化修飾方法，其特征在于：它是以銅為活性成分，對(duì)材料或器械進(jìn)行修飾； 優(yōu)選地，所述材料為植入材料、人工器官、醫(yī)用衛(wèi)生材料、醫(yī)用衛(wèi)生敷料、醫(yī)用縫合材料 或醫(yī)用縫合粘合劑；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述植入材料是小腸粘膜下層、脫細(xì)胞豬心包、脫細(xì)胞 牛心包、殼聚糖、聚乳酸或聚乙二醇； 優(yōu)選地，述銅是銅離子或含銅絡(luò)合物；優(yōu)選地，所述銅離子的濃度不低于5 μ Μ ;進(jìn)一步 優(yōu)選地，所述銅離子的濃度為5 μ Μ。
6. 銅在制備成骨抑制劑中的用途。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于：所述成骨抑制劑是抑制干細(xì)胞分化為骨 細(xì)胞的試劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的用途，其特征在于：所述銅是銅離子或含銅絡(luò)合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于：所述銅離子的濃度不低于0. 5 μ Μ ; 優(yōu)選地，所述銅離子的濃度為0. 5?5 μ Μ。
10. -種成骨抑制劑，其特征在于：它是以銅為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或 輔助性成分制備而成的藥劑； 優(yōu)選地，所述銅是銅離子或含銅絡(luò)合物；優(yōu)選地，所述離子的濃度不低于0. 5 μ Μ ;進(jìn)一 步優(yōu)選地，所述銅離子的濃度為0. 5?5 μ Μ ; 優(yōu)選地，所述輔助性成分是小腸粘膜下層。
【文檔編號(hào)】A61L15/18GK104083399SQ201410300441
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】解慧琪, 李順, 王旻, 劉宏銀 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院