一種用于治療腫瘤的聯(lián)合用藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于治療腫瘤的聯(lián)合用藥物，所述聯(lián)合用藥物由砷化合物溶液與巴西蘇木素類化合物的不同規(guī)格的單位制劑組成，所述的砷化物溶液通過如下方法制得：取As2O3粉末加入到無菌去離子水中得到懸浮液，所得懸浮液滴加NaOH溶液直至粉末完全溶解；所述巴西蘇木素類化合物由巴西蘇木素和巴西蘇木紅素組成。本發(fā)明將砷化合物、巴西蘇木素類化合物合用，可以提高砷化合物療效，控制砷化合物劑量和相應(yīng)的毒、副作用，使它的使用變得更加安全，拓展砷化合物治療譜，尤其在抗T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞方面表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用。
【專利說明】一種用于治療腫瘤的聯(lián)合用藥物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及砷化合物與巴西蘇木素類化合物在制備治療腫瘤的 聯(lián)合用藥物中的應(yīng)用，以及一種用于治療腫瘤的聯(lián)合用藥物。

【背景技術(shù)】
[0002] 三氧化二砷（As203)為中藥砒霜，20世紀(jì)70年代我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)其治療急性早幼粒 細(xì)胞白血病（APL)有效，引起了研究者和臨床醫(yī)生的廣泛關(guān)注。但是不同腫瘤細(xì)胞對As 2O3 的易感性差別很大。如CN01107536. 8涉及治療惡性淋巴瘤的藥物及其配制方法，其公開了 來源于人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞對As2O 3很敏感，而同樣來源于人類T淋巴瘤細(xì) 胞株Jurkat細(xì)胞對As2O3就不敏感。另外，腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外敏感性差異也大，許多腫瘤細(xì) 胞在體外能夠被As 2O3有效誘導(dǎo)凋亡，而在臨床應(yīng)用中卻反應(yīng)不敏感。實體瘤細(xì)胞株則大多 較不敏感，竺涵光等人（口腔醫(yī)學(xué)縱橫雜志2000年第16卷第1期35 - 37頁）報道：較多 的研究表明，三氧化二砷既有誘導(dǎo)腫瘤凋亡和分化作用，又有明顯的抗增殖作用。不僅可 以用于治療APL、CML等血液系統(tǒng)惡性腫瘤也有可能治療食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、口咽癌的實 體腫瘤，諸多的體外研究充分地證明了這一點。三氧化二砷治療實體腫瘤作用在較多的理 論研究雖已得到了證實，但臨床治療實體腫瘤卻未有取得明顯進(jìn)展的報道。究其原因，這 可能與三氧化二砷在血液中95 %?97 %的血紅蛋白結(jié)合的生化特性有關(guān)。在常規(guī)的APL 臨床治療方案中，血液的砷濃度平均在1 μ mol/L，峰值在4. 8 μ mol/L，按常規(guī)的血液擴(kuò)散 濃度，到達(dá)實體腫瘤的砷濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于治療濃度。經(jīng)動物體內(nèi)實驗表明：經(jīng)動脈微量輸液 泵輸入100 μ mol/L的As2O3，其局部灌注區(qū)域內(nèi)的組織濃度平均達(dá)7. 9 μ mol/L ;同條件下經(jīng) 靜脈輸入，其組織濃度僅達(dá)1. 4 μ mol/L ;這可能是血液系統(tǒng)惡性腫瘤顯效，而實體腫瘤作 用不明顯的關(guān)鍵所在。
[0003] 研究證實三氧化二砷具有顯著生理活性，有明顯的抗腫瘤作用，但同時它作為一 種劇毒藥物，它的毒性對人體正常組織的副作用也常被報道和研究。它的毒性作用呈現(xiàn)一 種劑量依賴關(guān)系，減少它的用量是一種可行安全的辦法，但同時又要發(fā)揮它對腫瘤組織的 細(xì)胞毒性作用。因此，除了選擇合適的給藥途徑外，研究如何減少As 2O3劑量和相應(yīng)的毒、副 作用，同時又要提高As2O3藥效，制劑的制備顯得尤為重要。
[0004] 近十幾年來，對三氧化二砷的研究的成果比較多，例如CN200380105498. 8公開了 三氧化二砷的口服組合物的制劑及其使用方法。又如CNO1107536. 8公開了治療惡性淋巴 瘤的藥物及其配制方法。再如CN98813016. 5公開了三氧化二砷制劑生產(chǎn)法及用三氧化二 砷或米拉索普治癌法。以上列舉的三個專利，所配制的三氧化二砷組合物的方法基本相同， 其步驟：均采用氫氧化鈉溶解，其溶液用稀鹽酸中和，并調(diào)節(jié)pH為7. 0?7. 2,三氧化二砷 終濃度為lmg/ml。現(xiàn)有技術(shù)制備的三氧化二砷組合物由偏亞砷酸鈉（NaAsO2)、三氧化二砷 和氯化鈉組成。其中CNOl 107536. 8研究結(jié)果表明，采用人惡性B淋巴瘤細(xì)胞Raji細(xì)胞，細(xì) 胞密度為2. 0 X 105/ml，經(jīng)As2O3濃度0. 5、I. 0、2. 0 μ mol/L作用24、48、72小時，所測活性細(xì) 胞數(shù)，反映〇. 5?2. 0 μ mol/L As2O3抑制細(xì)胞生長，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)；但對人T淋巴瘤 細(xì)胞株 jurkat 細(xì)胞，細(xì)胞密度為 2. OX 105/ml，As203 濃度（0· 5、1· 0、2· 0、4· O μ mol/L)不抑 制細(xì)胞生長。
[0005] 近幾年來，已經(jīng)有許多報道顯示，三氧化二砷與其他化療或非化療藥物聯(lián)用能增 強(qiáng)它的效果，發(fā)生協(xié)同效應(yīng)，從而減少三氧化二砷劑量和相應(yīng)的毒、副作用，使它的使用變 得更加安全，更加能夠拓展三氧化二砷治療譜。如CN200310104509. 2公開了大黃有效成分 在制備增強(qiáng)As2O3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用；如CN200810177336. X公開了一種抑制 乳腺癌細(xì)胞體外生長和治療乳腺癌的藥物；一種治療乳腺癌的藥物，它包括三氧化二砷和 粉防己堿兩種組分，三氧化二砷和粉防己堿兩藥聯(lián)合使用時可以降低三氧化二砷毒性，效 果優(yōu)于單獨(dú)用藥；在一定濃度范圍內(nèi)，聯(lián)合用藥產(chǎn)生協(xié)同作用。如CN201110089819. 6公開 了三氧化二砷與南天竹子配伍的藥物組合物及其制備和用途。以上列舉的三個專利均未見 公開三氧化二砷的制備方法。
[0006] 蘇木為豆科云實屬植物，其干燥心材，味甘、咸、微辛，入心、肝、脾，是一種傳統(tǒng)中 藥材，資源豐富，用途廣泛。具有舒筋通絡(luò)、活血散結(jié)、鎮(zhèn)靜、祛痰等功效，收載于中華人民共 和國藥典一部。
[0007] 關(guān)于蘇木的化學(xué)成分研究，據(jù)日本學(xué)者永井正博等人研究報道：蘇木中酚性成分 為其主要藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其包括查耳酮類、巴西蘇木素類、原巴西蘇木素類、高異黃 酮類衍生物，巴西蘇木素類化合物是蘇木中的主要活性成分，巴西蘇木素類包括巴西蘇木 素 （Brazilin C16H14O5)與巴西蘇木紅素 （Brazilein C16H12O5)。近幾十年來，國內(nèi)外研究發(fā) 現(xiàn)蘇木除傳統(tǒng)藥效外還具有免疫抑制、抗氧化性、抗菌、抗補(bǔ)體、抗腫瘤等新的藥理活性。如 CN01127907. 9公開了用于抗器官移植急性排斥反應(yīng)的單味藥-蘇木水提物，其可延長移植 心臟的存活時間，減輕排斥反應(yīng)對器官所致的免疫損傷。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)提取巴西蘇木紅素：
[0009] 如CN201010183648. 9公開了蘇木提取物制備灌注液制備工藝及其在治療膀胱癌 上的用途，該專利公開方法是：取蘇木粉碎，三次水提，合并三次提取液，減壓濃縮；靜置過 夜，除去沉淀；再加入石油醚，萃取，保留水相；再加入乙酸乙酯，萃取，去掉水相；減壓揮發(fā) 盡乙酸乙酯；干燥物稱重,加純化水，使干物質(zhì)含量為2%，加熱溶解，室溫靜置過夜，過濾 除去沉淀物；凍干，分裝。如CN200710122084. 6公開了藥物化合物巴西蘇木紅素制備方法 和用途，該專利公開方法是：1)將蘇木心材，采用堿水溶劑進(jìn)行加熱提取，得到提取液；2) 將提取液在室溫下加酸，使PH值為2-6,離心或靜止過濾，棄去上清液，取沉淀物，然后干 燥，得干燥物；3)將干燥物用醇溶解，進(jìn)行色譜分離，即制得巴西蘇木紅素。
[0010] 如CN201110117851. 0公開了一種巴西蘇木紅素的提純方法，該專利公開方法是： 將蘇木粉碎，加入提取罐中，以乙醇液為溶媒采用連續(xù)逆流法提取，提取液濃縮至浸膏，用 乙酸乙酯溶解，溶液與硅膠拌勻，低溫烘干后加入石油醚中，回流提取3-5次，濾出硅膠，再 加入乙酸乙酯回流提取3-6次，提取液除溶后得到巴西蘇木紅素粗品，最后采用高效制備 液相色譜法純化，收集目標(biāo)洗脫液，蒸干即得產(chǎn)品。
[0011] 現(xiàn)有技術(shù)提取巴西蘇木素：
[0012] 如CN200410044111. 9公開了蘇木有效部位群的藥物新用途，其制備方法：采用熱 回流提取，將蘇木粗粉，用75%乙醇浸泡，加熱至85°C，連續(xù)回流提取，過濾；反復(fù)2次，將濾 液合并，減壓濃縮，真空干燥，制成乙醇提取物干粉。將乙醇提取物干粉加入雙蒸水混懸，用 乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜止，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。減壓回收 乙酸乙酯，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥，得到乙酸乙酯提取物干粉。
[0013] 又如趙莉莉碩士論文（2011年5月）公開了對蘇木抗癌有效成分分析及其對膀胱 癌細(xì)胞抑制作用的研究。蘇木提取物的制備方法：稱取蘇木，用蒸餾水或乙醇或甲醇，常壓 回流lh，提取4次，合并提取液，減壓濃縮，離心、過濾，濾液加入等體積石油醚脫脂2次，水 相加入等體積乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部分，減壓蒸干溶劑（即得）。蘇木抗癌有 效成分對體外培養(yǎng)的膀胱癌細(xì)胞的增生抑制及誘導(dǎo)凋亡作用；巴西木素是蘇木中主要抗癌 有效成分之一，經(jīng)鑒定該化合物為巴西木素，分子式：C16H1405,分子量：286. 28。
[0014] 綜上，現(xiàn)有技術(shù)中以蘇木心材為原料，提取、制備巴西蘇木紅素制劑的方法占極大 多數(shù)（是按從蘇木中提取物的標(biāo)題計數(shù)為多數(shù)），而制備巴西蘇木素制劑的方法占極少數(shù)。 現(xiàn)有工藝流程繁瑣，處理周期長，且收率低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。并且，現(xiàn)有技術(shù)對蘇木中主 要兩種活性組分均只提取其中一種活性組分，或巴西蘇木紅素，或巴西蘇木素。如果沒有分 別提取巴西蘇木紅素、巴西蘇木素為主要成分的兩個組分，就會在主要兩種組分中丟失其 中一種活性組分，不但會影響藥物的效果，而且會因提取工藝、方法等問題而影響提取物的 得率。因此，亟需開發(fā)一種新的制備蘇木有效部位制劑的新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的第一個目的是提供砷化合物與巴西蘇木素類化合物在制備治療腫瘤的 聯(lián)合用藥物中的應(yīng)用，其藥效優(yōu)于單獨(dú)給藥。
[0016] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于治療腫瘤的聯(lián)合用藥物。
[0017] 下面對本發(fā)明采用的技術(shù)方案進(jìn)行具體說明。
[0018] 本發(fā)明提供了砷化合物溶液與巴西蘇木素類化合物在制備治療腫瘤的聯(lián)合用藥 物中的應(yīng)用，所述的砷化合物溶液通過如下方法制得：取As 2O3粉末加入到無菌去離子水中 得到懸浮液，所得懸浮液滴加 NaOH溶液直至粉末完全溶解；
[0019] 所述巴西蘇木素類化合物由巴西蘇木素和巴西蘇木紅素組成，所述的巴西蘇木素 類化合物的制備方法包括：
[0020] (1)以經(jīng)過粉碎的蘇木心材為原料，以蒸餾水或去離子水為溶劑，蘇木心材與蒸餾 水或去離子水的質(zhì)量比為1:2-8,在90?KKTC下提取0. 75?lh，過濾得到蘇木水提液， 濃縮至蘇木水提液總體積的1/6-1/20,得蘇木濃縮液；將蘇木濃縮液放置過夜形成結(jié)晶沉 淀，分離上層清液和沉淀A，清液中再加入用量為清液體積的3?5倍的95%乙醇，放置過 夜，離心去雜，濃縮回收乙醇，噴霧干燥，得巴西蘇木紅素；
[0021] (2)將沉淀A采用乙醇溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，真空干燥，將乙醇干燥物加 入去離子水混懸，用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮回收溶劑后，加熱水溶解，過濾，取濾液，靜 置，重結(jié)晶得到巴西蘇木素。
[0022] 進(jìn)一步，所述巴西蘇木素類化合物與砷化合物的質(zhì)量比以各自的制備原料（即蘇 木心材與As 2O3粉末）的質(zhì)量之比計大于50。本發(fā)明中，由于砷化合物具有毒性，而巴西蘇 木素類化合物無毒性，因此在聯(lián)合使用時，一般需盡量減少砷化合物的用量，在砷化合物用 量一定的情況下，增加巴西蘇木素類化合物的用量是有利的。
[0023] 本發(fā)明在砷化合物溶液的制備中，使用的As2O3粉末的純度為95%?99.9%。在 制備懸浮液時，一般使得每mL無菌去離子水中加入5?30mg As2O3粉末。本發(fā)明采用氫氧 化鈉溶液溶解As2O3,推薦溶解As2O3的NaOH溶液的濃度為3?6mol/L，優(yōu)選為3?4mol/ L，該濃度的氫氧化鈉可使得As2O3完全溶解。本發(fā)明所述的砷化合物溶液，在分裝制劑時， 可根據(jù)通過加入無菌去離子水和稀氫氧化鈉溶液（0. 1?I. 〇mol/L，優(yōu)選0. 2?0. 3mol/L) 以調(diào)節(jié)溶液濃度和pH值，例如使所得砷化合物溶液的濃度以投料的As2O3計為1?20mg/ ml以及pH值為7. 2?7. 3。本發(fā)明在砷化合物溶液的制備過程中不使用鹽酸。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種用于治療腫瘤的聯(lián)合用藥物，由砷化合物溶液與巴西蘇木素 類化合物的不同規(guī)格的單位制劑組成，所述的砷化物溶液通過如下方法制得：取As 2O3粉末 加入到無菌去離子水中得到懸浮液，所得懸浮液滴加 NaOH溶液直至粉末完全溶解；
[0025] 所述巴西蘇木素類化合物由巴西蘇木素和巴西蘇木紅素組成，所述的巴西蘇木素 類化合物的制備方法包括：
[0026] (1)以經(jīng)過粉碎的蘇木心材為原料，以蒸餾水或去離子水為溶劑，蘇木心材與蒸餾 水或去離子水的質(zhì)量比為1:2-8,在90?KKTC下提取0. 75?lh，過濾得到蘇木水提液， 濃縮至蘇木水提液總體積的1/6-1/20,得蘇木濃縮液；將蘇木濃縮液放置過夜形成結(jié)晶沉 淀，分離上層清液和沉淀A，清液中再加入用量為清液體積的3?5倍的95%乙醇，放置過 夜，離心去雜，濃縮回收乙醇，噴霧干燥，得巴西蘇木紅素；
[0027] (2)將沉淀A采用乙醇溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，真空干燥，將乙醇干燥物加 入去離子水混懸，用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮回收溶劑后，加熱水溶解，過濾，取濾液，靜 置，重結(jié)晶得到巴西蘇木素。
[0028] 進(jìn)一步，所述巴西蘇木素類化合物與砷化合物的質(zhì)量比以各自的制備原料（即蘇 木心材與As 2O3粉末）的質(zhì)量之比計大于50。本發(fā)明中，由于砷化合物具有毒性，而巴西蘇 木素類化合物無毒性，因此在聯(lián)合使用時，需盡量減少砷化合物的用量，在砷化合物用量一 定的情況下，增加巴西蘇木素類化合物的用量是有利的。
[0029] 所述的單位制劑為常見的劑型，如注射劑、介入劑、沖劑、散劑、片劑、丸劑、膠囊 齊?、微囊劑、軟膠囊劑、栓劑、膜劑、膏劑、配劑、氣霧劑、各種外用制劑等，優(yōu)選注射劑或介入 齊U。所述的單位制劑可根據(jù)常規(guī)的制劑工藝由砷化合物或巴西蘇木素類化合物及其藥學(xué)上 可接受的載體分別制成。
[0030] 所述的聯(lián)合用藥物可用于治療腫瘤，如淋巴瘤（具體例如人Burkitt淋巴瘤、人T 細(xì)胞淋巴瘤等）、實體腫瘤（如呼吸系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤、表皮組織 腫瘤等）；也可用于治療自身免疫病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0032] 1)、本發(fā)明在配制砷化合物溶液過程中不加入鹽酸，制得的砷化合物由偏亞砷酸 鈉（NaAsO 2)和三氧化二砷組成，分子結(jié)構(gòu)明確，而且藥物療效顯著，該溶液經(jīng)與中國專利 CN1370540A對比藥效的結(jié)果顯示，不僅對于人B淋巴瘤細(xì)胞具有抑制作用，而且對人T淋巴 瘤細(xì)胞也具有顯著的抑制作用。本發(fā)明所制備的砷化合物溶液的藥效好，較現(xiàn)有制備的砷 化合物技術(shù)更具有優(yōu)勢。
[0033] 2)、本發(fā)明將砷化合物、巴西蘇木素類化合物合用，可以提高砷化合物療效，控制 砷化合物劑量和相應(yīng)的毒、副作用，使它的使用變得更加安全，拓展砷化合物治療譜，尤其 在抗T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞方面表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖I-A為蘇木水提液的濃縮液放置形成結(jié)晶沉淀，將形成結(jié)晶沉淀后的蘇木濃縮 液分離成二部分；該圖為蘇木濃縮液的上層部分；
[0035] 圖I-B為放置形成結(jié)晶沉淀部分的結(jié)晶，采用乙醇溶解、乙酸乙酯萃取，取萃取液 置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，回收溶劑后，加水溶解，靜置重結(jié)晶，重結(jié)晶的溶解液。
[0036] 圖2為A、B兩個藥物對T淋巴細(xì)胞瘤jurkat細(xì)胞的凋亡作用柱形圖。
[0037] 圖2中分組：
[0038] 1、不加藥對照；
[0039] 2、加蘇木不同劑量（以蘇木原料重量計算，100、200、400、800μ g / ml);
[0040] 3、加砷化合物（以As2O3劑量計算，下面相同）As 2O3不同劑量（0· 2、0· 4、0· 8、 I. 6 μ g / ml)；
[0041] 4、As2O3O. 4 μ g / ml+蘇木不同劑量（100、200、400 μ g / ml);
[0042] 5、加蘇木 100 μ g / ml+As203 不同劑量（0· 2、0· 4、0· 8 μ g / ml);
[0043] 6、加蘇木 200 μ g / ml+As203 不同劑量（0· 2、0· 4、0· 8 μ g / ml)
[0044] 圖3-1?圖3-18為流式細(xì)胞儀測定砷化合物（以As2O3劑量計算μ g/ml，以下簡 稱A)或/和蘇木（以下簡稱B)A、B兩個藥物對T淋巴細(xì)胞瘤jurkat細(xì)胞的凋亡作用的細(xì) 胞調(diào)亡圖，其中：
[0045] 圖3-1 :不加藥對照；
[0046] 圖3-2?圖3-5 :分別對應(yīng)加蘇木不同劑量（100、200、400、800μ g / ml);
[0047] 圖3-6?圖3-9 :分別對應(yīng)加砷化合物（以As2O3劑量計算）As2O3不同劑量（0· 2、 0· 4、0· 8、1. 6 μ g / ml);
[0048] 圖 3-10-圖 3-12 :分別對應(yīng) As2O3O. 4μ g / ml+ 蘇木不同劑量（100、200、 400 yg/ ml)；
[0049] 圖3-13?圖3-15 :分別對應(yīng)加蘇木100μ g / ml+As203不同劑量（0. 2、0. 4、 0. 8 μ g / ml)；
[0050] 圖3-16-圖3-18 :分別對應(yīng)加蘇木200 μ g / ml+As203不同劑量（0. 2、0. 4、 0· 8 μ g / ml)。
[0051] 圖 4-卜A、4-l-B、4-l-C、4-2-A、4-2-B、4-2-C、4-3-A、4-3-B、4-3-C、4-4-A、4-4-B、 4-4-C、4-5-A、4-5-B、4-5-C為砷化合物單用及合用蘇木水提取液（簡稱A、B兩個藥物）對T 淋巴細(xì)胞瘤jurkat細(xì)胞線粒體的影響。其中，圖號中4-X(X = 1-5)表示五個組別：圖4-1 為對照組的細(xì)胞線粒體；圖4-2為As2O3 0. 4 μ g/ml ;圖4-3為As2O3 0. 8 μ g/ml ;圖4-4為 蘇木200μ g/ml ;圖4-5為蘇木200μ g/ml+As203 0. 4 μ g/ml ;利用熒光顯微鏡同時在同一 視野下拍照片，分別為常規(guī)濾光、紅色熒光、綠色熒光，利用熒光顯微鏡對每一個樣品，分別 在同一視野下拍照片，分別為常規(guī)濾光、紅色熒光、綠色熒光A、B、C圖三張（照片），即圖號 末尾的A、B、C分別表示該樣品獲得的常規(guī)濾光、紅色熒光、綠色熒光照片。

【具體實施方式】
[0052] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但應(yīng)理解本發(fā)明的范圍非僅限于這 些實施例的范圍。
[0053] 實施例一：砷化合物溶液的制備
[0054] 精確稱質(zhì)量IOOOmg純度為99. 9%的As2O3粉末倒入裝有200ml無菌去離子水的 燒瓶中，As2O 3呈懸浮液，通過加熱、滴加4mol/L NaOH至粉末完全溶解后，加無菌去離子水 750ml，再用0. 3mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液至pH至7. 3,并用無菌去離子水補(bǔ)足體積至IOOOml的 砷化合物溶液，濃度以投料As2O3計為lmg/ml。制備的As 2O3溶液采用過濾法（通過0. 22 μ m 的過濾器）進(jìn)行除菌并儲藏在消毒小瓶中。
[0055] 實施例二：巴西蘇木素類化合物的制備
[0056] 1)、巴西蘇木紅素的制備
[0057] 將經(jīng)過粉碎的中藥蘇木心材為原料，以蒸餾水或去離子水為溶劑，蘇木與蒸餾水 或去離子水的質(zhì)量比為6倍的比例，在95°C下提取Ih ;提取3次，合并提取液，采用240目 篩或濾網(wǎng)過濾、用中速或快速定性濾紙過濾或置于布氏漏斗上，利用真空泵對蘇木提取液 進(jìn)行抽濾，得到蘇木水提液；將蘇木水提液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中或電爐上濃縮，濃縮至蘇木提 取液的總體積1/15,得蘇木濃縮液；濃縮液放置過夜形成結(jié)晶沉淀，分離上層蘇木濃縮液 和結(jié)晶沉淀A，再加入上層蘇木濃縮液體積的4倍體積的95%乙醇，放置過夜，離心去雜，轉(zhuǎn) 速為2500 - 3500r/min，20min，再置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮、回收乙醇，將上層蘇木濃縮液置 于160-180°C下噴霧干燥，得巴西蘇木紅素粉末，其化學(xué)成分為以巴西蘇木紅素為主的巴西 蘇木素類化合物，多酚含量6. 8?7. 9 %。
[0058] 2)、巴西蘇木素的制備
[0059] 將結(jié)晶沉淀A采用乙醇溶解、置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，真空干燥，將乙醇干燥物加 入去離子水混懸，乙酸乙酯萃取，取萃取液濃縮回收溶劑后，加熱水溶解，置于抽濾器上過 濾除去雜質(zhì)，取出濾液，靜置重結(jié)晶，干燥即得巴西蘇木素粉末，其化學(xué)成分以巴西蘇木素 為主的巴西蘇木素類化合物，多酚含量1?2%。
[0060] 實施例三：采用實施例一制備的砷化合物與實施例二步驟1)制備的蘇木水提液 (由于水提液中組分即為所述的巴西蘇木素類化合物，故以該蘇木水提液來進(jìn)行體外實 驗）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用進(jìn)行體外實驗。
[0061] 1、試驗材料
[0062] 1)細(xì)胞株：從T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞、B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi細(xì)胞、肝癌細(xì)胞 HEPG2三種細(xì)胞株中選出T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞進(jìn)行實驗。
[0063] 2)藥物：砷化合物（配制方法為：由實施例1制得的砷化合物溶液，先用去離子水 稀釋到80 μ g/ml，再用1640培養(yǎng)液稀釋到所需濃度）；實施例二步驟1)制得的蘇木水提取 液（用1640培養(yǎng)液稀釋到所需濃度）。
[0064] 2、實驗方法及步驟
[0065] 1)細(xì)胞培養(yǎng)
[0066] 接種處于指數(shù)生長的人T淋巴細(xì)胞瘤株jurkat細(xì)胞于24孔板培養(yǎng)，每孔接種為 lml，細(xì)胞密度為2 X IO5Ail置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行藥效實驗。（藥效實驗分 組見表2)藥物作用24、48、72h，分別取細(xì)胞懸液經(jīng)0. 4%臺盼藍(lán)液染色作存活細(xì)胞、死亡細(xì) 胞計數(shù)。
[0067] 實驗經(jīng)砷化合物、蘇木水提取液的不同濃度，分別對3種腫瘤細(xì)胞（T淋巴瘤細(xì)胞 株Jurkat細(xì)胞、B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi細(xì)胞、肝癌細(xì)胞HEPG2)進(jìn)行細(xì)胞毒作用實驗。在實 驗選定的砷化合物、蘇木水提取液的不同劑量下單用與合用在3種細(xì)胞中分別有效，同時， 比較了 3種腫瘤細(xì)胞對砷化合物、蘇木水提取液的敏感性，從中選擇了對砷化合物、蘇木水 提取液的藥效相對不敏感的T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞作為主要藥效學(xué)實驗。進(jìn)行了砷 化合物（簡稱A)、蘇木水提取液（簡稱B)A、B兩個藥物對T淋巴細(xì)胞Jurkat細(xì)胞毒作用 體外實驗；
[0068] 2)藥效分組
[0069] 1、不加藥對照；2、加蘇木不同劑量（以蘇木原料重量計算100、200、400、 800 yg/ ml)；
[0070] 3、加砷化合物（以As2O3劑量計算，下面相同）As 2O3不同劑量（0· 2、0· 4、0· 8、 I. 6 μ g / ml)；
[0071] 4、As2O3O. 4 μ g / ml+蘇木不同劑量（100、200、400 μ g / ml);
[0072] 5、加蘇木 100 μ g / ml+As203 不同劑量（0· 2、0· 4、0· 8 μ g / ml);
[0073] 6、加蘇木 200 μ g / ml+As203 不同劑量（0· 2、0· 4、0· 8 μ g / ml)
[0074] 3)實驗指標(biāo)測定
[0075] ① AnnexinV/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡
[0076] 取處于對數(shù)生長期的人T淋巴細(xì)胞瘤株jurkat細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種為 3ml，細(xì)胞密度為2x 105/ml，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，（藥效分組同前）培養(yǎng)44h 后，分別取jurkat細(xì)胞I X IO6個/ml的實驗組與對照組的細(xì)胞，用PBS洗2次，1000r/min， 5min，棄上清液，在每100 μ 1細(xì)胞懸液中加入AnnexinV/PI試劑雙染色（操作按試劑盒方 法）制備完實驗樣品，進(jìn)行流式細(xì)胞儀對AnnexinV/PI雙染色細(xì)胞檢測。
[0077] 3、實驗結(jié)果
[0078] 表1、流式細(xì)胞儀測定兩個藥物對T淋巴細(xì)胞瘤jurkat的抑制作用
[0079]

【權(quán)利要求】
1. 一種砷化合物溶液與巴西蘇木素類化合物在制備治療腫瘤的聯(lián)合用藥物中的應(yīng)用， 其特征在于：所述的砷化合物溶液通過如下方法制得：取As 203粉末加入到無菌去離子水中 得到懸浮液，所得懸浮液滴加 NaOH溶液直至粉末完全溶解； 所述巴西蘇木素類化合物由巴西蘇木素和巴西蘇木紅素組成，所述的巴西蘇木素類化 合物的制備方法包括： (1) 以經(jīng)過粉碎的蘇木心材為原料，以蒸餾水或去離子水為溶劑，蘇木心材與蒸餾水或 去離子水的質(zhì)量比為1:2?8,在90?100°C下提取0. 75?lh，過濾得到蘇木水提液，濃縮 至蘇木水提液總體積的1/6?1/20,得蘇木濃縮液；將蘇木濃縮液放置過夜形成結(jié)晶沉淀， 分離上層清液和沉淀A，清液中再加入用量為清液體積的3?5倍的95 %乙醇，放置過夜， 離心去雜，濃縮回收乙醇，噴霧干燥，得巴西蘇木紅素； (2) 將沉淀A采用乙醇溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，真空干燥，將乙醇干燥物加入去 離子水混懸，用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮回收溶劑后，加熱水溶解，過濾，取濾液，靜置，重 結(jié)晶得到巴西蘇木素。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述巴西蘇木素類化合物與砷化合物的質(zhì) 量比以各自的制備原料蘇木心材與As20 3粉末的質(zhì)量之比計為大于50。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述砷化合物溶液的制備過程中不使 用鹽酸。
4. 一種用于治療腫瘤的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述聯(lián)合用藥物由砷化合物溶液與 巴西蘇木素類化合物的不同規(guī)格的單位制劑組成，所述的砷化物溶液通過如下方法制得： 取As 203粉末加入到無菌去離子水中得到懸浮液，所得懸浮液滴加 NaOH溶液直至粉末完全 溶解； 所述巴西蘇木素類化合物由巴西蘇木素和巴西蘇木紅素組成，所述的巴西蘇木素類化 合物的制備方法包括： (1) 以經(jīng)過粉碎的蘇木心材為原料，以蒸餾水或去離子水為溶劑，蘇木心材與蒸餾水或 去離子水的質(zhì)量比為1:2-8,在90?100°C下提取0. 75?lh，過濾得到蘇木水提液，濃縮至 蘇木水提液總體積的1/6-1/20,得蘇木濃縮液；將蘇木濃縮液放置過夜形成結(jié)晶沉淀，分 離上層清液和沉淀A，清液中再加入用量為清液體積的3?5倍的95%乙醇，放置過夜，離 心去雜，濃縮回收乙醇，噴霧干燥，得巴西蘇木紅素； (2) 將沉淀A采用乙醇溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，真空干燥，將乙醇干燥物加入去 離子水混懸，用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮回收溶劑后，加熱水溶解，過濾，取濾液，靜置，重 結(jié)晶得到巴西蘇木素。
5. 如權(quán)利要求4所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述巴西蘇木素類化合物與砷化合 物的質(zhì)量比以各自的制備原料蘇木心材與As20 3粉末的質(zhì)量之比計為大于50。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述砷化合物溶液的制備過程 中不使用鹽酸。
【文檔編號】A61K31/352GK104274489SQ201410246755
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月5日
【發(fā)明者】樓蘭花 申請人:樓蘭花