專利名稱：一種多蛋白腫瘤治療藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種治療、預(yù)防腫瘤(癌癥)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的組合物。
背景技術(shù)：
眾所周知，惡性腫瘤(癌癥)對(duì)人類健康的烕脅日益嚴(yán)重，己大量地消耗了人類的物質(zhì)資源和嚴(yán)重危害人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全
世界每年新增癌癥患者800萬(wàn)以上，死亡人數(shù)620萬(wàn)，我國(guó)每年新增癌癥患者160萬(wàn)以上，死亡人數(shù)160萬(wàn)，到2020年以上數(shù)字將翻一番，過幾年全世界癌癥患者將達(dá)到8400萬(wàn)人，這是一個(gè)可怕的數(shù)字。
惡性腫瘤(癌癥)，它不同于良性腫瘤的最主要特征是能侵襲周圍組織，疾病晚期癌細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，破壞被侵襲的器官,最終耗盡人體的生命體能，導(dǎo)致機(jī)體衰亡。惡性腫瘤(癌癥)幾乎在所有類型的細(xì)胞中均可發(fā)生。如何更有效地攻克惡性腫瘤(癌癥)，是新世紀(jì)擺在我們面前的艱巨任務(wù)。對(duì)于惡性腫瘤，過去一直延用傳統(tǒng)(手術(shù)療法、化學(xué)療法、放射療法)的綜合性方法，且已取很大的成功經(jīng)驗(yàn)，但是，惡性腫瘤的病死率仍然非常高，主要是死于惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。
人類對(duì)惡性腫瘤發(fā)生機(jī)理的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷了漫長(zhǎng)曲折的過程,各類學(xué)說
眾說紛紜。隨著生命科學(xué)和各門學(xué)科迅速發(fā)展和交叉滲透,特別是人類
對(duì)腫瘤細(xì)胞的分子遺傳學(xué)、腫瘤分子病理生理學(xué)和功能基因組學(xué)的研
究不斷深入，腫瘤基因治療已成為腫瘤生物治療領(lǐng)域研究的熱門話題，
已被廣大學(xué)者所接受，在腫瘤綜合治療中嶄露頭角。特別是近些年來(lái),世界各國(guó)將基因治療的方法從實(shí)驗(yàn)室研究(基礎(chǔ)研究)推進(jìn)到臨床試驗(yàn)
階段，并已取得了一定成果。但是攻克惡性腫瘤轉(zhuǎn)移率、病死率高的
3問題仍需付出不懈的努力。
2002年10月5日美國(guó)衛(wèi)生研究院(NIH)、癌癥研究院(NCI)、疾病控制和預(yù)防中心(CDC)美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)(ACS)和北美腫瘤登記中心聯(lián)合會(huì)(NAACCR)共同完成了美國(guó)"癌癥狀況年度報(bào)告"，美國(guó)財(cái)富雜志(Fortune)的專欄作家對(duì)(1975-2002)癌癥的診治作了總結(jié)性的回顧《人類在對(duì)抗癌癥的戰(zhàn)役中是失敗者？》，提出惡性腫瘤轉(zhuǎn)移率和病死率之所以高，與諸多因素有關(guān)1)腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性；2)腫瘤細(xì)胞多耐藥性；3)抗癌藥物設(shè)計(jì)思路不完善等。報(bào)告提出了應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施，特別關(guān)注了惡性腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理的研究資助項(xiàng)目太少的問題。美國(guó)從1971年開展抗癌癥大戰(zhàn)以來(lái)(與星球大戰(zhàn)計(jì)劃同步起動(dòng))，到2003年，美國(guó)癌癥研究院和國(guó)立衛(wèi)生研究院支持的癌癥研究項(xiàng)目，不到0.5%的研究項(xiàng)目與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)。2003年美國(guó)研究部門資助的癌癥研究項(xiàng)目8900個(gè)，92%沒有提及癌癥轉(zhuǎn)移。由于癌癥是一種多基因改變的疾病，除了癌(致癌癥)基因和抑制癌癥基因外，近來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，存在促使癌癥轉(zhuǎn)移的基因(metastasis genes)和抑制癌癥轉(zhuǎn)移的基因(metastasis suppressor genes)。關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移基因已有不少研究，但腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因表達(dá)異常的分子機(jī)制不十分清楚。研究腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制以及與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因之間的關(guān)系是攻克癌癥的契機(jī)。我們?cè)诔浞终莆瞻┌Y發(fā)病的分子病理生理學(xué)基礎(chǔ)和回顧人類上個(gè)世紀(jì)的抗癌歷經(jīng)中，認(rèn)識(shí)到癌癥是一種多基因變化的疾病，人類在診治的過程中應(yīng)遵守這一科學(xué)邏輯和病理生理變化的客觀規(guī)律。
實(shí)驗(yàn)研究表明癌癥是一個(gè)多階段、多因素參與的過程，同時(shí)大多數(shù)腫瘤又是單細(xì)胞起源，這就意味著在啟動(dòng)癌變的細(xì)胞克隆中，不斷分裂的子代細(xì)胞多次發(fā)生了遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)改變。由此產(chǎn)生的表型成為選擇的對(duì)象,隨之細(xì)胞的惡性程度逐步提高,最終成為轉(zhuǎn)移性癌。這些對(duì)癌變過程有著原發(fā)和關(guān)鍵效應(yīng)的基因改變，以一定的時(shí)間順序發(fā)生,這就構(gòu)成癌變或癌的遺傳學(xué)途徑。近來(lái)學(xué)者們大多認(rèn)同癌癥變化途徑
4與癌基因的獲能(激活、活化)和抑癌基因的失能，及癌癥轉(zhuǎn)移基因得 能和癌癥轉(zhuǎn)移抑制基因的失能(失活、表達(dá)下降甚至不表達(dá))有關(guān),到目 前為止，已發(fā)現(xiàn)癌基因超過100多種,腫瘤抑制基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基 因已超過30多種。細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分化的控制,是通過生長(zhǎng)因子和 細(xì)胞因子與膜表面受體的相互作用，進(jìn)而誘發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終在 核內(nèi)引起相應(yīng)基因的活化或抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)。原癌基因的產(chǎn)物還是在這些 途徑的關(guān)鍵步驟上發(fā)揮作用，如細(xì)胞外的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、跨膜 的生長(zhǎng)因子受體、從細(xì)胞質(zhì)間向核內(nèi)傳遞信號(hào)的各類蛋白，以及在核內(nèi)
作為轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)等。從實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果中分析， 癌基因粗略分成兩種類型第一類癌基因能使細(xì)胞避免衰老和凋亡,起
到永生化基因的作用；第二類癌基因能降低對(duì)生長(zhǎng)因子的要求，誘發(fā)細(xì) 胞形態(tài)的改變,使細(xì)胞增殖失調(diào),持續(xù)生長(zhǎng)并能轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，惡 性腫瘤細(xì)胞侵入局部淋巴管、血管或其他腔道后，瘤細(xì)胞便沿這些管 腔種植到其他部位，繼續(xù)繁殖增生。再近，康奈爾大學(xué)的大衛(wèi)，林頓教 授及其同事發(fā)現(xiàn)，這種觀點(diǎn)忽略了癌細(xì)胞擴(kuò)散前身體的關(guān)鍵性變化。 某個(gè)器官因擴(kuò)散而產(chǎn)生癌變以前，癌變?cè)l(fā)部位派出的"信使"早己為 癌細(xì)胞侵入該器官創(chuàng)造了條件。具體步驟是，癌變細(xì)胞產(chǎn)生某種蛋白， 讓身體特定部位的細(xì)胞發(fā)生異常，使原本健康的部位變成癌細(xì)胞生長(zhǎng) 的溫床。這個(gè)溫床不僅令癌細(xì)胞聚集在一起，而且能讓癌細(xì)胞數(shù)量激 增，最終造成健康器官癌變。第一次提出癌癥"轉(zhuǎn)移前環(huán)境"的新概念， 使癌癥擴(kuò)散的路徑圖更為清晰全面，有利于人們解決癌癥擴(kuò)散這一復(fù) 雜問題。如果能阻止癌癥建立"轉(zhuǎn)移前環(huán)境"，那就能遏制惡性腫瘤擴(kuò) 散，治愈就看到了曙光。癌變途徑的失能遺傳學(xué)的發(fā)生，是關(guān)系到腫瘤 抑制基因的功能失活(失能)，20世紀(jì)60年代在體細(xì)胞雜交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 癌細(xì)胞的惡性特征對(duì)正常細(xì)胞的表型為隱性。在小兒視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 的流行病研究表明,這類腫瘤的發(fā)生有遺傳和散發(fā)兩種形式。根據(jù)診斷 年齡分布的特點(diǎn)，Knudson提出了"兩次擊中"的理論.接著Comings進(jìn)一 步提出"兩次擊中"的是一個(gè)基因的等位基因，也就是說該突變基因是
5隱性的。后來(lái)的一系列研究證明，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生是位于13號(hào)
染色體上的一對(duì)RBI等位基因，由于基因突變，染色體丟失,體細(xì)胞染 色體重組或DNA甲基化等異常改變,引起RBI基因功能丟失(失能)的 結(jié)果,RBI基因是腫瘤抑制基因在癌變途徑中失能遺傳學(xué)事件的原型, 這一事件進(jìn)一步促進(jìn)了這一領(lǐng)域的研究。在家族性癌綜合癥應(yīng)用連鎖 分析和定位克隆技術(shù)，己發(fā)現(xiàn)30多種腫瘤抑制基因。總體上決定腫瘤 遺傳易感性的失能遺傳學(xué)事例遠(yuǎn)多于得能的遺傳學(xué)事例，這可能是由 于腫瘤抑制基因的作用是隱性的，當(dāng)一個(gè)腫瘤抑制基因失能后，剩下 的一個(gè)正常等位基因仍可能維持發(fā)育過程，這十年來(lái)對(duì)家族性癌癥綜 合治療進(jìn)行深入的研究,發(fā)現(xiàn)和鑒定了 30多種與癌相關(guān)基因,其中大多 數(shù)是腫瘤抑制基因。許多學(xué)者將腫瘤抑制基因分為兩組把關(guān)基因 (Gate Keeper)和管護(hù)基因(Caretaker),把關(guān)基因關(guān)系到細(xì)胞周期，細(xì)胞 凋亡和DNA復(fù)制的調(diào)控，它們通過抑制增殖或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，直接控制 腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)，它們的失能是癌變遺傳學(xué)途徑的事件,是癌的限速 因子， 一旦把關(guān)基因失能將啟動(dòng)癌癥演進(jìn)。管護(hù)基因關(guān)系到DNA修復(fù) 和維護(hù)基因組的完整性，它們的失能并不直接作用于癌變遺傳學(xué)途徑， 而是導(dǎo)致遺傳學(xué)的不穩(wěn)定,使把關(guān)基因、原癌基因等癌相關(guān)基因的突變 增加，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)。管護(hù)基因的產(chǎn)物具有識(shí)別、切除和 修復(fù)DNA錯(cuò)配和各類損傷等能力，以維護(hù)基因組的完整性。
此外,研究者發(fā)現(xiàn)除了上述兩類基因的得失能異常導(dǎo)致癌癥的發(fā)生 外，與另一類腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的失能密切相關(guān)，且這類基因的失能 是癌癥導(dǎo)致死亡的關(guān)鍵所至,至今已有多種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因被發(fā)現(xiàn)。 如果說腫瘤抑制基因主要是抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型；而腫瘤轉(zhuǎn)移抑 制基因主要是抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移表型。近年來(lái)有一些腫瘤轉(zhuǎn)移抑制 基因文獻(xiàn)報(bào)道1988年美國(guó)國(guó)立癌癥研究院(NCI) Steeg等發(fā)現(xiàn)，在7 株具有不同轉(zhuǎn)移能力的鼠K-1735黑色素癌細(xì)胞中，有一段基因其 mRNA水平與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，并且在低轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞株中 mRNA水平高出高轉(zhuǎn)移細(xì)胞10倍之多，他們把這一基因暫定為NM23,
6后來(lái)在嚙齒類動(dòng)物腫瘤轉(zhuǎn)移模型細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，也證明了 NM23mRNA水平與轉(zhuǎn)移抑制表型密切相關(guān)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中有兩個(gè)亞型 NM23 基因，分別表示 NM23-H1,和NM23-H2，NM23-H1基因定位于17號(hào)染色體著絲點(diǎn)附近，約P " —Q "間，研究表明NM23-H1和NM23-H2不僅為兩個(gè)完全不同的基因，而且分別受兩個(gè)獨(dú)立的調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)，其中NM23-H1的mRNA水平似乎與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移關(guān)系更為密切。后來(lái)研究者相繼發(fā)現(xiàn)了不同的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，如Timp-l和Timp-2,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過靜脈輸注重組Timp-l，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制。1995年Dong等從前列腺癌雜交細(xì)胞AT6.1的第11號(hào)染色體中分離到特異性抑制前列腺癌轉(zhuǎn)移基因,命名為Kail，后來(lái)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科醫(yī)師宗暉等發(fā)現(xiàn)Kail基因的失能與惡性卵巢癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，他們采用脂質(zhì)體介導(dǎo)Kail cDNA轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM，發(fā)現(xiàn)蛋白的表達(dá)水平有顯著差異。
近來(lái)，麻省理工學(xué)院懷德海研究所的Robert Weinbery用芯片技術(shù)來(lái)分析轉(zhuǎn)移老鼠乳腺癌細(xì)胞的基因表現(xiàn),從中找到一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子-TWIST，這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育過程中，背負(fù)著引發(fā)細(xì)胞移動(dòng)，以及組織重組的任務(wù)，而類似的細(xì)胞移動(dòng)和組織重組情況在腫瘤轉(zhuǎn)移的時(shí)候也會(huì)發(fā)生。他們發(fā)現(xiàn)會(huì)使由鈣粘附素E所調(diào)控的細(xì)胞粘附作用失效，以及產(chǎn)生上皮細(xì)胞上皮--間隙轉(zhuǎn)化,而且被阻斷了 Twist表現(xiàn)的癌細(xì)胞其轉(zhuǎn)移程度會(huì)降低,在人類乳腺癌中侵潤(rùn)性小葉癌中,也觀察到Twist抑制了鈣粘附素E的表現(xiàn)。另外,其他科學(xué)家們也在不同的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)諸多基因與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能密切相關(guān)，如PRL-3的酵素基因不在正常細(xì)胞表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中大量表達(dá)，以及發(fā)現(xiàn)WDNM1基因的mRNA表達(dá)是轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株DMBA-8的20倍，隨后克隆出的第二株WDNM2基因其表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。
Dr.Theodorecu D和同事們?cè)诎螂装┘?xì)胞T24和T24T的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)RhoGDI2基因與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，惡性程度不同，膀胱癌中RhoGD12的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)亦不相同，呈負(fù)相關(guān)。本公司在實(shí)驗(yàn)研究和對(duì)臨床惡性腫瘤病人的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)了 RhoGDI2基因與腫瘤轉(zhuǎn)移非常密切，經(jīng)750例正常人群和各種不同臨床惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的750多例病人的血液標(biāo)本。經(jīng)原位雜交方法測(cè)定RhoGDI2基因水平，發(fā)現(xiàn)正常人群RhoGDI2的表達(dá)大約在40-50%左右，與各種腫瘤體轉(zhuǎn)移病人在10 %水平，大部分病人RhoGDI2基因不表達(dá)，充分說明大部分病人RhoGDI2基因失能，研究的結(jié)果表明，RhoGDI2表達(dá)水平不僅與膀胱癌有關(guān),與其它各種惡性腫瘤也密切相關(guān)。同時(shí)，我們對(duì)二個(gè)癌癥好發(fā)家族的直系親屬的血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RhoGDI2基因的表達(dá)水平比正常人都低。因此，斷定RhoGDI2在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演了一個(gè)重要的角色。此處之所以詳細(xì)論述了腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)議題是因?yàn)榘┌Y的最終死亡均由于腫瘤的轉(zhuǎn)移造成，而且這一問題到目前為止仍無(wú)能為力.要攻克惡性腫瘤,一定要徹底解決腫瘤轉(zhuǎn)移的迷團(tuán)，才能使腫瘤的治療上一新臺(tái)階。癌癥的發(fā)生、演進(jìn)導(dǎo)致最后轉(zhuǎn)移,直至耗盡病人機(jī)體的能量而死亡，癌癥的發(fā)病機(jī)理可以用上面論述的相關(guān)發(fā)病機(jī)制進(jìn)行評(píng)述分析。由于多基因的協(xié)調(diào)失靈，加上機(jī)體的抗癌的免疫能力下降及其它因素改變，產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞惡變,一旦細(xì)胞產(chǎn)生惡變，形成惡性腫瘤后，它就能突破由膠原等組成的基底膜的屏障，開始向血道，淋巴道以及周邊組織進(jìn)行侵潤(rùn)性發(fā)展，直至向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，最后導(dǎo)致機(jī)體的生命終止。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述癌癥發(fā)病的機(jī)制，本發(fā)明的目的是提供一種多蛋白腫瘤(癌癥)綜合治療藥物。
本發(fā)明提供的腫瘤治療藥物包含腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白和腫瘤抑制蛋白以及藥物學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的腫瘤治療藥物中所包含的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白選自RhoGDI2蛋白。RhoGDI2蛋白能有效地抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。
8一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白是包含序列SEQ IDNO:l的同源蛋白R(shí)hoGDI2或其功能衍生物(功能片斷、等價(jià)物或其它描述)。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白為童組人同源蛋白R(shí)hoGDI2。
本發(fā)明的腫瘤治療藥物中所包含的腫瘤抑制蛋白選自MUS81蛋白、MDA-7蛋白。MUS81蛋白是 一個(gè)強(qiáng)有力的殺癌基因蛋白，在細(xì)胞系和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表明，當(dāng)它存在二個(gè)拷貝時(shí)，具有很大殺癌能力。MDA-7蛋白是有雙重功能的治療基因重組的蛋白，它的原型是白細(xì)胞介素24，能提高和增強(qiáng)免疫能力，能增加機(jī)體T細(xì)胞的殺傷能力，另外它亦有直接殺死腫瘤細(xì)胞的能力。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤抑制蛋白為包含SEQ ID NO: 2所述的序列的同源蛋白MUS81或它的功能衍生物(功能片斷、等價(jià)物或其它描述)。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤抑制蛋白為重組MUS81蛋白。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤抑制蛋白為包含SEQIDNO: 3
所述的序列的同源蛋白MDA-7或它的功能衍生物(功能片斷、等價(jià)物
或其它描述)。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤抑制蛋白為重組MDA-7蛋白。
癌癥的發(fā)生機(jī)制是多基因綜合失調(diào)所致,而且腫瘤的類型及發(fā)生的部位不同,其發(fā)病過程和機(jī)理各不相同。從組織學(xué)角度來(lái)分析,腫瘤發(fā)生
的來(lái)源不同(內(nèi)胚層和外胚層),腫瘤的分化演變,基因失調(diào)的機(jī)制不同。
因此,在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，各種不同的腫瘤在選擇治療蛋白時(shí),
各種搭配組合也不相同。
本發(fā)明提出治療蛋白的組合要依照病理學(xué)的基礎(chǔ)，科學(xué)的、有目的進(jìn)行治療基因的搭配組合。由于腫瘤轉(zhuǎn)移是生命終結(jié)的關(guān)鍵因素，在篩選治療基因時(shí)不能忽略這方面的重要性，每個(gè)搭配組合應(yīng)讓腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因參與。
9一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤治療藥物包含重組人同源蛋白
RhoGDI2和重組MUS81蛋白。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤治療藥物包含重組人同源蛋白 RhoGDI2和重組MDA-7蛋白。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤治療藥物包含重組人同源蛋白 RhoGDI2、重組MUS81蛋白和重組MDA-7蛋白。
本發(fā)明的腫瘤治療藥物中所包含的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白、腫瘤抑制 蛋白由編碼所述蛋白的基因插入重組表達(dá)載體后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、在宿 主細(xì)胞中表達(dá)后經(jīng)純化獲得。用于表達(dá)重組蛋白的三組基因均是人類 同源基因。RhoGDI2基因位于染色體12P.3上，基因序列全長(zhǎng)為605bp， 用Ect)Rl，XhoI裝在生產(chǎn)型的載體中；MDA-7基因位于染色體1Q32 位置上，基因序列全長(zhǎng)620bp,用BamHI,XhoI裝在生產(chǎn)型的載體 中；MUS81基因位于染色體11Q13位點(diǎn)上,基因序列全長(zhǎng)工1656bp,用 EcoRl xBal裝在生產(chǎn)型的載體中。本發(fā)明中將RhoGDI2、 MUS81、 MDA-7核苷酸序列插入到重組表達(dá)載體中，重組表達(dá)載體為本領(lǐng)域所 熟知的生產(chǎn)用表達(dá)質(zhì)粒載體。上述表達(dá)載體中含啟動(dòng)子序列,其有利于 插入的遺傳序列有效轉(zhuǎn)錄,表達(dá)載體通常含復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和允許作 轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型選擇的特殊基因。本發(fā)明適用的載體,不局限于在細(xì)菌中 的表達(dá)，也包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和其它細(xì)胞表達(dá)。本發(fā)明的載體亦負(fù)擔(dān) 在實(shí)驗(yàn)性生產(chǎn)和工業(yè)化生產(chǎn)任務(wù)。重組的治療基因按照GLP的要求進(jìn) 行蛋白產(chǎn)品生產(chǎn)，將來(lái)臨床用的治療蛋白產(chǎn)品將嚴(yán)格按照GMP的生產(chǎn) 要求進(jìn)行生產(chǎn)。
本發(fā)明的腫瘤治療藥物可以是單一產(chǎn)品的粉劑、水劑或膠囊形式， 或幾組產(chǎn)品的粉劑、水劑或膠囊包裝在一起的形式。分裝或以凍千粉 形式于4 'C或-2(TC低溫條件下儲(chǔ)存。
本發(fā)明的基因?qū)敕椒ㄒ驅(qū)雽?duì)象和具體病癥而異。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中， 我們有目的嘗試過蛋白的導(dǎo)入方法(給藥途徑)，觀察經(jīng)靜脈和肌肉注射 的蛋白在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)內(nèi)表達(dá)分布情況，靜脈注射后,肝、脾、心、腦、腎等器官表達(dá)率不盡相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的啟發(fā)是,不同類型的腫瘤、不同 部位的腫瘤、不同系統(tǒng)的腫瘤，給藥途徑的選擇不同。例如全身性腫 瘤，血液系統(tǒng)惡性腫瘤，采用靜脈注射方法最佳；呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤, 采用呼吸道吸入給藥方法最優(yōu)；表層腫瘤為局部注射直接注射到腫瘤 組織或表面皮膚給藥。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到優(yōu)選的導(dǎo)入方法是為了治療效果更 顯著。
本發(fā)明的癌癥多蛋白綜合治療是建立在惡性腫瘤發(fā)生、演進(jìn)的病 理基礎(chǔ)上的,這一創(chuàng)新性方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中得到驗(yàn)證，多蛋白綜合 治療和單一蛋白治療的技術(shù)進(jìn)行比較,前者有明顯治療效果，不管在腫 瘤腫塊消退、抑制腫瘤發(fā)生及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面和提高生存率等均有 明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。


圖1為實(shí)施例2中小鼠在治療前腫瘤的示意圖; 圖2為實(shí)施例2中小鼠在經(jīng)RhoGDI2和MDA-7蛋白治療后腫瘤 的示意圖3為實(shí)施例2中小鼠在經(jīng)MUS81, RhoGDI2禾Q MDA-7蛋白治
療后腫瘤的示意具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的方法可從以下具體實(shí)施方式
了解得更清楚。然而應(yīng)理解 以下具體實(shí)施例雖然表明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但只是闡述性的， 因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員明白，依據(jù)這些實(shí)施例的詳細(xì)描述所作出的各種 變化和修改都在本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)。 實(shí)施例1
一種多蛋白腫瘤治療藥物的制備，包括以下步驟及其工藝條件 步驟一基因克隆，構(gòu)建高表達(dá)質(zhì)粒
1、在mRNA水平選定RhoGDI2、 MUS81和MDA-7基因插入的
11最佳位置；
2、 將上述基因構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒；
3、 質(zhì)粒和細(xì)菌選好以后，將cDNA庫(kù)或己合成的上述基因分別用 內(nèi)切酶消化，放在一起用T4連接酶連接，所獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大 腸桿菌，便可獲得高表達(dá)RhoGDI2、 MUS81和MDA-7重組蛋白的重 組體；
步驟二重組菌的發(fā)酵
依次活化過夜，培養(yǎng)，誘導(dǎo)； 步驟三
1、 應(yīng)用超聲波粉碎法進(jìn)行菌體破碎；
2、 破碎液在4攝氏度下20000rpm離心，獲上清和沉淀上清進(jìn) 入色譜分離純化程序；
3、 上清經(jīng)過交換柱層析，以平衡緩沖液進(jìn)行階段性洗脫，經(jīng)過粗 純階段，可去除70%以上的雜蛋白；
4、 洗滌雜蛋白至吸收值為零，洗下目標(biāo)蛋白，收集兩個(gè)柱床體積
洗脫液即可獲得目標(biāo)蛋白
5、 最終產(chǎn)品純化
經(jīng)過色譜組合柱純化，獲得純度為98%的RhoGDI2、 MUS81和 MDA-7重組蛋白。
實(shí)施例2
將純化的RhoGDI2、 MUS81和MDA-7重組蛋白、RhoGDI2和 MDA-7重組蛋白分別處理小鼠皮下腫瘤，分析這兩組重組蛋白組合誘 導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的情況，兩組重組蛋白的濃度都為30ng/ml，結(jié)果請(qǐng)見 圖1、圖2及圖3所示，其中圖1為處理前小鼠皮下腫瘤的大小的示 意圖，圖2是經(jīng)RhoGDI2和MDA-7蛋白治療后腫瘤的示意圖，可見 腫瘤有縮小，圖3是小鼠在經(jīng)MUS81, RhoGDI2和MDA-7蛋白治療 后腫瘤的示意圖，可見腫瘤有明顯的縮小。由上述附圖可見，這兩組重組蛋白組合具有較強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但RhoGDI2、 MUS81 和MDA-7重組蛋白處理的腫瘤細(xì)胞凋亡率要高于RhoGDI2和MDA-7
重組蛋白處理的腫瘤細(xì)胞凋亡率。這說明用多種蛋白綜合治療的效果 要高于兩種蛋白的效果。序列表
SEQUENCE LISTING <110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司 <120> —種多蛋白腫瘤治療藥物 <130> /
<150> 200710171743.5 <151〉 2007-11-30
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Met Thr Glu Lys Ala Pro Glu Pro His Val Glu Glu Asp Asp Asp Asp 1 5 10
Glu Leu Asp Ser Lys Leu Asn Tyr Lys Pro Pro Pro Gin Lys Ser Leu
20 25 30
Lys Glu Leu Gin Glu Met Asp Lys Asp Asp Glu Ser Leu lie Lys Tyr 35 40 45
Lys Lys Thr Leu Leu Gly Asp Gly Pro Val Val Thr Asp Pro Lys Ala 50 55 60
Pro Asn Val Val Val Thr Arg Leu Thr Leu Val Cys Glu Ser Ala Pro
65 70
80
Gly Pro lie Thr Met Asp Leu Thr Gly Asp Leu Glu Ala Leu Lys Lys
85 90
15
75
95Glu Thr lie Val Leu Lys Glu Gly Ser Glu Tyr Arg Val Lys lie His
100 105 110
Phe Lys Val Asn Arg Asp lie Val Ser Gly Leu Lys Tyr Val Gin His
115 120 125
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Ser Tyr Gly Pro Arg Pro Glu Glu Tyr Glu Phe Leu Thr Pro Val Glu
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Glu Ala Pro Lys Gly Met Leu Ala Arg Gly Thr Tyr His Asn Lys Ser
165 170
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Val Asp lie Leu Leu Thr Trp Met Gin Lys Phe Tyr Lys Leu
195 200 20權(quán)利要求
1、一種多蛋白腫瘤治療藥物，包含腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白和腫瘤抑制蛋白，以及藥物學(xué)上可接受的載體賦形劑。
2、 如權(quán)利要求l所述的腫瘤治療藥物，其特征在于，所述腫瘤轉(zhuǎn) 移抑制蛋白選自RhoGDI2蛋白。
3、 如權(quán)利要求2所述的腫瘤治療藥物，其特征在于，所述腫瘤轉(zhuǎn) 移抑制蛋白為包含序列SEQ ID NO:l的同源蛋白R(shí)hoGDI2或其功能衍生物。
4、 如權(quán)利要求3所述的腫瘤治療藥物，其特征在于，所述腫瘤轉(zhuǎn) 移抑制蛋白為重組人同源蛋白R(shí)hoGDI2。
5、 如權(quán)利要求1所述的腫瘤治療藥物，其特征在于，所述腫瘤抑 制蛋白選自MUS81蛋白、MDA-7蛋白中的一種或兩種。
6、 如權(quán)利要求5所述的腫瘤治療藥物，其特征在于，所述腫瘤抑 制蛋白為包含SEQ ID NO: 2所示序列的MUS81蛋白或它的功能衍生 物。
7、 如權(quán)利要求6所述的腫瘤治療藥物，其特征在于，所述MUS81 蛋白為重組MUS81蛋白。
8、 如權(quán)利要求5所述的腫瘤治療藥物，其特征在于，所述腫瘤抑 制蛋白為包含SEQ ID NO: 3所示序列的同源蛋白MDA-7蛋白或它的 功能衍生物。
9、 如權(quán)利要求8所述的腫瘤治療藥物，其特征在于，所述其特征 在于MDA-7蛋白為重組MDA-7蛋白。
10、 如權(quán)利要求1所述的腫瘤治療藥物，其特征在于，它是單一 產(chǎn)品的粉劑、水劑或膠囊形式，或幾組產(chǎn)品的粉劑、水劑或膠囊包裝 在一起的形式。 全文摘要
本發(fā)明提供一種多蛋白腫瘤綜合治療藥物，包含腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白和腫瘤抑制蛋白，以及藥物學(xué)上可接受的載體或賦形劑。采用本發(fā)明的多蛋白腫瘤綜合治療藥物，比采用單一蛋白治療藥物效果更為明顯。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101485881SQ20081018199
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者張?jiān)聘? 裘建英 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司