中草藥組合物、納米乳劑和經(jīng)皮貼劑、及其制備和用于治療創(chuàng)傷性損傷的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中草藥組合物及其制備方法，所述組合物包含紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物。本發(fā)明還涉及一種水包油或油包水型納米乳劑及其制備方法，所述納米乳劑包含水相、有機(jī)相和表面活性劑，其中所述水相包含中草藥材料的水性溶劑提取物和/或所述有機(jī)相包含中草藥材料的油性溶劑提取物。本發(fā)明另外涉及一種包含所述納米乳劑的經(jīng)皮納米貼劑。本發(fā)明中草藥組合物可有效治療創(chuàng)傷性損傷，尤其是骨損傷。本發(fā)明納米乳劑和貼劑能夠顯著促進(jìn)中草藥有效成分的透皮吸收，提高藥物的生物利用度和療效。
【專利說明】中草藥組合物、納米乳劑和經(jīng)皮貼劑、及其制備和用于治療 創(chuàng)傷性損傷的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于治療骨損傷的中草藥配方，以及一種可應(yīng)用于所述中草藥配方的 納米乳劑和可應(yīng)用于所述納米乳劑的經(jīng)皮貼劑。本發(fā)明還涉及所述中草藥配方、納米乳劑 和經(jīng)皮貼劑的制備和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 創(chuàng)傷性的損傷，例如肌肉骨骼損傷--骨折，是門診常見癥之一。成人骨折的全球 發(fā)病率估計約為每年每1000人中有9. 0至22. 8人。鑒于骨折是老年人的常見癥，可以預(yù) 期由于老齡化，在不久的將來骨折病例數(shù)將持續(xù)增加。骨折的病人在康復(fù)出院前需要很長 的一段住院時間。1997年到1998年間紐約髖骨骨折固定術(shù)的平均住院時間為5天，最長為 33天；在1992年瑞士患的男性和女性骨折患者的平均住院時間分別為13. 3天和19. 6天， 而總住院天數(shù)則超過100萬天。骨折在降低社會生產(chǎn)力的同時，增加了衛(wèi)生服務(wù)資源利用 和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0003] 盡管如今外科手術(shù)能有效的進(jìn)行復(fù)位和固定，但是醫(yī)院和臨床工作人員很少關(guān)注 術(shù)后的愈合過程。骨折復(fù)位后，骨骼被鑄件或固定器所固定，此后的愈合主要依賴于自身的 恢復(fù)。病人在住院期間除了疼痛和炎癥治療外常處于無人看護(hù)狀態(tài)。盡管很多科研人員已 經(jīng)去尋找促進(jìn)骨骼愈合的方法，包括生物材料支架、生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白以及生物物 理刺激，但是這些干預(yù)措施還沒有被常規(guī)的臨床應(yīng)用所接受。
[0004] 促進(jìn)骨折的愈合是中醫(yī)的關(guān)鍵領(lǐng)域之一。幾乎所有中醫(yī)對骨折的處理都涉及中藥 糊劑（或藥膏）的局部施用，這樣的治療方式已經(jīng)被中國人使用了數(shù)千年。然而，這些草藥 的配方太多元化并且通常包含多種中草藥例如6種、更經(jīng)常超過十種。這樣的配方使得中 草藥復(fù)方由于嚴(yán)重缺乏基于相關(guān)證據(jù)的科學(xué)支持和臨床數(shù)據(jù)的良好系統(tǒng)證明而難以在世 界范圍內(nèi)被接受。因此，本領(lǐng)域存在這樣的需求：經(jīng)驗證具有良好療效、較低毒副作用的簡 化中草藥配方。
[0005] 中草藥配方的局部應(yīng)用在各種疾病治療例如骨損傷治療中有著廣泛的應(yīng)用。在局 部藥物遞送中，中草藥有效成分的經(jīng)皮運輸是藥物充分發(fā)揮治療效果的關(guān)鍵因素。然而，在 傳統(tǒng)的局部用藥劑中，某些中草藥活性成分例如由于水溶性差等原因難以通過皮膚擴(kuò)散， 從而限制了中草藥的生物利用度和局部用藥的有效性。由此，本領(lǐng)域也需要一種可有效經(jīng) 皮遞送中草藥活性成分的給藥系統(tǒng)，以提高局部施用的中草藥配方的生物利用率和效用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為滿足上述大量需求中的一個或多個，本申請?zhí)峁┝艘环N包含中草藥的水性和油 性提取物的中草藥組合物、可用于分散或溶解該中草藥組合物的納米乳劑、可用于遞送該 中草藥組合物的基質(zhì)型經(jīng)皮貼劑、和它們的制備方法以及在治療創(chuàng)傷性組織或骨骼損傷中 的用途。
[0007] 在一個方面，本發(fā)明涉及一種中草藥組合物，其包含紅花（Carthami Flos)、續(xù)斷 (Dipsaci Radix)、三七（NotoginsengRhizoma)和大黃（Rhei Rhizoma)的水性溶劑提取物 和油性溶劑提取物以及任選地，藥學(xué)上可接受的載體，并且其中所述中草藥組合物不包含 來自桅子（FructusGardeniae)和接骨木（SambucusWilliamsii)的提取物。
[0008] 在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物由下列組成：紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性 溶劑提取物和油性溶劑提取物以及任選地，藥學(xué)上可接受的載體。
[0009] 在一個實施方案中，所述水性溶劑為水和/或所述油性溶劑為醇、優(yōu)選乙醇，諸如 95%的乙醇水溶液。
[0010] 在一個實施方案中，紅花、續(xù)斷、三七和大黃的重量比為（0.8-1. 2) : (1-1.5):( 0. 8-1.2) : (1-2)，優(yōu)選1 : 1 : 1 : 1至1 : 1.5 : 1 : 2的范圍。優(yōu)選地，所述水性溶 劑提取物和所述油性溶劑提取物的重量比為10 : 1至7 : 1。更優(yōu)選地，所述水性溶劑 提取物和所述油性溶劑提取物的重量比以占所述組合物的重量百分比計為30% : 3%至 42% : 6%，更優(yōu)選 35% : 4. 3%至 39.8% : 5%。
[0011] 在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可通過以下步驟制備：
[0012] a)準(zhǔn)備紅花、續(xù)斷、三七和大黃，任選地將其切塊；
[0013] b)將步驟a)的原料共同或分別在水性溶劑中浸泡和/或回流下加熱足夠長的時 間，以獲得水性溶劑提取物，任選地將所得水性溶劑提取物進(jìn)行選自過濾、濃縮和冷凍干燥 的處理；
[0014] c)將步驟a)的原料或步驟b)所得的提取殘余物在油性溶劑中浸泡和/或回流加 熱足夠長的時間，以獲得油性溶劑提取物，任選地將所得油性溶劑提取物進(jìn)行選自過濾、濃 縮和冷凍干燥的處理；和
[0015] d)將獲得的所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物配制為組合物，其中任選 地將獲得的所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物與至少一種藥學(xué)可接受的載體組 合。
[0016] 在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可通過以下步驟制備：
[0017] a)準(zhǔn)備紅花、續(xù)斷、三七和大黃，任選地將其切塊；
[0018] b)將步驟a)的原料共同或分別在油性溶劑中浸泡和/或回流下加熱足夠長的時 間，以獲得油性溶劑提取物，任選地將所得油性溶劑提取物進(jìn)行選自過濾、濃縮和冷凍干燥 的處理；
[0019] c)將步驟a)的原料或步驟b)所得的提取殘余物在水性溶劑中浸泡和/或回流加 熱足夠長的時間，以獲得水性溶劑提取物，任選地將所得水性溶劑提取物進(jìn)行選自過濾、濃 縮和冷凍干燥的處理；和
[0020] d)組合獲得的所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物，其中任選地將獲得的 所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物與至少一種藥學(xué)可接受的載體組合。
[0021] 在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可以是糊劑、藥膏、納米乳劑或經(jīng)皮貼劑的形 式。
[0022] 在一個方面，本發(fā)明涉及一種水包油或油包水型納米乳劑，其包含水相、有機(jī)相和 表面活性劑，其中所述水相包含一種或多種中草藥材料的水性溶劑提取物和/或所述有機(jī) 相包含所述一種或多種中草藥材料的油性溶劑提取物。
[0023] 在一個實施方案中，本發(fā)明的納米乳劑是水包油型納米乳劑。
[0024] 在一個實施方案中，所述水相或有機(jī)相具有10_200nm、優(yōu)選10-50nm的液滴；和/ 或所述水相按重量計占所述納米乳劑的60-90%、優(yōu)選75-85% ;和/或所述有機(jī)相按重量 計占所述納米乳劑的2-20%、優(yōu)選2-8%;和/或所述表面活性劑按重量計占所述納米乳劑 的 4-40%、優(yōu)選 10-22%。
[0025] 取決于納米乳劑的類型，即取決于所述分散相為水相或有機(jī)相，所述分散相為 10-200nm、優(yōu)選10-50nm的水滴或油滴。
[0026] 在一個實施方案中，在本發(fā)明的納米乳劑中，形成所述水相的水相溶劑為水；和/ 或其中形成所述油相的油相溶劑為Sefsol-218、Capryol-90、甘油三脂、Myritol-318、朽 1檬 烯、液體石蠟、乙醇或其一種或多種的組合；和/或其中所述表面活性劑為具有范圍在8至 18的HLB值的非離子表面活性劑，例如Labrasol、氫化菌麻油EL(Cremophor EL)、吐溫20、 吐溫60和吐溫80,優(yōu)選為氫化蓖麻油EL和吐溫20。
[0027] 在一個實施方案中，在本發(fā)明的納米乳劑中，所述水性溶劑提取物和所述油性溶 劑提取物分別為上文所描述的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物。
[0028] 在一個實施方案中，所述水性提取物在納米乳劑中的含量以重量計（W/W)為 5-10% ;所述油性提取物在納米乳劑中的含量以重量計（W/W)為22-30%。
[0029] 在一個方面，本發(fā)明涉及一種制備本發(fā)明的水包油或油包水型納米乳劑的方法， 其可包括以下步驟：
[0030] 1)利用水性溶劑提取中草藥材料以獲得水性溶劑提取物，所述水性溶劑優(yōu)選為 水；
[0031] 2)利用油性溶劑提取中草藥材料以獲得油性溶劑提取物，所述油性溶劑優(yōu)選為 醇，更優(yōu)選為95%乙醇；
[0032] 3)將步驟1)獲得的水性溶劑提取物溶解于水相溶劑，以形成包含所述水性溶劑 提取物的水相，并且將步驟2)獲得的油性溶劑提取物溶解于油相溶劑，以形成包含所述油 性溶劑提取物的有機(jī)相；
[0033] 4)將所述水相和所述有機(jī)相與表面活性劑混合，形成均化前混合物；
[0034] 5)以12, 000-30, OOOrpm的速度將所述均化前混合物均化10-30分鐘，形成所述納 米乳劑。
[0035] 在一個方面，本發(fā)明涉及一種經(jīng)皮貼劑，其包含襯層、基質(zhì)層和剝離層，所述基質(zhì) 層包含本發(fā)明的水包油型或油包水型納米乳劑和粘合劑，所述納米乳劑優(yōu)選以重量計占所 述基質(zhì)層的1-25%;其中所述粘合劑優(yōu)選選自由卡波姆980、卡波普U20、卡波普HV-805EG、 羧甲基纖維素鈉、明膠、聚丙烯酸鈉鹽、聚丙烯酸鈉鹽NP700、聚乙烯吡咯烷酮10和聚乙 烯吡咯烷酮K90及其組合組成的組，所述粘合劑更優(yōu)選為聚丙烯酸鈉鹽、聚丙烯酸鈉鹽 NP700、卡波普HV-805EG和聚乙烯吡咯烷酮的組合；并且所述粘合劑優(yōu)選以重量計占所述 基質(zhì)層的10-15%。
[0036] 在一個實施方案中，所述基質(zhì)層進(jìn)一步包含選自交聯(lián)劑、濕潤劑、支架材料或填充 齊IJ、和pH控制劑組成的組的一種或多種成分。
[0037] 在一個實施方案中，其中所述基質(zhì)層以基質(zhì)層的重量計包含1-25%的納米乳劑、 10-15 %的粘合劑、0.01-0. 8 %的交聯(lián)劑、15-25 %的濕潤劑、1-10 %的支架材料或填充劑、 和將pH控制在5-6的pH控制劑。
[0038] 在一個方面，本申請?zhí)峁┝吮景l(fā)明的中草藥組合物、納米乳劑或經(jīng)皮貼劑在制備 用于治療創(chuàng)傷性損傷的藥物中的用途。
[0039] 在一個實施方案中，所述創(chuàng)傷性損傷為組織損傷或骨損傷，例如創(chuàng)傷性肌肉骨骼 損傷，諸如軟組織損傷或骨折。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖la顯示根據(jù)本發(fā)明制備的紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性提取物對LPS誘導(dǎo)的 RAW264. 7細(xì)胞中N0產(chǎn)生的影響。
[0041] 圖lb顯示根據(jù)本發(fā)明制備的紅花、續(xù)斷、三七和大黃的油性提取物對LPS誘導(dǎo)的 RAW264. 7細(xì)胞中N0產(chǎn)生的影響。
[0042] 圖2a顯示根據(jù)本發(fā)明制備的紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性提取物對UMR-106成 骨細(xì)胞活力和增殖的作用。
[0043] 圖2b顯示本發(fā)明制備的紅花、續(xù)斷、三七和大黃的油性提取物對UMR-106成骨細(xì) 胞活力和增殖的作用。
[0044] 圖3a_3f顯示損傷的骨組織經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的中草藥組合物治療6周后，屈服強(qiáng)度、 屈服強(qiáng)度做功、極限強(qiáng)度、極限強(qiáng)度做功、破壞強(qiáng)度、破壞強(qiáng)度做功得以顯著改善。
[0045] 圖4a顯示在接收隔室中測定的基于重量百分比的中草藥糊劑和納米貼劑的擴(kuò)散 性能的比較。
[0046] 圖4b顯示在豬皮膚中測定的基于重量百分比的中草藥糊劑和納米貼劑的擴(kuò)散性 能的比較。
[0047] 圖5為根據(jù)本發(fā)明制備的基質(zhì)型經(jīng)皮貼劑的示意圖。

【具體實施方式】
[0048] 下述【具體實施方式】更全面地闡述本發(fā)明及其多種附加的優(yōu)勢，以便本發(fā)明及本發(fā) 明的多種附加的優(yōu)勢都更加清晰。
[0049] 本發(fā)明一方面提供了一種中草藥組合物，其包含紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性溶 劑提取物和油性溶劑提取物以及任選地，藥學(xué)上可接受的載體，并且所述組合物不包含來 自桅子和接骨木的提取物。進(jìn)一步，本發(fā)明的中草藥組合物由下列組成：紅花、續(xù)斷、三七和 大黃的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物以及任選地，藥學(xué)上可接受的載體。
[0050] 上述水性溶劑和油性溶劑可以是本領(lǐng)域分別適合提取紅花、續(xù)斷、三七和大黃中 所含有的親水部分和疏水部分的藥學(xué)可接受的任何水性溶劑和任何油性溶劑，使得中草藥 的水性和油性成分，包括特別是有效成分，被充分的提取出來。
[0051] 至少對于上述中草藥，即紅花、續(xù)斷、三七和大黃，優(yōu)選的水性溶劑是水、更優(yōu)選蒸 餾水；優(yōu)選的油性溶劑是95%的乙醇水溶液。
[0052] 優(yōu)選地，紅花、續(xù)斷、三七和大黃中草藥材料的重量比可以為（0.8-1. 2) : (1-1.5) :(0. 8-1.2) : (1-2)，更優(yōu)選1 : 1 : 1 : 1至1 : 1.5 : 1 : 2;優(yōu)選地，所述中草藥組合物 中的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物的重量比為10 : 1至7 : 1，更優(yōu)選地，所述水性溶 劑提取物和所述油性溶劑提取物的重量比以占所述組合物的重量百分比計為40% : 4% 至 35% : 5%，優(yōu)選為 35% : 4.3%至 39.8% : 5%。
[0053] 可局部施用所述中草藥組合物，以有效治療治療創(chuàng)傷性損傷。所述創(chuàng)傷性損傷可 包括組織（例如軟組織）損傷或骨損傷，例如創(chuàng)傷性肌肉骨骼損傷，諸如骨折。
[0054] 所述治療基于所述中草藥組合物促進(jìn)骨愈合的作用，如由下文實施例所證實，其 中所述組合物的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物協(xié)同互補(bǔ)作用，在骨折發(fā)生后，有效調(diào) 控和協(xié)調(diào)炎癥的發(fā)展以及骨再生，促進(jìn)皮質(zhì)骨修復(fù)，促進(jìn)損傷的骨組織的愈合。本發(fā)明所 使用的中草藥成分在經(jīng)過充分提取后（例如實施例1)，其水性溶劑提取物和油性溶劑提取 物分別包含中草藥成分的親水活性成分和疏水活性成分。兩種類型的活性成分協(xié)同作用， 顯著促進(jìn)創(chuàng)傷性骨組織損傷的愈合（如實施例2所驗證）。本申請令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā) 明所選擇的中草藥復(fù)方不僅沒有隨著配方的簡化而在骨愈合效應(yīng)上受到影響，而且進(jìn)一步 顯著提高了骨骼生物力學(xué)強(qiáng)度，如圖3所示。同時，本發(fā)明的中草藥組合物的原料紅花、續(xù) 斷、三七和大黃的提取物對于生物體例如人體的毒副作用大大降低，可在有效治療疾病的 同時，降低對生物體造成不利影響的風(fēng)險。此外，本發(fā)明所選擇的中草藥成分其在本領(lǐng)域中 均具有明確的化學(xué)指標(biāo)，這使得可以對其進(jìn)行質(zhì)量控制和透皮研究。
[0055] 本發(fā)明另一方面提供了上述中草藥組合物的制備方法，其包括：
[0056] a)準(zhǔn)備紅花、續(xù)斷、三七和大黃，任選地將其切塊；
[0057] b)將步驟a)的原料共同或分別在水性溶劑中浸泡和/或回流下加熱足夠長的時 間，以獲得水性溶劑提取物，任選地將所得水性溶劑提取物進(jìn)行選自過濾、濃縮和冷凍干燥 的處理；
[0058] c)將步驟a)的原料或步驟b)所得的提取殘余物在油性溶劑中浸泡和/或回流加 熱足夠長的時間，以獲得油性溶劑提取物，任選地將所得油性溶劑提取物進(jìn)行選自過濾、濃 縮和冷凍干燥的處理；和
[0059] d)合并獲得的所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物，其中任選地將獲得的 所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物與至少一種藥學(xué)可接受的賦形劑組合；
[0060] 其中步驟b)和步驟c)的順序可交換，即可先進(jìn)行中草藥的油性溶劑提取，再進(jìn)行 水性溶劑提取。然而，優(yōu)選的步驟是先進(jìn)行水性溶劑提取。過濾步驟可用來除去固體殘渣。
[0061] 在溶劑中浸泡和/或回流下加熱的時間應(yīng)該足夠長，以充分提取中草藥成分。上 述四種中草藥原料可以在水性溶劑例如蒸餾水中浸泡例如至少1小時；在蒸餾水中回流加 熱，例如至少約2小時/次，優(yōu)選2次，可充分提取水性提取物。水性提取的殘余物一般可 在油性溶劑例如95%乙醇溶液中回流加熱例如至少2小時可充分提取油性提取物。確定不 同中草藥原料所需要的提取條件在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。
[0062] 其中將獲得的所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物配制為組合物的步驟 可依據(jù)預(yù)期的不同的藥物施用方式。例如，所獲得的水性提取物和油性提取物可簡單地混 合在一起，或者與任何適用的藥學(xué)可接受的賦形劑組合配制為適合不同途徑施用的劑型。 針對局部施用的劑型，獲得的所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物還可如下文所述 配制成局部施用納米乳劑，以改善藥物活性成分的經(jīng)皮遞送，從而提高藥物的生物利用度 和治療效果。
[0063] 在一個實施方案中，所述提取物可分別經(jīng)過濾、濃縮、冷凍干燥之后，與50%的乙 醇溶液混合，獲得用于局部施用的糊劑。
[0064] 本發(fā)明另一方面提供了一種納米乳劑，其包含水相、有機(jī)相和表面活性劑，其中所 述水相包含中草藥材料的水性溶劑提取物和/或所述有機(jī)相包含中草藥材料的油性溶劑 提取物。取決于例如藥物活性成分的種類、含量等，所述納米乳劑可采用水包油型或油包水 型，即分散連相可以為水相或油相。根據(jù)激光散射測定，本發(fā)明納米乳劑的分散相可具有 10nm到200nm的液滴（水滴或油滴，取決于納米乳劑的類型），優(yōu)選10-50nm。
[0065] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠依據(jù)例如乳劑的類型，確定納米乳劑中水相、油相等成分的 含量。例如，水相按重量計可以占所述納米乳劑的60-90%、優(yōu)選75-85%;和/或有機(jī)相按 重量計可以占所述納米乳劑的2-20 %、優(yōu)選2-8 %;和/或表面活性劑按重量計可以占所述 納米乳劑的4-40%、優(yōu)選10-22%。形成所述水相的水相溶劑可以為本領(lǐng)域任何適合的藥 學(xué)可接受的水相溶劑，例如水。
[0066] 形成所述油相的油相溶劑可以為本領(lǐng)域任何適合的藥學(xué)可接受的油相溶劑，例如 Sefsol-218、Capryol-90、甘油三脂、Myritol-318、朽1 樣烯（limonene)、液體石錯（liquid paraffin)、乙醇或其組合。
[0067] 可以加入表面活性劑以降低連續(xù)相和分散相之間的界面張力，從而形成乳劑?？?根據(jù)期望形成的納米乳劑的類型（即水包油型或油包水型）選擇合適的表面活性劑。有利 于形成水包油型乳劑的表面活性劑為具有范圍在8至18的HLB值（即親水-親油平衡值） 的非離子表面活性劑。此類表面活性劑的實例包括Labrasol、氫化菌麻油EL(Cremophor EL)、吐溫20、吐溫60和吐溫80,其中氫化蓖麻油EL和吐溫20更為優(yōu)選；所述表面活性劑 優(yōu)選按重量計占所述納米乳劑的4-40%，更優(yōu)選10-22%。
[0068] 重要的是，中草藥的提取物成分完全溶解在水相溶劑或油相溶劑中，以保證充分 的均化。中草藥的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物可采用如上文所述的以及其他任何適 用的方法提取獲得。所述提取物以及溶劑的用量可依據(jù)具體中草藥的用途、其所針對的疾 病、所述提取物的類型、提取率、提取物在水相溶劑和油相溶劑中的溶解度等由本領(lǐng)域技術(shù) 人員容易地確定。
[0069] 在一個實施方案中，當(dāng)采用油性溶劑例如醇諸如乙醇進(jìn)行提取時，基于所采用的 油性溶劑的特性，所得到的油性溶劑提取物包含水溶部分和油溶部分。在進(jìn)一步的實施方 案中，在本發(fā)明的提取方法中，中草藥先進(jìn)行水提取，然后進(jìn)行油性溶劑提取，從而在油性 溶劑提取過程中，中草藥中剩余的水溶部分和全部油溶部分被一并提取，這導(dǎo)致油性溶劑 提取物一部分是親水性，一部分是親油性的。所獲得的油性提取物中的水溶部分將由于其 親水性而包含在最終形成的納米乳劑的水相中。在一個實施方案中，水性提取物在納米乳 劑中的含量為5-lOwt. % ;油性提取物在納米乳劑中的含量為22-30wt. %。
[0070] 在一個實施方案中，本發(fā)明納米乳劑為在其水相中包含上述中草藥組合物（紅 花、續(xù)斷、三七和大黃）的水性溶劑提取物，在其油相中包含上述中草藥組合物的油性溶劑 提取物的水包油型納米乳劑。在進(jìn)一步的實施方案中，形成所述水相的溶劑可為水；和/或 形成所述油相的溶劑可為Capryol-90。該納米乳劑的組成，例如水相、油相、水性溶劑提取 物和油性溶劑提取物等，均可采用上文所提及的技術(shù)方案。
[0071] 在一個實施方案中，本發(fā)明納米乳劑包含74. 4-84. 8wt. %水相、3.8-3. 9wt. %有 機(jī)相以及11. 4-21. 7wt. %表面活性劑。
[0072] 在進(jìn)一步的一個實施方案中，本發(fā)明納米乳劑包含74. 4-84. 8wt. %水相，其 中所述水相溶劑為水；3.8-3.9被.％有機(jī)相，其中所述有機(jī)相溶劑為0&?^〇1-90;以及 11. 4-21. 7wt. %吐溫20作為表面活性劑。在進(jìn)一步的實施方案中，所述水相所包含的水性 提取物在所述納米乳劑中的含量為5-10%，所述油相中所包含的油性提取物在所述納米乳 劑中的含量為22-30%。所述納米乳劑提供了遞送中草藥水性提取物和油性提取物的特別 益處，顯著提高了中草藥活性成分的經(jīng)皮透過率。
[0073] 本發(fā)明另一方面提供了一種制備上述納米乳劑的方法，其包括：
[0074] 1)利用水性溶劑提取中草藥材料以獲得水性溶劑提取物，所述水性溶劑優(yōu)選為 水；
[0075] 2)利用油性溶劑提取中草藥材料以獲得油性溶劑提取物，所述油性溶劑優(yōu)選為 醇，更優(yōu)選為95%乙醇；
[0076] 3)將步驟1)獲得的水性溶劑提取物溶解于水相溶劑，以形成包含所述水性溶劑 提取物的水相，并且將步驟2)獲得的油性溶劑提取物溶解于油相溶劑，以形成包含所述油 性溶劑提取物的有機(jī)相；
[0077] 4)將所述水相和所述有機(jī)相與表面活性劑混合，形成均化前混合物；
[0078] 5)以12, 000-30, OOOrpm的速度將所述均化前混合物均化10-30分鐘，形成所述納 米乳劑。
[0079] 在一個實施方案中，將中草藥材料的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物（即所述 中草藥材料的親水部分和疏水部分）分別（充分）溶解在形成所述水相的水相溶劑和形成 所述油相的油相溶劑中，以獲得包含所述水性溶劑提取物的水相和包含所述油性溶劑提取 物的有機(jī)相。
[0080] 可選的，所述水性溶劑提取物和油性溶劑提取物為進(jìn)行了過濾、濃縮和/或冷凍 干燥處理的提取物，可選的，所述提取物為經(jīng)過冷凍干燥處理的粉末。
[0081] 在一個實施方案中，所述中草藥材料的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物分別為 上文所述的中草藥組合物中的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物，即紅花、續(xù)斷、三七和大 黃的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物。所述提取物可選的經(jīng)過濾、濃縮例如減壓濃縮和 冷凍干燥的處理為粉末形態(tài)。
[0082] 在一個制備納米乳劑的實施方案中，將表面活性劑先與所獲得的水相均勻混合， 接著與均勻的油相（即有機(jī)相）混合，獲得均化前混合物。之后的均化可采用機(jī)械均質(zhì)器 進(jìn)行，例如以12, 000-30, OOOrpm的速度進(jìn)行10-30分鐘，優(yōu)選以24, 000-30, OOOrpm的速度 進(jìn)行20-30分鐘。
[0083] 均化處理后所獲得的納米乳劑可進(jìn)行進(jìn)一步的1?壓均化工藝，以進(jìn)一步提1?其均 質(zhì)度。對于該高壓均化工藝，壓力可設(shè)置在200-800巴，均化循環(huán)數(shù)可設(shè)置為2-10次。 [0084] 本發(fā)明納米乳劑與傳統(tǒng)的中草藥劑型相比，如由下文實施例部分所驗證，可顯著 地全面提高藥物活性成分的經(jīng)皮擴(kuò)散，從而提高藥物的生物利用率，改善創(chuàng)傷性損傷的治 療效果。并且本發(fā)明的納米乳劑可分別在水相和有機(jī)相中包含多種藥物活性成分。
[0085] 本發(fā)明納米乳劑可適用于含有親水性有效活性成分和/或疏水性有效活性成分 的任何中草藥配方，尤其是本發(fā)明的中草藥組合物。
[0086] 本發(fā)明另一方面提供了 一種經(jīng)皮貼劑，其包含襯層、基質(zhì)層和剝離層。
[0087] 其中，所述基質(zhì)層包含如上文所述的水包油型或油包水型納米乳劑和粘合劑；其 中所述納米乳劑優(yōu)選以重量計占所述基質(zhì)層的1-25%;其中所述粘合劑選自由卡波姆980、 卡波普U20、卡波普HV-805EG、羧甲基纖維素鈉、明膠、聚丙烯酸鈉鹽、聚丙烯酸鈉鹽NP700、 聚乙烯吡咯烷酮10和聚乙烯吡咯烷酮K90及其組合組成的組，所述粘合劑優(yōu)選為聚丙烯酸 鈉鹽、聚丙烯酸鈉鹽NP700、卡波普HV-805EG和聚乙烯吡咯烷酮的組合；并且所述粘合劑優(yōu) 選以重量計占所述基質(zhì)層的10-15%。
[0088] 在一個實施方案中，所述基質(zhì)層進(jìn)一步包含選自交聯(lián)劑、濕潤劑、支架材料或填充 齊U、和pH控制劑的一種或多種成分。
[0089] 在所述基質(zhì)層的基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)形成中，往往會使用交聯(lián)劑。交聯(lián)劑的實例包括氯化鋁、 朽1檬酸、氨基乙酸二輕錯（dihydroxyaluminumaminoacetate)和聚乙烯醇。對于包含聚丙 烯酸鈉鹽的基質(zhì)層，優(yōu)選使用氨基乙酸二羥鋁。所述交聯(lián)劑優(yōu)選以重量計占所述基質(zhì)層的 0· 01-0. 8%。
[0090] 為了全面支持所述基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，還往往使用支架材料或填充劑。所述支架材料或填 充劑的實例包括碳酸鋁、高嶺土、二氧化硅和氧化鋅。其中，優(yōu)選使用高嶺土。優(yōu)選地，所述 支架材料以重量計占所述基質(zhì)層的1-10%。
[0091] 此外，所述基質(zhì)層還可包含濕潤劑以保持貼劑的濕潤。所述濕潤劑的實例包括甘 油、丙二醇、PEG-400、D-山梨醇、吐溫80及其組合。其中優(yōu)選的是甘油和D-山梨醇的組合。 優(yōu)選地，所述濕潤劑以重量計占所述基質(zhì)層的10-40%，優(yōu)選15-25%。
[0092] 所述基質(zhì)層還可進(jìn)一步補(bǔ)充pH控制劑，例如酒石酸。優(yōu)選所述基質(zhì)層的pH被控 制在5-6。
[0093] 在一個實施方案中，所述基質(zhì)層以基質(zhì)的重量計包含1-25 %的納米乳劑、10-15 % 的粘合劑、0.01-0. 8 %的交聯(lián)劑、15-25 %的濕潤劑、1-10 %的支架材料或填充劑、和將pH 控制在5-6的pH控制劑。
[0094] 在一個實施方案中，本發(fā)明基質(zhì)層包含17. 4-18. 4wt %的納米乳劑、 12. 4-12. 7wt%的粘合劑、0· 4wt%的交聯(lián)劑、19-19. 7wt%的濕潤劑、4. 6wt%的支架材料或 填充劑、〇. 2wt %的將pH控制在5-6的pH控制劑和余量的水。
[0095] 在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明基質(zhì)層包含17. 4-18. 4wt%的納米乳劑；8. lwt% 聚丙烯酸鈉鹽、2. 9wt%聚乙烯吡咯烷酮10和1.4wt%卡波普U20作為粘合劑或者8. lwt% 聚丙烯酸鈉鹽、〇. 3wt%聚丙烯酸鈉鹽NP-700、2. 9wt%聚乙烯批咯燒酮10和1. 4wt%卡 波普HV-805EG作為粘合劑；0. 4wt %氯化鋁或者0. 4wt %氨基乙酸二羥鋁作為交聯(lián)劑； 5. 8wt%甘油和13. 9wt% D-山梨醇作為濕潤劑；4. 6wt%高嶺土作為支架材料；0· 2wt%酒 石酸作為pH控制在5-6的pH控制劑和余量的水。在一個方面中，可包含在本發(fā)明的基質(zhì) 層中的納米乳劑是本申請中所定義的納米乳劑。本發(fā)明的包含基質(zhì)層的經(jīng)皮貼劑提供了遞 送中草藥水性提取物和油性提取物的特別益處，顯著提高了中草藥（例如紅花、續(xù)斷、三七 和大黃及其組合）活性成分的經(jīng)皮透過率。上述襯層是為本發(fā)明的貼劑提供支持的惰性襯 層。所述剝離層覆蓋并保護(hù)所述基質(zhì)層。
[0096] 襯層可以是基于聚乙烯的膜或允許不同的層結(jié)合為單獨網(wǎng)織物的基于聚酯 的層壓材料（laminate)。襯層的實例包括 CoTran9720、CoTran9722、Scotchpakl 109、 Scotehpak9723、Scotchpak9730和Scotchpak9735。在本發(fā)明中優(yōu)選的是不與所述基質(zhì)層 發(fā)生反應(yīng)的基于聚酯的膜。
[0097] 所述剝離層優(yōu)選具有低的透濕性，并且與所述基質(zhì)層相容，以保護(hù)所述基質(zhì)層。
[0098] 本發(fā)明經(jīng)皮貼劑可通過以下工藝制備：將構(gòu)成所述基質(zhì)層的基質(zhì)或基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)均勻 地涂在所述襯層上，在65-100°C下在烤箱中干燥6-24小時，優(yōu)選在70-80°C下干燥10-16 小時；冷卻后，將剝離層置于所述基質(zhì)層上以保護(hù)所述基質(zhì)層，獲得經(jīng)皮貼劑。
[0099] 本發(fā)明在一方面涉及如上文所述的中草藥組合物、包含其的納米乳劑或包含其的 經(jīng)皮貼劑（即包含含有所述中草藥組合物的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物的水包油 或油包水型納米乳劑的經(jīng)皮貼劑）在制備用于治療創(chuàng)傷性損傷的藥物中的用途。所述用途 基于上文所述的本發(fā)明中草藥組合物促進(jìn)骨愈合的作用。
[0100] 在一個實施方案中，所述創(chuàng)傷性損傷包括組織（例如軟組織）損傷或骨損傷；例如 創(chuàng)傷性肌肉骨骼損傷，諸如骨折。
[0101] 優(yōu)選局部施用所述中草藥組合物和包含其的所述納米乳劑。
[0102] 基于本發(fā)明納米乳劑促進(jìn)藥物活性成分的經(jīng)皮擴(kuò)散運輸?shù)男Ч景l(fā)明所述中草 藥組合物的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物的水包油或油包水型納米乳劑以及包含所 述納米乳劑的經(jīng)皮貼劑在局部施用時，將促進(jìn)所述提取物中藥物活性成分的經(jīng)皮擴(kuò)散，可 提高藥物的生物利用率，從而進(jìn)一步提高創(chuàng)傷性損傷的治療效果。
[0103] 以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，所 述具體實施例僅為了更加清楚地解釋本發(fā)明，無論如何都不應(yīng)視為對本發(fā)明的任何限制。 除非特別說明，所有試劑和設(shè)備均可商購獲得并且所有含量均以重量計算。
[0104] 實施例
[0105] 實施例中所使用的四味中草藥紅花、續(xù)斷、三七和大黃可根據(jù)中國藥典2010版中 推薦的方法，采用薄層色譜層析來鑒定。下文采用的紅花、續(xù)斷、三七和大黃均購自香港當(dāng) 地的中藥供應(yīng)商，且已經(jīng)根據(jù)上述方法加以鑒定。
[0106] 實施例1制備包含紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物 的中草藥組合物
[0107] 準(zhǔn)備四種草藥原材料（紅花、續(xù)斷、三七和大黃的重量比為1 : 1 : 1 : 1)共250 克，切成小段，在1. 0L蒸餾水中浸泡1小時。回流加熱煮沸2次，每次2小時，收集水提取 物，通過一片脫脂紗布過濾。殘余物以95%乙醇進(jìn)一步回流加熱煮沸2小時。收集乙醇提 取物并再次脫脂紗布過濾。水和乙醇的濾液分別在50°C下減壓濃縮，然后在冷凍干燥系統(tǒng) (Freezonel 2, Labconco, Missouri，美國）中凍干成為粉末。
[0108] 水提取物[CDNR(aq)]和乙醇提取物[CDNR(e)]的提取率分別為39. 8% w/w和 5. 0% w/w。
[0109] 取19. 5g CDNR(aq)和3. 0g CDNR(e)與17ml50%乙醇混合制備用于局部施用的中 草藥糊劑。
[0110] 實施例2包含紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物的中 草藥組合物對于促進(jìn)骨愈合的效果
[0111] 小鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞RAW254. 7和大鼠成骨細(xì)胞UMR-106均購自美國模式培 養(yǎng)物保藏中心（ATCC，美國）。采用實施例1中制備的紅花、續(xù)斷、三七和大黃水性提取物 (CDNR(aq))和油性提取物（CDNR(e))分別作為待測樣品。
[0112] 紅花、續(xù)斷、三七和大黃的油件溶劑提取物抑制LPS誘導(dǎo)的RM254. 7細(xì)胞中一氧 化氮的產(chǎn)牛
[0113] 為了體外測定本發(fā)明中草藥組合物的抗炎性（即脂多糖（LPS)誘導(dǎo)的一氧化氮抑 制），采用含有1〇%的胎牛血清0^€6了6吐11〇1(^丨68，化4)、10(^/1111青霉素和10〇11^/1鏈霉 素 （Life Technologies，USA)的高糖 DMEM(3500mg/L ;購自 Life Technologies，USA)培養(yǎng) 基，在37°C、5% C 0 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小鼠 RAW264. 7巨噬細(xì)胞。培養(yǎng)期間定期傳代。
[0114] 根據(jù)溶解度性質(zhì)的不同，分別采用上述DMEM培養(yǎng)基或DMS0水溶液（1 %，v/v)溶 解 CDNR(aq)至 0、50、100、200 和 400μ g/mL，溶解 CDNR(e)至 0、25、50、100 和 200μ g/mL ; 在此試驗中，1 %的DMS0水溶液對于細(xì)胞生長以及NO產(chǎn)生和檢測均無影響。
[0115] 以4X 106細(xì)胞/孔將RAW264. 7細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，分別采 用不同濃度的⑶NR(aq)和⑶NR(e)處理培養(yǎng)細(xì)胞24h ;每個處理濃度設(shè)置三個平行。之后 各孔加入1 μ g/ml LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集上清，加入相同體積的Griess試劑，放置15min。 540nm下測定各孔吸光度，根據(jù)吸光度計算一氧化氮的生成量。
[0116] 如圖la和圖lb所示，在LPS誘導(dǎo)的RAW264. 7細(xì)胞中，⑶NR(aq)沒有影響一氧化 氮產(chǎn)量（圖la);相比之下，在LPS誘導(dǎo)的RAW264. 7細(xì)胞中，與基準(zhǔn)對照組（即0濃度組） 相比，100 μ g/ml和200 μ g/ml的CDNR(e)分別顯著抑制一氧化氮產(chǎn)量的51 %和77% (p < 0. 05)(圖lb)。因此，紅花、續(xù)斷、三七和大黃的油性溶劑提取物在抗炎方面具有強(qiáng)效作 用。
[0117] 采用上述方法，以實施例1制備的中草藥糊劑測試水性提取物和油性提取物的混 合物對于一氧化氮產(chǎn)量的抑制，得到類似的抑制結(jié)果。這表明水性提取物不影響油性溶劑 提取物的抗炎效應(yīng)。
[0118] 紅花、續(xù)斷、三七和大昔的水件溶劑提取物促講UMR-106細(xì)朐的活力和增葙
[0119] 采用含 10% 的胎牛血清（Life Technologies, USA)、100U/ml 青霉素和 100mg/L 鏈 霉素（LifeTechnologies，USA)的高糖 DMEM(3500mg/L;LifeTechnologies，USA)培養(yǎng)基， 在37°C、5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大鼠骨肉瘤UMR-106細(xì)胞，培養(yǎng)期間定期傳代。
[0120] 根據(jù)溶解度性質(zhì)的不同，分別采用培養(yǎng)基或DMS0(1%，v/v)溶解將待測藥物（即 CDNR(aq)和 CDNR(e))分別溶解至 0、6· 25、12· 5、25、50 和 100μ g/mL 的濃度。
[0121] 待測藥物對細(xì)胞增殖的影響采用BrdU-ELISA試劑盒（Roches，USA)進(jìn)行測定。以 1000細(xì)胞/孔將UMR-106細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，分別采用不同濃度的 待測藥物與培養(yǎng)細(xì)胞共同孵育處理24h ;每個處理濃度設(shè)置三個平行。之后每孔加入10 μ L 的BrdU工作液（用5mg/ml的儲存液以6 μ L/mL稀釋而成）標(biāo)記細(xì)胞，繼續(xù)孵育2h。之后 去上清并用洗滌緩沖液洗滌，加入抗-BrdU抗體，孵育120分鐘。按照試劑盒所附說明書中 的提供的步驟測定細(xì)胞增殖的結(jié)果。
[0122] 不同濃度的待測藥物對細(xì)胞增殖的作用采用給藥組與空白溶劑對照組（即0濃度 組）的細(xì)胞增殖結(jié)果的比值來表示（空白溶劑對照組的細(xì)胞增殖結(jié)果計為100% )。
[0123] 如圖 2a 和圖 2b 所示，UMR-106 成骨細(xì)胞經(jīng) 6. 25-100 μ g/ml (p < 0· 01)的 ⑶NR(aq)處理24小時，可觀察到顯著的活力增強(qiáng)和增殖效果，二者分別從11 %增長至20% (圖2a)，以及從6%增長至22% (圖2b)。然而，UMR-106成骨細(xì)胞在經(jīng)⑶NR(e)處理24 小時后，活力和增殖并沒有出現(xiàn)顯著提高，因此該CDNR(e)成分沒有發(fā)揮作用。可見，紅花、 續(xù)斷、三七和大黃的水性溶劑提取物在促進(jìn)骨骼形成中具有強(qiáng)效的作用。
[0124] 采用上述方法，以實施例1制備的中草藥糊劑測試水性提取物和油性提取物的混 合物對于UMR-106細(xì)朐的活力和增葙的作用，得到類似的促講結(jié)果。這表明油性提取物不 影響水性溶劑提取物的促進(jìn)骨骼形成的效應(yīng)。
[0125] 體內(nèi)評估中草藥纟目合物糊劑對促講骨愈合的效果
[0126] 20只月齡為15.2±1.41(均值±標(biāo)準(zhǔn)差）的雌性5?四8脫-0&￥167大鼠購自香港 中文大學(xué)（CUHK)的實驗動物服務(wù)中心。所有大鼠被飼養(yǎng)在溫控（25°C )和光控（12小時白 天/黑夜循環(huán)）環(huán)境中。
[0127] 首先大鼠被肌注氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物（80mg/kg氯胺酮和8mg/kg甲苯噻 嗪）麻醉。然后在左側(cè)股骨上，用電鉆在股骨的中段通過前-后的方式鉆出相鄰的兩個雙 側(cè)孔（每個孔直徑為2mm)。用牙科銑鉆將兩個孔橋接成2mmX 4mm的缺損。在右側(cè)脛骨上， 用電鉆在近側(cè)干骺端通過內(nèi)-外的方式鉆出直徑為2. 4_的雙側(cè)骨缺損。所有的鉆孔過程 都經(jīng)過0.9%無菌生理鹽水灌注消毒，鉆孔在切口閉合前以大量的鹽水沖洗去除殘留的骨 碎片。
[0128] 大鼠按每組10只分成兩組。在對照組中，在大鼠的左側(cè)股骨和右側(cè)脛骨上覆蓋不 干膠薄膜而不做任何治療；在中草藥糊劑治療組中，在大鼠的左側(cè)股骨和右側(cè)脛骨上局部 施用0. 5ml的實施例1中制備的糊劑，用不干膠薄膜覆蓋所述糊精以防止其脫落和變干。 整個治療周期時間為6周，期間每2天更換所有的薄膜和糊劑。在第42天對大鼠實施安樂 死。收集大鼠的左側(cè)和右側(cè)的大腿骨，去除多余的軟組織但保留骨膜。使用Hounsfield材 料測試儀（KM25，Redhill，英國）進(jìn)行四點彎曲實驗。裝載最大2500N的負(fù)載單元，上部和 下部支承件的跨度分別為8. 0和20mm。將位于股骨中段的鉆孔骨缺損放置于兩個上支撐 件的中間，然后以從后向前的方式5mm/min的恒定速度向樣品施壓直至斷裂。記錄加載屈 服（load at yield)用于分析。將鉆孔股骨（左）的所有數(shù)據(jù)都以正常股骨（右）進(jìn)行歸 一化。其結(jié)果表示為以正常股骨為基準(zhǔn)的歸一化的比例。
[0129] 如圖3a_3f所示，本發(fā)明中草藥糊劑組合物在骨愈合過程中顯著促進(jìn)了骨的生物 力學(xué)特性。在鉆孔的皮質(zhì)股骨中，與對照組相比，經(jīng)過42天治療后，糊劑治療組表現(xiàn)出增 加15%的歸一化的屈服強(qiáng)度和增加13%的屈服功（P < 0. 05)(圖3a和3b)。糊劑治療組 在極限強(qiáng)度（圖3c和3d)和破壞強(qiáng)度（圖3e和3f)上也顯示了有益作用。四點彎曲實驗 表明，本發(fā)明的中草藥組合物能夠顯著改善愈合中的鉆孔骨缺損的生物力學(xué)性能（骨骼強(qiáng) 度）。
[0130] 根據(jù)上述結(jié)果，可見，包含紅花、續(xù)斷、三七和大黃的乙醇提取物的本發(fā)明中草藥 組合物能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的一氧化氮產(chǎn)生，從而抑制炎癥。"抗炎"是中醫(yī)理論中治 療骨折的一個關(guān)鍵性治療原則，它旨在控制和減輕骨折部位及周圍軟組織的腫脹和疼痛。 另一方面，包含紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水提取物的本發(fā)明中草藥組合物能夠顯著促進(jìn) UMR-106細(xì)胞的活力以及增殖，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞再生，而成骨細(xì)胞再生是骨修復(fù)過程的重 要機(jī)制。這在骨折愈合修復(fù)階段，當(dāng)軟骨內(nèi)成骨發(fā)生并且造骨細(xì)胞開始在軟骨愈傷組織形 成新的層狀骨時尤其有效。
[0131] 上述體內(nèi)試驗的生物力學(xué)測試結(jié)果提供了局部施用本發(fā)明中草藥組合物對促進(jìn) 骨愈合的有力證據(jù)。與對照相比，本發(fā)明中草藥組合物所產(chǎn)生的更高的股骨抗彎曲能力表 明，應(yīng)用其的治療能夠在發(fā)生永久變形（可能由微骨折引起的）之前提高骨骼強(qiáng)度以承受 更多壓力。上述實驗結(jié)果證明，本發(fā)明包含紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性溶劑提取物和油 性溶劑的中草藥組合物能夠通過體外途徑有效調(diào)控炎性和骨再生，且體內(nèi)實驗也證實了其 在促進(jìn)皮質(zhì)骨修復(fù)方面的功效。直接施用所述本實施例的糊劑于骨折處的皮膚上時獲得了 類似的功效。
[0132] 采用其它比例（即 0· 8 : 1 : 0· 8 : 1、L 2 : 1. 5 : 1. 2 : 2和 1 : 1. 5 : 1 : 2) 的紅花、續(xù)斷、三七和大黃組合物的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物配制的中草藥糊劑， 其中水性溶劑提取物和油性溶劑提取物分別占中草藥糊劑的重量百分比在30% : 3%至 42% : 6%之間變化，包括35% : 4. 3%至39. 8% : 5%)，重復(fù)上述試驗，獲得類似的調(diào)控 炎性和骨再生、促進(jìn)皮質(zhì)骨修復(fù)等顯著的促進(jìn)創(chuàng)傷性骨愈合和組織愈合的效果（數(shù)據(jù)未示 出）。
[0133] 毒性試驗表明，本發(fā)明的紅花、續(xù)斷、三七和大黃中草藥配方對生物體的毒性也大 大降低（數(shù)據(jù)未示出）。
[0134] 實施例3. 1包含中草藥水性提取物和油性提取物的水包油型納米乳劑的制備
[0135] 根據(jù)實施例1的方法分別制備獲得中草藥材料紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性提 取物粉末和油性提取物粉末。
[0136] 分別稱取所獲得的水性提取物粉末約lg、油性提取物粉末約4g、Capryol_90約lg 和水約7g ;混合均勻；超聲處理以使得全部的提取物粉末充分溶解。室溫下靜置使得相分 離；收集上層獲得有機(jī)相，底層為水相。
[0137] 取1. 71g表面活性劑吐溫20首先與12. 73g水相混合，在磁力攪拌器下溫和攪拌， 混合均勻。之后與0. 56g有機(jī)相混合，超聲處理5min，獲得預(yù)均化混合物。
[0138] 采用機(jī)械均化器以24000rpm的旋轉(zhuǎn)速度將所述預(yù)均化混合物均化20min，形成本 發(fā)明的納米乳劑。
[0139] 經(jīng)激光散射（90Plus/BI_MAS，布魯克海文儀器公司（90Plus/BI_MAS，fcookhaven Instruments Corporation)，美國）測定，所形成的納米乳液中所含油滴的平均直徑為 200nm，其含有3. 8wt. %有機(jī)相、84. 8wt. %水相以及11. 4wt. %表面活性劑。
[0140] 實施例3. 2包含中草藥水性提取物和油性提取物的水包油型納米乳劑的制備
[0141] 根據(jù)實施例3. 1的方法獲得分別包含紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性提取物和油 性提取物的水相和油相。
[0142] 將吐溫20 3. 48g首先與11. 9g水相混合，在磁力攪拌器下溫和攪拌，混合均勻。之 后與0. 62g有機(jī)相混合，超聲處理5min，獲得預(yù)均化混合物。
[0143] 采用機(jī)械均化器以30000rpm的旋轉(zhuǎn)速度將所述預(yù)均化混合物均化30min，形成本 發(fā)明的納米乳劑。
[0144] 經(jīng)激光散射測定，所形成的納米乳液中所含油滴的平均直徑為40nm，其含有 3. 9wt. %有機(jī)相、74. 4wt. %水相以及21. 7wt. %表面活性劑（吐溫20)。
[0145] 實施例4. 1包含本發(fā)明納米乳劑的經(jīng)皮貼劑的制備。
[0146] 混合7g聚丙烯酸鈉鹽、4g高嶺土、0. 35g氯化錯、5g甘油和12g D-山梨醇得到A 相。將0. 15g酒石酸加入15g水中獲得0. lwt. %酒石酸溶液；然后將2.5g聚乙烯吡咯烷 酮10溶解在該酒石酸溶液中得到B相。在磁力攪拌子的高速攪拌下將1. 2g卡波普U20在 24g水中溶脹，獲得膠狀液體，即C相。
[0147] 首先將B相和C相混合，在1400rpm速度下攪拌3min，之后與A相混合。將獲得的 混合物溶液（即A相、B相和C相的混合物）通過0. 5_篩過濾，與15g的實施例3. 1獲得 的納米乳劑混合，在800rpm下攪拌lOmin，獲得混合物，即用于形成基質(zhì)層的基質(zhì)。
[0148] 所獲得的基質(zhì)含有8. lwt %聚丙烯酸鈉鹽、4. 6wt %高嶺土、0. 4wt %氯化錯、 5. 8wt%甘油、13. 9wt% D-山梨醇、0· 2wt%酒石酸、2. 9wt%聚乙烯批咯燒酮10、L 4wt%卡 波普U20、17. 4wt%納米乳劑和余量的水。
[0149] 將所獲得的基質(zhì)以本領(lǐng)域任何適用的操作均勻地涂在Scotchpak9735襯層上，在 75°C下烘烤12小時。冷卻后，將Scotchpakl022剝離層放置在所獲得的貼上，置于基質(zhì)層 上以保護(hù)該基質(zhì)層，最終獲得貼劑。
[0150] 該貼劑的厚度為1. 1mm，粘合附著力為〇· 33N。
[0151] 實施例4. 2包含本發(fā)明納米乳劑的經(jīng)皮貼劑的制備。
[0152] 混合7g聚丙烯酸鈉鹽、0. 25g聚丙烯酸鈉鹽NP-700、4g高嶺土、0. 35g氨基乙酸二 羥鋁和12g D-山梨醇得到A相。將0. 15g酒石酸加入15g水中獲得0. lwt. %酒石酸溶液； 然后將2. 5g聚乙烯吡咯烷酮10溶解在該酒石酸溶液中得到B相。在磁力攪拌子的高速攪 拌下將1. 2g卡波普HV-805EG在24g水中溶脹，獲得膠狀液體，即C相。
[0153] 首先將B相和C相混合，在1400rpm速度下攪拌3min，之后與A相混合。將獲得的 混合物溶液（即A相、B相和C相的混合物）通過0. 5mm篩過濾，與4. 5g甘油和16g的實 施例3. 2獲得的納米乳劑混合，在800rpm下攪拌lOmin，獲得混合物，即用于形成基質(zhì)層的 基質(zhì)。
[0154] 所獲得的基質(zhì)含有8. lwt %聚丙烯酸鈉鹽、0. 3wt %聚丙烯酸鈉鹽NP-700、 4. 6wt%高嶺土、0· 4wt%氨基乙酸二輕錯、13· 8wt% D-山梨醇、0· 2wt%酒石酸、2. 9wt%聚 乙烯吡咯烷酮l〇、l. 4wt%卡波普HV-805EG、5. 2wt%甘油、18. 4wt%納米乳劑和余量的水。
[0155] 將所獲得的基質(zhì)以本領(lǐng)域任何適用的操作均勻地涂在Scotchpak9735襯層上，在 75°C下烘烤12小時。冷卻后，將Scotchpakl022剝離層放置在所獲得的貼上，置于基質(zhì)層 上以保護(hù)該基質(zhì)層，最終獲得貼劑。
[0156] 該貼劑的厚度為1. 2mm，粘合附著力為0· 62N。
[0157] 實施例5本發(fā)明納米乳劑促進(jìn)藥物活性成分的透皮吸收
[0158] 使用垂直式的Franz擴(kuò)散池 （Hanson Research,美國）進(jìn)行體外皮膚擴(kuò)散研究。 所述擴(kuò)散池帶有7mL的接收池，具有3. 8cm2的擴(kuò)散面積。將約1. 1mm厚的豬皮膚樣品切 成4. 5-5cm2的片，夾在擴(kuò)散池的兩個隔室之間，其中角質(zhì)層面向供體隔室，真皮面向受體隔 室。接收相由生理鹽水溶液（0.9% NaCl)組成。在供體隔室中填充待測樣品和相應(yīng)的對照 樣品：待測樣品采用上文實施例4. 2制備的本發(fā)明包含含有中草藥水性和油性提取物的納 米乳劑的透皮貼劑，其表面積被控制在約4cm2 ;對照樣品采用上文實施例1中所制備的含 有中草藥水性和油性提取物的中草藥糊劑。通過外部水循環(huán)器，將整個擴(kuò)散池維持在37°C 以模擬生物體的體溫，并維持600rpm的攪拌。在第24h時，收集來自接收隔室和豬皮膚樣 品的樣品，通過檢測接收溶液（接收相）和豬皮膚內(nèi)標(biāo)記物的含量來分析待測和對照樣品 的透過性能。上述實驗重復(fù)三次。
[0159] 紅花、續(xù)斷、三七和大黃的代表性活性成分（即化學(xué)標(biāo)記）列于下表：
[0160]

【權(quán)利要求】
1. 一種中草藥組合物，其包含紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性溶劑提取物和油性溶劑提 取物以及任選地，藥學(xué)上可接受的載體，并且其中所述中草藥組合物不包含來自桅子和接 骨木的提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其由下列組成：紅花、續(xù)斷、三七和大黃的水性溶劑提取 物和油性溶劑提取物以及任選地，藥學(xué)上可接受的載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述水性溶劑為水和/或所述油性溶劑為乙醇， 優(yōu)選95 %的乙醇水溶液。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的組合物，其中紅花、續(xù)斷、三七和大黃的重量比為（0.8_ 1.2) : (1-1.5) : (0.8-1.2) : (1-2)，優(yōu)選1 : 1 : 1 : 1至1 : 1.5 : 1 : 2的范圍；優(yōu) 選地，所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物的重量比為10 : 1至7 : 1，更優(yōu)選地， 所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物的重量比以占所述組合物的重量百分比計為 30% : 3%至 42% : 6%，優(yōu)選 35% : 4.3%至 39.8% : 5%。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的組合物，其通過以下步驟制備： a) 準(zhǔn)備紅花、續(xù)斷、三七和大黃，任選地將其切塊； b) 將步驟a)的原料共同或分別在水性溶劑中浸泡和/或回流下加熱足夠長的時間，以 獲得水性溶劑提取物，任選地將所得水性溶劑提取物進(jìn)行選自過濾、濃縮和冷凍干燥的處 理； c) 將步驟a)的原料或步驟b)所得的提取殘余物在油性溶劑中浸泡和/或回流加熱足 夠長的時間，以獲得油性溶劑提取物，任選地將所得油性溶劑提取物進(jìn)行選自過濾、濃縮和 冷凍干燥的處理；和 d) 將獲得的所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物配制為組合物，其中任選地將 獲得的所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物與至少一種藥學(xué)可接受的載體組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的組合物，其通過以下步驟制備： a) 準(zhǔn)備紅花、續(xù)斷、三七和大黃，任選地將其切塊； b) 將步驟a)的原料共同或分別在油性溶劑中浸泡和/或回流下加熱足夠長的時間，以 獲得油性溶劑提取物，任選地將所得油性溶劑提取物進(jìn)行選自過濾、濃縮和冷凍干燥的處 理； c) 將步驟a)的原料或步驟b)所得的提取殘余物在水性溶劑中浸泡和/或回流加熱足 夠長的時間，以獲得水性溶劑提取物，任選地將所得水性溶劑提取物進(jìn)行選自過濾、濃縮和 冷凍干燥的處理；和 d) 組合獲得的所述水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物，其中任選地將獲得的所述 水性溶劑提取物和所述油性溶劑提取物與至少一種藥學(xué)可接受的載體組合。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的組合物，其是糊劑、藥膏、納米乳劑或經(jīng)皮貼劑的形式。
8. -種水包油或油包水型納米乳劑，其包含水相、有機(jī)相和表面活性劑,其中所述水相 包含一種或多種中草藥材料的水性溶劑提取物和/或所述有機(jī)相包含所述一種或多種中 草藥材料的油性溶劑提取物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的納米乳劑，其中所述水相或有機(jī)相具有10-200nm、優(yōu)選 10-50nm的液滴；和/或所述水相按重量計占所述納米乳劑的60-90%、優(yōu)選75-85% ;和/ 或所述有機(jī)相按重量計占所述納米乳劑的2-20%、優(yōu)選2-8%;和/或所述表面活性劑按重 量計占所述納米乳劑的4-40%、優(yōu)選10-22%。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的納米乳劑，其中形成所述水相的水相溶劑為水；和/或 其中形成所述油相的油相溶劑為Sefsol-218、Capryol-90、甘油三脂、Myritol-318、檸檬 烯、液體石蠟、乙醇或其一種或多種的組合；和/或其中所述表面活性劑為具有范圍在8至 18的HLB值的非離子表面活性劑，例如Labrasol、氫化菌麻油EL(Cremophor EL)、吐溫20、 吐溫60和吐溫80,優(yōu)選為氫化蓖麻油EL和吐溫20。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8-10任一項所述的納米乳劑，其中所述水性溶劑提取物和所述油性 溶劑提取物分別為根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所限定的水性溶劑提取物和油性溶劑提取物。
12. -種制備權(quán)利要求8-11任一項所述的水包油或油包水型納米乳劑的方法，其包括 以下步驟： 1) 利用水性溶劑提取中草藥材料以獲得水性溶劑提取物，所述水性溶劑優(yōu)選為水； 2) 利用油性溶劑提取中草藥材料以獲得油性溶劑提取物，所述油性溶劑優(yōu)選為醇，更 優(yōu)選為95 %乙醇； 3) 將步驟1)獲得的水性溶劑提取物溶解于水相溶劑，以形成包含所述水性溶劑提取 物的水相，并且將步驟2)獲得的油性溶劑提取物溶解于油相溶劑，以形成包含所述油性溶 劑提取物的有機(jī)相； 4) 將所述水相和所述有機(jī)相與表面活性劑混合，形成均化前混合物； 5) 以12, 000-30, OOOrpm的速度將所述均化前混合物均化10-30分鐘，形成所述納米乳 劑。
13. -種經(jīng)皮貼劑，其包含襯層、基質(zhì)層和剝離層，所述基質(zhì)層包含權(quán)利要求8-11任一 項所述的水包油型或油包水型納米乳劑和粘合劑，所述納米乳劑優(yōu)選以重量計占所述基質(zhì) 層的1-25% ;其中所述粘合劑優(yōu)選選自由卡波姆980、卡波普U20、卡波普HV-805EG、羧甲 基纖維素鈉、明膠、聚丙烯酸鈉鹽、聚丙烯酸鈉鹽NP700、聚乙烯吡咯烷酮10和聚乙烯吡咯 烷酮K90及其組合組成的組，所述粘合劑更優(yōu)選為聚丙烯酸鈉鹽、聚丙烯酸鈉鹽NP700、卡 波普HV-805EG和聚乙烯吡咯烷酮的組合；并且所述粘合劑優(yōu)選以重量計占所述基質(zhì)層的 10-15%。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的經(jīng)皮貼劑，其中所述基質(zhì)層進(jìn)一步包含選自交聯(lián)劑、濕潤 齊U、支架材料或填充劑和PH控制劑組成的組的一種或多種成分。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的經(jīng)皮貼劑，其中所述基質(zhì)層以基質(zhì)的重量計包含1-25%的 納米乳劑、10-15 %的粘合劑、0. 01-0. 8%的交聯(lián)劑、15-25 %的濕潤劑、1-10 %的支架材料 或填充劑、和將pH控制在5-6的pH控制劑。
16. 權(quán)利要求1-7任一項所述的組合物、權(quán)利要求8-11任一項所述的納米乳劑或權(quán)利 要求13-15任一項所述的經(jīng)皮貼劑在制備用于治療創(chuàng)傷性損傷的藥物中的用途。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中所述創(chuàng)傷性損傷為組織損傷或骨損傷，例如創(chuàng)傷性 肌肉骨骼損傷，諸如軟組織損傷或骨折。
【文檔編號】A61P17/02GK104208173SQ201410232730
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月29日
【發(fā)明者】林嘉穎, 高俊熙, 蕭永沁, 劉碧珊, 劉大偉, 高錦明, 吳嘉名, 梁秉中 申請人:納米及先進(jìn)材料研發(fā)院有限公司