一種培養(yǎng)基及用該培養(yǎng)基生產(chǎn)多成分高活性靈芝菌粉方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中每升含有大米粉1-5g，馬鈴薯汁1-40g，山葡萄籽粉1-6g，人參粉1-2g，杏仁粉1-3g，枸杞子粉1-3g，山楂汁1-4g，銀杏葉1-5g，磷酸二氫鉀0.1-0.5g，硫酸鎂0.1-0.5g，葡萄糖1-5g，其余為水，PH值自然；利用本發(fā)明的培養(yǎng)基，將具有天然藥物活性成分的靈芝菌經(jīng)過液體深層發(fā)酵制得多成分高活性的靈芝菌粉，所獲靈芝菌粉中除含有靈芝本身活性成分外，還含有黃酮類化合物和皂角苷活性物質(zhì)，是一種純生物不含有其他任何有害物質(zhì)靈芝菌粉；而且培養(yǎng)基的來源廣泛，易得，成本低。
【專利說明】一種培養(yǎng)基及用該培養(yǎng)基生產(chǎn)多成分局活性靈芝菌粉方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物深層發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種多成分高活性靈芝及靈芝菌粉的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]靈芝:治愈萬癥，其功能應(yīng)驗，靈通神效，故名靈芝，又名“不死藥”俗稱“靈芝草”，多孔菌科類、一年生真菌，靈芝作為藥物已正式被國家藥典收載，同時它又是國家批準的新資源食品，無毒副作用，可以藥食兩用。科學(xué)研究表明，靈芝的藥理成分非常豐富，其中有效成份可分為十大類，包括靈芝多糖、靈芝多肽、三萜類、16種氨基酸(其中含有七種人體必需氨基酸)、蛋白質(zhì)、留類、甘露醇、香豆精苷、生物堿、有機酸(主含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。靈芝對人體具有雙向調(diào)節(jié)作用，所治病種，涉及心腦血管、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌、呼吸、運動等各個系統(tǒng)，尤其對腫瘤、肝臟病變、失眠以及衰老的防治作用十分顯著。
[0003]通過生物發(fā)酵的方式提高靈芝藥用活性成分的含量因為其具有生產(chǎn)周期短、節(jié)省勞動力和受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點被認為是一種有效的方法。但目前國內(nèi)外對靈芝的研究主要集中在發(fā)酵條件及活性成分分離等層面上，整體發(fā)酵水平不高，如專利(申請?zhí)?0111953.2)公開了一種液體發(fā)酵法同時生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的工藝,靈芝酸含量可達
2.8mg/100mg，胞內(nèi)和 胞外多糖總量高達2.34克/升，但該方法效率低，不能滿足工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的需要；而專利(申請?zhí)?01210110969.5)雖然公開了一種利用擴張蛋白提高靈芝菌絲體中總黃酮產(chǎn)量的方法，即通過向液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入擴張蛋白來提高總黃酮的產(chǎn)量，但此專利中所用的擴張蛋白液制備方法繁復(fù)，不利于工廠化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種簡單易行且成本低的利用具有天然活性成分的靈芝菌，通過培養(yǎng)基的選擇，經(jīng)液體深層發(fā)酵、生物轉(zhuǎn)化合成含有高比率黃酮類化合物和皂角苷活性成分的靈芝菌粉的方法，具體技術(shù)方案如下。
[0005]本發(fā)明提供了一種深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝菌粉的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基每升中含有大米粉l_5g，馬鈴薯汁1-40 g，山葡萄籽粉1-6 g，人參粉1-2 g，杏仁粉1-3 g，枸杞子粉1-3 g，山楂汁1-4 g，銀杏葉1-5 g，磷酸二氫鉀0.1-0.5 g，硫酸鎂0.1-0.5 g，葡萄糖1-5 g，其余為水，PH值自然。
[0006]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基每升中含有大米粉l_5g，馬鈴薯汁1-10 g，山葡萄籽粉1-3.5 g，人參粉1-1.5 g，杏仁粉1-1.2g，枸杞子粉1-2.5g，山楂汁1-2.5g，銀杏葉1-2.5g，磷酸二氫鉀0.1-0.5g，硫酸鎂0.1-0.25g，葡萄糖l_3g，其余為水，PH值自然。
[0007]基于上述的培養(yǎng)基，本發(fā)明提供了深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝的方法，主要包括如下步驟:
I)將靈芝菌種在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到斜面菌種；2)將斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中，進行擴繁培養(yǎng)，得到液體種子；
3)將步驟2)得到的液體種子按0.5-1%的接種量接種到一級種子罐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到一級種子液；
4)將步驟3)得到的一級種子液按5-10%的接種量接種到上述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基中，在條件為溫度25-27 °C，壓力0.03-0.05MPa,空氣流量1:0.5-1.0v/v,菌絲濃度40-55w/v的條件下，深層發(fā)酵培養(yǎng)56-72h，得到發(fā)酵液；
5)將步驟4)得到的發(fā)酵液經(jīng)過濾得到靈芝濕菌絲體和過濾液，濕菌絲體干燥后研磨得到靈芝菌粉；過濾液經(jīng)真空濃縮干燥后研磨得到靈芝菌粉。
[0008]優(yōu)選地，在上述深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝的方法中，步驟I)所述的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)的條件為:在溫度為22-25°C的條件下，培養(yǎng)5_7天。
[0009]優(yōu)選地，在上述深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝的方法中，步驟2)所述液體種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為在22-25°C的溫度下，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為100-120轉(zhuǎn)/min，暗培養(yǎng)3-5天。
[0010]優(yōu)選地，在上述深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝的方法中，步驟3)所述一級種子罐培養(yǎng)基為綜合培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為在25-27°C的溫度下，培養(yǎng)48h。
[0011]目前，由于野生靈芝資源有限，而通過人工栽培獲得的靈芝實體所帶來的農(nóng)藥及污染很難去除。發(fā)酵法可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)溫度及時間等條件，在短時間內(nèi)得到大量的靈芝菌絲體，其在組成上與人工栽培得到的靈芝實體相似，但其克服了污染及農(nóng)藥問題。
[0012]靈芝本身藥理成分非常豐富，其中有效成份可分為十大類，包括靈芝多糖、靈芝多肽、三萜類、16種氨基酸(其中含有七種人體必需氨基酸)、蛋白質(zhì)、留類、甘露醇、香豆精苷、生物堿、有機酸(主含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。經(jīng)研究，野生靈芝含有極其微量的黃酮類化合物。而黃酮類化合物具有促進血液循環(huán)，阻抗動脈硬化形成，改善降低血液中膽固醇含量減少脂肪在血液血管壁上的積累，降低冠狀動脈阻塞，止痛、止血治療外傷引發(fā)的癥狀，對防止體內(nèi)各組織發(fā)炎形成的抗體和消除體內(nèi)過多的氧化自由基有明顯療效。目前經(jīng)研究已經(jīng)從野生靈芝中分離出黃酮類化合物，但其含量是抑制其應(yīng)用的主要因素。
[0013]靈芝本身不含有皂角苷活性物質(zhì)，但皂角苷具有抗癌抑制腫瘤，降低血糖，改善代謝，降低血脂，抑制肥胖，降低血小板凝聚，避免形成血栓，改善血液流變避免心肌梗塞和增強機體免疫抗病能力。
[0014]本發(fā)明就是利用深層發(fā)酵方法通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的組成，提高靈芝菌絲中黃酮類化合物和皂角苷活性物質(zhì)的含量。具體來講，本發(fā)明培養(yǎng)基中所選用的組分中含有大量的黃酮類化合物和皂角苷活性物質(zhì)，如山葡萄籽、銀杏葉等有效成分主要為黃酮類化合物，而人參、杏仁粉等則含有皂角苷等有效成分，這些組分通過液體深層發(fā)酵、生物轉(zhuǎn)化合成含有黃酮類化合物和皂角苷活性物質(zhì)的靈芝菌絲。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點如下:
I)本發(fā)明通過靈芝菌經(jīng)液體深層發(fā)酵獲得比一般普通靈芝及其菌絲體粉活性成分多的靈芝菌粉；
2)本發(fā)明獲得的靈芝菌粉中除含有靈芝本身活性成分外，還含有黃酮類化合物和皂角苷活性物質(zhì)，是一種純生物不含有其他任何有害物質(zhì)的多成分、高活性靈芝菌粉；
3)培養(yǎng)基的來源廣泛，易得，成本低；
4)本發(fā)明所采用的制備方法工藝簡單，重復(fù)性好，環(huán)境可控，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做詳細說明。
[0017]實施例中所用靈芝菌為黑靈芝(Ganoderma),赤靈芝(Ganoderma Lucidum)和紫靈芝(Ganoderma neo-japonicum)均購自于北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司。
靈芝菌粉中活性成分的確定由國家藥物代謝產(chǎn)物分析中心和青島科標化工分析檢測有限公司完成。具體而言，相應(yīng)的方法為:
蛋白質(zhì)的測定:凱氏定氮法；活性多糖、三萜:紫外分光光度計；總黃酮:蘆丁計；皂角苷、腺苷:高效液相色譜方法。
[0018]實施例1
1)制備培養(yǎng)基:每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯汁40g，大米粉5g，山葡萄籽粉6g，人參粉2g，杏仁粉3g,枸杞子3g,山楂汁4g,銀杏葉5g,磷酸二氫鉀0.5g,硫酸鎂0.5g,葡萄糖5g,其余為水，PH自然；
2)將黑靈芝(Ganoderma)，接種到斜面PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到斜面菌種，溫度為25°C，培養(yǎng)7天；
3)將斜面菌種接種到PDA液體種子培養(yǎng)基中，進行擴繁培養(yǎng)，在25°C條件下，培養(yǎng)5天，得到液體種子；
4)將液體種子按0.5%的接種量接種到一級種子罐中在27°C條件下，培養(yǎng)48h，得到一級種子；
5)將一級種子液按10%的接種量接種步驟I)所述的培養(yǎng)基中，在條件為溫度27°C，壓力0.05MPa,空氣流量1: 1.0v/v,菌絲濃度55w/v的條件下，深層發(fā)酵培養(yǎng)72h，得到發(fā)酵液；
6)將步驟5)得到的發(fā)酵液經(jīng)板框濾得到靈芝濕菌絲體和過濾液，濕菌絲體干燥后研磨得到過80目篩靈芝菌粉；過濾液經(jīng)真空濃縮干燥后研磨過80目得到靈芝菌粉。
[0019]實施例2:與實施例1條件相同，靈芝菌種為赤靈芝(Ganoderma Lucidum)?
[0020]實施例3:與實施例1條件相同，靈芝菌種為紫靈芝(Ganoderma neo-japonicum)。
[0021]實施例4
1)制備培養(yǎng)基:每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯汁20g，大米粉3g，山葡萄籽粉3g，人參粉2g，杏仁粉2g,枸杞子2g,山楂汁2g,銀杏葉3g,磷酸二氫鉀0.3g,硫酸鎂0.2g,葡萄糖3g,其余為水，PH自然；
2)將黑靈芝(Gan oderma)，接種到斜面PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到斜面菌種，溫度為22°C，培養(yǎng)5天；
3)將斜面菌種接種到PDA液體種子培養(yǎng)基中，進行擴繁培養(yǎng)，在22°C條件下，培養(yǎng)3天，得到液體種子；
4)將液體種子按1%的接種量到一級種子罐中在25°C條件下，培養(yǎng)48h，得到一級種
子；5)將一級種子液按5%的接種量接種步驟I)所述的培養(yǎng)基中，在條件為溫度25°C，壓力0.03MPa,空氣流量1: 0.5v/v,菌絲濃度40w/v的條件下，深層發(fā)酵培養(yǎng)56h，得到發(fā)酵液；
6)將步驟5)得到的發(fā)酵液經(jīng)板框濾得到靈芝濕菌絲體和過濾液，濕菌絲體干燥后研磨得到過80目篩靈芝菌粉；過濾液經(jīng)真空濃縮干燥后研磨過80目得到靈芝菌粉。
[0022]實施例5
1)制備培養(yǎng)基:每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯汁10g，大米粉2g，山葡萄籽粉2g，人參粉lg，杏仁粉lg，枸杞子2g,山楂汁Ig,銀杏葉2g,磷酸二氫鉀0.3g,硫酸鎂0.2g,葡萄糖2g,其余為水，PH自然；
2)將黑靈芝(Ganoderma)，接種到斜面PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到斜面菌種，溫度為23°C，培養(yǎng)5天；
3)將斜面菌種接種到PDA液體種子培養(yǎng)基中，進行擴繁培養(yǎng)，在24°C條件下，培養(yǎng)4天，得到液體種子；
4)將液體種子按0.8%的接種量接種到一級種子罐中在26°C條件下，培養(yǎng)48h，得到一級種子；
5)將一級種子液按10%的接種量接種步驟I)所述的培養(yǎng)基中，在條件為溫度26°C，壓力0.04MPa,空氣流量1: 0.8v/v,菌絲濃度40w/v的條件下，深層發(fā)酵培養(yǎng)66h，得到發(fā)酵液；
6)將步驟5)得到的發(fā)酵液經(jīng)板框濾得到靈芝濕菌絲體和過濾液，濕菌絲體干燥后研磨得到過80目篩靈芝菌粉；過濾液經(jīng)真空濃縮干燥后研磨過80目得到靈芝菌粉。
[0023]實施例中各個主要活性成分通過相應(yīng)的測定方法得到表1和表2的數(shù)據(jù):
表1為相同條件下不同接種菌種的活性成分測定:
【權(quán)利要求】
1.一種深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝菌粉的培養(yǎng)基，其特征在于，所述每升培養(yǎng)基中含有大米粉l_5g,馬鈴署汁1-40 g，山葡萄籽粉1-6 g，人參粉1-2 g，杏仁粉1-3 g,枸杞子粉1-3 g，山楂汁1-4 g，銀杏葉1-5 g，磷酸二氫鉀0.1-0.5 g，硫酸鎂0.1-0.5 g，葡萄糖1-5 g，其余為水，PH值自然。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝菌粉的培養(yǎng)基，其特征在于，所述每升培養(yǎng)基中含有大米粉l_5g，馬鈴薯汁1-10 g，山葡萄籽粉1-3.5 g，人參粉1-1.5 g，杏仁粉1-1.2g，枸杞子粉1-2.5g，山楂汁1-2.5g，銀杏葉1-2.5g，磷酸二氫鉀0.1-ο.5g，硫酸鎂0.1-0.25g，葡萄糖l_3g，其余為水，PH值自然。
3.一種用上述權(quán)利要求所述培養(yǎng)基深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝菌粉的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將靈芝菌種在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到斜面菌種； 2)將斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中，進行擴繁培養(yǎng)，得到液體種子； 3)將步驟2)得到的液體種子按0.5-1%的接種量接種到一級種子罐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到一級種子液； 4)將步驟3)得到的一級種子液按5-10%的接種量接種到上述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基中，在溫度25-27°C，壓力0.03-0.05MPa,空氣流量1:0.5-1.0v/v,菌絲濃度40_55w/v的條件下，深層發(fā)酵培養(yǎng) 56-72h，得到發(fā)酵液； 5)將步驟4)得到的發(fā)酵液經(jīng)過濾得到靈芝濕菌絲體和過濾液，濕菌絲體干燥后研磨得到靈芝菌粉；過濾液經(jīng)真空濃縮干燥后研磨得到靈芝菌粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝菌粉的方法，其特征在于，步驟I)中所述的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為22-25°C，培養(yǎng)5_7天。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的深層發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝菌粉的方法，其特征在于，步驟2)中所述液體種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為22-25°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為100-120轉(zhuǎn)/min,暗培養(yǎng)3-5天。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)多成分高活性靈芝菌粉的方法，其特征在于，步驟3)中所述一級種子罐培養(yǎng)基為綜合培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為25-27°C，48h。
【文檔編號】A61K36/074GK103966107SQ201410198266
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】王曉坤, 王玉順, 王仁岐 申請人:大連佳騰生物科技有限公司