一種源于中華鱉的抗微生物肽及其基因、制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種源于中華鱉的抗微生物肽及其基因、制備方法和應(yīng)用，其屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。經(jīng)過(guò)中華鱉肝臟總RNA提取、mRNA純化、mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫(kù)構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，再利用PCR方法篩選得到中華鱉抗菌肽Ps-CATH4基因；再通過(guò)化學(xué)合成方法得到抗微生物肽Ps-CATH4，它是直鏈多肽，含有32個(gè)氨基酸殘基，理論等電點(diǎn)為12.9，分子量是3913.68Da。該抗微生物肽富含堿性氨基酸，具有很強(qiáng)的抗菌活性，其對(duì)多種臨床耐藥菌也有較好的殺滅作用；還具有低溶血、低細(xì)胞毒、不易產(chǎn)生耐藥性等有益特點(diǎn)，且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不含有二硫鍵及環(huán)狀結(jié)構(gòu)，方便化學(xué)合成及基因工程制備。故可作為制備抗病原微生物感染的藥物或作為化妝品、保健品、食品、飼料中的添加劑，有很好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】—種源于中華鱉的抗微生物肽及其基因、制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種來(lái)源于中華鳘(Pelodiscus sinensis)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽PS-CATH4及其編碼基因，主要應(yīng)用在制備抗病原微生物感染藥物及在化妝品、保健品、食品、飼料的添加劑中，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]Cathelicidin是一類由N端信號(hào)肽區(qū)域、中間保守cathelin結(jié)構(gòu)域和C端高度特異的成熟肽區(qū)域構(gòu)成的具有多功能的宿主抗菌肽家族，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是:具有N端信號(hào)肽區(qū)域(30個(gè)殘基左右)、中間保守cathelin結(jié)構(gòu)域(99 114個(gè)殘基)和C端高度特異的成熟肽區(qū)域(12 100個(gè)殘基)。Cathelicidin具有廣譜的抗菌活性，能快速、廣譜地殺滅多種病原微生物，包括革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、真菌、寄生蟲(chóng)和病毒等，特別是對(duì)許多臨床耐藥細(xì)菌同樣具有作用，這引起了人們的注意。除此之外，cathelicidin還具有許多其他生物學(xué)活性，如對(duì)多種免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T細(xì)胞)具有趨化作用、誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫粒和組織胺釋放、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)傷口愈合、誘導(dǎo)血管發(fā)生、誘導(dǎo)變異細(xì)胞系細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì)胞活化等。這些優(yōu)勢(shì)使其在臨床的應(yīng)用有著良好的前景。
[0003]近年來(lái)由于抗生素的濫用，各種耐藥及超級(jí)耐藥菌層出不窮，對(duì)臨床的抗感染治療造成巨大威脅，因此新型抗病原微生物模板的研發(fā)迫在眉睫。Cathelicidins對(duì)許多臨床耐藥細(xì)菌有著很強(qiáng)的殺菌活性，對(duì)許多致病菌殺害作用的速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)抗生素的作用，體外抗微生物測(cè)試中，大多數(shù)Cathelicidin成熟肽可以在微摩爾和亞微摩爾的濃度下快速殺死廣泛的微生物。最重要的是由于其特別的殺菌機(jī)制，不會(huì)引起耐藥性。目前發(fā)現(xiàn)的Cathelicidins的殺菌機(jī) 制有很多，常見(jiàn)的是通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性介導(dǎo)的即通過(guò)靜電相互作用吸引并結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，進(jìn)一步在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜的孔洞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。此外，抗菌肽還具有其他的殺菌機(jī)制，如抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、改變細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成等。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介導(dǎo)的殺菌作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)抗生素，并且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。
[0004]關(guān)于抗菌肽藥物，目前cathelicidin的研究熱點(diǎn)主要集中在消炎、抗感染和抗真菌等方面，應(yīng)用方式可以是局部的也可以是系統(tǒng)的，劑型可以是口服也可以外用。尤其由于陽(yáng)離子抗菌肽的表達(dá)與皮炎、侵入性燒傷膿血癥、腫瘤病毒引起的肉贅等之間的病理聯(lián)系，這些抗菌肽對(duì)這些疾病的局部治療有較好的開(kāi)發(fā)前景。目前有部分抗菌肽藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，例如Pexiganan是爪蟾抗菌肽Magainin的類似物，目前已作為治療足部感染藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，它也是第一個(gè)進(jìn)行商業(yè)開(kāi)發(fā)的抗菌肽；Hlfl-ll是人乳鐵蛋白前11個(gè)氨基酸殘基組成的抗菌肽，通過(guò)I / II期臨床試驗(yàn)研究表明Hlfl-1通過(guò)靜脈給藥時(shí)是安全的、耐受性良好的；來(lái)源于豬protegrin的IB-367用于治療腫瘤患者口腔潰瘍，已進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)等。Cathelicidin的應(yīng)用不僅限于醫(yī)藥領(lǐng)域，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和日化用品領(lǐng)域，cathelicidin也存在巨大的應(yīng)用潛能。[0005]化妝品添加劑指的是在化妝品的基礎(chǔ)配方必須要用的原料之外的成分，而大多數(shù)化妝品基礎(chǔ)配方最主要的原料應(yīng)該是油脂，水和表面活性劑，因此其他組分如香精，防腐劑，色素，保濕劑，美白劑以及所有的功能性原料都屬于添加劑。有報(bào)道稱日本政府規(guī)定了約有102種化學(xué)添加物對(duì)皮膚有害，包括香精香料，化妝品用色素，化妝品用防腐劑，表面活性劑和部分油脂。而抗菌肽具有抗菌活性以及抗氧化活性，可以替代有害的添加劑如防腐劑，抗氧化劑。另外，關(guān)于抗菌肽在添加劑中的作用，完全不局限于化妝品，比如食品的添加劑，是指為了改善食品品質(zhì)，或滿足食品保鮮、防腐和加工工藝的需要而加入到食品中的人工合成物或天然物質(zhì)，如漂白劑，防腐劑，著色劑，香精香料，抗氧化劑等，其中防腐劑能抑制食品微生物生長(zhǎng)和繁殖，延長(zhǎng)食品的保存時(shí)間，抗氧化劑是為控制食品的氧化，尤其是控制油脂食品的“酸敗”起了重要作用，但是這些添加劑往往被擅自濫用，給人身體帶來(lái)巨大傷害，特別是有致癌的副作用，所以可以用抗菌肽替代防腐劑和抗氧化劑。
[0006]2002年，世界衛(wèi)生組織(W H O)發(fā)表公告指出“在牲畜養(yǎng)殖過(guò)程中，停止以往慣用的飼料添加劑抗生素的做法，將在不危害動(dòng)物和農(nóng)民利益的前提下，可減少對(duì)人類健康的威脅“?？股刈鳛轱暳咸砑觿?yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展起了重要的作用，但是其在動(dòng)物體內(nèi)和動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留，以及病原菌產(chǎn)生的抗藥性問(wèn)題，對(duì)人類的健康和環(huán)境產(chǎn)生了負(fù)面的影響。并且完全使我國(guó)出口肉類，海產(chǎn)品等受到了限制，從而影響收益。尋找新型、安全的抗菌劑代替抗生素，已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外飼料學(xué)科的一項(xiàng)重要內(nèi)容。抗菌肽具有廣譜的抗菌作用，對(duì)畜禽具有促生長(zhǎng)和治療疾病的功能，是無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留的綠色產(chǎn)品，有望成為抗生素的替代品，在畜牧生產(chǎn)上發(fā)揮重要的作用。目前在畜禽生產(chǎn)，水產(chǎn)養(yǎng)殖等均有應(yīng)有。
[0007]中華鳘又名水魚(yú)、甲魚(yú)、團(tuán)魚(yú),是常見(jiàn)的養(yǎng)殖龜種。野生中華鱉在中國(guó)、日本、越南北部、韓國(guó)、俄羅斯東部都可見(jiàn)。水棲性，常棲息于沙泥底質(zhì)的淡水水域。有上岸進(jìn)行日光浴的習(xí)性。肉食性，以魚(yú)、蝦、軟體動(dòng)物等為主食，多夜間覓食。中華鱉屬于龜鱉目鱉科鱉亞科中華鱉屬，目前關(guān)于中華鱉cathelicidin宿主防御肽的研究和應(yīng)用還沒(méi)有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供一種來(lái)源于中華鳘(Pelodiscus sinensis)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽PS-CATH4及其編碼基因，主要應(yīng)用在制備抗病原微生物感染藥物及在化妝品、保健品、食品、詞料的添加劑中。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案:
一種源于中華鱉的抗微生物肽PS-CATH4，所述抗微生物肽PS-CATH4是一種堿性的直鏈多肽，含有32個(gè)氨基酸殘基，理論等電點(diǎn)為12.9，分子量是3913.68道爾頓，其全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為:蘇氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-色氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-異亮氨酸-精氨酸-精氨酸-天冬酰胺-精氨酸-色氨酸-谷酰胺-異亮氨酸-異亮氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-亮氨酸-賴氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-甘氨酸。
[0010]編碼抗微生物肽PS-CATH4前體cathelicidin的基因由483個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為:Iatggagacct gcctgaaaat cctgctgctc gtcggggtgg tcacagcagc ccccacgtca
61 cccgcatctt ctctgccatc ccacgaggat gcgattttag cagcagtaca ggtgtacaac
121 caagagccag gcgtaacgct ggcctaccgg ctcctggaag cggagcctca gccagactgg
181 gacgtgactt cgaaaactgt ccagccgctg aaatttacta ttaaagagac agtgtgcctg
241 atctcggaga aacgcgacat caaccaatgc gatttcaaag aagacgggct gatcaaagac
301 tgctctggat tcttctccac tgaacaggac cccccctctg ccatgatcaa atgcgaggat
361 gcgtctgagg agcctgatat cgtcacccgg ggccgctggg ggagattcaa gaggagagcg
421 ggtaggttta ttcgcagaaa tcgctggcaa atcatttcga ctggtctcaa gctgattggc
481 tag
其中385到480是編碼抗微生物肽Ps-CATH4的核苷酸序列。
[0011]抗微生物肽PS-CATH4的合成包括以下步驟:(I)根據(jù)所述抗微生物肽Ps_CATH4的核苷酸序列編碼的Ps-CATH4氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀合成得到抗微生物肽Ps-CATH4的全序列；
(2)通過(guò)HPLC反相柱對(duì)所述抗微生物肽PS-CATH4的全序列進(jìn)行層析脫鹽純化，并確定純度大于97%，得到抗微生物肽PS-CATH4 ；
(3)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定所述抗微生物肽PS-CATH4的分子量；等電聚焦電泳測(cè)定所述抗微生物肽PS-CATH4的等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定所述抗微生物肽PS-CATH4的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0012]所述抗微生物肽PS-CATH4作為制備抗病原微生物感染的藥物或作為化妝品、保健品、食品、詞料中的添加劑。
[0013]所述編碼抗微生物肽PS-CATH4的核苷酸序列據(jù)其推測(cè)合成的抗微生物肽Ps-CATH4溶于滅菌超純水，應(yīng)用于藥理活性檢測(cè)。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:經(jīng)過(guò)中華鱉肝臟總RNA提取、mRNA純化、mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫(kù)構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，再利用PCR方法篩選得到中華鱉抗菌肽PS-CATH4基因；再通過(guò)化學(xué)合成方法得到抗微生物肽PS-CATH4，它是直鏈多肽，含有32個(gè)氨基酸殘基，理論等電點(diǎn)為12.9，分子量是3913.68Da。該抗微生物肽富含堿性氨基酸，具有很強(qiáng)的抗菌活性，其對(duì)多種臨床耐藥菌也有較好的殺滅作用；還具有低溶血、低細(xì)胞毒、不易產(chǎn)生耐藥性等有益特點(diǎn)，且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不含有二硫鍵及環(huán)狀結(jié)構(gòu)，方便化學(xué)合成及基因工程制備。故可作為制備抗病原微生物感染的藥物或作為化妝品、保健品、食品、飼料中的添加劑，有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是抗微生物肽PS-CATH4的殺菌動(dòng)力學(xué)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0017]實(shí)施例1抗微 生物肽PS-CATH4前體cathelicidin的基因提取
(I)中華鱉肝臟總RNA提取(以下實(shí)驗(yàn)所用器具和試劑均經(jīng)過(guò)處理，無(wú)RNase)A.從新鮮宰殺的中華鱉各種新鮮組織上分別剪下Ig左右的小塊，分別放入液氮預(yù)冷的細(xì)胞凍存管中，然后迅速放入液氮中保存；
B.將保存在液氮中的組織材料取出，放入預(yù)冷的研缽內(nèi)，迅速充分研磨，期間不斷向研缽內(nèi)加入少許液氮；將大約30 mg的組織粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 ml離心管中，向其中分別加入400 μ I Buffer R-1 (裂解液，RNA Miniprep Kit提供)，用21-25號(hào)針頭的注射器反復(fù)抽吸8-10次，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加入150 μ I Buffer R-Π，渦旋振蕩15_30s，4 C，12000 rpm 離心 5 min ；
C.將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，加入250ul異丙醇，迅速吸打混勻；將混合液分別轉(zhuǎn)移至離心吸附柱，室溫，6000 rpm離心Imin ;棄廢液,然后加入500 μ I BufferWlA, 4 C，12000 rpm 離心 Imin ;棄廢液，加入 700 μ I Bufferff2A, 4 C，12000 rpm 離心Imin ;棄廢液,加入700 μ I Buffer W2A, 4 C，12000 rpm離心I min;棄廢液，空管12000 rpm離心I min ;將離心吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，然后直接向吸附膜上滴加 70-100 μ I Buffer TE，室溫放置 Imin, 12000 rpm 離心 I min 洗脫得到總 RNA0
[0018](2)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 第一鏈的合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄):
A.在新的0.2ml PCR管(無(wú)DNase和RNase)中配制下列混合液:
將 I μ g 的模板 RNA、1 μ I 的 3’ In-Fusion SMARTer CDS Primer (50 μ Μ)及 2.5 μ I的去離子水混合均勻，短暫離心；PCR儀中72 C保溫5 min后，然后42 C2 min ;短暫離心后，在上述管中配制如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液:
將 4.5μ I 的上述混合 液、2.0 μ I 的 5Χ First-Strand Buffer,0.25 μ I 的 DTT(100 mM) ,1.0μ I 的 dNTP Mix (10 mM )、1.0μ1 的 SMARTer V Oligonucleotide (12μ Μ),0.25 μ I 的 RNase Inhibitor (40U/ μ I)及 1.0μ1 的 SMARTScribe ? ReverseTranscriptase (100 U)*混合均勻后,短暫離心；在PCR儀中完成以下程序:42 C,90min ；68 C，IOmin ;4 C，保存。cDNA 保存于-80 C。
[0019]第二鏈的合成:
將 2μ I 的第一鏈 cDNA ,80 μ I 的去離子水、10 μ I 的 IOXAdvantage 2 PCR buffer、2μ I 的 50 X dNTP Mix、2 μ I 的 5，PCR primer,2 μ I 的 In-Fusion SMARTer CDSIIIprimer及 2μ I 的 50XAdvantage 2 Polymerase Mix 混合。
[0020](3)采用半巢式PCR進(jìn)行中華鱉cathelicidin的基因克隆篩選
引物使用前先12000 rpm離心5min，然后根據(jù)標(biāo)明的摩爾數(shù)加入相應(yīng)體積的ddH20溶解至20 μ M的濃度。以合成的肝臟cDNA為模板，以Pl和In-Fusion SMARTer⑶S為引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。在0.2ml PCR管中加入8 μ I的ddH20、l μ I的cDNA模板、0.5 μ I的正向引物 Pl (20 μ Μ)、0.5μ I 的反向引物 In-Fusion SMARTer CDS (20 μ Μ)和 10 μ I 的
2XPfu PCR MasterMix，混勻后，短暫離心。PCR條件為:94 C變性5min ;25個(gè)循環(huán):94 C變性30s，60 C退火30s，72 C延伸Imin ;72 C延伸IOmin ;4 C保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ I產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。
[0021]取上步PCR產(chǎn)物I μ I加入99 μ I ddH20稀釋100倍作為模板，以P2和CDS III為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。在0.2 ml PCR管中先后加入7 μ I的ddH20、l μ I的一次PCR產(chǎn)物稀釋液模板、I μ I的正向引物Ρ2(20 μΜ)、1μ I的反向引物CDS III (20 μΜ)和IOyl的 2XPfu PCR Master Mix ;PCR條件為:94 C變性5min ;25個(gè)循環(huán):94 C變性30s，58 C退火30s，72 C延伸lmin;72 C延伸IOmin ;4 C保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ 1，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。
[0022]擴(kuò)增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進(jìn)行目的片段回收。將回收的目的DNA片段與測(cè)序載體PMD19-T Vecter連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)CaCl2-MgCl2法制備好的DH5a感受態(tài)細(xì)胞。取100 μ I轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在含有100 μ Ig/ml氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上；表面晾干后，放在37 C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16 h。挑取單菌落用M13引物PCR檢測(cè)插入片段大小。挑取陽(yáng)性菌落，搖菌提取質(zhì)粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377進(jìn)行核苷酸測(cè)序。
[0023](4)中華鳘cathelicidin的基因序列測(cè)定和結(jié)果:
編碼其前體cathelicidin的基因由483個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為:
I atggagacct gcctgaaaat cctgctgctc gtcggggtgg tcacagcagc ccccacgtca
61 cccgcatctt ctctgccatc ccacgaggat gcgattttag cagcagtaca ggtgtacaac
121 caagagccag gcgtaacgct ggcctaccgg ctcctggaag cggagcctca gccagactgg
181 gacgtgactt cgaaaactgt ccagccgctg aaatttacta ttaaagagac agtgtgcctg
241 atctcggaga aacgcgacat caaccaatgc gatttcaaag aagacgggct gatcaaagac
301 tgctctggat tcttctccac tgaacaggac cccccctctg ccatgatcaa atgcgaggat
361 gcgtctgagg agcctgatat cgtcacccgg ggccgctggg ggagattcaa gaggagagcg
421 ggtaggttta ttcgcagaaa tcgctggcaa atcatttcga ctggtctcaa gctgattggc
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中華鱉cathelicidin編碼區(qū)的cDNA核苷酸的序列表為:序列長(zhǎng)度為483個(gè)堿基，序列類型:核酸，鏈數(shù):單鏈，拓?fù)鋵W(xué):直鏈狀，序列種類:cDNA，來(lái)源:中華鱉肝臟。
[0024]編碼中華鱉cathelicidin抗微生物肽Ps- CATH4為第385到480位核苷酸，其氨
基酸序列為:蘇氨酸L精氨酸2_甘氨酸3_精氨酸4_色氨酸5_甘氨酸6-精氨酸7_苯丙氨酸8_賴氨酸9_精氨酸I精氨酸&丙氨酸12_甘氨酸13_精氨酸14_苯丙氨酸15_異亮氨酸
16-精氨酸17_精氨酸18_天冬酰胺19_精氨酸2°_色氨酸21_谷酰胺22_異亮氨酸23_異亮氨酸24_絲氨酸25_蘇氨酸26_甘氨酸27_亮氨酸28_賴氨酸29_亮氨酸3°_異亮氨酸31_甘氨酸
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O
[0025]實(shí)施例2 PS-CATH4的化學(xué)制備方法:
(I)根據(jù)編碼中華鱉cathelicidin基因推斷的成熟肽Ps_CATH4氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(Applied Biosystems)合成其全序列，通過(guò)HPLC反相柱層析脫鹽純化,并確定其純度大于97%。
[0026](2)分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。合成的PS-CATH4抗菌肽可以溶于滅菌超純水，用于藥理活性檢測(cè)。
[0027]實(shí)施例3中華鱉抗微生物肽PS-CATH4的藥理實(shí)驗(yàn):
1.PS-CATH4抗菌活性檢測(cè):
將化學(xué)合成的PS-CATH4以2mg/ml的濃度溶解在無(wú)菌超純水中；用接種環(huán)挑取新活化的微生物，然后均勻涂布在新的LB瓊脂板上；將直徑0.5 cm的圓形無(wú)菌濾紙片放在上述瓊脂板上，然后向紙片上滴加10 μ I PS-CATH4樣品溶液；放入37 ° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h ;觀察抑菌圈形成與否，將對(duì)PS-CATH4敏感的菌株記錄下來(lái)。
[0028]2.Ps_CATH4 對(duì)敏感菌株最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)的測(cè)定
該實(shí)驗(yàn)以無(wú)菌液體LB作陰性對(duì)照，最小抑菌濃度的定義為肉眼可以觀察到的完全抑制微生物生長(zhǎng)的最低多肽濃度，或者是光吸收值不高于陰性對(duì)照5%的最低濃度。挑取新活化的微生物，接種至無(wú)菌液體 LB培養(yǎng)基，37° C恒溫振蕩器中200 rpm培養(yǎng)10_16h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；用紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液600 nm光波處的吸光值，吸光值為I時(shí)，濃度大約為109cfu/ml，將菌液用無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基稀釋至IO6 cfu/ml，冰上待用；在96微孔板上配制濃度梯度為 200 μ g/ml>100 μ g/ml、50 μ g/ml>25 μ g/ml>12.5 μ g/ml、6.25 μ g/ml、
3.13 μ g/ml、1.56 μ g/ml、0.78 μ g/ml、0.39 μ g/ml、0.20 μ g/ml 的經(jīng) 0.22 mm 孔徑膜過(guò)濾的 Ps- CATH 4 樣品溶液(即 51.112μΜ、25.556μΜ、12.778μΜ、6.389μΜ、3.194 μ Μ,
1.597 μ Μ、0.800 μ Μ、0.399 μ Μ、0.199 μ Μ、0.010 μ Μ、0.051 μ Μ),每孔 50 μ I ;每孔加入 50μ I上述稀釋菌液；在恒溫振蕩器中37 °C,100 rpm振蕩培養(yǎng)10-16h ;使用酶標(biāo)儀測(cè)600 nm吸光值或肉眼觀察；上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。另取一塊96孔板，同樣操作，僅是每孔多加IOOmMNaCl，仍然重復(fù)3次，取平均值。
[0029]表1 PS-CATH4的最小抑菌濃度(MIC)
【權(quán)利要求】
1.一種源于中華鱉的抗微生物肽PS-CATH4，其特征在于:所述抗微生物肽PS-CATH4是一種直鏈多肽，含有32個(gè)氨基酸殘基，理論等電點(diǎn)為12.9，分子量是3913.68道爾頓，其全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為:蘇氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-色氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸_賴氨酸_精氨酸_精氨酸_丙氨酸_甘氨酸_精氨酸_苯丙氨酸_異売氨酸_精氨酸-精氨酸-天冬酰胺-精氨酸-色氨酸-谷酰胺-異亮氨酸-異亮氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-亮氨酸-賴氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-甘氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于中華鱉的抗微生物肽PS-CATH4，其特征在于:編碼抗微生物肽PS-CATH4前體cathelicidin的基因由483個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為:
I atggagacct gcctgaaaat cctgctgctc gtcggggtgg tcacagcagc ccccacgtca
61 cccgcatctt ctctgccatc ccacgaggat gcgattttag cagcagtaca ggtgtacaac
121 caagagccag gcgtaacgct ggcctaccgg ctcctggaag cggagcctca gccagactgg
181 gacgtgactt cgaaaactgt ccagccgctg aaatttacta ttaaagagac agtgtgcctg
241 atctcggaga aacgcgacat caaccaatgc gatttcaaag aagacgggct gatcaaagac
301 tgctctggat tcttctccac tgaacaggac cccccctctg ccatgatcaa atgcgaggat
361 gcgtctgagg agcctgatat cgtcacccgg ggccgctggg ggagattcaa gaggagagcg
421 ggtaggttta ttcgcagaaa tcgctggcaa atcatttcga ctggtctcaa gctgattggc
481 tag 其中385到480是編碼抗微生物肽PS-CATH4的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于中華鱉的抗微生物肽PS-CATH4，其特征在于，抗微生物肽PS-CATH4的合成包括以下步驟: (1)根據(jù)所述抗微生物肽PS-CATH4的核苷酸序列編碼的PS-CATH4氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀合成得到抗微生物肽PS-CATH4的全序列； (2)通過(guò)HPLC反相柱對(duì)所述抗微生物肽PS-CATH4的全序列進(jìn)行層析脫鹽純化，并確定純度大于97%，得到抗微生物肽PS-CATH4 ； (3)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定所述抗微生物肽PS-CATH4的分子量；等電聚焦電泳測(cè)定所述抗微生物肽PS-CATH4的等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定所述抗微生物肽PS-CATH4的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于中華鱉的抗微生物肽PS-CATH4的應(yīng)用，其特征在于:所述抗微生物肽PS-CATH4作為制備抗病原微生物感染的藥物或作為化妝品、保健品、食品、飼料中的添加劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種源于中華鱉的抗微生物肽PS-CATH4的應(yīng)用，其特征在于，所述編碼抗微生物 肽PS-CATH4的核苷酸序列據(jù)其推測(cè)合成的抗微生物肽PS-CATH4溶于滅菌超純水，應(yīng)用于藥理活性檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】A61P31/00GK103936845SQ201410197982
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】于海寧, 王義鵬, 喬雪, 蔡莎莎 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)