高效分泌一氧化氮的重組間充質(zhì)干細胞及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效分泌一氧化氮的重組間充質(zhì)干細胞及其制備方法與應用。該重組間充質(zhì)干細胞,是降低受體間充質(zhì)干細胞中SOCS1基因表達量得到的重組間充質(zhì)干細胞；所述受體間充質(zhì)干細胞為離體的間充質(zhì)干細胞；所述SOCS1是細胞因子信號傳導抑制蛋白1。本發(fā)明的重組間充質(zhì)干細胞分泌NO能力強，從而抑制T細胞活化的能力增強。本發(fā)明的重組間充質(zhì)干細胞制備方法操作簡單、方便實用。
【專利說明】高效分泌一氧化氮的重組間充質(zhì)干細胞及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效分泌一氧化氮的重組間充質(zhì)干細胞及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)存在于幾乎所有的組織中，并且已從骨髓、脂肪組織、臍帶、胎盤和羊膜液中分離出。MSCs具有強大的自我更新能力和多向分化潛能，是移植領域應用前景廣闊的再生來源細胞；同時，MSC是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，MSC在炎癥細胞因子刺激后對免疫系統(tǒng)表現(xiàn)出很強的抑制作用，所以MSC應用于減少免疫排斥，延長移植物存活時間，治療相關免疫失調(diào)癥，如自身免疫疾病等方面。MSC在炎癥因子刺激下能夠分泌大量的趨化因子和具有免疫抑制特性的一氧化氮(NO)。在趨化因子的作用下，免疫細胞被趨化到MSC周圍并被其局部高濃度的NO所抑制。然而在最新研究中，MSC被發(fā)現(xiàn)在一定條件下同樣可以促進免疫反應，如果MSC所處環(huán)境中沒有足夠的促炎癥細胞因子誘導其產(chǎn)生足量的NO，MSC是可以增強免疫反應的，這一現(xiàn)象在體外的細胞增殖實驗以及遲發(fā)超敏反應的疾病動物模型中都得到了充分的驗證。
[0003]細胞因子信號傳導抑制蛋白I (suppressor of cytokine signalingl, S0CS1)以負反饋通路來調(diào)控IFNy、IFNa、IL-10、IL-12、IL-15和IL-21在內(nèi)的多種細胞因子信號通路。當細胞因子結合其受體時，SOCSl的表達就會上調(diào)，然后SOCSl結合Janus激酶酪氨酸激酶(JAK)的催化位點、結合并募集泛素轉(zhuǎn)移酶復合體靶向到JAK中進行蛋白體降解，進而抑制JAK活性。SOCSl也調(diào)控STAT和間接調(diào)節(jié)TLR信號通路。樹突細胞是專職的抗原遞呈細胞，在維持自身抗原耐受和激活先天及適應性免疫方面具有關鍵的調(diào)節(jié)作用。以前研究表明SOCSl能在樹突細胞中被誘導，沉默SOCSl能增強樹突細胞和抗原特異抗腫瘤免疫的抗原遞呈。下調(diào)樹突細胞SOCSl的產(chǎn)生能夠允許更多的信號傳遞到T細胞，并且導致記憶T細胞群體的擴張。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供在炎癥因子刺激下能夠高效分泌一氧化氮的重組間充質(zhì)干細胞及其制備方法與應用。
[0005]本發(fā)明所提供的重組間充質(zhì)干細胞，是降低受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達量得到的重組間充質(zhì)干細胞；所述受體間充質(zhì)干細胞為離體的間充質(zhì)干細胞；所述SOCSl為細胞因子信號傳導抑制蛋白I。
[0006]本發(fā)明所提供的制備所述重組間充質(zhì)干細胞的方法，包括降低受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達量得到所述重組間充質(zhì)干細胞；所述受體間充質(zhì)干細胞為離體的間充質(zhì)干細胞；所述SOCSl為細胞因子信號傳導抑制蛋白I。
[0007]其中，所述離體的間充質(zhì)干細胞為哺乳動物的離體的間充質(zhì)干細胞，如小鼠的離體的間充質(zhì)干細胞(骨髓間充質(zhì)干細胞或胚胎間充質(zhì)干細胞)，所述SOCSl是具體為氨基酸序列為SEQ ID N0.2的蛋白質(zhì)。SEQ ID N0.2由212個氨基酸組成。
[0008]上述重組間充質(zhì)干細胞或方法中，所述降低受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達量包括向所述受體間充質(zhì)干細胞中導入抑制所述受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達的物質(zhì)。
[0009]上述重組間充質(zhì)干細胞或方法中，抑制所述受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達的物質(zhì)可為任何可以降低所述受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達的shRNA、編碼所述shRNA的DNA分子、表達所述shRNA的表達載體、表達所述shRNA的重組微生物(如病毒);抑制所述受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達的物質(zhì)還可為降低所述受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達的siRNA、編碼所述siRNA的DNA分子、表達所述siRNA的表達載體、表達所述siRNA的重組微生物(如病毒)。
[0010]其中，降低所述受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達的shRNA是形成莖環(huán)結構的短發(fā)夾RNA，所述莖環(huán)結構中莖的一條鏈序列是SEQ ID N0.1的第4_22位，所述莖環(huán)結構中莖的另一條鏈序列與SEQ ID N0.1的第4-22位反向互補。在本發(fā)明的一個實施方式中，降低所述受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達的shRNA的核苷酸序列是SEQ IDN0.1。
[0011]上述重組間充質(zhì)干細胞或方法中，所述重組間充質(zhì)干細胞具有下述Al和A2中的至少一種特性:
[0012]Al、所述重組間充質(zhì)干細胞的一氧化氮分泌能力高于所述受體間充質(zhì)干細胞；
[0013]A2、所述重組間充質(zhì)干細胞的免疫抑制能力高于所述受體間充質(zhì)干細胞。
[0014]上述重組間充質(zhì)干細胞或方法中，所述免疫抑制能力體現(xiàn)為抑制遲發(fā)型超敏反應能力。
[0015]上述的重組間充質(zhì)干細胞在制備抑制T細胞增殖的產(chǎn)品(如藥物)中的應用和在制備免疫抑制劑中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0016]以上述的重組間充質(zhì)干細胞為活性成分的抑制T細胞增殖的產(chǎn)品和免疫抑制劑，也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017]上文中，所述免疫抑制劑均可為遲發(fā)型超敏反應抑制劑。
[0018]上文中，所述T細胞均可為⑶3+T細胞。
[0019]下述1)-10)中的任一種抑制所述受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達的生物材料也屬于本發(fā)明的保護范圍:
[0020]I) shRNA,是形成莖環(huán)結構的短發(fā)夾RNA，所述莖環(huán)結構中莖的一條鏈序列是SEQID N0.1的第4-22位，所述莖環(huán)結構中莖的另一條鏈序列與SEQ ID N0.1的第4_22位反向互補；
[0021] 2 )表達I)所述的shRNA的表達載體；
[0022]3)表達I)所述的shRNA的重組微生物細胞；
[0023]4)表達I)所述的shRNA的重組動物細胞；
[0024]5)表達I)所述的shRNA的重組植物細胞；
[0025]6 ) I)所述 shRNA 產(chǎn)生的 s iRNA ;
[0026]7)表達6)所述siRNA的表達載體；
[0027]8)表達6)所述siRNA的重組微生物細胞；
[0028]9)表達6)所述siRNA的重組動物細胞；[0029]10)表達6)所述siRNA的重組植物細胞。
[0030]上述生物材料中，I)所述的shRNA的一條鏈的核苷酸序列可為SEQ ID N0.1,1)所述的shRNA的另一條鏈的核苷酸序列與SEQ ID N0.1反向互補；I)所述shRNA產(chǎn)生的siRNA的一條鏈序列可為SEQ ID N0.1的第4-22位，I)所述shRNA產(chǎn)生的siRNA的另一條鏈序列與SEQ ID N0.1的第4-22位反向互補。
[0031]實驗證明，同樣數(shù)量的降低受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達量得到的重組間充質(zhì)干細胞MSC/SOCSlsh在炎性因子刺激下分泌NO的能力是受體間充質(zhì)干細胞的2.6-4倍，所述重組間充質(zhì)干細胞在MSC:T=1:80時仍能抑制T細胞增殖，重組間充質(zhì)干細胞MSC/SOCSlsh與受體間充質(zhì)干細胞相比，抑制遲發(fā)型超敏反應能力增強。本發(fā)明的重組間充質(zhì)干細胞可穩(wěn)定傳代，凍存，復蘇。本發(fā)明的重組間充質(zhì)干細胞分泌NO能力強，從而抑制T細胞活化的能力增強。本發(fā)明的重組間充質(zhì)干細胞制備方法操作簡單、方便實用。因此，本發(fā)明建立了穩(wěn)定的高效分泌NO的重組間充質(zhì)干細胞的制備方法，為間充質(zhì)干細胞的研究和應用奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為炎癥細胞因子誘導MSCs中的SOCSl表達。
[0033]A為原代MSCs用2ng/ml IFN y +TNF α分別刺激Oh、12h和24h的SOCSl基因相對
表達量。
[0034]B 為 C3H10T1/2 用 2ng/ml IFN y +TNF α 分別刺激 Oh、12h 和 24h 的 SOCSl 基因相
對表達量。
[0035]C、C3H10Tl/2 分別用 0、0.5、2 和 10ng/ml IFN Y+TNF α 來處理24h，real-time PCR測定SOCSlmRNA含量。
[0036]D、C3H10Tl/2 分別用 0、0.5、2 和 10ng/ml IFN y +TNF α 來處理 24h，western blot檢測SOCSl含量。
[0037]圖2為S0CS1敲低后MSCs的特性。
[0038]A.S0CS1敲低。SOCSlmRNA(上圖)通過real-time PCR確定，蛋白表達(下圖)通過western blot檢驗。
[0039]B.BrdU摻入通過流式細胞儀分析評定。數(shù)值為表示方框內(nèi)的細胞百分數(shù)。
[0040]C.MSC/CTLsh和MSC/SOCSlsh細胞表面標記通過流式細胞儀分析檢驗，橫線上的數(shù)值表示方框內(nèi)的細胞百分數(shù)。
[0041]D.成脂分化通過油紅染色來檢驗；成骨分化用堿性磷酸酶ALP來評定。
[0042]圖3為MSC/SOCSlsh增強對T細胞增殖的抑制。
[0043]圖3中的百分數(shù)為發(fā)生增殖的細胞的百分比。左側列由上至下分別為1:10MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)，I:20MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)，I:40MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)，I:80MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)；右側列由上至下分別為1: 10MSC/S0CSlsh和T細胞共培養(yǎng)，I:20MSC/S0CSlsh和T細胞共培養(yǎng)，I:40MSC/S0CSlsh和T細胞共培養(yǎng)，I:80MSC/SOCSlsh和T細胞共培養(yǎng)。
[0044]圖4為敲低S0CS1能夠增強MSCs體內(nèi)的免疫抑制能力。
[0045]A.S0CS1缺陷的MSCs增強黑色素瘤生長。16天后，殺鼠取黑色素瘤并稱其重量(上面柱狀圖)。每一組代表性的腫瘤拍照(下面照片)。數(shù)據(jù)表示的是代表性的3次獨立實驗 mean±S.D.，* Ρ〈0.05 和* * Ρ〈0.01。PBS 表示 PBS 組、MSC/SOCSlsh 表示 MSC/SOCSlsh組、MSC/CTLsh 表示 MSC/CTLsh 組。
[0046]B.SOCSl缺陷的MSCs抑制遲發(fā)型超敏反應(DTH)。數(shù)據(jù)表示的是代表性的3次獨立實驗 mean±S.D.，* Ρ〈0.05 和**Ρ〈0.01。Saline 表示 Saline 組、OVA 表示 OVA 組、MSC/SOCSlsh表示MSC/SOCSlsh組、MSC/CTLsh表示MSC/CTLsh組，MSC表示受體間充質(zhì)干細胞組。
[0047]圖5為S0CS1負調(diào)控MSCs中的iNOS表達和NO生產(chǎn)。
[0048]A.1NOS表達通過real-time PCR(上圖)和 western blot (下圖)測定.MSC/CTLsh或 MSC/SOCSlsh 經(jīng)或不經(jīng) 2ng/ml IFN y +TNF α 處理 24h。[0049]B.MSC/CTLsh或MSC/SOCSlsh不經(jīng)過(上圖)或經(jīng)過(下圖)照射處理，然后用2ng/ml IFN y +TNF α處理24h。用Griess測定上清液中NO的含量。
[0050]C.Q)3+T 細胞經(jīng)過 PMA(50ng/ml)和 ionomycin(lug/ml)刺激 24h,然后與 MSC/CTLsh或MSC/SOCSlsh以1:20的比率(MSC:T)培養(yǎng)，在共培養(yǎng)開始時，添加L-NMMA(ImM)，48h后，所有的細胞經(jīng)流式細胞儀測定T細胞增殖情況，數(shù)值近似等于方框內(nèi)的細胞數(shù)。
[0051]圖6為慢病毒載體GVl 18的圖譜。
【具體實施方式】
[0052]下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0053]材料和方法
[0054]下述實施例中的主要試劑與儀器如下:
[0055]a -MEM 培養(yǎng)液(Gibco 公司，cat.n0.12000-022)，DMEM-HG 培養(yǎng)液(Gibco 公司，cat.n0.10566-024)，胎牛血清(上海依科賽生物制品有限公司產(chǎn)品cat.n0.FSP500)；
0.01M、pH7.2-7.4的PBS，地塞米松，磷酸化維生素C，β -磷酸甘油，II型膠原酶，胰酶，油紅O染液，堿性磷酸酶試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品。
[0056]慢病毒載體GV118(上海吉凱基因化學技術有限公司)的圖譜如圖6所示，含有熒光標記 EGFP，含有元件 mU6-MCS-Ub1-EGFP。
[0057]小鼠:C57BL/6小鼠從軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心購買，并且在無特定病原體條件下飼養(yǎng)。動物在年齡和性別上都相互匹配，并且所有的實驗操作都符合軍事醫(yī)學科學院實驗動物條例。
[0058]細胞:來源于骨髓的小鼠原代MSCs(MSCs)的分離和培養(yǎng)按照下述文獻中的方法進行:Yang, Y.Μ., Li, H., Zhang, L., Dang, R.J., Li, P., Wang, X.Y., Zhu, H., Guo, X.M., Zhang, Y., Liu, Y.L., et al.(2013).[A new method for isolating and culturingmouse bone marrow mesenchymal stem cells].Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi/Zhongguo bing Ii sheng Ii xue hui=Journal of experimental hematology/ChineseAssociation of Pathophysiology21, 1563-1567。
[0059]鼠胚胎MSC 細胞系 C3H10Tl/2(CCL-226?)細胞(簡稱 C3H10T1/2)從 ATCC 獲得，并且生長在含有4mM谷氨酰胺、100U/ml青鏈霉素和10%胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)液中(MEM, Gibco)，在 5%C023 7°C 培養(yǎng)。
[0060]FACS 檢測 MSC 的免疫表型:抗鼠 CD45, CD105, CD44, CD29, CDllb, Sca-1 (Seal)抗體來自 BioLegend.BrdUflow kit 來自 BD Pharmingen (SanDiego, CA, USA).數(shù)據(jù)在 FACSAria 11 (BD)上收集并且用FlowJo軟件(TreeStar)分析。
[0061]病毒感染:MSCs在轉(zhuǎn)染前一天種含血清和無抗生素的培養(yǎng)液中，次日，在10ug/mlpolybrene (Santa Cruz)存在下，用含有表達鼠SOCSlshRNA(MSC/SOCSlsh)或?qū)φ章《?MSC/CTLsh) (Shanghai GeneChemC0., Ltd, China)慢病毒來轉(zhuǎn)染 MSCs。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染克隆通過FACS篩選獲得.[0062]體外分化:對于成骨分化，細胞用成骨誘導分化完全培養(yǎng)液(DMEM-HG培養(yǎng)液含10%胎牛血清及ICT7M地塞米松，IOmM β -憐酸甘油，50 μ M ascorbate_2phosphate)來培養(yǎng)。對于成脂分化，細胞用成脂誘導分化完全培養(yǎng)液(DMEM-HG培養(yǎng)液含10%胎牛血清及ICT6M 地塞米松，10ng/ml 胰島素，0.5 μ M IBMX (isobutyl-1-methyl-xanthine) , 200 μ Mindomethacin)來培養(yǎng)，ALP檢測和Oil-Red-O染色按照下述文獻中的方法進行:Yang, Y.Μ., Li, H., Zhang, L., Dang, R.J., Li, P., Wang, X.Y., Zhu, H., Guo, X.M., Zhang, Y., Liu, Y.L.,et al.(2013).[A new method for isolating and culturing mouse bone marrowmesenchymal stem cells].Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi/Zhongguo bing Iisheng Ii xue hui=Journal of experimental hematology/Chinese Association ofPathophysiology21, 1563-1567。
[0063]NO檢測:MSCs用IFN y和TNF a (R&D)刺激.培養(yǎng)上清液的NO使用Griess試劑(Sigma-Aldrich)測定。簡言之,所有NO3被NO還原酶轉(zhuǎn)換成NO2,并且總的NO2用Griess反應檢測。
[0064]定量PCR --總RNA用TRIZOL(Sigma)抽提并且用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Takara)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA被用作模板添加Τ0Υ0Β0品牌SYBR Green試劑(Shanghai, China)在實時定量PCR來確定特定基因表達。其中，小鼠β-actin基因引物:
[0065]CTTCCGCCTTAATACTTC (forward)和 AAGCCTTCATACATCAAG (reverse);小鼠 S0CS1 基因引物:CAACGGAACTGCTTCTTC(forward)和 AAGGCAGTCGAAGGTCTC(reverse);小鼠 iNOS 基因引物:CAGCTGGGCTGTACAAACCTT (forward)和 CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG(reverse)。
[0066]Western blot:在SDS樣品緩沖液的蛋白樣品被加熱并且在SDS-polyacrylaminde gel上分裂.蛋白電印跡到PVDF轉(zhuǎn)移膜上，并且用抗S0CS1，iNOS或β -ACTIN(CelI Signaling Technology, Inc.)抗體孵育,4°C過夜。最后,根據(jù)手冊說明，把這個印跡易受于化學發(fā)光檢測。
[0067]統(tǒng)計分析.數(shù)據(jù)用mean土S.D.來表示,通過非配對雙尾t檢驗來評定數(shù)據(jù)差異。
[0068]本申請中，S0CS1是氨基酸序列為SEQ ID N0.2的蛋白質(zhì)，其NCBI ReferenceSequence:NP—001258532.1。
[0069]實施例1、原代培養(yǎng)的鼠骨髓MSC和鼠胚胎MSC細胞系在炎癥因子刺激下S0CS1基因表達量增加的倍數(shù)相同 [0070]將來源于骨髓的C57BL/6小鼠原代MSCs (簡稱原代MSCs)和鼠胚胎MSC細胞系C3H10T1/2 (CCL-226?)(簡稱 C3H10T1/2)分別經(jīng)過 2ng/ml 炎癥因子 IFN y +TNF α 刺激不同時間(12h和24h)，其SOCSl含量的變化用實時定量PCR檢測。結果如圖1中A和圖1中B所示，與對照組(未進行炎癥因子刺激)相比，來源于骨髓的小鼠原代MSCs和鼠胚胎MSC細胞系C3H10Tl/2(CCL-226?)中SOCSl顯著的被誘導，并且SOCSl基因表達量增加的倍數(shù)相同。說明來源于骨髓的小鼠原代MSCs和鼠胚胎MSC細胞系C3H10T1/2 (CCL-226?對炎癥因子的反應是類似的，細胞系在體內(nèi)外研究中更容易獲得也更高效，所以隨后的研究使用MSC細胞系一C3H10T1/2，并且指代MSCs。
[0071]具體的實驗方法如下:將來源于骨髓的小鼠原代MSCs和鼠胚胎MSC細胞系C3H10Tl/2(CCL-226?)分別在含有 2ng/ml IFNy ,2ng/ml TNFa、4mM谷氨酰胺、100U/ml 青鏈霉素和10%胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)液在5%C0237°C分別培養(yǎng)12h和24h進行炎癥因子的刺激，同時設不進行炎癥因子刺激的對照，用實時定量PCR檢測這兩種細胞中的SOCSl
基因的表達量。
[0072]實施例2、間充質(zhì)干細胞中SOCSl表達與炎癥因子呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴性關系[0073]將鼠胚胎MSC細胞系C3H10Tl/2(CCL-226?)在含有不同濃度炎癥因子、4mM谷氨酰胺、100U/ml青鏈霉素和10%胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)液在5%C023 7°C培養(yǎng)24h，用實時定量PCR檢測這兩種細胞中的SOCSl基因的表達量并用western blot檢測S0CS1的表達量。所用的培養(yǎng)液中炎癥因子的濃度分別為0ng/ml IFNy和0ng/ml TNFa (Ong/ml IFNy+TNFa ),0.5ng/ml IFN Y 和 0.5ng/ml TNFa (0.5ng/ml IFN y+TNF a )>2ng/mlIFNy 和 2ng/ml TNFa (2ng/ml IFN y+TNF a )U0ng/ml IFNy 和 lOng/ml TNFa (lOng/ml IFN y+TNF a )D結果如圖1中C和D所示，隨著炎癥因子IFN Y和TNF a刺激的濃度(0.5，2和10ng/ml)升高，鼠胚胎MSC細胞系C3H10T1/2 (CCL-226?)的S0CS1表達呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴性關系，在最高的炎癥因子組，SOCSlmRNA水平升高到5倍(圖1中C)。為了證實實時定量PCR結果,進一步做了 western blot檢測。用同樣處理，S0CS1的蛋白水平也顯示顯著增加(圖1中D)。
[0074]實施例3、S0CS1基因表達量低于受體間充質(zhì)干細胞的重組間充質(zhì)干細胞的構建
[0075]1、抑制受體間充質(zhì)干細胞中S0CS1基因表達的物質(zhì)的制備
[0076]該實驗所制備的抑制受體間充質(zhì)干細胞中S0CS1基因表達的物質(zhì)是表達靶向S0CS1的ShRNA (名稱為SOCSlsh)的重組慢病毒(名稱為SOCSlsh慢病毒)。同時制備表達陰性對照shRNA (名稱為CTLsh)的重組慢病毒(名稱為CTLsh慢病毒)。
[0077]SOCSlsh的序列如下:
[0078]ucuACCUGAGUUCCUUCCCCUUcucgagAAGGGGAAGGAACUCAGGUaguuuuuuc (SEQ IDN0.1)；
[0079]CTLsh 的序列如下:ucuUUCUCCGAACGUGUCACGUcucgagACGUGACACGUUCGGAGAAaguuu
UUUCo
[0080]將SOCSlsh的編碼DNA (將SEQ ID N0.1的核苷酸U替換為T的雙鏈DNA)插入GVl 18的Hpa I和Xho I位點間得到SOCSlsh的表達載體，將CTLsh的編碼DNA(將SEQ IDN0.2的核苷酸U替換為T的雙鏈DNA)插入GVl 18的Hpa I和Xho I位點間得到CTLsh的表達載體。用SOCSlsh的表達載體包裝表達SOCSlsh的慢病毒(名稱為SOCSlsh慢病毒)，用CTLsh的表達載體包裝表達CTLsh的慢病毒(名稱為CTLsh慢病毒)。SOCSlsh慢病毒和CTLsh慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司制備。SOCSlsh慢病毒和CTLsh慢病毒中除表達的shRNA序列不同外，其它均相同。
[0081]2、一氧化氮分泌能力增加的重組間充質(zhì)干細胞的制備
[0082]將C3H10T1/2作為受體間充質(zhì)干細胞，制備一氧化氮分泌能力增加的重組間充質(zhì)干細胞。具體方法如下:將鼠胚胎MSC細胞系C3H10Tl/2(CCL-226?)在轉(zhuǎn)染前一天接種在含血清和無抗生素的培養(yǎng)液中，次日，在10ug/ml polybrene (聚凝胺)(Santa Cruz)存在下，用表達SOCSlsh的SOCSlsh慢病毒或表達CTLsh的CTLsh慢病毒轉(zhuǎn)染鼠胚胎MSC細胞系C3H10Tl/2(CCL-226?)。根據(jù)綠色熒光蛋白(GFP)表達情況，通過FACS篩選獲得穩(wěn)定的SOCSlsh慢病毒轉(zhuǎn)染克隆(名稱為MSC/SOCSlsh)，穩(wěn)定的CTLsh慢病毒轉(zhuǎn)染克隆(名稱為MSC/CTLsh)。MSC/SOCSlsh 和 MSC/CTLsh 都顯示綠色熒光。MSC/SOCSlsh 即為一氧化氮分泌能力增加的重組間充質(zhì)干細胞。
[0083]3、一氧化氮分泌能力增加的重組間充質(zhì)干細胞的特性
[0084]3.1S0CS1基因表達特性
[0085]實時定量PCR檢測受體間充質(zhì)干細胞一C3H10Tl/2、MSC/S0CSlsh和MSC/CTLsh中的S0CS1基因表達情況，western blot檢測MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh中的S0CS1表達情況，結果表明MSC/SOCSlsh中的S0CS1基因表達量是受體間充質(zhì)干細胞一C3H10T1/2和MSC/CTLsh的1/3，說明靶向S0CS1的shRNA顯著降低了受體間充質(zhì)干細胞中的S0CS1基因表達量。western blot的結果與實時定量PCR檢測結果一致(圖2中A)。圖2中A中，MSC表示受體間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2。
[0086]3.2增殖特性、細胞周期動力學特性和免疫表型
[0087]下一步，分析了 S0CS1在MSCs中沉默的作用。為了檢驗S0CS1對MSCs增殖的作用，做了細胞計數(shù)。培養(yǎng)10代，MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh的增殖活性沒有顯著差異，表現(xiàn)為初始均為4X IO3個/孔，三天后分別為(55±9.9)父103個/孔和(58±4.9) X IO3個/孔，七天后分別為(472.5±74.2) X IO3個/孔和(464± 121) X IO3個/孔。而且，BrdU插入數(shù)據(jù)顯示S0CS1沉默沒有引起細胞周期動力學的明顯改變(圖2中B)。MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh 的 CD105, CD44, CD29, Sca-1 呈現(xiàn)陽性，CD45, CDllb 為陰性；FACS 結果顯示 MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh含有相似的免疫表型(圖2中C)。
[0088]其中，細胞計數(shù)的方法如下:將MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh分別按4X IO3個/孔種于48孔板，第三天和第七天分別用0.25%的胰酶(Gibco, cat.n0.12664-025)消化3-5分鐘，然后計數(shù)。
[0089]BrdU摻入法檢測細胞增殖:將MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh分別按1.5 X IO5個/孔種于6孔板，每孔加入BrdU (Sigma, B5002)至其終濃度為10 μ M，2小時后用0.25%的胰酶消化細胞，按試劑盒說明進行抗體標記(BD，cat.n0.552598)。
[0090]3.3能分化為成脂細胞和成骨細胞
[0091]MSCs能夠分化成脂肪細胞和成骨細胞取決于體外的培養(yǎng)條件。當用成脂誘導分化完全培養(yǎng)液培養(yǎng)時，MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh能夠分化成脂肪，通過油紅染色檢測，MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh顯示正常的脂滴聚集(圖2中D上圖)。當用成骨誘導分化完全培養(yǎng)液培養(yǎng)時，MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh能夠被誘導成骨分化，成骨誘導后，MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh顯示增強的ALP活性，ALP為一種成骨細胞分化的早期標志(圖2中D下圖)。對分化標志物Runx2and Osteocalcium的表達分析證實類似的成骨進程。[0092]3.4增強體內(nèi)外的免疫抑制
[0093]3.4.1增強體外免疫抑制
[0094]檢驗了敲低SOCSl的MSCs—MSC/SOCSlsh免疫調(diào)節(jié)功能。由于在免疫細胞中，SOCSl通過抑制Janus kinases (JAKs)作為諸如IFNy、IL_12的多種細胞因子信號傳遞的負反饋調(diào)節(jié)劑。假設MSC/SOCSlsh具有免疫增強活性。為了檢驗這個假設，小鼠CD3+T細胞(下文簡稱T細胞)用CFSE染色并用PMA和inomyosin來刺激，然后與不同比率的MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh培養(yǎng)。正如所料，從CFSE強度降低所示，T細胞增殖被MSC/CTLsh抑制。然而，與刺激T細胞增殖相反，MSC/SOCSlsh展示更強的免疫抑制活性。在1:80 (MSCs:T cells)的低比率時，MSC/SOCSlsh能顯著地抑制T細胞增殖，而MSC/CTLsh組的T細胞增殖比例與受體間充質(zhì)干細胞相近(圖3)。
[0095]具體實驗方法如下:經(jīng)⑶3 ε MicroBead Kits (MiltenyiBiotec)從小鼠脾臟分離的⑶3+Τ細胞用5μΜ CFSE(Invitrogen)在室溫標記7min。根據(jù)手冊方案說明來中止標記。洗后，⑶3+T 細胞用 50ng/ml PMA, lug/ml ionomycin (Sigma)激活 24h,然后與 MSC/SOCSlsh或MSC/CTLsh進行共培養(yǎng)。細胞分裂由熒光密度減弱所反映，經(jīng)流式細胞儀分析。
[0096]實驗設八個處理，分別為1:10MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)，I:20MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)，I:40MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)，I:80MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)，I: IOMSC/SOCSlsh和T細胞共培養(yǎng)，I:20MSC/S0CSlsh和T細胞共培養(yǎng)，I:40MSC/S0CSlsh和T細胞共培養(yǎng)，I:80MSC/S0CSlsh和T細胞共培養(yǎng)。將T細胞按6 X IO5個細胞/孔種入48孔板，按照相應的比例接入MSC，共培養(yǎng)48h后收集T細胞，所有細胞通過CFSE強度減弱所示使用流式細胞儀來檢測T細胞增殖，數(shù)據(jù)代表三次獨立的實驗。
[0097]其中，八個處理的共培養(yǎng)細胞中，接入的T細胞均為6X IO5個細胞/孔；I:IOMSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)，1:20MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)，1:40MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)，
1:80MSC/CTLsh和T細胞共培養(yǎng)這四個處理中接入的MSC/CTLsh分別是6X 1O4個細胞/孔、3 X 1O4個細胞/孔、1.5 X 1O4個細胞/孔、7500個細胞/孔；1:10MSC/S0CSlsh和T細胞共培養(yǎng)，1:20MSC/S0CSlsh和T細胞共培養(yǎng)，I:40MSC/S0CSlsh和T細胞共培養(yǎng)，1:80MSC/SOCSlsh和T細胞共培養(yǎng)這四個處理中接入的MSC/SOCSlsh分別是6X IO4個細胞/孔、3 X1O4個細胞/孔、1.5 X 1O4個細胞/孔、7500個細胞/孔。
[0098]3.4.2增強體內(nèi)免疫抑制
[0099]免疫反應對于控制腫瘤生長是至關重要的。由于MSC/SOCSlsh在體外顯示更強的免疫抑制能力，檢測它對小鼠體內(nèi)黑色素瘤模型中的作用。B16-F0黑色素瘤細胞與MSC/SOCSlsh或MSC/CTLsh聯(lián)合注入小鼠體內(nèi)，16天后，腫瘤稱重。發(fā)現(xiàn)兩種MSCs都能促進腫瘤生長，但MSC/SOCSlsh表現(xiàn)出更強的效果，MSC/SOCSlsh組腫瘤的重量是MSC/CTLsh組的
2倍(圖4中A)。MSCs免疫抑制的一個顯著效應是能夠抑制DTH反應。進一步檢驗了它在DTH反應中的免疫抑制效果。OVA免疫的小鼠用OVA單獨或OVA結合MSC/SOCSlsh或MSC/CTLsh來給小鼠足墊注射，通過測量足墊增厚來評價DTH反應。與預期一樣，施加MSC/CTLsh能夠降低炎癥。與其對黑色素瘤模型效果相似，MSC/SOCSlsh表現(xiàn)出更強的免疫抑制作用，足墊增厚表現(xiàn)快速降低，MSC/SOCSlsh組足墊增厚是OVA組的0.5倍，MSC/SOCSlsh組足墊增厚是MSC/CTLsh組的0.7倍，是受體間充質(zhì)干細胞組的0.7倍(圖4中B)。說明降低受體間充質(zhì)干細胞中S0CS1基因表達量得到的重組間充質(zhì)干細胞MSC/SOCSlsh與受體間充質(zhì)干細胞相比，抑制遲發(fā)型超敏反應能力增強，體內(nèi)免疫抑制能力增強。
[0100]總之，降低受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達量得到的重組間充質(zhì)干細胞MSC/SOCSlsh與受體間充質(zhì)干細胞相比，體內(nèi)外免疫抑制能力均增強。
[0101]圖4中A的增強黑色素瘤生長的實驗方法如下:小鼠黑色素瘤細胞B16-F0(ATCC-CRL-6322?)在體外用a -MEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0102]C57BL/6小鼠，雌性，4~6周齡。實驗重復三次，每次重復將實驗動物隨機分成三組(每組10只)，即PBS組、MSC/SOCSlsh組和MSC/CTLsh組，分別進行如下處理:
[0103]PBS組:實驗第I天進行初次免疫，第3、6、9天分別進行加強免疫。其中，初次免疫為:每只小鼠后背皮下注射100 μ I含5X IO5個B16-F0的PBS(在0.01Μ、ρΗ7.2-7.4的PBS中加入B16-F0得到的細胞懸液，100 μ I該細胞懸液中B16-F0的含量為5 X IO5個細胞);加強免疫均為每只小鼠后背皮下注射PBS。
[0104]MSC/SOCSlsh組:實驗第I天進行初次免疫，第3、6、9天分別進行加強免疫。其中，初次免疫為:每只小鼠后背皮下注射100μ I含5X105個B16-F0和I X IO6個MSC/SOCSlsh的 PBS(在 0.01M、pH7.2-7.4 的 PBS 中加入 B16-F0 和 MSC/SOCSlsh 得到的細胞懸液，100 μ I該細胞懸液中B16-F0的含量為5 X IO5個細胞，MSC/SOCSlsh的含量為IXlO6個細胞)；加強免疫均為每只小鼠后背皮下注射100μ I含IXlO6個MSC/SOCSlsh的PBS (在0.01M、pH7.2-7.4的PBS中加入MSC/SOCSlsh得到的細胞懸液，100 μ I該細胞懸液中MSC/SOCSlsh的含量為IXlO6個細胞)。
[0105]MSC/CTLsh組:實驗第I天進行初次免疫，第3、6、9天分別進行加強免疫。其中，初次免疫為:每只小鼠后背皮下注射100 μ I含5 X IO5個B16-F0和I X IO6個MSC/CTLsh的PBS (在 0.01M、ρΗ7.2-7.4 的 PBS 中加入 B16-F0 和 MSC/CTLsh 得到的細胞懸液，100 μ I 該細胞懸液中B16-F0的含量為5 X IO5個細胞，MSC/CTLsh的含量為I X IO6個細胞);加強免疫均為每只小鼠后背皮下注射100 μ I含IX IO6個MSC/CTLsh的PBS(在0.01Μ、ρΗ7.2-7.4的PBS中加入MSC/CTLsh得到的細胞懸液，100 μ I該細胞懸液中MSC/CTLsh的含量為I X IO6個細胞)。
[0106]每天觀察小鼠并且第16天當腫瘤長大到影響運動時對小鼠進行安樂死。取下黑色素瘤然后稱重。
[0107]圖4中B的遲發(fā)型超敏反應的實驗方法如下:C57BL/6小鼠，雌性，8~10周齡。實驗重復三次，每次重復將實驗動物隨機分成五組(每組10只)，即Saline組、OVA組、MSC/SOCSlsh組、MSC/CTLsh組和受體間充質(zhì)干細胞組，分別進行如下處理:
[0108]Saline組:第一天每只小鼠尾根注射50 μ I生理鹽水和50 μ I完全弗氏佐劑來進行免疫，第7天將30 μ I生理鹽水注射到右后腳墊，左后腳墊注射30ul生理鹽水。24h后，用游標卡尺(n0.7308，Mitutoyo, Tokyo, Japan)來測量抗原誘導的足墊增厚情況。厚度增加為右后足墊厚度減去左后腳墊厚度。
[0109]OVA組:第一天每只小鼠尾根注射50μ I含OVA的生理鹽水(在生理鹽水中加入OVA得到的液體，50 μ I該液體中OVA的含量為10 μ g)和50 μ I完全弗氏佐劑來進行免疫，第7天將含200 μ g OVA的30 μ I生理鹽水(在生理鹽水中加入OVA得到的液體，30 μ I該液體中OVA的含量為200 μ g)注射到右后腳墊，左后腳墊注射30ul生理鹽水。24h后，用游標卡尺(n0.7308，Mitutoyo, Tokyo, Japan)來測量抗原誘導的足墊增厚情況。厚度增加為右后足墊厚度減去左后腳墊厚度。
[0110]MSC/SOCSlsh組:第一天每只小鼠尾根注射50 μ I含OVA的生理鹽水(在生理鹽水中加入OVA得到的液體，50 μ I該液體中OVA的含量為10 μ g)和50 μ I完全弗氏佐劑來進行免疫，第7天將含200 μ g OVA和2.5 X IO5個細胞MSC/SOCSlsh的30 μ I生理鹽水(在生理鹽水中加入OVA和MSC/SOCSlsh得到的液體，30 μ I該液體中OVA的含量為200 μ g，MSC/SOCSlsh的含量為2.5 X IO5個細胞)注射到右后腳墊，左后腳墊注射30ul生理鹽水。24h后，用游標卡尺(n0.7308, Mitutoyo, Tokyo, Japan)來測量抗原誘導的足墊增厚情況。厚度增加為右后足墊厚度減去左后腳墊厚度。
[0111]MSC/CTLsh組:第一天每只小鼠尾根注射50 μ I含OVA的生理鹽水(在生理鹽水中加入OVA得到的液體，50 μ I該液體中OVA的含量為10 μ g)和50 μ I完全弗氏佐劑來進行免疫，第7天將含200 μ g OVA和2.5 X IO5個細胞MSC/CTLsh的30 μ I生理鹽水(在生理鹽水中加入OVA和MSC/CTLsh得到的液體，30 μ I該液體中OVA的含量為200 μ g, MSC/CTLsh的含量為2.5 X IO5個細胞)注射到右后腳墊，左后腳墊注射30ul生理鹽水。24h后，用游標卡尺(n0.7308，Mitutoyo, Tokyo, Japan)來測量抗原誘導的足墊增厚情況。厚度增加為右后足墊厚度減去左后腳墊厚度。 [0112]受體間充質(zhì)干細胞組:第一天每只小鼠尾根注射50μ I含OVA的生理鹽水(在生理鹽水中加入OVA得到的液體，50 μ I該液體中OVA的含量為10 μ g)和50 μ I完全弗氏佐劑來進行免疫，第7天將含200 μ g OVA和2.5 X IO5個細胞C3H10T1/2的30 μ I生理鹽水(在生理鹽水中加入OVA和C3H10T1/2得到的液體，30 μ I該液體中OVA的含量為200 μ g，C3H10T1/2的含量為2.5X IO5個細胞)注射到右后腳墊，左后腳墊注射30ul生理鹽水。24h后，用游標卡尺(n0.7308, Mitutoyo, Tokyo, Japan)來測量抗原誘導的足墊增厚情況。厚度增加為右后足墊厚度減去左后腳墊厚度。
[0113]3.5 一氧化氮分泌能力增加
[0114]先前研究表明前炎癥細胞因子能夠刺激小鼠MSCs表達iNOS和產(chǎn)生NO，這能夠抑制T淋巴細胞增殖。在前炎癥細胞因子存在下，MSCs生產(chǎn)NO能力不隨著傳代增加而改變。為了檢測炎癥細胞因子誘導MSCs產(chǎn)生NO效率，增加IFN- Y +TNF- α (每種0.5ng/ml, 2ng/ml和10ng/ml)濃度梯度來刺激MSCs。結果表明MSCs對低濃度的細胞因子就有強烈反應。當添加IFN- Y +TNF- α濃度低到0.5ng/ml,就能觀察到顯著地誘導出NO生成。Real-timePCR顯示iNOS (—氧化氮合酶)的產(chǎn)生隨著IFN-Y+TNF-α刺激濃度梯度增加而增多。接著,檢測S0CS1敲低后iNOS的表達。iNOS mRNA和iNOS蛋白表達分別通過real-time PCR和 western blotting analysis 來檢測。圖 5 中 A 顯不在 MSC/SOCSlsh 中 iNOS mRNA 和iNOS蛋白表達顯著增加。炎癥因子刺激MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh，其上清液用于測定NO濃度。如圖5中B所示，S0CS1敲低后，NO生成顯著增加，不管MSCs是否被照射:在不照射的情況下，相同細胞數(shù)量的MSC/SOCSlsh的一氧化氮分泌量是62.3 μ Μ，相同細胞數(shù)量的MSC/CTLsh的一氧化氮分泌量是15.7μΜ，相同細胞數(shù)量的受體間充質(zhì)干細胞-C3H10T1/2的一氧化氮分泌量是15.5 μ M，MSC/SOCSlsh的一氧化氮分泌能力是MSC/CTLsh的4倍，MSC/SOCSlsh的一氧化氮分泌能力是受體間充質(zhì)干細胞的4倍；在照射的情況下，相同細胞數(shù)量的MSC/SOCSlsh的一氧化氮分泌量是60.1 μ Μ，相同細胞數(shù)量的MSC/CTLsh的一氧化氮分泌量是22.7 μ Μ，相同細胞數(shù)量的受體間充質(zhì)干細胞-C3H10T1/2的一氧化氮分泌量是21.9 μ Μ,MSC/SOCSlsh 的一氧化氮分泌能力是 MSC/CTLsh 的 2.6 倍，MSC/SOCSlsh 的一氧化氮分泌能力是受體間充質(zhì)干細胞的2.7倍。說明降低受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達量得到的重組間充質(zhì)干細胞MSC/SOCSlsh與受體間充質(zhì)干細胞相比，一氧化氮分泌能力顯著增加，增加了 2.7-4倍。圖5中B中，MSC表示受體間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2。
[0115]為了進一步證實NO依賴性的MSC/SOCSlsh強力免疫抑制功能方式，添加iNOS抑制劑 NG-monomethyl-L-arginine acetate salt (L-NMMA)來測定 T 細胞增殖。與期望的一致，在共培養(yǎng)測定中，L-NMMA完全恢復T細胞增殖(圖5中C)。因此，SOCSl可能通過抑制iNOS表達及NO產(chǎn)生來削弱MSCs免疫抑制能力。
[0116]其中，圖5中B上圖的實驗方法如下:實驗重復三次，每次重復將MSC/SOCSlsh、C3H10T1/2 和 MSC/CTLsh 分別在含有 2ng/ml IFN y、2ng/ml TNF a、4mM 谷氨酰胺、lOOU/ml青鏈霉素和10%胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)液在5%C023 7°C 24h，用Griess測定上清液中NO的含量。其中，測定NO時培養(yǎng)液中的細胞含量均為10000個細胞/100 μ I。
[0117]圖5中B下圖的實驗方法如下:實驗重復三次，每次重復將MSC/SOCSlsh、C3H10T1/2和MSC/CTLsh分別用60Co照射，照射劑量為15Gy，在含有2ng/ml IFN Y、2ng/ml TNFa、4mM谷氨酰胺、100U/ml青鏈霉素和10%胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)液在5%C0237°C 24h，用Griess測定上清液中NO的含量。其中，測定NO時培養(yǎng)液中的細胞含量均為10000個細胞/100 μ I。
【權利要求】
1.重組間充質(zhì)干細胞，是降低受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達量得到的重組間充質(zhì)干細胞；所述受體間充質(zhì)干細胞為離體的間充質(zhì)干細胞；所述SOCSl是細胞因子信號傳導抑制蛋白1。
2.制備權利要求1所述重組間充質(zhì)干細胞的方法，包括降低受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達量得到所述重組間充質(zhì)干細胞；所述受體間充質(zhì)干細胞為離體的間充質(zhì)干細胞；所述SOCSl是細胞因子信號傳導抑制蛋白I。
3.根據(jù)權利要求1所述的重組間充質(zhì)干細胞或權利要求2所述的方法，其特征在于:所述降低受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達量包括向所述受體間充質(zhì)干細胞中導入抑制所述受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達的物質(zhì)。
4.根據(jù)權利要求1或3所述的重組間充質(zhì)干細胞或權利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述重組間充質(zhì)干細胞具有下述Al和A2中的至少一種特性: Al、所述重組間充質(zhì)干細胞的一氧化氮分泌能力高于所述受體間充質(zhì)干細胞； A2、所述重組間充質(zhì)干細胞的免疫抑制能力高于所述受體間充質(zhì)干細胞。
5.根據(jù)權利要求1或3或4所述的重組間充質(zhì)干細胞或權利要求2或3或4所述的方法，其特征在于:所述免疫抑制能力體現(xiàn)為抑制遲發(fā)型超敏反應能力。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的重組間充質(zhì)干細胞或方法，其特征在于:所述離體的間充質(zhì)干細胞為哺乳動物的離體的間充質(zhì)干細胞。
7.權利要求1-6中任一所述的重組間充質(zhì)干細胞的應用，為Cl或c2: Cl、權利要求1-6中任一所述的重組間充質(zhì)干細胞在制備抑制T細胞增殖的產(chǎn)品中的應用； c2、權利要求1-6中任一所述的重組間充質(zhì)干細胞在制備免疫抑制劑中的應用。
8.dl或d2的產(chǎn)品: dl、抑制T細胞增殖的產(chǎn)品，其活性成分為權利要求1-6中任一所述的重組間充質(zhì)干細胞； d2免疫抑制劑，其活性成分為權利要求1-6中任一所述的重組間充質(zhì)干細胞。
9.下述1)-10)中的任一種抑制受體間充質(zhì)干細胞中SOCSl基因表達的生物材料: 1)shRNA，是形成莖環(huán)結構的短發(fā)夾RNA，所述莖環(huán)結構中莖的一條鏈序列是SEQ IDN0.1的第4-22位，所述莖環(huán)結構中莖的另一條鏈序列與SEQ ID N0.1的第4_22位反向互補； 2)表達1)所述的shRNA的表達載體； 3)表達1)所述的shRNA的重組微生物細胞； 4)表達1)所述的shRNA的重組動物細胞； 5)表達1)所述的shRNA的重組植物細胞； 6)1)所述shRNA產(chǎn)生的siRNA ； 7)表達6)所述siRNA的表達載體； 8)表達6)所述siRNA的重組微生物細胞； 9)表達6)所述siRNA的重組動物細胞； 10)表達6)所述siRNA的重組植物細胞。
10.根據(jù)權利要求9所述的生物材料，其特征在于:1)所述的shRNA的一條鏈的核苷酸序列是SEQ ID N0.1，1)所述的shRNA的另一條鏈的核苷酸序列與SEQ ID N0.1反向互補；1)所述shRNA產(chǎn)生的siRNA的一條鏈序列是SEQ ID N0.1的第4_22位，1)所述shRNA產(chǎn)生的siRNA的另一條鏈序列與SEQ ID N0.1的第4_22位反向互補。
【文檔編號】A61P35/00GK103898050SQ201410125862
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權日:2014年3月31日
【發(fā)明者】江小霞, 張雷, 黨瑞杰, 李萍, 楊燕美, 李紅, 朱恒, 毛寧 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所