一種香料煙花蕾多糖、其制備方法及其作為抗氧化劑的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種香料煙花蕾多糖，其制備方法包括以下步驟：按照料液比為1∶20-40的比例向預(yù)處理后的香料煙花蕾中添加蒸餾水，于50-80℃、200-500W下超聲提取4-8min，然后離心，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后醇析靜置，離心取沉淀，采用Sevage法脫除蛋白后再次醇析靜置并離心取沉淀，經(jīng)后處理即得；同時公開了該多糖作為抗氧化劑的應(yīng)用。本發(fā)明從煙草花蕾中提取多糖，不僅能夠減少煙草加香的成本，并且煙草花蕾多糖能在煙草中發(fā)揮其清除自由基、抗癌等活性，給廣大煙民帶來了福音。本發(fā)明方法提取時間短，提取率高，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】一種香料煙花蕾多糖、其制備方法及其作為抗氧化劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于煙草產(chǎn)品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種香料煙花蕾多糖、其制備方法及其作為抗氧化劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]多糖，又稱多聚糖，是由單糖組成的高分子化合物。它是來自高等植物、動物細胞膜以及微生物細胞的天然大分子物質(zhì)，它是由十個到上萬個單糖基以糖苷鍵結(jié)合而成的天然大分子物質(zhì)，由于其分子式為(CH2O)n，所以通常人們又稱其為“碳水化合物”。我國對多糖的研究起步相對較晚，起始于20世紀70年代，1982年中國生物化學(xué)協(xié)會在青島召開第一次糖的生物學(xué)術(shù)會議。隨后，全國各地掀起多糖研究的熱潮，研究的對象涉及真菌類、植物、動物以及花粉等多種來源的多糖；近年來，國內(nèi)對大量中草藥多糖及糖綴合物如天門冬、純毛石耳、山藥、枸杞、蘆薈、月皮、松子殼、玉米穗、白木通、板藍根、酸棗仁多糖等進行了深入的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析和廣泛的生物活性研究，相繼報道了它們具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫能力等藥理作用。
[0003]多糖的提取一般采用熱水、酸、堿、乙醇等作為溶劑，并且多數(shù)采用熱水浸提法進行粗提。聶凌鴻采用熱水浸提廣東淮山水溶性多糖，在固液比1: 8，浸提溫度45°C，浸提時間2h的最佳工藝條件下，提取率為0.2816%。而在固液比1: 8，NaOH濃度為0.3mol/L,浸提時間為Ih的最佳堿提工藝條件下，廣東淮山水溶性多糖的提取率為0.2529%。在廣東淮山水溶性多糖的最佳提取工藝中，堿提具有相對較快的速度，而熱水浸提能夠得到相對較高的提取率。另外，也可以兩種溶劑結(jié)合使用。水提取的缺點是提取溫度高，耗時長且效率低，成本高，安全性低，而酸堿提取易破壞多糖的空間結(jié)構(gòu)及活性。
[0004]國內(nèi)在對于煙草花蕾基礎(chǔ)方面的研究還剛剛起步，在相關(guān)文獻中僅見少量報告。因此設(shè)計一種煙草花蕾多糖的提取方法十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種香料煙花蕾多糖、其制備方法及其作為抗氧化劑的應(yīng)用。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種香料煙花蕾多糖的制備方法，包括以下步驟:按照料液比為1: 20-40 (質(zhì)量體積Kg: ml)的比例向預(yù)處理后的香料煙花蕾中添加蒸餾水，于50-80°C、200-500W下超聲提取4-8min，然后離心，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(優(yōu)選為65_75°C )濃縮后醇析靜置，離心取沉淀，再次溶解沉淀后采用Sevage法脫除蛋白后再次醇析靜置并離心取沉淀，經(jīng)后處理(所述后處理方法為:真空冷凍干燥)即得香料煙花蕾多糖。
[0007]制得的香料煙花蕾多糖再利用層析柱分離純化后得精制多糖。
[0008] 所用層析柱的填料為S印harose CL-6B ;洗脫液為0.2 mo I/L的NaCl溶液。[0009]所述預(yù)處理將香料煙花蕾干燥后粉碎至50-70目。
[0010]上述方法中，醇析靜置時的溫度為2_6°C，靜置時間為10_14h ;離心時離心速率為8000-10000r/min，離心時間為10_15min，離心時的溫度為2_6°C。
[0011]為達到較高的提取率，較好的，上述方法中，選用以下參數(shù):料液比為1: 35 ;超聲提取溫度為70°C，超聲提取的功率為300w，超聲提取時間為6min ;離心溫度為4°C。
[0012]利用上述方法制得的香料煙花蕾多糖。
[0013]上述方法制得的香料煙花蕾多糖作為抗氧化劑的應(yīng)用。
[0014]Sevage法脫除蛋白采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)即可。醇析靜置時優(yōu)選使用無水乙醇進行醇析。
[0015]本發(fā)明在單因素實驗分析的基礎(chǔ)上，確定了超聲波法提取香料煙花蕾多糖的最佳工藝為:功率300W、時間6min、料液比1:35、溫度70°C，在這個條件下，香料煙花蕾多糖有最大提取率，為2.62% ;此外，采用鄰二氮菲法確定了香料煙花蕾多糖對羥基自由基的清除活性比較顯著；采用DPPH法檢測確定了香料煙花蕾多糖具有較好的DPPH.自由基清除能力，兩種方法證明了香料煙花蕾多糖是一種良好的抗氧化物質(zhì)。
[0016]本發(fā)明采用超聲輔助水提法提取香料煙煙草花蕾多糖，超聲輔助水提法比傳統(tǒng)方法更有效率。與傳統(tǒng)萃取相比，超聲輔助水提取法能夠顯著縮短提取的時間、提高提取率，是一種高效實用的多糖提取方法，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
[0017]超聲的工作機理如下:超聲的機械化學(xué)作用通過破壞細胞壁和加強細胞內(nèi)的傳質(zhì)作用，提高了植物中有機化合物的提取速度。超聲波在液體內(nèi)傳播時，液體介質(zhì)不斷受到壓縮和拉伸，在拉力作用下，液體斷裂形成暫時的近似真空的空洞，壓縮時，這些空洞就會發(fā)生崩潰，出現(xiàn)局部高溫以及放電現(xiàn)象，產(chǎn)生空化作用。超聲波空化可以從穩(wěn)態(tài)空化轉(zhuǎn)化成瞬態(tài)空化，空化泡瞬間長大破裂，吸收的能量在極短的時間和極小的空間內(nèi)釋放出來，形成高溫高壓的環(huán)境，同時伴隨有一定強度的沖擊波和微聲流，從而破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，使其在瞬間破裂，釋放細胞內(nèi)的有效成分，大大提高了提取率。超聲方法比傳統(tǒng)方法更有效率，并且超聲波萃取法并不影響水溶性多糖的生物性能。
[0018]煙草燃燒過程中的潛香類物質(zhì)能釋放出對人的香味感受起著重要作用的香味成分。這類化合物具有在自然條件下?lián)]發(fā)性弱，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的特點。在煙草中糖類物質(zhì)與其他化合物之間通過反應(yīng)形成的煙草糖苷化合物就是非常重要的一類潛香化學(xué)物質(zhì)。因此糖類是加香時很重要的一種物質(zhì)，本發(fā)明從煙草花蕾中提取多糖，不僅能夠減少煙草加香的成本，并且煙草花蕾多糖能在煙草中發(fā)揮其清除自由基、抗癌等活性，給廣大煙民帶來了?§#。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為香料煙花蕾多糖組分Fr-1和Fr-1I的S印harose CL-6B層析柱分離圖譜； 圖2為香料煙花蕾多糖組分Fr-1和Fr-1I的紅外鑒定圖譜；
圖3為香料煙花蕾多糖組分Fr-1和Fr-1I對OH.自由基的清除能力；
圖4為香料煙花蕾多糖組分Fr-1和Fr-1I對DPPH.自由基的清除能力。
【具體實施方式】[0020]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。
[0021]下述實施例中所述香料煙花蕾為巴斯瑪I號香料煙花蕾，采摘自云南；SeVage試劑選用體積比為5:1的氯仿/正丁醇混合溶液。
[0022]實施例1
(1)將香料煙花蕾自然風干后粉碎至50-70目得預(yù)處理后的香料煙花蕾1Og；
(2)按照料液比為1: 20 (質(zhì)量體積比g: ml)的比例向預(yù)處理后的香料煙花蕾中添加蒸懼水，于50°C、200W下超聲提取8min,接著2°C、8000r/min下離心15min后取上清液，65°C下將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原來體積的1/2 ；
(3)2°C下向濃縮液中加入無水乙醇，醇析靜置14h，接著2°C、8000r/min下離心15min后取沉淀，再次蒸餾水溶解沉淀之后利用Sevage法脫除蛋白，取上層多糖溶液；
(4)2 °C下向多糖溶液中加入無水乙醇，醇析靜置14h，然后2°C、8000r/min下離心15min取沉淀，再經(jīng)真空冷凍干燥即得香料煙花蕾多糖0.2g。
[0023]實施例2
(1)將香料煙花蕾自然風干后粉碎至50-70目得預(yù)處理后的香料煙花蕾IOg；
(2)按照料液比為1: 35 (質(zhì)量體積比g: ml)的比例向預(yù)處理后的香料煙花蕾中添加蒸懼水，于70°C、300W下超聲提取6min,接著4°C、10000r/min下離心12min后取上清液，70°C下將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原來體積的1/3 ；
(3)4°C下向濃縮液中加入無水乙醇，醇析靜置12h，接著4°C、10000r/min下離心12min后取沉淀，再次蒸餾水溶解沉淀之后利用Sevage法脫除蛋白，取上層多糖溶液；
(4)4°C下向多糖溶液中加入無水乙醇，醇析靜置12h，然后4°C、10000r/min下離心12min取沉淀，再經(jīng)真空冷凍干燥即得香料煙花蕾多糖0.262g。
[0024]實施例3
(1)將香料煙花蕾自然風干后粉碎至50-70目得預(yù)處理后的香料煙花蕾IOg；
(2)按照料液比為1: 40 (質(zhì)量體積比g: ml)的比例向預(yù)處理后的香料煙花蕾中添加蒸餾水，于80°C、500W下超聲提取4min，接著6°C、9000r/min下離心10min后取上清液，75 °C下將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原來體積的2/3 ；
(3)6°C下向濃縮液中加入無水乙醇,醇析靜置IOh,接著6°C、9000r/min下離心10min后取沉淀，再次蒸餾水溶解沉淀之后利用Sevage法脫除蛋白，取上層多糖溶液；
(4)6 °C下向多糖溶液中加入無水乙醇，醇析靜置10h，然后6°C、9000r/min下離心IOmin取沉淀，再經(jīng)真空冷凍干燥即得香料煙花蕾多糖0.235g。
[0025]將上述實施例中制得的香料煙花蕾多糖用層析柱進行分離和純化，獲得精制多糖；所用層析柱(2.5X60cm)的填料為S印harose CL-6B ;洗脫液為0.2 mo I/L NaCl溶液。具體操作為:取50mg香料煙花蕾多糖，用5mL 0.2 mo I/L NaCl溶液溶解后，過孔徑0.22Mm的濾膜，上柱，洗脫液以0.6mL /min的流速進行洗脫，部分收集器收集，150滴/管。每管取ImL精制多糖溶液，采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量。重復(fù)上柱5次。將同一組分的多糖收集在一起，濃縮 透析(透析袋分子量3500)后，(TC冷凍干燥。采用傅里葉紅外光譜技術(shù)對其分子結(jié)構(gòu)進行表征，確認獲得的兩個多糖組分為Fr-1和Fr-1I，結(jié)果見圖1和2。
[0026]最佳工藝條件的確定
通過單因素試驗確定功率、時間、料液比、溫度四個因素對香料花蕾多糖提取率的最佳水平。
[0027]功率:在料液比1: 30 (質(zhì)量體積比g: ml)，提取溫度60°C，提取時間4min，超聲波功率分別為100、200、300、400、500 W的條件下進行試驗，得出最佳功率水平，選擇200W、300W和400W三個水平設(shè)計正交試驗。
[0028]時間:在超聲波功率300 W，提取溫度60°C，料液比1: 30 (m: V)，提取時間分別為2、4、6、8、10 min的條件下進行試驗，得出最佳時間水平，選擇2min、4min和6min三個水
平設(shè)計正交試驗。
[0029]料液比:在超聲波功率300 W，提取溫度60°C，提取時間4 min，料液比分別為I: 20,1: 25、1: 30,1: 35、1:40 (質(zhì)量體積比g: ml的條件下進行試驗，得出最佳料液比水平，選擇1: 25、I: 30和1: 35三個水平設(shè)計正交試驗。
[0030]溫度:超聲波功率300 W，料液比1: 30 (質(zhì)量體積比g: ml)，提取時間4min，提取溫度分別為40、50、60、70、80 V的條件下進行試驗，得出最佳溫度水平，選擇50 V、60 V和70°C三個溫度水平進行正交試驗。
[0031]正交試驗:在單因素實驗分析的基礎(chǔ)上，選擇了 200W、300W和400W三個功率水平，2min、4min和6min三個時間水平，I: 25、1: 30和I: 35三個料液比水平，50°C、60°C和70°C三個溫度水平，進行正交試驗，可得出超聲波法提取香料煙花蕾多糖的最佳工藝為:功率300W、時間6min、料液比1: 35、溫度70°C時，在這個條件下，采用紫外可見分光光度計，運用苯酚-硫酸顯色法測得香料煙花蕾多糖有最大提取率，為2.62%，結(jié)果見表1。
[0032]表1:香料煙花蕾多糖超聲提取正交試驗結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種香料煙花蕾多糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:按照料液比為I: 20-40的比例向預(yù)處理后的香料煙花蕾中添加蒸餾水，于50-80°C、200-500W下超聲提取4-8min，然后離心，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后醇析靜置，離心取沉淀，采用Sevage法脫除蛋白后再次醇析靜置并離心取沉淀，經(jīng)后處理即得香料煙花蕾多糖。
2.如權(quán)利要求1所述的香料煙花蕾多糖的制備方法，其特征在于:利用層析柱將香料煙花蕾多糖分離純化后得精制多糖。
3.如權(quán)利要求2所述的香料煙花蕾多糖的制備方法，其特征在于:所用層析柱的填料為 Sepharose CL-6B ;洗脫液為 0.2mol/L 的 NaCl 溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的香料煙花蕾多糖的制備方法，其特征在于:所述預(yù)處理為將香料煙花蕾干燥后粉碎至50-70目。
5.如權(quán)利要求1所述的香料煙花蕾多糖的制備方法，其特征在于:醇析靜置時的溫度為2-6°C，靜置時間為10-14h。
6.如權(quán)利要求1所述的香料煙花蕾多糖的制備方法，其特征在于:離心時離心速率為8000-10000r/min，離心時間為10_15min，離心時的溫度為2_6°C。
7.如權(quán)利要求1所述的香料煙花蕾多糖的制備方法，其特征在于:料液比為1: 35;超聲提取溫度為70°C，超聲提取的功率為300W，超聲提取時間為6min ;離心溫度為4°C。
8.利用權(quán)利要求1-7任一所述的香料煙花蕾多糖的制備方法制備的香料煙花蕾多糖。
9.權(quán)利要求8所述的香料煙花蕾多糖作為抗氧化劑的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK103910808SQ201410125258
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】許春平, 鄭堅強, 肖源, 馬宇平, 毛多斌, 孫斯文, 劉遠上 申請人:河南中煙工業(yè)有限責任公司