Peg-sa及其藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了聚乙二醇（PEG）化的干擾素衍生物（PEG-SA）及其藥物組合物和制備方法。其中，該藥物組合物能充分利用干擾素衍生物（IFN-SA）PEG化制備獲得的多種產(chǎn)物，包括PEG-SA二聚體。另外，本發(fā)明也提供了該藥物組合物的原料（如，PEG-SA二聚體）和應(yīng)用等。
【專利說(shuō)明】PEG-SA及其藥物組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)(尤其是干擾素)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及聚乙二醇(PEG)化的干擾素衍生物(PEG-SA)及其藥物組合物和制備方法。其中，該藥物組合物能充分利用干擾素衍生物(IFN-SA) PEG化制備獲得的多種產(chǎn)物，包括PEG-SA 二聚體，簡(jiǎn)化了產(chǎn)物分離純化過(guò)程和/或提高了產(chǎn)物分離純化操作的寬容度，而且藥效也不差于、甚至略高于由純化的PEG-SA單體組成的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]早在本世紀(jì)初，我們就研究開(kāi)發(fā)了一種具有強(qiáng)抗病毒活性的人α干擾素衍生物，其被命名為IFN-SA，其氨基酸序列等情況可以參見(jiàn)中國(guó)專利第01102915.3號(hào)(《抗病毒活性的人α干擾素衍生物》，CN1281623C)。
[0003]為了降低干擾素自身的免疫原性并為了提高在體液中的半衰期，我們開(kāi)發(fā)了IFN-SA的N末端α氨基上單PEG化的產(chǎn)物(即PEG_IFN_SA，本文中簡(jiǎn)稱為PEG-SA)及其制備工藝，通過(guò)分子篩層析柱進(jìn)行細(xì)致的分離純化，去除了修飾2個(gè)PEG的IFN-SA等副產(chǎn)物，最終獲得了在RP-HPLC上僅表現(xiàn)為單一吸收峰的PEG-SA，其以純的單體形式存在，藥效確切，無(wú)論是純度上還是藥效上都非常適合藥物應(yīng)用(可以參見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)第201010516710.1號(hào)(《重組集成干擾素變異體聚乙二醇偶聯(lián)物的制備和應(yīng)用》，CN102453089A))。
[0004]本領(lǐng)域?qū)儆谖鞣结t(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，在西方醫(yī)藥的核心一還原論這一基本理論的指導(dǎo)下(目前中醫(yī)藥現(xiàn)代化也有許多開(kāi)始接受西藥化這種還原論的思路了，可以參見(jiàn)郭志軍，等.天津中醫(yī)藥，2003，2 0 (1):55)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該去進(jìn)行該藥物臨床方面的研究，而對(duì)該藥物本身結(jié)構(gòu)和純化的研究會(huì)在此止步，至少?zèng)]有動(dòng)機(jī)將純的PEG-SA單體去混用其他未知功效的物質(zhì)。
[0005]然而，我們跳出了西方醫(yī)學(xué)的限制，根據(jù)自身令人意外的發(fā)現(xiàn)，即在純的PEG-SA單體中加入少量PEG-SA 二聚體，不但基本不影響藥效，某些配比還能提高藥效，由此開(kāi)發(fā)新的PEG-SA及其藥物組合物，其中包括PEG-SA 二聚體，在基本不影響藥效的前提下，更充分地利用了 IFN-SA PEG化過(guò)程中產(chǎn)生的約10-15%的PEG-SA多聚體(大部分是二聚體，可以直接利用約一半)，降低了 IFN-SA的損耗，節(jié)約了成本，并且簡(jiǎn)化了產(chǎn)物分離純化過(guò)程、提高了生產(chǎn)效率(如可用高濃度的IFN-SA溶液作為起始原料)和/或提高了產(chǎn)物分離純化操作的寬容度。
[0006]另外，我們還開(kāi)發(fā)了新的PEG-SA的制備方法，沒(méi)有受現(xiàn)有技術(shù)優(yōu)化的結(jié)果阻礙，使得產(chǎn)生的副產(chǎn)物與現(xiàn)有技術(shù)的不同，更易于利用，即盡管會(huì)產(chǎn)生較多新的PEG-SA多聚體(如，二聚體)副產(chǎn)物，但是利用還原條件即可恢復(fù)成單體加以回收，更重要的是，這樣的少量PEG-SA多聚體(尤其是二聚體)也可以直接與PEG-SA單體配制(或一步收集)成上述藥物組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供新的IFN衍生物、其藥物組合物、藥物制劑及制備和應(yīng)用等。
[0008]具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了 PEG-1FN的制備方法，所述方法包括:
[0009](1)摩爾比為1:3.5~4.5的IFN和PEG醛在pH5~6緩沖液中以硼氫化物催化反應(yīng)，獲得PEG-SA反應(yīng)液；和
[0010](2)用色譜柱純化步驟(1)獲得的PEG-1FN反應(yīng)液，收集PEG-SA ；
[0011]其特征在于，
[0012](a)在步驟(1)中，IFN的濃度為8~12mg/ml，反應(yīng)的溫度為23_27°C，和反應(yīng)的時(shí)間為43~53 ;
[0013](b)任選在步驟(2)中，僅僅用一步體積排阻色譜柱來(lái)純化；和
[0014](C)任選在步驟(2)中，收集PEG-1FN單體和/或多聚體。
[0015]在本文中，“PEG”和聚乙二醇可以互換使用，在與活性反應(yīng)基團(tuán)連用的時(shí)候(如PEG醛)，指的是活性反應(yīng)基團(tuán)(如醛)活化的PEG分子；在與蛋白質(zhì)(如IFN)連用的時(shí)候(如PEG-1FN)，指的是PEG化的蛋白質(zhì)。目前，PEG和帶有活性反應(yīng)基團(tuán)的PEG基本已經(jīng)商品化。
[0016]在本發(fā)明中，PEG醛優(yōu)選可以是PEG丙醛、PEG 丁醛或PEG戊醛等。PEG可以是直鏈的，也可以是支鏈的。PEG可以有一個(gè)或多個(gè)(如兩個(gè))連接點(diǎn)，優(yōu)選只有一個(gè)，另一個(gè)可以用惰性基團(tuán)(如甲氧基)封閉。另外，PEG的分子量可以是任何合適的分子量，通常為5~80kDa，優(yōu)選為10~40kDa，如為10kDa、20kDa或40可Da等，在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，優(yōu)選為20kDa。在本文中，如無(wú)相反指示，PEG與數(shù)字的連用，表示PEG的分子量為相應(yīng)數(shù)字的千Da，如PEG20表示20kDa的PEG。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，PEG醛是分子量為20kDa的單甲氧基聚乙二醇丁醛。
[0017]在本文中，如無(wú)相反指示，“IFN”和干擾素可以互換使用，指的是天然的干擾素或者保留天然干擾素基本結(jié)構(gòu)(如與天然干擾素序列同一性大于80%，優(yōu)選大于90%，更優(yōu)選大于95%，如大于97%、98%或99%)的干擾素衍生物。IFN的實(shí)例包括但不限于α干擾素(gpIFNa )，如 IFNa -2a 和 IFNa -2b。
[0018]在本發(fā)明中，IFN優(yōu)選是IFN-SA。IFN-SA，在本文中也可以簡(jiǎn)稱為SA，是強(qiáng)抗病毒活性的人α干擾素衍生物，其結(jié)構(gòu)(如氨基酸序列)記載于中國(guó)專利第01102915.3號(hào)和/或中國(guó)專利申請(qǐng)第201010516710.1號(hào)中。
[0019]因此，優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法是PEG-SA的制備方法，所述方法包括:
[0020](1)摩爾比為1:3.5~4.5的IFN-SA和PEG醛在pH5~6緩沖液中以硼氫化物催化反應(yīng)，獲得PEG-SA反應(yīng)液；和
[0021](2)用色譜柱純化步驟(1)獲得的PEG-SA反應(yīng)液，收集PEG-SA ；
[0022]其特征在于，
[0023](a)在步驟(1)中，IFN-SA的濃度為8~12mg/ml，反應(yīng)的溫度為23_27°C，和反應(yīng)的時(shí)間為43~53 ;
[0024](b)任選在步驟(2)中，僅僅用一步體積排阻色譜柱來(lái)純化；和
[0025](C)任選在步驟(2)中，收集PEG-SA單體和/或多聚體。
[0026]中國(guó)專利申請(qǐng)第201010516710.1號(hào)公開(kāi)了一種PEG-SA的制備方法并優(yōu)化了各項(xiàng)制備參數(shù)。其中，摩爾比優(yōu)選為1:4;優(yōu)選pH5.3~5.8，如pH5.5 ;和/或，硼氫化物優(yōu)選是氰基硼氫化鈉。使用這些必要條件獲得了高修飾率、活性/結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的產(chǎn)物，副產(chǎn)物中存在一定的多個(gè)PEG修飾的多聚體(如2個(gè)PEG修飾在一個(gè)IFN上；這種副產(chǎn)物不方便回收利用，因?yàn)槿コ粋€(gè)PEG的反應(yīng)條件，往往也使得另一個(gè)PEG掉下來(lái))，通過(guò)SP Sepharose和Superdex75這兩種色譜柱來(lái)分離純化。當(dāng)然，要獲得這樣的產(chǎn)物，還有些必要條件，如溫度不可過(guò)高，明確要求設(shè)定在4°C;以及，IFN濃度不可過(guò)高，明確要求設(shè)定在3.0~4.0mg/ml。
[0027]我們沒(méi)有被中國(guó)專利申請(qǐng)第201010516710.1號(hào)的內(nèi)容所禁錮，發(fā)現(xiàn)采用并非該文獻(xiàn)設(shè)定的優(yōu)化條件(如，濃度、溫度和時(shí)間)，在保持N末端α氨基上連接PEG的性質(zhì)的前提下，反而能產(chǎn)生非常有益的效果。采用我們重新優(yōu)化的條件，副產(chǎn)物是PEG-SA多聚體，通過(guò)電泳和體積排阻色譜沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多個(gè)PEG聚合在一個(gè)IFN上的副產(chǎn)物。這樣，經(jīng)過(guò)還原反應(yīng)即可使得多聚體還原成單體，從而方便回收；多聚體的分子量成倍上升，使得用體積排阻色譜純化時(shí)，單體和多聚體的峰分得更開(kāi)，可以進(jìn)行一步分離純化，而無(wú)需兩種色譜柱；而且，通過(guò)一步色譜純化，可以直接收集獲得單體和多聚體等多種分離的產(chǎn)物，當(dāng)然也可以直接收集獲得包括單體和多聚體的混合物或者包括不同多聚體的混合物。
[0028]為了清楚起見(jiàn)，在本文中，PEG-SA多聚體指的是PEG-SA單體多聚而形成的多聚體，其分子量是PEG-SA單體的多倍；而并不是PEG修飾的多聚體(多個(gè)PEG修飾在同一蛋白質(zhì)上的聚合體，其分子量的增加值僅與PEG個(gè)數(shù)相關(guān))。這樣的多聚體可以通過(guò)與分子量有關(guān)的分離鑒定技術(shù)來(lái)鑒定，如電泳、體積排阻色譜、質(zhì)譜等。在本發(fā)明中，PEG-SA多聚體包括PEG-SA 二聚體和PEG-SA三聚體等，優(yōu)選為二聚體。這些多聚體可以通過(guò)與電泳相同的還原條件解聚成單體，從而方便直接制備單體。
[0029]優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，在步驟(1)中，IFN-SA的濃度優(yōu)選為9~Ilmg/ml，在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，優(yōu)選為10mg/ml。也優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，在步驟(I)中，反應(yīng)的溫度優(yōu)選為24-26°C，在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，優(yōu)選為25 V。還優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，在步驟(1)中，反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為46~50，在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，優(yōu)選為48小時(shí)。這些我們優(yōu)化的條件與中國(guó)專利申請(qǐng)第201010516710.1號(hào)所啟示的方向不同，是非顯而易見(jiàn)的。
[0030]在本發(fā)明第一方面的方法中，步驟(2)可以采用中國(guó)專利申請(qǐng)第201010516710.1號(hào)記載的多步色譜純化的過(guò)程，但是優(yōu)選僅僅一步純化。其中，所用的體積排阻色譜是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的色譜技術(shù)，許多體積排阻色譜柱已經(jīng)商業(yè)化，但是沒(méi)有現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)僅僅通過(guò)一步體積排阻色譜就能分離純化IFN單體和多聚體，更沒(méi)有現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)僅僅一步的體積排阻色譜適用于本發(fā)明第一方面步驟(1)的產(chǎn)物的分離純化。
[0031 ] 在第二方面，本發(fā)明提供了 PEG化的干擾素衍生物，其為PEG-1FN多聚體，如PEG-1FN 二聚體。在本文中，PEG-1FN多聚體指的是PEG-1FN單體多聚而形成的多聚體，其分子量是PEG-1FN單體的多倍。
[0032]優(yōu)選本發(fā)明第二方面的PEG化的干擾素衍生物為PEG-SA多聚體。在本發(fā)明中，PEG-SA多聚體包括PEG-SA 二聚體和PEG-SA三聚體等，優(yōu)選為PEG-SA 二聚體。我們首次發(fā)現(xiàn)了 PEG-SA多聚體，并且研究了它們的功能。首先，它們能還原成單體而間接作為原料；其次，它們，尤其是PEG-SA 二聚體，可以少量直接替代PEG-SA單體而基本不影響(甚至有時(shí)會(huì)提高)藥效，而且 這樣的藥用是安全的。
[0033]在第三方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括PEG-1FN單體和PEG-1FN 二聚體，其中PEG-1FN 二聚體僅少量存在與大量PEG-1FN單體中。例如，其中PEG-SA單體含量為90~99.5%而且PEG-SA 二聚體含量為0.5~10%，優(yōu)選其中PEG-SA單體含量為91~99%而且PEG-SA 二聚體含量為I~9%，更優(yōu)選其中PEG-SA單體含量為92~98.5%而且PEG-SA二聚體含量為1.5~8%，最優(yōu)選其中PEG-SA單體含量為95~98% (如95.5%,96%,96.5%、97% 或 97.5%)而且 PEG-SA 二聚體含量為 2 ~5% (如 2.5%、3%、3.5%、4% 或 4.5%)。
[0034]在本文中，如無(wú)相反指示，百分比(B卩“ ％”)指的是重量百分比。通過(guò)兩個(gè)百分比數(shù)值，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易地計(jì)算出它們的比例，例如97.5%和2.5%的比例是97.5:2.5。顯然，這樣的比例是重量比例。
[0035]優(yōu)選本發(fā)明第三方面的藥物組合物是藥物組合物，其包括PEG-SA單體和PEG-SA二聚體，其中PEG-SA 二聚體僅少量存在與大量PEG-SA單體中。例如，其中PEG-SA單體含量為90~99.5%而且PEG-SA 二聚體含量為0.5~10%，優(yōu)選其中PEG-SA單體含量為91~99%而且PEG-SA 二聚體含量為I~9%，更優(yōu)選其中PEG-SA單體含量為92~98.5%而且PEG-SA 二聚體含量為1.5~8%，最優(yōu)選其中PEG-SA單體含量為95~98% (如95.5%、96%、96.5%,97% 或 97.5%)而且 PEG-SA 二聚體含量為 2 ~5% (如 2.5%、3%、3.5%、4% 或 4.5%)。
[0036]我們首次發(fā)現(xiàn)了 PEG-SA多聚體，尤其是PEG-SA 二聚體，可以少量替代PEG-SA單體，而這樣的藥用是安全的。因此，優(yōu)選本發(fā)明第三方面的藥物組合物具有低體內(nèi)免疫原性。低體內(nèi)免疫原性能產(chǎn)生非常有益的效果，如不容易引發(fā)免疫反應(yīng)而用藥更加安全；又如用藥效率高，不容易產(chǎn)生中和抗體抵消部分用藥量，所以用藥量減少，而用藥量減少又增強(qiáng)用藥安全性。
[0037]更優(yōu)選本發(fā)明第三方面的藥物組合物四周用藥后的抗體滴度的幾何均數(shù)小于20，更優(yōu)選小于15，更加優(yōu)選小于12，如小于10或8。通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的檢測(cè)方法，如本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】的檢測(cè)方法，可以測(cè)量出四周用藥后的抗體滴度，計(jì)算出幾何均數(shù)。
[0038]也更優(yōu)選本發(fā)明第三方面的藥物組合物停藥四周后的抗體滴度的幾何均數(shù)小于3，更優(yōu)選小于2，更加優(yōu)選小于1，如小于0.3或0.1。通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的檢測(cè)方法，如本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】的檢測(cè)方法，可以測(cè)量出停藥四周后的抗體滴度，計(jì)算出幾何均數(shù)。
[0039]我們首次發(fā)現(xiàn)了 PEG-SA多聚體，尤其是PEG-SA 二聚體，可以少量替代PEG-SA單體而基本不影響(甚至有時(shí)會(huì)提高)藥效。因此，優(yōu)選本發(fā)明第三方面的藥物組合物抗病毒的效果不差于(甚至優(yōu)于)PEG-1FN (尤其是PEG-SA)單體的抗病毒的效果。通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的檢測(cè)方法，如本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】的檢測(cè)方法，可以測(cè)量出抗病毒的效果，計(jì)算出結(jié)果判斷是否不差于或優(yōu)于，如通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算來(lái)判斷是否沒(méi)有顯著差異或者顯著提高了。
[0040]在本發(fā)明中，病毒指的是IFN所能抗的任何病毒，例如肝炎病毒、乳頭狀病毒、單純性皰疹病毒、HIV、EB病毒、冠狀病毒和/或流感病毒等，優(yōu)選是肝炎病毒，如HBV或HCV。
[0041]在第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第三方面的藥物組合物的制備方法。該制備方法可以包括將PEG-1FN (尤其是PEG-SA)單體和二聚體混合的過(guò)程。其中，單體和二聚體可以通過(guò)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中的方法分離純化，也可以按照現(xiàn)有技術(shù)記載的方法，如PEG-SA單體的制備可以參見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)第201010516710.1號(hào)。
[0042]根據(jù)本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，只要在一定的保留時(shí)間段不換收集管(即，直接)收集單體和二聚體對(duì)應(yīng)的峰或其中純的部分，就可以獲得單體和二聚體的混合物。所以，優(yōu)選本發(fā)明第四方面的方法不包括單體和二聚體混合的過(guò)程，而是直接獲得的。例如，本發(fā)明第四方面的方法包括本發(fā)明第一方面的方法，而且其中收集PEG-1FN (尤其是PEG-SA)是一次性收集PEG-1FN (尤其是PEG-SA)單體和PEG-1FN (尤其是PEG-SA) 二聚體的混合物，并且其中PEG-1FN (尤其是PEG-SA)單體和PEG-1FN (尤其是PEG-SA)二聚體的比例是本發(fā)明第三方面中所述的含量比例。然后冷凍干燥棄去溶劑即可。
[0043]為了清楚起見(jiàn)，在本文中，PEG-1FN (尤其是PEG-SA)單體和PEG-1FN (尤其是PEG-SA) 二聚體的比例 為90~99.5:0.5~10，優(yōu)選為91~99:1~9，更優(yōu)選為92~98.5:1.5 ~8，最優(yōu)選為 95 ~98 (如 95.5,96,96.5、97 或 97.5):2 ~5 (如 2.5、3、3.5、4或 4.5)。
[0044]本發(fā)明第四方面的方法可以是有意的，這樣可以充分利用產(chǎn)生的(一部分)二聚體，減少回收后還原的工作量；也可以是無(wú)意的，如生手操作換收集管時(shí)機(jī)掌握欠佳，使得單體中混入了少量二聚體，這樣客觀上提高了分離純化操作的寬容度。所以，本發(fā)明第四方面的方法從多個(gè)角度看都是有益的。
[0045]在第五方面，本發(fā)明提供了藥物制劑，其包括本發(fā)明第三方面的藥物組合物和藥學(xué)上可接受的輔料。
[0046]在本文中，藥學(xué)上可接受的輔料指無(wú)毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、佐劑、包裹材料或其他制劑輔料。所用輔料可與相應(yīng)的給藥形式相適應(yīng)，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的載體配成注射劑、(注射用)凍干粉、噴霧劑、口服溶液、口服混懸液、片劑、膠囊、腸溶片、丸劑、粉劑、顆粒劑、持續(xù)釋放或延遲釋釋放等制劑。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明第三方面的藥物組合物通過(guò)注射方式給藥，因此，本發(fā)明第五方面的藥物制劑優(yōu)選為注射劑，即適于配制成注射給藥的輔料特別優(yōu)選的。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，藥學(xué)上可接受的輔料可以是適合注射的溶液。
[0047]用藥量可以根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得，根據(jù)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的等效劑量換算關(guān)系(通?？蓞⒁?jiàn)FDA、SFDA等藥品管理機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)意見(jiàn)，也可參見(jiàn)“黃繼漢等.藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004Sep; 9 (9): 1069-1072”)可從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量推導(dǎo)出人的有效劑量。
[0048]在第六方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面的PEG化的干擾素衍生物在制備抗病毒、抗癌或增強(qiáng)免疫功能的藥物組合物或藥物制劑中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，癌指的是IFN所能抗的任何癌，例如肝癌、乳腺癌、腎癌或白血病。
[0049]本發(fā)明第二方面的PEG化的干擾素衍生物(尤其是PEG-SA多聚體，如PEG-SA 二聚體)可以作為藥物原料而還原制備成PEG化的干擾素衍生物(尤其是PEG-SA)單體，再進(jìn)一步制備成藥物組合物或藥物制劑。
[0050]本發(fā)明第二方面的PEG化的干擾素衍生物(尤其是PEG-SA多聚體，如PEG-SA 二聚體)也可以直接作為藥物組合物或藥物制劑中的成分而制備成藥物組合物或藥物制劑。優(yōu)選本發(fā)明第六方面的應(yīng)用是IFN (尤其是PEG-SA)單體和本發(fā)明第二方面的PEG化的干擾素衍生物(尤其是PEG-SA多聚體，如PEG-SA 二聚體)聯(lián)合的應(yīng)用，即IFN (尤其是PEG-SA)單體和本發(fā)明第二方面的PEG化的干擾素衍生物(尤其是PEG-SA多聚體，如PEG-SA二聚體)聯(lián)合在制備抗病毒、抗癌或增強(qiáng)免疫功能的藥物組合物或藥物制劑中的應(yīng)用。
[0051]更優(yōu)選在本發(fā)明第六方面的應(yīng)用中，PEG-SA單體和PEG多聚體的比例是是本發(fā)明第三方面中所述的含量比例。
[0052]在第七方面，本發(fā)明提供了 PEG-SA單體的制備方法，其包括還原本發(fā)明第二方面的PEG化的干擾素衍生物(如PEG-SA 二聚體和/或三聚體)的步驟。優(yōu)選還原所用的還原劑是還原電泳所用的還原劑，如疏基乙醇和/或二硫蘇糖醇(DDT)等。
[0053]在第八方面，本發(fā)明提供了鑒定藥物制劑是否含有本發(fā)明第三方面的藥物組合物的方法，其包括，測(cè)定該藥物制劑中PEG-SA單體和PEG-SA 二聚體含量，和計(jì)算PEG-SA單體和PEG多聚體的比例是否是本發(fā)明第三方面中所述的含量比例。測(cè)定方法包括電泳、色譜(尤其是體積排阻色譜)等分離和鑒定集于一身的技術(shù)，通常通過(guò)獲得的電泳或者色譜(尤其是體積排阻色譜)圖譜進(jìn)行面積歸一法分析，可以計(jì)算得出其中的含量。
[0054]為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0055]另外，本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明 進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中重復(fù)敘述過(guò)一樣。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0056]圖1是PEG-SA的體積排阻色譜的洗脫圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0057]以下結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，其中試劑以及樣品均可通過(guò)商業(yè)渠道獲得，實(shí)驗(yàn)步驟如有未盡之處，均可參見(jiàn)醫(yī)藥管理部門(mén)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和指引，尤其是《中國(guó)藥典》的規(guī)定，并可以按照商業(yè)化的原料、設(shè)備的廠商說(shuō)明來(lái)進(jìn)行。
[0058]實(shí)施例1IFN-SA的制備
[0059]IFN-SA的基因構(gòu)建、重組表達(dá)載體構(gòu)建、蛋白的融合表達(dá)以及發(fā)酵和純化過(guò)程，均參照中國(guó)專利第01102915.3號(hào)(《抗病毒活性的人α干擾素衍生物》，CN1281623C)進(jìn)行，由此獲得IFN-SA。
[0060]實(shí)施例2PEG-SA的制備和純化
[0061]基本參照中國(guó)專利申請(qǐng)第201010516710.1號(hào)(《重組集成干擾素變異體聚乙二醇偶聯(lián)物的制備和應(yīng)用》，CN102453089A)所述的制備和純化工藝，用實(shí)施例1獲得的IFN-SA與mPEG-ButyrALD-20kD (純度大于95%，相對(duì)分子量為2.0 X IO4Da,購(gòu)自北京鍵凱科技有限公司)為原料(兩者摩爾比為1:4)在pH5.5體系中以氰基硼氫化鈉(購(gòu)自Sigma公司)催化反應(yīng)，以制備PEG20-SA反應(yīng)液，其中所不同的地方在于:參與反應(yīng)的IFN-SA溶液濃度為10mg/mL，于25°C下反應(yīng)48小時(shí)。由此，制備得到PEG20-SA反應(yīng)液。
[0062]將上述PEG20-SA反應(yīng)液上樣于TSKgel G3000SWXL體積排阻色譜柱上，用IOmM PB(PH7.0)洗脫。洗脫圖譜如圖1所示，分別收集各洗脫峰，經(jīng)電泳和元素分析，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為10.962和11.370的峰為分子量約為128kDa (在非還原電泳條件下的；在還原(添加了巰基乙醇)電泳條件下，分子量約為43kDa)、IFN-SA:mPEG (摩爾比)為1:1的產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為PEG20-SA三聚體；保留時(shí)間為12.470的峰為分子量約為85kDa (在非還原電泳條件下的；在還原電泳條件下，分子量約為43kDa)、IFN-SA:mPEG (摩爾比)為1:1的產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為PEG20-SA 二聚體，約占蛋白質(zhì)產(chǎn)物的14% ;保留時(shí)間為14.354的峰為分子量約為43kDa(非還原和還原電泳條件下均是)、IFN-SA:mPEG(摩爾比)為1:1的產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為PEG20-SA單體，約占蛋白質(zhì)產(chǎn)物的48% ;保留時(shí)間為21.032的峰為分子量約為22kDa、IFN-SA:mPEG(摩爾比)為1:0的產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為未反應(yīng)的IFN-SA，約占蛋白質(zhì)產(chǎn)物的36% ;此后的峰均為溶劑中的小分子等。
[0063]由于不包括約60kDa的產(chǎn)物，PEG20-SA單體的峰與其他峰分離得較開(kāi)，因此PEG20-SA單體純品可以通過(guò)體積排阻色譜一步就分離純化出，未反應(yīng)的IFN-SA也可以由此直接回收；PEG20-SA 二聚體和三聚體的峰比較緊密，但是收集保留時(shí)間在12.3之后的PEG20-SA二聚體的峰，仍舊可以獲得可供直接利用的PEG20-SA 二聚體純品；由于PEG20-SA三聚體較少，而且與二聚體的峰分離效果一般，所以可以和PEG20-SA 二聚體的峰一起收集，獲得PEG20-SA多聚體混合物。以上純化的PEG20-SA單體和二聚體以及多聚體混合物分別冷凍干燥，備用。另外，PEG20-SA多聚體(含二聚體)可以用于還原為單體。
[0064]實(shí)施例3PEG-SA及其組合物的安全性及藥效研究
[0065]取按照實(shí)施例2制備的純化的各種PEG20-SA單體和二聚體等，溶于生理鹽水中進(jìn)行以下安全性和藥效實(shí)驗(yàn)。
[0066](1)皮下注射食蟹猴的血清抗藥抗體的酶聯(lián)免疫吸附分析
[0067]研究目的在于考察各種PEG-SA注射后是否會(huì)引起針對(duì)IFN-SA的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)作用動(dòng)物為食蟹猴，雌雄各半，隨機(jī)分組:組1:空白對(duì)照組，給藥生理鹽水；組2:單體實(shí)驗(yàn)組，給藥PEG20-SA單體，劑量為50μ g/kg ;組3:二聚體實(shí)驗(yàn)組，給藥PEG20-SA 二聚體，劑量為50μ g/kg ;組4:多聚體實(shí)驗(yàn)組，給藥PEG20-SA多聚體，劑量為30μg/kg ;組5:5%二聚體的單體混合組，給藥PEG20-SA單體(劑量為47.5 μ g/kg)和二聚體(劑量為2.5 μ g/kg);組6:2% 二聚體的單體混合組，給藥PEG20-SA單體(劑量為49 μ g/kg)和二聚體(劑量為I μ g/kg)。每周注射給藥一次，連續(xù)給藥四周，給藥期間每?jī)芍芎屯Ｋ幒笏闹芊謩e采血約500 μ L，離心分離血清后用間接ELISA法檢測(cè)該血清中抗IFN-SA的抗體滴度，并計(jì)算抗體滴度的幾何均數(shù)(為抗體滴度倒數(shù)的反對(duì)數(shù)平均值)，考察PEG-SA引起的免疫原性。
[0068]結(jié)果如表1所示，各種PEG-SA的給藥都會(huì)產(chǎn)生一定量的抗IFN-SA抗體，其中，PEG-SA單體的給藥只會(huì)引發(fā)少量的抗IFN-SA抗體，而且停藥4周后即可恢復(fù)；而PEG-SA多聚體(主要是二聚體，也含三聚體)的中劑量直接給藥和純化的PEG-SA 二聚體大劑量直接給藥，都會(huì)顯著大幅提高抗IFN-SA抗體的量，即使停藥4周后也沒(méi)能夠恢復(fù)，但是純化的PEG-SA 二聚體比多聚體要小得多，標(biāo)明多聚體中的少量三聚體更容易引起免疫反應(yīng)；令人意外的是，在PEG-SA單體中替代混入少量PEG-SA 二聚體，并不影響抗IFN-SA抗體的量，與單獨(dú)給藥PEG-SA單體沒(méi)有顯著的區(qū)別，在給藥期間產(chǎn)生少量的抗IFN-SA抗體，而且停藥4周后即可恢復(fù)。這表明，PEG-SA多聚體的直接用藥會(huì)提高體內(nèi)免疫原性，降低長(zhǎng)期用藥的藥效，并且?guī)?lái)用藥安全性隱患，因此不建議直接使用PEG-SA多聚體；純化的PEG-SA單體及其中混入少量(不超過(guò)8%，優(yōu)選不超過(guò)5%)的PEG-SA 二聚體，具有安全限度以內(nèi)的低體內(nèi)免疫原性，而且能夠很快恢復(fù)，都可以直接用藥。
[0069]表1皮下注射PEG-SA后食蟹猴血清中抗IFN-SA的抗體滴度[0070]
【權(quán)利要求】
1.PEG-SA的制備方法，所述方法包括: (1)摩爾比為1:3.5~4.5 (如I:4)的IFN-SA和PEG醛(優(yōu)選PEG丙醛、PEG 丁醛或PEG戊醛，更優(yōu)選其中PEG的分子量為10~40kDa，如為20kDa)在pH5~6 (優(yōu)選pH5.3~5.8，如pH5.5)緩沖液中以硼氫化物(如氰基硼氫化鈉)催化反應(yīng)，獲得PEG-SA反應(yīng)液；和 (2)用色譜柱純化步驟(1)獲得的PEG-SA反應(yīng)液，收集PEG-SA； 其特征在于， (a)在步驟(1)中，IFN-SA的濃度為8~12mg/ml(優(yōu)選為9~llmg/ml,如10mg/ml),反應(yīng)的溫度為23-27°C (優(yōu)選為24-26°C，如25°C )，和反應(yīng)的時(shí)間為43~53 (優(yōu)選為46~50，如48小時(shí))； (b)任選在步驟(2)中，僅僅用一步體積排阻色譜柱來(lái)純化；和 (c)任選在步驟(2)中，收集PEG-SA單體和/或多聚體(如二聚體)。
2.PEG化的干擾素衍生物，其為PEG-SA多聚體，如PEG-SA 二聚體。
3.藥物組合物，其包括PEG-SA單體和PEG-SA二聚體，其中PEG-SA單體含量為90~99.5%而且PEG-SA 二聚體含量為0.5~10%，優(yōu)選其中PEG-SA單體含量為91~99%而且PEG-SA 二聚體含量為I~9%，更優(yōu)選其中PEG-SA單體含量為92~98.5%而且PEG-SA 二聚體含量為1.5~8%，最優(yōu)選其中PEG-SA單體含量為95~98%(如95.5%,96%,96.5%,97%或 97.5%)而且 PEG-SA 二聚體含量為 2 ~5% (如 2.5%、3%、3.5%、4% 或 4.5%)。
4.權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其具有低體內(nèi)免疫原性，優(yōu)選其四周用藥后的抗體滴度的幾何均數(shù)小于20，更優(yōu)選小于15，更加優(yōu)選小于12，如小于10或8 ;也優(yōu)選其停藥四周后的抗體滴度的幾何均數(shù)小于3，更優(yōu)選小于2，更加優(yōu)選小于1，如小于0.3或0.1。
5.權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其抗病毒(如HBV或HCV)的效果不差于PEG-SA單體的抗病毒(如HBV或HCV)的效果。
6.權(quán)利要求3~5之任一所述的藥物組合物的制備方法，其包括權(quán)利要求1所述的方法，而且其中收集PEG-SA是一次性收集PEG-SA單體和PEG-SA多聚體的混合物，并且其中PEG-SA單體和PEG-SA多聚體的比例是權(quán)利要求3中所述的含量比例。
7.藥物制劑，其包括權(quán)利要求3~5之任一所述的藥物組合物和藥學(xué)上可接受的輔料。
8.權(quán)利要求2所述的干擾素衍生物(如PEG-SA二聚體)在制備抗病毒(如HBV或HCV)、抗癌(如肝癌、乳腺癌、腎癌或白血病)或增強(qiáng)免疫功能的藥物組合物或藥物制劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其是PEG-SA單體和權(quán)利要求2所述的干擾素衍生物(如PEG-SA 二聚體)聯(lián)合的應(yīng)用，優(yōu)選其中PEG-SA單體和PEG多聚體的比例是權(quán)利要求3中所述的含量比例。
10.鑒定藥物制劑是否含有權(quán)利要求3~5之任一所述的藥物組合物的方法，其包括，測(cè)定該藥物制劑中PEG-SA單體和PEG-SA 二聚體含量，和計(jì)算PEG-SA單體和PEG多聚體的比例是否是權(quán)利要求3中所述的含量比例。
【文檔編號(hào)】A61P37/04GK103936847SQ201410119240
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】馮靜, 楊柳 申請(qǐng)人:北京凱因科技股份有限公司