用于治療退變性病癥的ledgf肽及其制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供具有抗蛋白質(zhì)聚集活性的LEDGF肽和使用方法。本文公開的LEDGF肽顯示治療退變性疾病和具有包括氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)聚集應(yīng)激的各種細(xì)胞應(yīng)激的疾病的能力。此外，本發(fā)明提供延長(zhǎng)釋放制劑，包括適于眼部施用的制劑。
【專利說明】用于治療退變性病癥的LEDGF肽及其制劑
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年5月21日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/649, 847和2012年 11月16日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2012/065620的優(yōu)先權(quán)。以上確認(rèn)的優(yōu)先權(quán)申請(qǐng) 的內(nèi)容據(jù)此以引用的方式完全并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明大體上涉及用于治療退變性疾病和具有包括氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)聚集應(yīng)激 的各種細(xì)胞應(yīng)激的疾病的新型晶狀體上皮源性生長(zhǎng)因子（LEDGF)肽及其組合物。更具體來(lái) 說，本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性和持續(xù)的遞送分布的新型LEDGFh 26制劑和它們治療蛋白 質(zhì)聚集介導(dǎo)的疾病、老年性疾病和退變性疾病的用途。
[0004] 背景
[0005] 在美國(guó)，包括老年性黃斑變性（AMD)和視網(wǎng)膜色素變性（RP)的眼后段疾病是致 盲的主要病因。（Jager等，N Em J MED，2008. 358(24) :2606-17)。當(dāng)前，在美國(guó)約800萬(wàn) 個(gè)體正摧患AMD,并且截至2020年，預(yù)期這個(gè)數(shù)目會(huì)達(dá)到1200萬(wàn)。（Jager等；Friedman等 Arch 0phthalmol，2004. 122(4):第564-72頁(yè)）。與慢性氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的干性形式 的 AMD (干性 AMD)占 AMD 病例的 90%。（Libby 等 Adv Exp Med Biol，2010. 664:第 403-9 頁(yè)；Stuen. Generations，2003. 27 :第8-14頁(yè)）。另一方面，RP是一種由超過50個(gè)不同基 因突變引起的遺傳疾病。（〇hguro，H.等，Nihon Ganka Gakkai Zasshi，2002. 106(8):第 461-73 頁(yè)；Dryja，，等，Nature，1990. 343 (6256):第 364-6 頁(yè)。）全世界約 150 萬(wàn)人當(dāng)前罹 患 RP。（Hartong 等，Lancet，2006. 368 (9549):第 1795-809 頁(yè)）。
[0006] 眼的獨(dú)特解剖結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能是針對(duì)眼背面（包括視網(wǎng)膜退變性疾病）的藥物 治療劑進(jìn)步的主要障礙。（Kompella等，Ther Deliv.l(3):第435-56頁(yè)）。由于存在各 種靜態(tài)屏障（角膜、結(jié)膜和鞏膜以及其它組織）和動(dòng)態(tài)屏障（眨眼、淚膜、淚翻轉(zhuǎn)和誘發(fā)的 流淚），表面施用途徑在向眼背面遞送藥物方面是低效的。（Gaudana，R.等，Ocular drug delivery. Aaps J，2010. 12(3):第 348-60 頁(yè)；Thrimawithana 等 Drug Discov Today， 2011. 16 (5-6):第270-7頁(yè)）。另一方面，血液視網(wǎng)膜屏障（BRB)、全身性降解、全身性副作用 和在靶標(biāo)部位處濃度較低是靜脈內(nèi)途徑的主要挑戰(zhàn)。如前眼房?jī)?nèi)、眼周、視網(wǎng)膜下的其它途 徑具有它們自身的一小組問題，所述問題與表面和全身性施用途徑共有一些爭(zhēng)論點(diǎn)（Baid 等 Drug Development and the back ofthe eye. Kompella UB 編.2〇10,第 4〇9-448 頁(yè)： Springer)。如玻璃體內(nèi)注射的局部遞送將藥物放置在緊密鄰近視網(wǎng)膜（視網(wǎng)膜退變性疾 病的靶標(biāo)組織）處且因此是向視網(wǎng)膜遞送藥物的最有效途徑。然而，頻繁玻璃體內(nèi)注射藥 物會(huì)導(dǎo)致各種并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜出血、眼內(nèi)炎、眼內(nèi)壓增加，而更不必提及患者 順應(yīng)性和感染。（Peyman 等 Retina，2009. 29(7):第 875-912 頁(yè)· ；Wu 等 Semin Ophthalmol， 2009.24(2):第100-5頁(yè)）。因此，對(duì)可延長(zhǎng)藥物在眼中的保留的組合物和遞送系統(tǒng)存在需 要。
[0007] 新型藥物遞送系統(tǒng)已贏得較大關(guān)注，其可持續(xù)延長(zhǎng)時(shí)期來(lái)持續(xù)或控制釋放藥物以 及增加如蛋白質(zhì)、基因和其它小分子的治療劑的穩(wěn)定性和生物可用度。生物可降解（PLGA、 PCL)和非生物可降解（例如維曲賽特（Vitraset)和萊替舍特（Retisert))植入物提供用 于歷經(jīng)數(shù)月至數(shù)年持續(xù)釋放藥物的平臺(tái)。然而，生物可降解植入物的不穩(wěn)定藥物釋放分布 以及要求高度侵襲性眼手術(shù)是少許缺點(diǎn)。微米顆粒和納米顆粒持續(xù)數(shù)周至數(shù)月提供囊封的 分子的持續(xù)釋放。然而，在制備期間使用如二氯甲烷的有機(jī)溶劑會(huì)使蛋白質(zhì)變性且降低蛋 白質(zhì)功效，從而導(dǎo)致治療無(wú)效。此外，囊封效率、控制的顆粒尺寸和制備期間的無(wú)菌性是其 它障礙。也已嘗試基于離子電滲、微針、超聲的眼部遞送，然而，主要進(jìn)步是就小分子藥物而 言，且仍然處于探究階段并且需要驗(yàn)證以確定它們的功效和安全性。因此，隨著涌現(xiàn)的用于 視網(wǎng)膜變性的療法獲得不斷提高的進(jìn)步，向后段的非侵襲性或最小侵襲性控制和持續(xù)遞送 正變得極其重要。
[0008] 概述
[0009] 本發(fā)明涉及可以高數(shù)量、高純度或兩者產(chǎn)生的LEDGF生物活性肽。舉例來(lái)說，如 通過SDS-PAGE和SEC-HPLC所定量，本發(fā)明涉及可在每升培養(yǎng)物20mg或大于20mg下且在 90 %或大于90 %純度下產(chǎn)生的LEDGF肽。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，肽是約40kDa單體，其 可以SOkDa二聚體形式存在。在另一示例性實(shí)施方案中，肽主要具有無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)且包括 N末端應(yīng)激相關(guān)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選TAT結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0010] 在另一示例性實(shí)施方案中，肽包含LEDGF的氨基酸I-SZe(LEDGF1I 26)。在另一示 例性實(shí)施方案中，肽包含SEQ ID NO :2。在另一示例性實(shí)施方案中，肽包含與SEQ ID NO: 2具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨 基酸序列。此外，本發(fā)明包括編碼SEQ ID NO :2的核酸序列或編碼與SEQ ID NO :2具有至 少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨基酸序列 的核酸序列。本發(fā)明還包括含有所述核酸序列的載體。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，載體是 pET-28a(+)載體。
[0011] 在另一方面，本發(fā)明包含含有LEDGF肽的組合物。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，組合 物包含LEDGF肽與藥物載體、稀釋劑、賦形劑或其組合的組合。在另一示例性實(shí)施方案中， 組合物包含與如鋅的膠態(tài)金屬顆粒締合或結(jié)合以形成納米裝配體的LEDGF肽。在另一示例 性實(shí)施方案中，組合物包含囊封或結(jié)合于裝載至多孔外部顆粒中的內(nèi)部顆粒的LEDGF肽。 在某些示例性實(shí)施方案中，用于以上組合物中的LEDGF肽是LEDGF 1I6。
[0012] 在另一方面，本發(fā)明涉及通過向有需要的患者施用以上LEDGF肽組合物來(lái)治療蛋 白質(zhì)聚集介導(dǎo)的疾病的方法。在某些示例性實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)聚集介導(dǎo)的疾病是視網(wǎng) 膜變性疾病。示例性視網(wǎng)膜變性疾病包括但不限于老年性黃斑變性（AMD)、視網(wǎng)膜色素變 性（RP)和糖尿病性視網(wǎng)膜病變（DR)。在另一示例性實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)聚集介導(dǎo)的疾病 是神經(jīng)退變性疾病，包括但不限于阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD)、帕金森氏病 (Parkinson's disease, F1D)、亨廷頓氏?。℉D)、肌萎縮性側(cè)索硬化或朊病毒疾病。
[0013] 附圖簡(jiǎn)述
[0014] 圖1是純化全長(zhǎng)LEDGF的免疫印跡，其指示試圖純化全長(zhǎng)LEDGF會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定和 片段化產(chǎn)物。
[0015] 圖2是比較全長(zhǎng)LEDGF與LEDGFh26的圖。
[0016] 圖3是瓊脂糖凝膠的圖片，其顯示編碼LEDGF1I26的核酸序列被成功克隆至 pET-28a(+)中。PCR擴(kuò)增Ledgf^326基因且接著連接至pET-28a(+)載體中。泳道1:PCR 擴(kuò)增的Ledgf ^26基因，泳道2 :未切割環(huán)狀pET-28a (+)，泳道3 :線性化BamHI消化的 pET-28a (+)，泳道 4 :未切割環(huán)狀 pLEDGFn (連接有 LedgfV32f^ pET-28a (+))，泳道 5 :線 性化BamHl消化的PLEDGFh26，泳道6 :線性化HindIII消化的PLEDGFh26，泳道7 和 HindIII 雙重消化的 PLEDGFh26，泳道 8 :自 PleDGFh26PCR 擴(kuò)增 Ledgf基因。
[0017] 圖4A至4C是一組顯示成功表達(dá)和純化LEDGF1I的圖：A) SDS-PAGE-泳道1蛋 白質(zhì)標(biāo)記（Fermentas，Glen Burnie，MD),泳道2未誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，泳道3IPTG誘導(dǎo) 的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，泳道4溶解產(chǎn)物的可溶性部分，泳道5由FPLC-陽(yáng)離子交換管柱獲得的 LEDGFn，泳道6由FPLC-凝膠過濾管柱獲得的LEDGFn5B) FPLC-陽(yáng)離子交換色譜圖；C) FPLC-凝膠過濾色譜圖。
[0018] 圖5A至是一組顯示LEDGF1I2J^某些物理特征的圖。A) SEC-HPLC :使用含有ImM CaClj^]25mM Tris-HCL緩沖液（pH 7.0)在Agilent Bio-SEC管柱上按尺寸分離LEDGF^6。 LEDGF1I6主要洗脫為在11. 5分鐘時(shí)的單峰，伴有約5%較高分子量物質(zhì)。B)MALDI-T0F : LEDGF1I6具有分子量40kDa，并且可以二聚體形式存在。C)DLS :使用Nano ZS在25mM磷酸 鹽緩沖液（pH 7.0)中分析LEDGF1I6尺寸。LEDGF 具有直徑約IOnm的單分散群體，不存 在聚集體。D) SDS-PAGE :在4-15% SDS-PAGE膠凝上在還原性（β -巰基乙醇且煮沸）和非 還原性（無(wú) β-巰基乙醇且不煮沸）條件下按尺寸分離LEDGFm26。非還原性膠凝指示存在 LEDGF1J6 的二聚體。
[0019] 圖6Α至6Β是一組代表關(guān)于LEDGF1I的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)特征的其它數(shù)據(jù)的圖。Α)圓 二色性：使用Chirascan分析25mM磷酸鹽緩沖液（ρΗ7· 0)中的500 μ g/ml LEDGF1^26的二 級(jí)結(jié)構(gòu)。未獲得α-螺旋或β-折疊的特征峰。此外，在200nm下存在強(qiáng)烈陰性信號(hào)指示 LEDGF1I6主要是無(wú)規(guī)卷曲蛋白質(zhì)。B)LEDGF 模型：通過I-Tasser蛋白質(zhì)建模服務(wù)器 基于LEDGF1I6的氨基酸序列和與結(jié)構(gòu)可在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的蛋白質(zhì)的同源性來(lái)預(yù)測(cè) LEDGF^J-D結(jié)構(gòu)。根據(jù)3-D模型，LEDGF1I6是無(wú)規(guī)卷曲蛋白質(zhì)。
[0020] 圖7A至7F提供代表關(guān)于LEDGF^j^預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)特征的其它數(shù)據(jù)的其它圖。熒光光 譜術(shù)-化學(xué)變性：A)在激發(fā)波長(zhǎng)280nm下自300至400nm記錄與含0-6M脲的25mM磷酸鹽 緩沖液（pH 7.0) -起孵育的300μ/πι1 LEDGF1I26的熒光光譜。B)將340/356nm下的熒光 強(qiáng)度比率相對(duì)于脲濃度繪圖以確定構(gòu)象穩(wěn)定性參數(shù)。C)自220至260nm記錄與含0-6M脲的 25禮磷酸鹽緩沖液（?!17.0)-起孵育的30(^8/11111^6? 1_326的〇)光譜。0)將23011111下 的CD信號(hào)相對(duì)于脲濃度繪圖以確定構(gòu)象穩(wěn)定性參數(shù)。E)使用熱使LEDGF^/變性且自215 至250nm記錄相應(yīng)⑶信號(hào)變化。F)將222nm下的⑶信號(hào)相對(duì)于溫度繪圖以確定LEDGF 1J6 的熔解溫度。
[0021] 圖8A至8B是一組顯示LEDGFp32fJg夠從聚集介導(dǎo)的應(yīng)激中挽救ARPE-19細(xì)胞的 圖。ARPE-19細(xì)胞在A)不存在或B)存在聚集應(yīng)激下用LEDGFh 26處理48小時(shí)。
[0022] 圖9A至9B是一組說明LEDGF1I延遲RCS大鼠中的光受體功能性損失的圖。A) 使用〇.41og cd-s/m2閃光記錄暗視ERG，并且將暗視B波幅值相對(duì)于大鼠年齡繪圖。對(duì)于 明視ERG，使用30cd/m 2背景光使大鼠適應(yīng)光照3分鐘，隨后記錄ERG。B)將明視B波幅值 相對(duì)于大鼠年齡繪圖。將個(gè)別大鼠的三個(gè)ERG平均化且接著將各組內(nèi)的b波幅值平均化以 得到平均值。數(shù)據(jù)代表N = 3的平均值土 S. D.。*，相較于相應(yīng)未處理組，p < 0. 05。
[0023] 圖10是一組顯示LEDGFn6/鋅納米裝配體在稀釋之后穩(wěn)定的圖。
[0024] 圖IlA至IlC是一組顯示在不存在或存在添加劑下的LEDGF1-326三級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí) 結(jié)構(gòu)和尺寸變化的圖。
[0025] 圖12是在還原性條件下裝載的LEDGFn6W SDS-PAGE膠凝圖片。
[0026] 圖13A至13B是一組顯示在存在和不存在各種添加劑下LEDGF1I26的可溶性蛋白 質(zhì)和不溶性聚集體的量的圖。
[0027] 圖13C是顯示在存在各種添加劑下不存在LEDGFn6的不溶性聚集體的微量離心 管圖片。
[0028] 圖14是描繪在存在和不存在各種添加劑下LEDGF1I6的免疫反應(yīng)性的圖。
[0029] 圖15A至15C是一組顯示在添加劑存在下LEDGF1I2J^結(jié)構(gòu)完整性和構(gòu)象穩(wěn)定性的 生物物理學(xué)表征的圖。A)在各種添加劑存在下，在280nm激發(fā)下，1^06匕_ 326在34211111下的 隨時(shí)間而變的熒光強(qiáng)度。抝1^06匕_326在208nm下的隨時(shí)間和添加劑而變的圓二色性（CD)。 C) LEDGFm26的隨時(shí)間和添加劑而變的流體動(dòng)力學(xué)尺寸。
[0030] 圖16是提供LEDGF1I隨時(shí)間而變的分子量分析的SDS-PAGE膠凝圖片。
[0031] 圖17A至17D是一組顯示在鋅存在下的LEDGF^gA米裝配體形成的圖。A)動(dòng)態(tài) 光散射。1^06? 1_326在鋅存在下形成納米裝配體。B)圓二色性。在鋅存在下，LEDGF^dA 二級(jí)結(jié)構(gòu)被改變。C)熒光光譜術(shù)。在鋅存在下，LEDGFh26-光光譜被淬滅，從而指示疏水 性殘基暴露于極性更大環(huán)境。D)紫外光譜術(shù)：在0. ImM和ImM鋅存在下而非在IOmM鋅下， LEDGFh26紫外吸收被淬滅。
[0032] 圖18是LEDGF1I6鋅納米裝配體的一組TEM圖像。
[0033] 圖19A至19D是一組說明LEDGF1I^米裝配體的可逆形成的圖。
[0034] 圖20A至20D是說明LEDGF^jA米裝配體的穩(wěn)定性隨時(shí)間增加的一組圖和 SDS-PAGE膠凝圖像。
[0035] 圖21是說明ARPE-19細(xì)胞對(duì)LEDGF1I^米裝配體的攝取增加的圖。
[0036] 圖22是描繪MTT測(cè)定的結(jié)果的圖，其說明LEDGF1I納米裝配體能夠從血清饑餓 中挽救ARPE-19細(xì)胞。
[0037] 圖23A至23D是一組說明如使用視網(wǎng)膜電描記術(shù)所考查，LEDGF1I 26納米裝配體能 夠降低視網(wǎng)膜變性的圖。
[0038] 圖24A至24H是一組說明如通過檢測(cè)正常SD大鼠中的Alexa-LEDGF1I 2f^熒光信 號(hào)所測(cè)量，LEDGF1I6納米裝配體在玻璃體中持續(xù)至少14天的圖。A)說明在玻璃體內(nèi)注射 SD大鼠眼之前，空白掃描的結(jié)果。B)和C)分別說明對(duì)照和LEDGF1I6裝配體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 D) 和E)說明如由Flurotron掃描獲得的在包括玻璃體、脈絡(luò)膜-RPE和水狀液的各種組織 中的熒光信號(hào)；F)、G)和H)分別使以上測(cè)量的玻璃體、脈絡(luò)膜-RPF和水狀液的熒光信號(hào)轉(zhuǎn) 換成實(shí)際LEDGF^ 26納米裝配體。
[0039] 圖25是說明納米裝配體能夠保持LEDGF1I的免疫反應(yīng)性的圖。
[0040] 圖26A至26B是A)用LEDGF1I26轉(zhuǎn)染的ARPE-19細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定的一組圖像 以及B)說明細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定的結(jié)果隨時(shí)間和LEDGF 1I^度而變的圖。
[0041] 圖27是說明測(cè)定結(jié)果的圖，其指示用LEDGF1I轉(zhuǎn)染的ARPE-19細(xì)胞中的吞噬活 性增加。
[0042] 圖28A至28D是一組說明對(duì)用LEDGF1I6注射的SD大鼠眼的組織學(xué)分析的結(jié)果的 圖像和圖。A)是對(duì)眼垂直截面和玻璃體內(nèi)注射部位的圖示描繪。B)是正常SD、未處理RCS 和LEDGF1I6處理的RCS視網(wǎng)膜的橫截面的一組圖像。C)和D)是分別描繪對(duì)照和LEDGF 處理的視網(wǎng)膜中的眼外核層和內(nèi)核層的測(cè)量厚度的圖。
[0043] 圖29是對(duì)照和LEDGFu處理的大鼠 SD視網(wǎng)膜的免疫熒光圖像的圖面。
[0044] 圖30是顯示His-LEDGFp326自示例性PinP組合物累積釋放的圖
[0045] 圖31是顯示在大鼠眼中用Alexa-His-LEDGFn6進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射之后的非侵襲 性眼熒光光度法的結(jié)果的圖。
[0046] 詳述
[0047] 定義
[0048] 如本文所用，"視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜性"是指視網(wǎng)膜以及鄰近于視網(wǎng)膜的一般性眼后段 兩者。
[0049] 如本文所用，"治療"是指完全逆轉(zhuǎn)或消除潛伏疾病、臨時(shí)或持續(xù)防止疾病進(jìn)展、臨 時(shí)或持續(xù)消退疾病、以及改善一種或多種與疾病相關(guān)的癥狀。
[0050] 術(shù)語(yǔ)"肽"、"多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用。除非另外指示，否則所述術(shù) 語(yǔ)是指具有至少兩個(gè)通過肽鍵連接的氨基酸的聚合物。因此，所述術(shù)語(yǔ)包括寡肽、蛋白質(zhì)片 段、類似物、衍生物、糖基化衍生物、聚乙二醇化衍生物、融合蛋白等。
[0051] 如本文所用，"序列同一性/類似性"是指兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列的同一性、類 似性。序列同一性可以同一性百分比來(lái)量度，百分比越高，序列越相同。比對(duì)方法和供比較 的序列在本領(lǐng)域中是熟知的。各種程序和比對(duì)算法描述于Smith和Waterman, Adv. Appl. Math. 2 :482,1981 ;Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. 48 :443 ;Pearson 和 Lipman, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85 :2444,1988 ;Higgins 和 Sharp，Gene，73 :237-44,1988 ;Higgins 和 Sharp，CABI0S 5 :151-3,1989 ;Corpet 等 Nuc. Acids. Res. 16 :10881-10,1990 中，所述文獻(xiàn) 呈現(xiàn)對(duì)序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算的詳述考慮。
[0052] NCBI 基本局部比對(duì)研究工具（BLAST) (Altschule 等 J. Mol. Biol. 215 :403-10， 1990)可自若干來(lái)源，包括國(guó)家生物信息中心（NCBI，National Library of Medicine， Building 38A，Room 8N805, Bethesda，MD 20894)和在因特網(wǎng)上獲得以與序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx關(guān)聯(lián)使用。Blastp用于比較氨基酸序列。其 它信息可見于NCBI網(wǎng)站。
[0053] -般來(lái)說，一旦對(duì)準(zhǔn)，即通過對(duì)相同氨基酸殘基存在于兩個(gè)序列中所處的位置的 數(shù)目計(jì)數(shù)來(lái)確定匹配的數(shù)目。同一性百分比是通過用匹配的數(shù)目除以鑒定的序列中闡述的 序列長(zhǎng)度或連貫長(zhǎng)度（如來(lái)自鑒定的序列中闡述的序列的100個(gè)連續(xù)核苷酸或氨基酸殘 基），隨后用100乘以所得值來(lái)確定。
[0054] 引言
[0055] 全長(zhǎng)LEDGF能夠從P23H突變視紫紅質(zhì)（rhodopsin)聚集誘導(dǎo)的應(yīng)激中挽救視網(wǎng) 膜色素上皮細(xì)胞（Baid等，PLoS One. 6(9):第e24616頁(yè)）。然而，由于要求蛋白質(zhì)維持特 定三維結(jié)構(gòu)以保持生物活性，所以在蛋白質(zhì)可用作治療劑的水平上使基因翻譯成蛋白質(zhì)已 始終具有挑戰(zhàn)性。此外，由于在整個(gè)生物合成和純化過程期間缺乏蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，所以生產(chǎn) 和生物合成常常失敗。此外，為有效使用蛋白質(zhì)治療劑，常常必須達(dá)成數(shù)毫克產(chǎn)量以有效表 征蛋白質(zhì)性質(zhì)。舉例來(lái)說，每500ml僅產(chǎn)生0. 9mg全長(zhǎng)LEDGF，遠(yuǎn)低于為適當(dāng)表征蛋白質(zhì)所 需的數(shù)十毫克，并且會(huì)產(chǎn)生片段化產(chǎn)物。
[0056] 本發(fā)明提供維持全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的細(xì)胞存活活性，同時(shí)允許以高數(shù)量和純度產(chǎn)生和純 化LEDGF肽的LEDGF肽。此外，本發(fā)明的LEDGF肽具有抗蛋白質(zhì)聚集活性。本發(fā)明的LEDGF 肽顯示治療退變性疾病和與包括氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)聚集應(yīng)激的各種細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)聯(lián)的疾 病的能力。因此，如本發(fā)明的LEDGF肽的分子可代表一種用于治療多種蛋白質(zhì)聚集介導(dǎo)的 疾病，包括其它視網(wǎng)膜退變性和神經(jīng)退變性疾病的通用治療性蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包含適用 于治療以上疾病的延長(zhǎng)釋放LEDGF肽制劑。
[0057] LEDGF 肽
[0058] 本發(fā)明的LEDGF肽含有全長(zhǎng)LEDGF的N末端肽。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，LEDGF 肽包含LEDGF N末端應(yīng)激相關(guān)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。盡管不受以下理論限制，但LEDGF充當(dāng)轉(zhuǎn)錄 因子且啟始其它應(yīng)激反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄的能力可有助于LEDGF肽保護(hù)免遭蛋白質(zhì)聚集介導(dǎo) 的疾病的能力?；蛘撸琇EDGF肽可直接或通過其它中間蛋白質(zhì)結(jié)合錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，并且 有助于正常折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的泛素化以確保蛋白水解降解。在某些示例性實(shí)施方 案中，LEDGF肽可還包含TAT結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0059] 在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，LEDGF肽是LEDGF1J6 (SEQ ID NO: 2)。LEDGFh26被純 化至接近均質(zhì)。LEDGF^6S要具有無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，在室溫下穩(wěn)定，并且以40kDa單體和/或 80kDa二聚體形式存在。如以下實(shí)施例章節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)所述，LEDGFp 32fJg夠防止ARPE-19 細(xì)胞中P23H突變視紫紅質(zhì)介導(dǎo)的聚集應(yīng)激。單次玻璃體內(nèi)注射1^06?1_ 326使視網(wǎng)膜退變性 大鼠模型中的光受體功能性損失降低超過八周。
[0060] 本發(fā)明的LEDGF肽也包括與LEDGFh26具有至少約70 %、至少約75 %、至少約 80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%序列同一性的LEDGF肽。在一個(gè)示例性實(shí)施 方案中，LEDGF肽包括涵蓋全長(zhǎng)LEDGF的N末端應(yīng)激相關(guān)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域且與LEDGFm 26具有 至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%序列同一 性的肽。在另一示例性實(shí)施方案中，LEDGF肽包括具有N末端應(yīng)激相關(guān)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和TAT 結(jié)合結(jié)構(gòu)域且與LEDGF1I6具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少 約90%或至少約95%序列同一性的肽。此外，本發(fā)明包括涵蓋大于或小于SEQ ID NO :2的 326個(gè)氨基酸的肽，其中較大或較小肽不導(dǎo)致在生物合成和純化期間LEDGF生物活性或穩(wěn) 定性顯著降低。LEDGF肽供與本發(fā)明一起使用的適合性可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過使用 以下實(shí)施例章節(jié)中所述的測(cè)定評(píng)估推定肽與生物物理學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)和生物活性的類 似性來(lái)確定。普通技術(shù)人員可預(yù)測(cè)地認(rèn)識(shí)到與LEDGF 1I6具有類似生物物理學(xué)性質(zhì)、生物化 學(xué)性質(zhì)和生物活性的LEDGF肽將具有類似效用且因此屬于本發(fā)明的范圍。
[0061] 在某些示例性實(shí)施方案中，上述LEDGF肽是以合成方式制備。在某些其它示例性 實(shí)施方案中，上述LEDGF肽是以重組方式制備。適于表達(dá)LEDGF肽的宿主包括但不限于大腸 桿菌（E.coli)、酵母屬（Saccharomces)、畢赤酵母屬（Picchia)、桿菌屬（Bacillus)、CH0、 BHK、COS 和 NSO 細(xì)胞。
[0062] 標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑
[0063] 本文所述的LEDGF肽可使用已知技術(shù)提供為生理可接受的制劑。由E. W. Martin 所著的 Remington, s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. , Easton, PA,第 19 版（1995))描述適于藥物遞送本文公開的LEDGF肽的組合物和制劑。
[0064] 本發(fā)明的制劑可以片劑、膠囊、糖錠、扁囊劑、溶液、混懸液、乳液、粉劑、氣霧劑、栓 齊?、噴霧劑、軟錠劑、軟膏劑、霜?jiǎng)?、糊劑、泡沫劑、凝膠劑、棉塞、子宮托、顆粒劑、大丸劑、嗽 口劑、植入物、裝置、滴眼劑或經(jīng)皮貼片形式施用。
[0065] 制劑包括適于口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、吸入、表面（包括經(jīng)皮膚、經(jīng)皮、經(jīng)頰和滴眼 劑）、經(jīng)陰道、胃腸外（包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、眼內(nèi)、氣管內(nèi)和硬膜外）、眼部（眼 周、眼內(nèi)，包括脈絡(luò)膜上、視網(wǎng)膜下和玻璃體內(nèi)）或吸入施用的制劑。在一個(gè)示例性實(shí)施方 案中，本發(fā)明的肽被配制來(lái)供經(jīng)鞏膜、脈絡(luò)膜上、視網(wǎng)膜下或玻璃體內(nèi)遞送。經(jīng)鞏膜遞送包 括結(jié)膜下、眼球筋膜下和眼球后經(jīng)鞏膜遞送。制劑可宜以單位劑型呈現(xiàn)且可通過常規(guī)醫(yī)藥 技術(shù)來(lái)制備。所述技術(shù)包括使活性成分和藥物載體或賦形劑締合的步驟。一般來(lái)說，制劑 是通過使活性成分與液體載體或微細(xì)固體載體或兩者均一且精細(xì)締合，并且接著必要時(shí)使 產(chǎn)物成形來(lái)制備。
[0066] 適于口服施用的本發(fā)明的制劑可呈現(xiàn)為個(gè)別單元，如膠囊、扁囊劑或片劑，各自含 有預(yù)定量的活性成分；粉劑或顆粒劑；于水性液體或非水性液體中的溶液或混懸液；或水 包油液體乳液或油包水乳液等。
[0067] 片劑可通過任選與一種或多種輔助成分一起壓制或模制來(lái)制備。壓制片劑可通過 在適合機(jī)器中壓制任選與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑混合 的呈自由流動(dòng)形式（如粉劑或顆粒）的活性成分來(lái)制備。模制片劑可通過在適合機(jī)器中模 制濕潤(rùn)粉劑狀化合物與惰性液體稀釋劑的混合物來(lái)制備。片劑可任選被包覆或劃線且可被 配制以便提供其中活性成分的緩慢或控制釋放。
[0068] 適于在口中進(jìn)行表面施用的制劑包括糖錠，其包含活性劑于通常是蔗糖和阿拉伯 膠或黃蓍膠的調(diào)味基質(zhì)中；軟錠劑，其包含活性成分于如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠的 惰性基質(zhì)中；以及嗽口劑，其包含待施用的成分于適合液體載體中。
[0069] 適于向皮膚進(jìn)行表面施用的制劑可呈現(xiàn)為包含待施用的成分于藥學(xué)上可接受的 載體中的軟膏劑、霜?jiǎng)?、凝膠劑、糊劑和滴眼劑。
[0070] 用于經(jīng)直腸施用的制劑可呈現(xiàn)為具有包括例如可可脂或水楊酸鹽的適合基質(zhì)的 栓劑。
[0071] 適于經(jīng)鼻施用的其中載體是固體的制劑包括顆粒尺寸例如在20至500微米的范 圍內(nèi)的粗粉，其是以進(jìn)行鼻吸的方式施用；即通過鼻部通道自貼近鼻部固持的具有粉劑的 容器快速吸入。適于施用的其中載體是液體的制劑（如例如鼻噴霧劑或如滴鼻劑）包括活 性成分的水性或油性溶液。
[0072] 適于經(jīng)陰道施用的制劑可呈現(xiàn)為除活性成分之外也含有如本領(lǐng)域中已知為適當(dāng) 的成分（如載體）的子宮托、棉塞、霜?jiǎng)⒛z劑、糊劑、泡沫劑或噴霧制劑。
[0073] 適于吸入的制劑可呈現(xiàn)為除活性成分之外也含有如本領(lǐng)域中已知為適當(dāng)?shù)某煞?(如載體）的噴霧、粉塵、粉劑或噴霧制劑。
[0074] 適于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性無(wú)菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩 沖劑、制菌劑和致使制劑與預(yù)定接受者的血液等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性無(wú)菌混懸液， 其可包括混懸劑和增稠劑；凝膠劑；和手術(shù)放置將植入物。
[0075] 納米裝配制劑
[0076] 在某些示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的LEDGF肽可通過使LEDGF肽與膠態(tài)金屬顆粒 結(jié)合或另外締合來(lái)以納米顆粒裝配體形式遞送。任何膠態(tài)金屬都可用于本發(fā)明中。膠態(tài)金 屬包括任何水不溶性金屬顆粒、分散在液體水中的金屬化合物、水溶膠或金屬溶膠。膠態(tài)金 屬顆粒可選自周期表的IA、IB、IIB和IIIB族中的金屬以及過渡金屬，尤其是VIII族的那 些。示例性金屬包括鋅、金、銀、鋁、釕、鐵、鎳和鈣。其它適合金屬包括呈它們的所有各種氧 化狀態(tài)的以下金屬：裡、納、緩、鐘、銳、欽、鑰;、絡(luò)、猛、鉆、銅、嫁、銀、銀、鑰、鈕!、鋼、錫、鶴、鍊、 鉬和釓。金屬優(yōu)選以離子形式自適當(dāng)金屬化合物獲得，例如Al 3+、RU3+、Zn2+、Fe3+、NilPCa 2+。
[0077] 在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，納米顆粒是通過直接向含有LEDGF肽的溶液中添加膠 態(tài)金屬來(lái)形成。如本文所用，"納米顆粒"是指一種或多種結(jié)合或吸附于單一膠態(tài)金屬顆粒 的表面的肽或結(jié)合或吸附于多個(gè)膠態(tài)金屬顆粒的肽。舉例來(lái)說，LEDGF/Zn納米顆粒是通過 在室溫下以控制方式添加 IOmM Zn(II)來(lái)形成。此后，在37°C下歷經(jīng)24小時(shí)時(shí)期使納米裝 配體形成。使用其它膠態(tài)金屬來(lái)形成其它納米裝配體的條件可易于由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 確定。
[0078] 顆粒包顆粒制劑
[0079] 在另一示例性實(shí)施方案中，LEDGF肽被配制成顆粒包顆粒延長(zhǎng)釋放制劑。本發(fā)明 的延長(zhǎng)釋放組合物包含含有在較大多孔外部顆粒內(nèi)的內(nèi)部顆粒，包括各種構(gòu)造，如納米顆 粒在多孔微粒中（PMP包NP)、小納米顆粒在多孔大納米顆粒中（PLNP包SNP)、以及小微粒 在多孔大微粒中（PLMP包SMP)。相較于較大顆粒，內(nèi)部顆粒較小且相對(duì)不可膨脹。外部顆 粒是可膨脹的且在加工期間形成允許在外部顆粒的多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)嵌入內(nèi)部顆粒的顯著多孔 結(jié)構(gòu)。
[0080] 如本發(fā)明的上下文中所用，如果顆粒的初始表面積在約1. 25倍至約100倍的范圍 內(nèi)增加，那么顆粒被視為在超臨界流體存在下膨脹。在某些示例性實(shí)施方案中，如果顆粒的 初始表面積在約1. 25至約5倍、約5至約25倍、約25至約50倍、約50至約75倍、或約75 至100倍的范圍內(nèi)膨脹，那么顆粒被視為會(huì)膨脹。或者，如果顆粒的初始尺寸增加至少5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或 50%，那么顆粒被視為會(huì)膨脹。
[0081] 本發(fā)明的內(nèi)部顆粒是使用在超臨界流體存在下不膨脹的聚合或非聚合物材料制 備。在某些示例性實(shí)施方案中，納米顆粒材料是在超臨界流體存在下將不膨脹的聚合物材 料。在某些示例性實(shí)施方案中，聚合物材料是在超臨界二氧化碳存在下將不膨脹的材料。 可用于本發(fā)明中的適合聚合和非聚合物材料的實(shí)例包括聚交酯（PLA)、聚（乙醇酸）、乳酸 和乙醇酸的共聚物（PLGA)、纖維素衍生物、殼聚糖、聚乙烯（PE)、聚丙烯、聚（四氟乙烯）、 聚（對(duì)苯二甲酸乙二酯）、氧化鐵、氧化鈰、氧化鋅、金、銀、其它生物相容性金屬和晶體、以 及二氧化硅。結(jié)晶材料或結(jié)晶區(qū)域較大的材料在超臨界流體加工期間膨脹的可能性較小。 聚合內(nèi)部顆?？墒褂贸Ｒ?guī)乳化-溶劑蒸發(fā)方法或其它類似適合合成方法來(lái)制備。LEDGF肽 可在形成期間囊封在內(nèi)部顆粒中，或在內(nèi)部顆粒形成之后裝載在表面上。
[0082] 本發(fā)明的外部顆粒是使用在超臨界流體存在下膨脹的材料制備。在某些示例性 實(shí)施方案中，微粒材料是在超臨界流體存在下膨脹的聚合物材料。在某些示例性實(shí)施方案 中，材料在超臨界二氧化碳存在下膨脹?？捎糜诒景l(fā)明中的適合聚合物材料的實(shí)例包括丙 交酯-共聚-乙交酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亞烷基二醇、聚亞烷基氧化物、聚乙烯醇、聚乙烯 醚、聚乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯及其共聚物。此外，適合聚合物材料也包括烷基 纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合 物、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸 纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧乙基纖維素、纖維素聚（甲基丙烯酸 甲酯）、聚（甲基丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（乙烯醇）、聚（乙酸乙烯酯）和 聚乙烯吡酪烷酮。一般來(lái)說，非晶材料或非晶區(qū)域較大的材料適于在超臨界流體加工期間 膨脹。聚合外部顆?？墒褂贸Ｒ?guī)乳化-溶劑蒸發(fā)或其它類似適合合成方法來(lái)制備。在某些 示例性實(shí)施方案中，LEDGF肽可在形成期間囊封在外部顆粒中或在外部顆粒形成之后裝載 在表面上。
[0083] 產(chǎn)生各種顆粒構(gòu)造的方法是使用超臨界流體流動(dòng)技術(shù)來(lái)達(dá)成。所得無(wú)有機(jī)溶劑裝 載尤其非常適合于易經(jīng)受聚集或降解的藥物，如基于肽和核苷酸的藥物。舉例來(lái)說，LEDGF 肽可被裝載在內(nèi)部顆粒、外部顆?；騼烧叩谋砻嫔?；內(nèi)部顆粒、外部顆?；騼烧叩幕|(zhì)中； 存在于外部顆粒的孔中；或其組合。在某些示例性實(shí)施方案中，LEDGF肽可存在于內(nèi)部顆 粒的表面上。在另一示例性實(shí)施方案中，LEDGF肽可存在于內(nèi)部和外部顆粒的表面上。在 另一示例性實(shí)施方案中，LEDGF肽可存在于內(nèi)部顆粒的基質(zhì)中。在另一示例性實(shí)施方案中， LEDGF膚可存在于內(nèi)部顆粒與外部顆粒兩者的基質(zhì)中。在另一不例性實(shí)施方案中，此外，治 療劑可存在于外部顆粒的多孔結(jié)構(gòu)中。
[0084] 使內(nèi)部顆粒和外部顆?；旌显谝黄鹎以诟邏合卤┞队诔R界流體。在某些示例性 實(shí)施方案中，超臨界流體是二氧化碳。在暴露于超臨界流體后，外部顆粒膨脹以在外部表面 上產(chǎn)生多孔結(jié)構(gòu)。超臨界流體接著使內(nèi)部顆粒注入外部顆粒中以形成顆粒包顆粒延長(zhǎng)釋放 制劑。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，顆粒包顆粒延長(zhǎng)釋放制劑包含在直徑約1 μ m至約100 μ m 的外部微粒中并入直徑約Inm至約900nm的內(nèi)部納米顆粒。在另一示例性實(shí)施方案中，顆粒 包顆粒延長(zhǎng)釋放制劑包含在直徑約IOnm至約999nm的外部納米顆粒中并入直徑約Inm至 約300nm的內(nèi)部納米顆粒。在另一示例性實(shí)施方案中，顆粒包顆粒延長(zhǎng)釋放制劑包括在直 徑約2 μ m至約500 μ m的外部微粒中并入直徑約1 μ m至約100 μ m的內(nèi)部微粒。對(duì)適當(dāng)尺 寸的內(nèi)部和外部顆粒的選擇將取決于構(gòu)成顆粒的材料的類型、外部顆粒在所用超臨界流體 中的膨脹能力、以及待并入在外部顆粒內(nèi)的內(nèi)部顆粒的尺寸。這些是可易于由本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員選擇的所有因素。一般來(lái)說，內(nèi)部顆粒與外部顆粒之間的尺寸比率可自約1 : 5至 約1 : 100變化。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，尺寸比率可為1 : 5、1 : 10、1 : 15、1 : 20、 1 : 25、1 : 30、1 : 35、1 : 40、1 : 45、1 : 50、1 : 55、1 : 60、1 : 65、1 : 70、1 : 75、 1 : 80、1 : 85、1 : 90、1 : 95 或 1 : 100。
[0085] PMP包NP的形成可通過在約IOOOpsi至約HOOpsi下暴露納米顆粒和微粒來(lái)達(dá) 成。暴露時(shí)間可例如自約5分鐘至約2小時(shí)變化。溫度可在30°C至45°C的范圍內(nèi)。對(duì)適當(dāng) 壓力和溫度范圍的選擇是主要由接近給定超臨界流體的超臨界點(diǎn)的溫度和壓力范圍決定。 因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠選擇基于所用超臨界流體、所需外部顆粒膨脹的尺寸或 量、以及所需外部顆粒中的孔隙度確定范圍的適當(dāng)時(shí)間、溫度和壓力。舉例來(lái)說，持續(xù)較長(zhǎng) 時(shí)期和/或在較高壓力下暴露繼之以壓力淬滅將導(dǎo)致膨脹和孔隙性大于較短暴露時(shí)間和/ 或壓力。
[0086] 在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，內(nèi)部顆粒和外部顆粒是在約1 : 3的比率下混合。在 一個(gè)示例性實(shí)施方案中，所用內(nèi)部顆粒與外部顆粒的比率是約1 : 9。這些比率將影響納米 顆粒并入和藥物緩慢釋放的程度。一般來(lái)說，內(nèi)部顆粒相對(duì)于外部顆粒的量越大，外部顆粒 中并入的內(nèi)部顆粒的量越高，從而增加藥物釋放速率和劑量。內(nèi)部顆粒相對(duì)于外部顆粒的 量越小，爆發(fā)性釋放越小。
[0087] 蛋白質(zhì)聚集介導(dǎo)的疾病和治療方法
[0088] 本發(fā)明的LEDGF制劑可用于治療蛋白質(zhì)聚集介導(dǎo)的疾病?？捎帽景l(fā)明的LEDGF組 合物治療的蛋白質(zhì)聚集介導(dǎo)的疾病包括視網(wǎng)膜退變性疾病和神經(jīng)退變性疾病。視網(wǎng)膜退變 性疾病包括老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。神經(jīng)退變性疾病包 括阿爾茨海默病（AD)、帕金森氏?。≒D)、亨廷頓氏?。℉D)、肌萎縮性側(cè)索硬化和朊病毒疾 病。
[0089] 在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明包含治療視網(wǎng)膜退變性疾病的方法，其包括向 患有視網(wǎng)膜退變性疾病的患者施用包含本發(fā)明的LEDGF肽的組合物。在某些示例性實(shí)施方 案中，LEDGF肽是SEQ OD NO :2。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，LEDGF組合物是經(jīng)鞏膜遞送。 在另一示例性實(shí)施方案中，LEDGF組合物是以滴眼劑形式向眼進(jìn)行表面施用。在另一示例性 實(shí)施方案中，LEDGF組合物是以延長(zhǎng)釋放制劑形式植入或全身性施用。在一個(gè)示例性實(shí)施 方案中，延長(zhǎng)釋放制劑是納米裝配延長(zhǎng)釋放制劑，如LEDGF/鋅納米裝配制劑。在另一示例 性實(shí)施方案中，延長(zhǎng)釋放制劑是顆粒包顆粒制劑，如納米顆粒于多孔微粒中（PMP包NP)制 劑。
[0090] 在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明包含降低視網(wǎng)膜退變性疾病中蛋白質(zhì)聚集的方 法，其包括向患有視網(wǎng)膜退變性疾病的患者施用包含本發(fā)明的LEDGF肽的組合物。在某些 示例性實(shí)施方案中，LEDGF肽是LEDGFm 26。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，LEDGF組合物是經(jīng)鞏 膜遞送。在另一示例性實(shí)施方案中，LEDGF組合物是以滴眼劑形式向眼進(jìn)行表面施用。在 另一示例性實(shí)施方案中，LEDGF組合物是以延長(zhǎng)釋放制劑形式植入或全身性施用。在一個(gè) 示例性實(shí)施方案中，延長(zhǎng)釋放制劑是本發(fā)明的納米顆粒延長(zhǎng)釋放制劑，如LEDGF/鋅納米顆 粒制劑。在另一示例性實(shí)施方案中，延長(zhǎng)釋放制劑是顆粒包顆粒制劑，如納米顆粒于多孔微 粒中（PMP包NP)制劑。
[0091] 在另一示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明包含治療神經(jīng)退變性疾病的方法，其包括向患 有神經(jīng)退變性疾病的患者施用包含本發(fā)明的LEDGF肽的組合物。在某些示例性實(shí)施方案 中，LEDGF肽是LEDGF 1I6。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，LEDGF組合物是腹膜內(nèi)遞送。在另一 示例性實(shí)施方案中，LEDGF組合物是口服施用。在另一示例性實(shí)施方案中，LEDGF組合物是 以延長(zhǎng)釋放制劑形式全身性施用。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，延長(zhǎng)釋放制劑是本發(fā)明的納 米顆粒延長(zhǎng)釋放制劑，如LEDGF/鋅納米顆粒制劑。在另一示例性實(shí)施方案中，延長(zhǎng)釋放制 劑是顆粒包顆粒制劑，如納米顆粒于多孔微粒中（PMP包NP)制劑。
[0092] 在另一示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明包含降低神經(jīng)退變性疾病中蛋白質(zhì)聚集的方 法，其包括向患有神經(jīng)退變性疾病的患者施用包含本發(fā)明的LEDGF肽的組合物。在某些示 例性實(shí)施方案中，LEDGF肽是LEDGFm 26。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，LEDGF組合物是腹膜 內(nèi)遞送。在另一示例性實(shí)施方案中，LEDGF組合物是口服施用。在另一示例性實(shí)施方案中， LEDGF組合物是以延長(zhǎng)釋放制劑形式施用。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，延長(zhǎng)釋放制劑是本發(fā) 明的納米顆粒延長(zhǎng)釋放制劑，如LEDGF/鋅納米顆粒制劑。在另一示例性實(shí)施方案中，延長(zhǎng) 釋放制劑是顆粒包顆粒制劑，如納米顆粒于多孔微粒中（PMP包NP)制劑。
[0093] 組合物和方法由以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明，所述實(shí)施例無(wú)論如何都不應(yīng)解 釋為對(duì)其范圍施加限制。相反，應(yīng)明確了解的是在不脫離本發(fā)明的精神下可采取其各種在 讀取本文描述之后可向本領(lǐng)域技術(shù)人員顯現(xiàn)它們自身的其它實(shí)施方案、修改和等效物。 實(shí)施例
[0094] 實(shí)施例1
[0095] 1.材料
[0096] 質(zhì)粒 pEGFP-LEDGF 由 Toshimichi Shinohara 博士 （University of Nebraska Medical Center，Omaha，NE)惠贈(zèng)。正向和反向引物自 Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)獲得。DNA聚合酶 I、T4DNA連接酶和限制酶自 New England Biolab Inc. (Ipswich, MA)獲得。QIAquick膠凝提取試劑盒、QIAprep旋轉(zhuǎn)小型制備試劑 盒和QIAGEN質(zhì)粒小型試劑盒自Qiagen (Valencia，CA)獲得。XK 16/20管柱、S-200凝膠過 濾管柱、SP 瓊脂糖珠粒自 GE Lifesciences Healthcare (Piscataway，NJ)獲得。ARPE-19 細(xì)胞自ATCC(Manassas，VA)獲得。DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、轉(zhuǎn)脂胺2000、LB培 養(yǎng)基和超純瓊脂糖自Invitrogen (Carsbad，CA)獲得。除非指定，否則所有其它材料都自 Sigma-Aldrich(St. Louis，MO)獲得。
[0097] 制備LEDGF^DNA構(gòu)建體
[0098] 將編碼 LEDGFh26蛋白的基因克隆至 pET_28a(+)載體（Novagen，Madison，WI)中。 簡(jiǎn)要來(lái)說，使用由HindIII限制核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)組成的正向引物5'AGTAGTGGATCCATGACTCG CGATTTCAAAC3' (SEQ ID NO :3)和由BamHI限制核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)組成的反向引物5'AATAATA AGCTTTCACTGCTCAGTTTCCATTTGTTC' 3 (SEQ ID NO :4)，自 pEGFP-LEDGF 質(zhì)粒 PCR (聚合酶鏈反 應(yīng)）擴(kuò)增Ledgf^26基因。使用DNA聚合酶I用以下方案進(jìn)行PCR擴(kuò)增：在94°C下變性5分 鐘；繼之以36個(gè)循環(huán)：在94°C下變性30秒，在50°C下退火45秒并在72°C下延伸2分鐘；以 及最終在72°C下進(jìn)行延伸步驟5分鐘。根據(jù)制造商方案，使用QIAquick膠凝提取試劑盒純 化擴(kuò)增的LedgfV 326基因。此后，分別使用HindIII和BamHI限制酶在5'和3'末端處連續(xù) 消化純化的LedgfH 6基因插入物和pET-28a(+)載體。接著根據(jù)制造商方案使用QIAprep 旋轉(zhuǎn)小型制備試劑盒來(lái)純化它們。在4°C下使用T4DNA連接酶將插入物和載體的粘末端連 接過夜。根據(jù)制造商方案使用熱激程序用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ci細(xì)胞。挑選 十個(gè)菌落且使用QIAGEN質(zhì)粒小型試劑盒擴(kuò)增、提取和純化質(zhì)粒。通過三種不同方式確認(rèn) LedgfH6插入pET-28a(+)載體中：首先通過PCR篩選，其次通過限制消化，并且最后通過 DNA測(cè)序。使用2%瓊脂糖凝膠分析重組DNA的純度和尺寸。使用NanoDrop 1000 (Thermo scientific, Wilmington, DE)進(jìn)行DNA定量。進(jìn)一步培養(yǎng)顯示陽(yáng)性PCR信號(hào)和正確測(cè)序結(jié) 果的菌落，并且制備細(xì)菌甘油儲(chǔ)備物并儲(chǔ)存在-80°C下供所有未來(lái)使用。
[0099] 生物信息學(xué)分析
[0100] 將LEDGF1I氨基酸序列提交至ExPASy生物信息學(xué)資源門戶且計(jì)算LEDGF M26W 分子量、理論pi、氨基酸組成、原子組成、消光系數(shù)、估計(jì)半衰期。
[0101] 表達(dá)和純化LEDGFh326
[0102] 對(duì)于蛋白質(zhì)生物合成，根據(jù)制造商方案使用QIAGEN質(zhì)粒小型試劑盒自大腸桿 菌DH5a菌落擴(kuò)增和純化PLEDGFh 26質(zhì)粒。接著根據(jù)制造商方案將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌 BL21(DE3)菌株中。此后，將含有質(zhì)粒的細(xì)菌的單菌落接種至含有SOyg/ml卡那霉素的 LB(魯里亞（Luria)肉湯）培養(yǎng)基中過夜。添加1 %過夜生長(zhǎng)培養(yǎng)物接種物至一升含有 50^8/1111卡那霉素的1^培養(yǎng)基中。使培養(yǎng)物在371：下生長(zhǎng)直至培養(yǎng)基的光密度（0.0.)達(dá) 到0.6-0. 8。通過添加 IPTG (異丙基-β-D-硫代-半乳糖苷）以達(dá)到最終濃度200 μ M來(lái) 誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。此后，在37°C下再孵育細(xì)胞3小時(shí)且通過在4°C下在3000g下離心15分 鐘來(lái)收集。將收集的細(xì)胞再混懸于緩沖液A(25mM Tris-HCKpH 7.0)、I mM EDTA、ImM PMSF 和5%蔗糖）中。在70%輸出（36瓦）5秒繼之以冷卻15秒下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脈沖超聲處理 (]^8〇11丨1，3〇11；^31:〇1 3000，？31'111；[1^(1316，附），持續(xù)總計(jì)30分鐘。在4°(1|下在 1300(^下離 心溶解的細(xì)胞20分鐘以分離溶解產(chǎn)物的可溶性和不溶性部分。在SDS-PAGE上分析可溶性 (上清液）和不溶性（離心塊）部分的蛋白質(zhì)含量且測(cè)定產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的可溶性/不溶性 性質(zhì)。
[0103] FPLC =LEDGFp32f^在可溶性部分中表達(dá)，如通過SDS-PAGE所確定。使用快速蛋白 質(zhì)液相色譜（FPLC)技術(shù)分兩步，首先基于電荷（陽(yáng)離子交換）且接著基于尺寸（凝膠過 濾）來(lái)純化LEDGFh 26。簡(jiǎn)要來(lái)說，將陽(yáng)離子交換SP瓊脂糖珠粒裝填在XK 16/20管柱中且 使用緩沖液A在2ml/min流速下進(jìn)行平衡。此后，在流速lml/min下將可溶性部分裝載在 管柱上。管柱接著用五管柱體積的緩沖液A在2ml/min流速下洗滌。使用尖銳梯度的氯化 鈉（0至28%電導(dǎo)）洗脫大多數(shù)非特異性以及松散結(jié)合的雜質(zhì)。在移除顯著比例的管柱結(jié) 合雜質(zhì)之后，使用在40分鐘內(nèi)電導(dǎo)自28 %至40 %的第二梯度的NaCl達(dá)成LEDGF^26的進(jìn) 一步洗脫。通過使用嵌入紫外檢測(cè)器測(cè)量280nm下的吸光度來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)洗脫曲線。在洗 脫過程期間收集2. 5ml洗脫份且在SDS-PAGE上分析以測(cè)定純度。將含有高蛋白質(zhì)量的洗 脫份匯合在一起。使用透析緩沖液（25mM Tris (pH 7.0)和0. 1 %鹿糖）透析匯合的洗脫份 且接著凍干48小時(shí)。將凍干蛋白質(zhì)溶解于2ml去離子水中。對(duì)于下一純化步驟，使用平衡 緩沖液 B (25mM Tris-HCl (pH 7. 0)和 IOOmM NaCl)在流速 lml/min 下使預(yù)裝填的 S-200 凝 膠過濾管柱平衡。接著將來(lái)自陽(yáng)離子交換的LEDGF1I^*縮溶液裝載于S-200管柱上。使 用緩沖液B在流速lml/min下洗脫LEDGF^ 26。在約100分鐘時(shí)獲得尖銳峰，收集Iml洗脫 份。使用SDS-PAGE分析收集的洗脫份。將含有純LEDGFh 26的洗脫份匯合在一起。接著在 4°C下以三次緩沖交換在透析緩沖液（25mM Tris-HCKpH 7.0)和0. 1%蔗糖）中充分透析 純化LEDGF^dS小時(shí)以移除過量鹽和其它雜質(zhì)。在-80°C下冷凍并凍干透析的LEDGFp32f^S 小時(shí)。將凍干的LEDGFn6等分且儲(chǔ)存在-80°C下以達(dá)成所有未來(lái)目的。
[0104] 紫外光譜術(shù)：準(zhǔn)確稱重12mg凍干的LEDGFm26且接著溶解于Iml去離子水中。使 用 Spectramax M5(Molecular Devices，Downingtown，PA)自 200nm至 400nm記錄紫外吸收 光譜。使用去離子水連續(xù)稀釋樣本直至獲得280nm下的吸光度小于1。這個(gè)吸光度用于基 于摩爾消光系數(shù)計(jì)算樣本中存在的純化蛋白質(zhì)的量。
[0105] 物理表征
[0106] 通過 SDS-PAGE、SEC-HPLC 和 MALDI-T0F 來(lái)測(cè)定 LEDGF1J2f^ 白的分子量和純度。
[0107] SDS-PAGE :簡(jiǎn)要來(lái)說，將5 μ g LEDGFp32f^ SDS-PAGE樣本緩沖液（含有β -巰基乙 醇）中煮沸10分鐘。將蛋白質(zhì)樣本裝載于4-15% SDS-PAGE膠凝（Bi〇-Rad，Hercules，CA) 上且在30mA下進(jìn)行電泳90分鐘。膠凝接著用考馬斯亮藍(lán)（coomassie brilliant blue) 染色且使用GelDoc? XR(Biorad，Hercules，CA)在白光下觀察。對(duì)于非還原性SDS-PAGE， 將LEDGFh26稀釋于非還原性樣本緩沖液（無(wú) β-巰基乙醇）中且避免煮沸。
[0108] SEC-HPLC :將凍干蛋白質(zhì)溶解于去離子水中以達(dá)到最終濃度500μ g/ml且經(jīng) 0. 22um(PVDF)過濾器過濾。利用Agilent Bio SEC-3管柱，在25°C下使用25mM含有ImM CaCljA Tris緩沖液（pH 7.0)以流速lml/min評(píng)估蛋白質(zhì)。用分子量標(biāo)準(zhǔn)物（Invitrogen) 校正管柱。在214nm下測(cè)量紫外吸光度。
[0109] MALDI-T0F :通過用 4800Plus MALDI T0F/T0F?(AB Sciex，F(xiàn)ramingham，MA)測(cè)定分 子量來(lái)確認(rèn)蛋白質(zhì)均質(zhì)性和身份。將蛋白質(zhì)樣本溶解入標(biāo)準(zhǔn)MALDI基質(zhì)芥子酸的溶液中， 點(diǎn)樣且干燥于金屬靶板上。自5900強(qiáng)度的1000次激光照射以總離子流（TIC)形式收集數(shù) 據(jù)。
[0110] DLS :使用 zetasizer Nano ZS (Malvern，Westborough，MA)分析 LEDGF卜326蛋白 的均質(zhì)性和尺寸。簡(jiǎn)要來(lái)說，將凍干蛋白質(zhì)樣本溶解于去離子水中以得到最終蛋白質(zhì)濃度 2. 5mg/ml。使用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)，在173°反向散射角下進(jìn)行數(shù)據(jù)收集來(lái)以數(shù)目、強(qiáng)度和體 積平均值量度尺寸。測(cè)量結(jié)果是13次掃描的平均值。
[0111] 生物物理學(xué)表征
[0112] 對(duì)于生物物理學(xué)表征，在25mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0)中充分透析蛋白質(zhì)以移除 Tris-HCl和蔗糖，并且經(jīng)0. 22 μ m PVDF注射器過濾器過濾。使用Origin? 8. 5 (OriginLab Corp., Northampton, MA)或 SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc, Chicago, IL)分 析獲得的光譜。使用如下由Scholtz等定義的等式I和2擬合數(shù)據(jù)以確定AG、m值和 [脲]1/2[62]。

【權(quán)利要求】
1. 一種包含晶狀體上皮源性生長(zhǎng)因子（L邸G巧的氨基酸序列的膚，其中所述膚包含 LEDGF N末端應(yīng)激相關(guān)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
2. 如權(quán)利要求1所述的膚，其中所述膚還包含TAT結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
3. 如權(quán)利要求1所述的膚，其中所述膚具有約40kDa的分子量。
4. 如權(quán)利要求1所述的膚，其中所述膚具有氨基酸序列SEQ IDN0;2,或與SEQ ID NO: 2具有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %或至少95 %序列同一性的氨基 酸序列。
5. -種核酸序列，其編碼如權(quán)利要求4所述的膚。
6. -種載體，其包含如權(quán)利要求5所述的核酸序列。
7. -種組合物，其包含如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的膚。
8. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其還包含藥物載體、稀釋劑、賦形劑或其組合。
9. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述膚與膠態(tài)金屬納米顆粒結(jié)合或締合。
10. 如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述膠態(tài)金屬納米顆粒是金、銀、鉛、釘、鋒、鐵、 媒、巧、裡、軸、鎮(zhèn)、鐘、筑、鐵、饑、鉛、猛、鉆、銅、嫁、餓、魄、鋼、把、鋼、錫、鶴、練、笛或亂膠態(tài) 金屬納米顆粒。
11. 如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述納米顆粒是鋒納米顆粒。
12. 如權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的組合物，其還包含藥物載體、稀釋劑、賦形劑或 其組合。
13. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述膚結(jié)合或囊封于內(nèi)部顆粒中，并且其中所述 內(nèi)部顆粒被裝載在多孔外部顆粒中。
14. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述內(nèi)部顆粒是由在超臨界二氧化碳中不膨脹 的顆粒材料制得。
15. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述內(nèi)部顆粒材料是聚合物材料。
16. 如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述內(nèi)部顆粒聚合物材料選自由W下組成的 組；聚交醋（PLA)、聚（己醇酸）（PGA)、乳酸和己醇酸的共聚物（PLGA)、纖維素衍生物和殼 聚糖。
17. 如權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述內(nèi)部顆粒聚合物材料是聚交醋（PLA)。
18. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述外部顆粒是由在超臨界二氧化碳中膨脹的 顆粒材料制得。
19. 如權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述外部顆粒是聚合物材料。
20. 如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述聚合物材料是選自W下的材料；聚醜胺、聚 碳酸醋、聚亞焼基二醇、聚亞焼基氧化物、聚己帰醇、聚己帰離、聚己帰醋、聚己帰化咯焼麗、 聚己交醋及其共聚物、焼基纖維素、輕焼基纖維素、纖維素離、纖維素醋、硝基纖維素、丙帰 酸醋和甲基丙帰酸醋的聚合物、甲基纖維素、己基纖維素、輕丙基纖維素、輕基-丙基甲基 纖維素、輕下基甲基纖維素、己酸纖維素己酸下酸纖維素、己酸鄰苯二甲酸纖維素、駿己基 纖維素、纖維素聚（甲基丙帰酸甲醋）、聚（甲基丙帰酸己醋）、聚（甲基丙帰酸下醋）、聚 (己帰醇）、聚（己酸己帰醋）和聚己帰化酪焼麗。
21. 如權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述外部顆粒材料是丙交醋-共聚-己交醋。
22. -種治療蛋白質(zhì)聚集介導(dǎo)的疾病的方法，其包括向有需要的患者施用如權(quán)利要求 7至21中任一項(xiàng)所述的組合物。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述聚集介導(dǎo)的疾病是眼病。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述眼病是視網(wǎng)膜變性疾病。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜變性疾病是老年性黃斑變性（AMD)或 視網(wǎng)膜色素變性（RP)。
26. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述聚集介導(dǎo)的疾病是神經(jīng)退變性疾病。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述神經(jīng)退變性疾病是阿爾茨海默?。ˋD)、帕金 森氏?。≒D)、亨廷頓氏?。?、肌萎縮性側(cè)索硬化或化病毒疾病。
28. -種降低蛋白質(zhì)聚集介導(dǎo)的疾病中蛋白質(zhì)聚集的方法，其包括向有需要的患者施 用如權(quán)利要求7至21中任一項(xiàng)所述的組合物。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中蛋白質(zhì)聚集是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激或兩者引 起。
30. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述患者患有視網(wǎng)膜變性疾病。
31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜變性疾病是AMD或RP。
32. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述患者患有神經(jīng)退變性疾病。
33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述神經(jīng)退變性疾病是AD、PH、皿、肌萎縮性側(cè)索 硬化或化病毒疾病。
【文檔編號(hào)】A61K38/18GK104470534SQ201380038504
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月21日
【發(fā)明者】烏達(dá)伊·B·康佩拉, 林庫(kù)·拜德, 阿倫·K·烏帕德亞伊, 薩拉·揚(yáng)德拉普 申請(qǐng)人:科羅拉多大學(xué)董事會(huì)