原生動(dòng)物火雞組織滴蟲(chóng)(h.meleagridis)培養(yǎng)物的生產(chǎn)和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于生產(chǎn)火雞組織滴蟲(chóng)(H.meleagridis)單菌株培養(yǎng)物的方法，該方法的特征在于以下步驟：(a)提供包含火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞和野生型菌群的火雞組織滴蟲(chóng)異生(xenic)培養(yǎng)物，(b)用抗生素混合物處理異生培養(yǎng)物，從而殺滅野生型菌群，(c)離心并洗滌火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞，(d)控制步驟(b)的有效性，(e)重懸洗滌的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞，(f)將一種或多種單菌株添加到重懸的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞，以及(g)將一種或多種單菌株和重懸的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞一起培養(yǎng)以便獲得火雞組織滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物。本發(fā)明還公開(kāi)了一種疫苗制劑，其由組織滴蟲(chóng)成分、細(xì)菌成分以及藥學(xué)上可接受的非生物制劑化合物組成，其中所述組織滴蟲(chóng)成分由減毒的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物組成，所述細(xì)菌成分由一種或多種單菌株的培養(yǎng)物組成。
【專利說(shuō)明】原生動(dòng)物火雞組織滴蟲(chóng)（H.MELEAGRIDIS)培養(yǎng)物的生產(chǎn)和 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及原生動(dòng)物火雞組織滴蟲(chóng)（Histomonas meleagridis) (H. meleagridis) 培養(yǎng)物的生產(chǎn)和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 有鞭毛的原生動(dòng)物火雞組織滴蟲(chóng)與禽當(dāng)中的組織滴蟲(chóng)?。ㄍx詞，黑頭?。┯?關(guān)，這是主要發(fā)生在火雞和雞當(dāng)中的一種疾病。該疾病的特點(diǎn)是肝臟的壞死性病變， 盲腸壁增厚和潰瘍以及硫磺色的糞便。組織滴蟲(chóng)病導(dǎo)致高死亡率，尤其是在火雞群 中。雞顯示出較高的組織滴蟲(chóng)病耐受性，并且病變通常局限于盲腸中（McDougald, Avian Dis. 49 (2005)，462-476 ;Springer，Exp. Parasitol. 28 (1970)，383-392)。
[0003] 在歐洲和北美的大多數(shù)國(guó)家中，在實(shí)行有效的藥品和食品添加劑中對(duì)鞭毛蟲(chóng)的禁 令之后，由于其對(duì)禽群所構(gòu)成的威脅以及與疾病爆發(fā)相關(guān)的重大經(jīng)濟(jì)損失，在過(guò)去十年中 增加了對(duì)火雞組織滴蟲(chóng)的科研興趣。
[0004] 這種寄生蟲(chóng)火雞組織滴蟲(chóng)屬于毛滴蟲(chóng)目（Trichomonadida)雙核內(nèi)變形蟲(chóng) 科（Dientamoebidae)。原生動(dòng)物的共同特征包括帶有一個(gè)鞭毛的副基器（parabasal apparatus)、氫化酶體、以及帶有淀粉顆?；蚣?xì)菌的食物泡（feed vacuole)。這些特征表 明了細(xì)菌和原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)之間體外和體內(nèi)相互作用的高度重要性（Delappe等人，Exp. Parasitol. 2(1953), 79-86)〇
[0005] Goedbloed 等人（Avian Dis.6(1962), 302-315)公開(kāi)了 向組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物中 添加細(xì)菌，其中來(lái)自火雞的肝臟提取物被補(bǔ)充有大腸桿菌，以產(chǎn)生火雞組織滴蟲(chóng)的單棲 (monoxenic)培養(yǎng)物（"單棲"意思是單一的外源性細(xì)菌培養(yǎng)物被添加到含有所有天然存在 于肝臟材料的細(xì)菌的活檢材料中，如大腸桿菌或球菌）。這種單棲培養(yǎng)物已被用于建立火雞 組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物，但是細(xì)菌群落生境的存在總被認(rèn)為對(duì)于建立這種培養(yǎng)物是必要的（EP 1 721 965 A);它遵循的是，為了建立火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物，細(xì)菌成分的存在是必不可少的。
[0006] 不同于Goedbloed等人的報(bào)告，對(duì)火雞組織滴蟲(chóng)體外培養(yǎng)的研究表明單菌株 不適合原生動(dòng)物的連續(xù)體外繁殖，所述研究獲自現(xiàn)有的培養(yǎng)物，這種培養(yǎng)物含有混合的 火雞盲腸菌群，連同大腸桿菌或弗羅思特桿菌（Escherichia freundii)的活和死細(xì)胞 (Lesser, Helminthol. Soc. Wash. 31 (1964)，265-266)。因此，最近已經(jīng)質(zhì)疑單細(xì)菌培養(yǎng)物支 持寄生蟲(chóng)體外生長(zhǎng)的能力（Hauck等人，J.Parasitol.96(2010)，1-7)。這個(gè)問(wèn)題對(duì)于目前 正在研究中的體外培養(yǎng)物非常重要，所有這些體外培養(yǎng)物都含有從中分離出火雞組織滴蟲(chóng) 的鳥(niǎo)的野生型盲腸菌群（例如，van der Heijden等人，Avian Pathol. 34(2005)，505-508)。 從患病火雞的排泄物建立克隆原生動(dòng)物培養(yǎng)物，給原生動(dòng)物和細(xì)菌之間相互作用的連續(xù)和 擴(kuò)展的檢查提供了新的機(jī)遇（EP 1 721 965 A)。這種克隆培養(yǎng)物對(duì)于建立只含單菌株的明 確培養(yǎng)物而言將是一個(gè)良好的開(kāi)端，或許也使得能夠進(jìn)行特定的細(xì)菌交換。
[0007] 另一方面，抗火雞組織滴蟲(chóng)感染的疫苗需要安全的抗原（Lund等人，Exp. Parasitol. 18 (1966)，403-407)。一種用于提供安全抗原的方法是提供用于接種的 減毒培養(yǎng)物。最近已經(jīng)能夠制得減毒的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物（Liebhart等人，Avian Pathol. 39(2010)，399-403 ;Liebhart 等人，Poultry Sci. 90(2011)，996-1003 ;Hess 等人， Vaccine 26(2008)，4187-4193)。然而，這樣的培養(yǎng)物仍然源自天然來(lái)源，例如通過(guò)使用顯 微操作的個(gè)體化（Hess等人，Parasitol. 133(2006)，547-554 ;(更普遍的：）Clark等人， Clin. Microb. Rev. 15(2002)，329-341)，因此還含有天然來(lái)源的菌群。最近，還使得提供火 雞組織滴蟲(chóng)的克隆培養(yǎng)物成為可能（EP 1 721 965 A)，然而雖然這些培養(yǎng)物相對(duì)于組織滴 蟲(chóng)而言是克隆的，這些克隆培養(yǎng)物甚至仍然含有僅粗略明確其性質(zhì)的混合細(xì)菌培養(yǎng)物。
[0008] 對(duì)于疫苗的市場(chǎng)授權(quán)，在獸醫(yī)領(lǐng)域中同樣需要有效成分的明確組成。因此，通常 不可能注冊(cè)并使用不明確的細(xì)菌組成的培養(yǎng)物（這包括單棲培養(yǎng)物）用于工業(yè)應(yīng)用（如 Goedbloed等人，1962報(bào)道的）。因此，有必要提供一種藥物組合物，其不僅包含減毒的火雞 組織滴蟲(chóng)細(xì)胞，而且相對(duì)于細(xì)菌成分而言還是均勻設(shè)計(jì)的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是建立一種明確的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物，其具有明確的 細(xì)菌成分，所述細(xì)菌成分缺乏"野生型"的細(xì)菌環(huán)境。更具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的是調(diào)查 是否有可能提供一種其中只存在一種（單一）菌株的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物，以及是否有可 能用一種或多種其它菌株替代或補(bǔ)充這種株來(lái)獲得明確定義的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物，在其 中不僅火雞組織滴蟲(chóng)成分是明確定義的（例如，作為克隆和/或減毒培養(yǎng)物），細(xì)菌成分也 是明確定義的，從而允許利用火雞組織滴蟲(chóng)的減毒株來(lái)進(jìn)行適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)和注冊(cè)針對(duì)抗火雞 組織滴蟲(chóng)的工業(yè)上可應(yīng)用的疫苗。這將使得能夠提供抗火雞組織滴蟲(chóng)的工業(yè)上可應(yīng)用的疫 苗，這是本發(fā)明的核心目的。這種明確定義的火雞組織滴蟲(chóng)/細(xì)菌培養(yǎng)物也將有利于調(diào)查 火雞組織滴蟲(chóng)在某些細(xì)菌存在時(shí)的生長(zhǎng)行為，以及分析寄生蟲(chóng)和細(xì)菌在體外和體內(nèi)之間的 相互作用。
[0010] 因此，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)火雞組織滴蟲(chóng)OLmeleagridiS)單菌株培養(yǎng)物 的方法，特征在于以下步驟：
[0011] (a)提供包含火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞和野生型菌群的火雞組織滴蟲(chóng)的異生培養(yǎng)物 (xenic culture)，
[0012] (b)用抗生素混合物處理異生培養(yǎng)物，從而殺滅野生型菌群，
[0013] (C)離心并洗滌火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞，
[0014] (d)控制步驟（b)的有效性，
[0015] (e)重懸洗滌的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞，
[0016] (f)向重懸的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞中添加一種或多種單菌株，以及
[0017] (g)將一種或多種單菌株和重懸的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞一起培養(yǎng)以便獲得火雞組織 滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物。
[0018] 采用本發(fā)明，首次在液體基質(zhì)中提供了火雞組織滴蟲(chóng)的培養(yǎng)物，其具有明確的細(xì) 菌成分，其中"野生型"菌群被完全除去并且被替換為一種或多種單菌株。在火雞組織滴蟲(chóng) 的克隆培養(yǎng)物中，通過(guò)利用各種抗生素選擇性破壞初始細(xì)菌將排泄物菌群替換成明確的菌 株，同時(shí)保持鞭毛蟲(chóng)活著。在本發(fā)明的過(guò)程中，還證明能夠無(wú)需明顯損害原生動(dòng)物的細(xì)胞來(lái) 進(jìn)行這種細(xì)菌破壞。發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)依賴于細(xì)菌，尤其是依賴細(xì)菌的能量代謝。 發(fā)現(xiàn)大腸桿菌強(qiáng)烈支持寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)，而鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella Typhimurium)和綠 膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)效率較低，但在本發(fā)明的范圍內(nèi)仍然良好地發(fā)揮作 用。共聚焦激光顯微鏡顯示，火雞組織滴蟲(chóng)能吸收綠色熒光蛋白標(biāo)記的大腸桿菌DH5ci，這 表明細(xì)菌作為原生動(dòng)物可能的食品供應(yīng)。在經(jīng)歷連續(xù)體外傳代的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物中通 過(guò)將菌群替換成大腸桿菌DH5a，能夠表明減弱過(guò)程獨(dú)立于細(xì)菌，如在體內(nèi)所表明的。在本 發(fā)明的過(guò)程中進(jìn)一步表明，大腸桿菌DH5 a可以被一種或多種菌株所替代，這允許提供明 確定義的抗火雞組織滴蟲(chóng)感染的疫苗，其中所述疫苗包含工業(yè)上可應(yīng)用的細(xì)菌疫苗成分。 此外，也顯示在受感染火雞中的內(nèi)臟菌群對(duì)原生動(dòng)物的致病力沒(méi)有負(fù)面影響。因此，這表明 減弱不依賴于培養(yǎng)物中的細(xì)菌，而是體外傳代。采用本發(fā)明，提供了明確定義的工業(yè)上可應(yīng) 用的抗火雞組織滴蟲(chóng)感染的疫苗，其允許有效保護(hù)動(dòng)物，還滿足獸醫(yī)注冊(cè)和使用所必需的 法定和形式要求（Ganas 等人，Int. J. Parasitol. 42 (2012)，893-901)。
[0019] 在本發(fā)明的過(guò)程中，術(shù)語(yǔ)"單菌株"或"（火雞組織滴蟲(chóng)的）單菌株培養(yǎng)物"是指細(xì) 菌成分由純培養(yǎng)物中單一分離物的后代組成，并且通常源自初始的單菌落（Di jkshoorn等 人，J. Med. Microbiol. 49 (2000)，397-401)。這是細(xì)菌學(xué)中的常用基本運(yùn)算單位并且通常也 被稱為"分類學(xué)意義上的株"。"單菌株"不是一個(gè)天然的概念，因?yàn)?天然"初始單菌落的這 些后代（defendant)被保持在人工培養(yǎng)中。這個(gè)定義無(wú)疑被用來(lái)表示株的身份。盡管在分 類學(xué)意義上，可能存在著株在性質(zhì)上的對(duì)應(yīng)物，根據(jù)本發(fā)明的"單菌株"能夠明確地區(qū)別于 火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物中的任何野生型菌群，例如通過(guò)其純度（主要通過(guò)火雞組織滴蟲(chóng)天然 環(huán)境中各種細(xì)菌物種的組成）、通過(guò)其遺傳同一性（例如，相對(duì)于突變、缺失或獲得質(zhì)粒等） 等。因此，也很清楚在本發(fā)明的培養(yǎng)物中還存在一種以上的單菌株，其明顯區(qū)別于火雞組織 滴蟲(chóng)的野生型菌群。盡管為了提供一種工業(yè)上可應(yīng)用的疫苗產(chǎn)品，可添加到火雞組織滴蟲(chóng) 培養(yǎng)物中的單菌株的數(shù)目是可變的，不優(yōu)選添加超過(guò)五種的單菌株。截然相反的是，特別優(yōu) 選提供僅具有單菌株的根據(jù)本發(fā)明的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物。然而，出于一些原因（如，給火 雞組織滴蟲(chóng)提供更好的環(huán)境），具有不超過(guò)四種，優(yōu)選不超過(guò)三種，尤其是不超過(guò)兩種單菌 株的實(shí)施方式是優(yōu)選的。
[0020] 與具有（一種或多種）"單菌株"的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物相反，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ) (火雞組織滴蟲(chóng)的）"異生"培養(yǎng)物是指火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物，其生長(zhǎng)或存在與未知微生物有 關(guān)，尤其是與源自火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞所取自的天然環(huán)境的菌群有關(guān)。此外，術(shù)語(yǔ)"單棲"（由 Goedbloed等人，1962使用）僅僅是指將單一外源細(xì)菌培養(yǎng)物添加到取自天然環(huán)境（如肝 組織）的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物，它仍然包含所有或部分天然存在的細(xì)菌。甚至Hess等人 2006中公開(kāi)的火雞組織滴蟲(chóng)克隆培養(yǎng)物仍包含至少部分初始環(huán)境的細(xì)菌混合物。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)多種步驟，即抗生素或控制步驟的組合應(yīng)用，確保完全除去天然 的（"野生型"）細(xì)菌環(huán)境。優(yōu)選地，通過(guò)事先檢驗(yàn)火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的菌群來(lái)選擇抗生 素，其中火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物應(yīng)純化自這種野生型菌群。因此，步驟（a)優(yōu)選伴隨著異生培 養(yǎng)物的菌群分析?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的技術(shù)來(lái)進(jìn)行這種檢驗(yàn)，例如通過(guò)經(jīng)典的細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè) 試，包括抗性測(cè)試，或者通過(guò)采用分子生物學(xué)方法，例如PCR。這種檢驗(yàn)之后，可以根據(jù)發(fā)現(xiàn) 存在于火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物中的細(xì)菌類型優(yōu)化抗生素混合物。通常，在本方法步驟（b)中 所用的混合物中優(yōu)選采用具有不同代謝機(jī)制的抗生素。根據(jù)本發(fā)明的方法，步驟（b)中使 用的抗生素混合物包含至少兩種不同的抗生素?？偸强紤]所分析或預(yù)期的菌群來(lái)選擇混合 物，并優(yōu)選由不同化合物類型的抗生素組成以達(dá)到破壞野生型菌群的最強(qiáng)效果。根據(jù)本發(fā) 明過(guò)程中研究的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物，根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式采用了含有至 少三種不同抗生素的抗生素混合物。多利培南、新霉素和利福平的混合物表現(xiàn)出有效殺滅 野生型菌群的特定有益效果。
[0022] 對(duì)于本發(fā)明，幾乎任何火雞組織滴蟲(chóng)的分離物可以被轉(zhuǎn)化為單菌株培養(yǎng)物。因?yàn)?通常還優(yōu)選所得培養(yǎng)物的火雞組織滴蟲(chóng)成分是均一的，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式是以火雞組 織滴蟲(chóng)的克隆培養(yǎng)物為開(kāi)始，優(yōu)選通過(guò)火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的顯微操作建立的克隆培養(yǎng) 物。例如在EP 1 721 965 A中已經(jīng)公開(kāi)了這種克隆培養(yǎng)物，并且其僅含有源自單細(xì)胞的火 雞組織滴蟲(chóng)。因此，相對(duì)于培養(yǎng)物的寄生蟲(chóng)成分而言，這種培養(yǎng)物是均一的，并且尤其優(yōu)選 用于制備明確的抗火雞組織滴蟲(chóng)感染的疫苗。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明方法中的一個(gè)必要步驟是控制步驟（d)，其中控制用抗生素進(jìn)行處理 的效果。然而，基于事先對(duì)菌群的分析而優(yōu)化的抗生素混合物通常有效殺滅所有存在的細(xì) 菌，對(duì)于其它情況或者初始樣本或培養(yǎng)物中包含抗性菌株的情況，這可能是不必要的。因 此，如果控制步驟導(dǎo)致對(duì)殘留細(xì)菌的檢測(cè)，則用抗生素進(jìn)行處理以及隨后的離心和洗滌步 驟必須重復(fù)進(jìn)行。例如，可以通過(guò)額外添加另一抗生素混合物進(jìn)行步驟（f)(當(dāng)然，向混合 物中所添加的細(xì)菌單株對(duì)這種混合物是抗性的），從而然后和步驟（f) 一起或者在步驟（f) 之后進(jìn)行重復(fù)的步驟（b)。優(yōu)選地，使用不同的抗生素混合物進(jìn)行這種"重復(fù)"步驟（b)的 抗生素處理，優(yōu)選隨著存活細(xì)菌的性質(zhì)調(diào)整抗生素。也可以在改變抗生素混合物的組成之 前分析存活細(xì)菌的性質(zhì)。
[0024] 對(duì)于初始細(xì)菌動(dòng)物群（fauna)的調(diào)查（見(jiàn)上文），也為了控制步驟（d)，可以使 用任何合適的原核生物分析技術(shù)（如經(jīng)典的細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)試或采用分子生物學(xué)方法，例如 PCR);優(yōu)選的方法在步驟（b)或（c)之后采用菌落形成單位的確定。尤其在需要重復(fù)步驟 (b)和（c)的情況下，優(yōu)選還重復(fù)步驟（d)，也就是說(shuō)，首次應(yīng)用抗生素混合時(shí)如果野生型菌 群尚未完全從火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞中除去。
[0025] 步驟（a)至（g)，尤其步驟（b)至（g)并不一定必須按照字母順序進(jìn)行（當(dāng)然，盡 管步驟（a)通常會(huì)是初始步驟，以及步驟（g)是用于獲得所述培養(yǎng)物的最后步驟）。例如， 單菌株的添加（步驟（f))也可以在步驟（c)、（d)或（e)之前加入。也可以在這些步驟期 間進(jìn)行這種添加，例如甚至在步驟（b)期間（如接近結(jié)束時(shí)）、步驟（c)(如離心之后和洗滌 之前）或步驟（e)期間。當(dāng)然，步驟（b)期間單菌株的添加，還取決于單菌株相較于所用抗 生素混合物的抗生素抗性特性，從而保證所添加的細(xì)菌能夠存活。例如，還在步驟（b)、（e)、 (f)或（g)之后進(jìn)行控制步驟⑷（或在這些步驟期間，例如在步驟（b)期間（如接近結(jié)束 時(shí)）、步驟（c)(如離心之后和洗滌之前）或步驟（e)期間）；或者甚至進(jìn)行一次以上，如在 步驟（c)、（e)、（f)和/或（g)之后（或期間）。
[0026] 如果控制步驟（d)顯示野生型菌群尚未完全從火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞中除去，也可以 重復(fù)步驟（b)和（c)。然而，必須注意重復(fù)這些步驟允許含有火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞和（存在的 或添加的）細(xì)菌的混合物得以適當(dāng)?shù)拇婊睢ａ槍?duì)給定的起始原料，可以通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)火雞 組織滴蟲(chóng)細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞貫穿整個(gè)本方法過(guò)程中的存活來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。例如，臺(tái)盼藍(lán)染色法 可用于區(qū)分活的和死的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞；例如可以通過(guò)經(jīng)典的微生物測(cè)試方法測(cè)試細(xì)菌 細(xì)胞，如瓊脂平板測(cè)試（和菌落計(jì)數(shù)）。優(yōu)選地，本方法相對(duì)于火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞和細(xì)菌細(xì) 胞進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而避免細(xì)菌和原生動(dòng)物之間的非生理性不平衡，這將威脅火雞組織滴蟲(chóng)細(xì) 胞的存活。
[0027] 在本發(fā)明過(guò)程中所用的單菌株的性質(zhì)是關(guān)鍵的，只要其應(yīng)當(dāng)能夠使火雞組織滴蟲(chóng) 細(xì)胞適當(dāng)存活和生長(zhǎng)。眾所周知，細(xì)菌成分對(duì)于培養(yǎng)火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞是必不可少的。在 本發(fā)明的過(guò)程中，可以觀察到只有兼性厭氧的菌株表現(xiàn)出良好的性能。為了顯示出現(xiàn)對(duì)于 火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞的這種令人滿意的存活/生長(zhǎng)性能，有必要提供兼性厭氧或需氧物種的 單菌株，即進(jìn)行有氧呼吸的細(xì)菌。在本發(fā)明過(guò)程中進(jìn)行的研究表明，如果在步驟（f)中添加 選自如下的一種或多種菌株的單菌株培養(yǎng)物：大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌金黃色葡萄球菌 (Staphlyococcus aureus)和/或綠膿假單胞菌，貝U可以得到特別好的結(jié)果。
[0028] 尤其優(yōu)選的菌株的單菌株培養(yǎng)物可以選自：梭菌屬，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌 (Clostridium perfringens sp.)，尤其是產(chǎn)氣莢膜梭菌野生株 PA10/2010 (Clostridium perfringens field strain PA10/2010);腸球菌屬，優(yōu)選奠腸球菌（Enterococcus faecal i s sp.)，尤其是糞腸球菌ATCC29212 ;沙門(mén)氏菌屬，優(yōu)選鼠傷寒血清型沙門(mén)氏 菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium sp·)，尤其是鼠傷寒血清型沙門(mén)氏 菌ATCC14028;沙門(mén)氏菌屬，優(yōu)選腸炎血清型沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis sp·)，尤其是腸炎血清型沙門(mén)氏菌ATCC13076;大腸桿菌（Escherichia coli sp.)，尤其是大腸桿菌ATCC25922、大腸桿菌DH5 α、或者轉(zhuǎn)化有載體pGFPuv的大腸桿菌；葡 萄球菌屬，優(yōu)選金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus),尤其是金黃色葡萄球菌野生株 PA10/10643和/或假單胞菌屬，優(yōu)選綠膿假單胞菌，尤其是綠膿假單胞菌ATCC27853。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明方法的單菌株培養(yǎng)物還包含所有培養(yǎng)成分，其對(duì)于火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞 的生長(zhǎng)/存活是必需的。因此，火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞優(yōu)選保持在含有胎牛血清的培養(yǎng)基中，優(yōu) 選還含有緩沖劑、氨基酸和碳水化合物源，尤其是淀粉。這種介質(zhì)被證明特別適于根據(jù)本發(fā) 明的方法。
[0030] 盡管根據(jù)本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于任何火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物，優(yōu)選出于疫苗接 種的目的提供這樣的培養(yǎng)物。出于疫苗接種的目的，優(yōu)選使用減毒形式的病原體（火雞 組織滴蟲(chóng)），優(yōu)選火雞組織滴蟲(chóng)的減毒克隆培養(yǎng)物，尤其是火雞組織滴蟲(chóng)土耳其/奧地利 /2922-C6/04 (H. meleagridis Turkey/Austria/2922_C6/04)。最近這種減毒形式已經(jīng)成 為可獲得的（Liebhart 等人，Avian Pathol. 39(2010)，399-403 ;Liebhart 等人，Poultry Sci. 90(2011)，996-1003 ;Hess 等人，Vaccine 26(2008)，4187-4193)，并且可以通過(guò)采用 根據(jù)本發(fā)明的方法針對(duì)這種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化成單菌株培養(yǎng)物。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的方法將野生型菌群替換為單菌株。方便采用遺傳修飾株用于步驟 (f)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)使用基因技術(shù)特征（包括抗生素抗性基因或標(biāo)記基因）容易控制這種細(xì)菌 細(xì)胞的存在或缺失。因此，在實(shí)施例部分用大腸桿菌DH5CI進(jìn)行步驟（f)。然而，在許多情 況下不希望疫苗中存在遺傳操作的細(xì)菌。因此，可以期望的是提供一種火雞組織滴蟲(chóng)的單 菌株培養(yǎng)物，其僅僅含有未經(jīng)遺傳操作的細(xì)菌，即源自天然來(lái)源的株。為了提供這樣的培養(yǎng) 物，可以采用這種未經(jīng)遺傳操作的單菌株進(jìn)行步驟（f)。另一方面，本發(fā)明過(guò)程中也證明，能 夠?qū)⑴囵B(yǎng)物中的單菌株替換為另一種單菌株。例如，可以通過(guò)未經(jīng)遺傳修飾的株來(lái)替換遺 傳修飾的株。事實(shí)上，已證明用遺傳修飾的單菌株進(jìn)行步驟（f)然后再將這種遺傳修飾的 株替換為未經(jīng)遺傳修飾的一種或多種單菌株是更加容易、更加可控并且更加安全的。因此， 根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選形式是按這種方式進(jìn)行的，其中在步驟（f)中添加的一種或多種單 菌株，通過(guò)以下步驟被一種或多種其它單菌株所替代：
[0032] (h)用抗生素或抗生素混合物處理步驟（g)中獲得的火雞組織滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng) 物從而殺滅步驟（f)中添加的菌株，其中所述抗生素或抗生素混合物特異性殺滅步驟（f) 中添加的一種或多種單菌株，
[0033] (i)離心、洗滌并重懸火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞，
[0034] (j)向重懸的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞中添加一種或多種單菌株，以及
[0035] (k)將一種或多種單菌株和重懸的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞一起培養(yǎng)以便獲得火雞組織 滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物。
[0036] 優(yōu)選地，步驟（j)中添加的株是未經(jīng)遺傳修飾的株（主要由于法規(guī)的原因；然 而，這也可以隨時(shí)間和國(guó)家的不同而不同）。特別優(yōu)選地，在步驟（j)中使用如下單菌株： (條件是僅使用未遺傳修飾的株）梭菌屬，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌，尤其是產(chǎn)氣莢膜梭菌野生 株P(guān)A10/2010 ;腸球菌屬，優(yōu)選糞腸球菌，尤其是糞腸球菌ATCC29212 ;沙門(mén)氏菌屬，優(yōu)選 鼠傷寒血清型沙門(mén)氏菌，尤其是鼠傷寒血清型沙門(mén)氏菌ATCC14028 ;沙門(mén)氏菌屬，優(yōu)選腸 炎血清型沙門(mén)氏菌，尤其是腸炎血清型沙門(mén)氏菌ATCC13076 ;大腸桿菌，尤其是大腸桿菌 ATCC25922 ;葡萄球菌屬，優(yōu)選金黃色葡萄球菌，尤其是金黃色葡萄球菌野生株P(guān)A10/10643 和/或假單胞菌屬，優(yōu)選綠膿假單胞菌，尤其是綠膿假單胞菌ATCC27853。
[0037] 根據(jù)本方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，以5至500、優(yōu)選10至100、尤其是30至70 μ g/ ml多利培南，50至5000、優(yōu)選100至1000、尤其是300至700 μ g/ml新霉素以及30至3000、 優(yōu)選50至1500、尤是100至500 μ g/ml利福平的濃度應(yīng)用步驟（b)中的抗生素混合物。
[0038] 優(yōu)選地，步驟（b)中的抗生素混合物包含至少兩種，優(yōu)選至少三種選自如下的抗 生素：氯霉素、復(fù)方新諾明（cotrimoxazol)、二氟沙星、多利培南、恩諾沙星、卡那霉素、林 可霉素、馬波沙星、美羅培南、新霉素、利福平、大觀霉素和鏈霉素。
[0039] -般情況下，步驟（b)以及任選步驟（k)有必要在一定的溫度下進(jìn)行足以完全殺 滅細(xì)菌細(xì)胞的一段時(shí)間，但不能太長(zhǎng)以至于顯著危及火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的存活（參見(jiàn)例 如Goeldbloed等人，1962的實(shí)施例4,其中報(bào)告所有原生動(dòng)物在12小時(shí)后被殺滅）。
[0040] 在本方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，至少步驟（g)和任選步驟（k)在35至45°C，優(yōu)選38 至42 °C的溫度下進(jìn)行。
[0041] 在本方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟（b)和任選步驟（h)在35至45°C，優(yōu)選38 至42 °C的溫度下進(jìn)行。
[0042] 在本方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟（b)和任選步驟（h)進(jìn)行至少1小時(shí)，優(yōu)選 至少5小時(shí)，尤其至少10小時(shí)。已證明約20小時(shí)的持續(xù)時(shí)間是最佳持續(xù)時(shí)間。
[0043] 如上面已經(jīng)指出的，單菌株優(yōu)選是兼性厭氧或需氧菌株。
[0044] 如上面已經(jīng)指出的，步驟（f)中添加的單菌株優(yōu)選是遺傳修飾的菌株；此外，步驟 (j)中添加的單菌株優(yōu)選是未經(jīng)遺傳修飾的菌株。
[0045] 步驟（C)和任選步驟⑴中所用洗滌溶液優(yōu)選是相同的或至少源自培養(yǎng)溶液，其 中火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞通常在本方法的過(guò)程中，尤其是在步驟（g)以及任選步驟（k)中進(jìn)行 培養(yǎng)。這樣的培養(yǎng)溶液是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如可以源自本文引用的文獻(xiàn)。因此，優(yōu) 選用培養(yǎng)溶液進(jìn)行洗滌步驟。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明的方法是用于提供單株細(xì)菌火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的高度可靠的方法。 然而，通過(guò)省略步驟（c)、（d)和（e)中的一個(gè)或多個(gè)，和/或通過(guò)在步驟（b)中僅使用單一 抗生素而非抗生素混合物，也可能獲得這種培養(yǎng)物。然而，這種方法還可以產(chǎn)生來(lái)自初始培 養(yǎng)物的殘留細(xì)菌，因?yàn)榛痣u組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物中細(xì)菌野生型群的有些成員可耐受這種單一抗 生素。
[0047] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種疫苗制劑，其由如下組成：
[0048] -組織滴蟲(chóng)成分，其由減毒的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物組成，
[0049] -細(xì)菌成分，其由一種或多種單菌株培養(yǎng)物組成，以及
[0050] -藥學(xué)上可接受的非生物制劑化合物。
[0051] 本疫苗制劑不僅包含明確的火雞組織滴蟲(chóng)成分（如最近EP 1 721 965 A中所實(shí) 施的），除此外還包含明確的細(xì)菌成分。細(xì)菌成分由單菌株培養(yǎng)物組成（在某些情況下，可 以在細(xì)菌成分中提供一種以上（若干）單菌株），從而使得疫苗制劑對(duì)于兩種成分而言都是 明確的且充分表征的。細(xì)菌成分還使得能夠明確區(qū)別于火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的天然菌群， 因?yàn)槿绫景l(fā)明中所定義的具有細(xì)菌成分的疫苗不能源自天然來(lái)源。通過(guò)調(diào)查這種現(xiàn)有技術(shù) 疫苗的菌群的性質(zhì)和組成,從包含細(xì)菌的任何火雞組織滴蟲(chóng)疫苗的細(xì)菌成分的性質(zhì)和組成 中可輕易檢測(cè)到這點(diǎn)。包含根據(jù)本發(fā)明的單菌株成分的疫苗可以源自已知的火雞組織滴蟲(chóng) 培養(yǎng)物，而不事先破壞初始菌群。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明的方法使得能夠同時(shí)提供作為火雞組織滴蟲(chóng)單菌株培養(yǎng)物的組織滴 蟲(chóng)成分和細(xì)菌成分。因此，優(yōu)選的是，本疫苗包含火雞組織滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物，尤其是根 據(jù)本發(fā)明的方法獲得的火雞組織滴蟲(chóng)單菌株培養(yǎng)物。
[0053] 在本疫苗制劑的優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)菌組成包含一種單菌株的培養(yǎng)物，優(yōu)選菌株 選自：梭菌屬，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌，尤其是產(chǎn)氣莢膜梭菌野生株P(guān)A10/2010 ;腸球菌屬，優(yōu)選 糞腸球菌，尤其是糞腸球菌ATCC29212 ;沙門(mén)氏菌屬，優(yōu)選鼠傷寒血清型沙門(mén)氏菌，尤其是 鼠傷寒血清型沙門(mén)氏菌ATCC14028 ;沙門(mén)氏菌屬，優(yōu)選腸炎血清型沙門(mén)氏菌，尤其是腸炎血 清型沙門(mén)氏菌ATCC13076 ;大腸桿菌，尤其是大腸桿菌ATCC25922、大腸桿菌DH5a、或轉(zhuǎn)化 有載體pGFPuv的大腸桿菌；葡萄球菌屬，優(yōu)選金黃色葡萄球菌，尤其是金黃色葡萄球菌野 生株P(guān)A10/10643和/或假單胞菌屬，優(yōu)選綠膿假單胞菌，尤其是綠膿假單胞菌ATCC27853 ; 優(yōu)選選自這些的未經(jīng)遺傳修飾的株。
[0054] 根據(jù)本疫苗制劑優(yōu)選的實(shí)施方式，減毒的火雞組織滴蟲(chóng)是減毒的火雞組織滴蟲(chóng)克 隆培養(yǎng)物，尤其是火雞組織滴蟲(chóng)土耳其/奧地利/2922-C6/04。對(duì)于這樣的減毒培養(yǎng)物，其 有必要是穩(wěn)定的，即對(duì)于生長(zhǎng)超過(guò)至少5代而言是穩(wěn)定的。"穩(wěn)定的生長(zhǎng)"是指生長(zhǎng)性質(zhì)沒(méi) 有隨著傳代而顯著改變，如生長(zhǎng)速度偏離不超過(guò)20 %。
[0055] 已證明根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑特異性地有利于預(yù)防組織滴蟲(chóng)病，優(yōu)選在禽，尤其 是火雞和雞當(dāng)中，以及在獵禽，尤其是山雞、鷓鴣、珍珠雞和鵪鶉當(dāng)中。
[0056] 在根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑中藥學(xué)上可接受的非生物制劑化合物可以是通常包含 在疫苗中的任何化合物（當(dāng)然，除了如本文定義的組織滴蟲(chóng)成分和細(xì)菌成分以外），尤其是 在禽疫苗中。因此，藥學(xué)上可接受的非生物制劑化合物可以是緩沖液、佐劑、尤其氫氧化鋁、 防腐劑、填充劑、穩(wěn)定劑、營(yíng)養(yǎng)物，并且通常由兩種或多種這種化合物的組合組成。
[0057] 疫苗制劑可以配制成適于疫苗的任何形式，例如作為片劑尤其包衣片劑、膠囊劑、 油包水乳液、食品、噴霧制劑、液體制劑尤其是飲用水添加劑、可注射制劑尤其是已經(jīng)包裝 在注射器中的、作為凝膠、作為凝膠墊或其組合。
[0058] 根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，例如水、鹽 水、培養(yǎng)液、穩(wěn)定劑、碳水化合物、蛋白質(zhì)、含有蛋白的試劑例如牛血清或脫脂乳以及緩沖 液或其任意組合作為藥學(xué)上可接受的非生物制劑化合物。穩(wěn)定劑可以是SPGA。SPGA含 有 0· 2181M 蔗糖（74. 62g)、0· 00376M KH2PO4 (0· 52g)、K2HPO4O. 0071M(1. 25g)、谷氨酸鉀 0.0049M(0.912g)和1%血清白蛋白（10g)。SPGA成分的上述量的各種變化是本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的，并且谷氨酸鈉經(jīng)常取代谷氨酸鉀，但是改變的組合物仍然稱為SPGA。例如， SPGA穩(wěn)定劑可含有谷氨酸單鈉而不是谷氨酸單鉀；另一種SPGA穩(wěn)定劑每升無(wú)菌蒸餾水中 含有74.62g蔗糖、0.45g KH2P04、1.35g K2HP04、0.956g L-谷氨酸單鈉、以及40ml人白蛋白 (albuminosol)的25%溶液。一般情況下,SPGA穩(wěn)定劑含有約2至約10%的糖，如鹿糖；從 約0. 05至約0. 3%的單-或二元堿金屬磷酸鹽或其混合物，例如KH2P04、K2HP0 4、NaH2PO^ Na2HPO4;從約0. 05至約0. 2%的谷氨酸堿金屬鹽，例如谷氨酸鈉或鉀；以及從約0. 5%至約 2 %的血清白蛋白，如牛血清白蛋白或人白蛋白。SPGA穩(wěn)定劑的制劑中可以進(jìn)行各種成分替 換。例如，淀粉水解物，如葡萄糖或葡聚糖可被全部或部分替換為蔗糖，以及酪蛋白或PVP 可以全部或部分替換為白蛋白。碳水化合物包括例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、 葡聚糖或其組合。此外，蛋白質(zhì)如白蛋白、或酪蛋白、或含有蛋白的試劑例如牛血清或脫脂 乳，可用作藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。用作藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的緩沖液包 括馬來(lái)酸鹽、磷酸鹽、CABS、哌啶、甘氨酸、檸檬酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽、 丙酸鹽、哌嗪、吡啶、甲次砷酸鹽、琥珀酸鹽、MES、組氨酸、bis-tris、磷酸鹽、乙醇胺、ADA、碳 酸鹽、ACES、PIPES、咪唑、BIS-TRIS 丙烷、BES、M0PS、HEPES、TES、M0PS0、M0BS、DIPS0、TAPS0、 TEA、焦磷酸鹽、HEPPSO、P0PS0、甘氨酸、肼、甘氨酰甘氨酸、TRIS、EPPS、N-二甘氨酸、HEPBS、 TAPS、AMPD、TABS、AMPS0、?；撬猁}、硼酸鹽、CHES、甘氨酸、氫氧化銨、CAPS0、碳酸鹽、甲胺、 哌嗪、CAPS或其任何組合。疫苗制劑可以凍干或冷凍干燥。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā) 明的疫苗制劑可進(jìn)一步包含至少一種佐劑。佐劑的實(shí)例包括弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐 齊?、維生素 E、非離子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、礦物油、植物油、卡波普氫氧化鋁、磷 酸鋁、氧化鋁、油乳液（如Bayol 或Marcol 52?啲）、皂苷或維生素-E增溶劑或其任意 組合。在一些實(shí)施方案中，疫苗制劑可包括尤其是用于粘膜應(yīng)用的佐劑，例如大腸桿菌不耐 熱的毒素或霍亂毒素。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑可經(jīng)眼、卵內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、通過(guò)氣霧 (噴霧接種）、經(jīng)由泄殖腔或肌內(nèi)施用。當(dāng)受試者是禽時(shí)，優(yōu)選滴眼、卵內(nèi)和氣霧施用。特別 優(yōu)選氣霧施用將疫苗制劑施用至大量受試者。特別優(yōu)選以膠囊或包衣的形式提供根據(jù)本發(fā) 明的疫苗。這允許適當(dāng)保存細(xì)菌/原生動(dòng)物的混合物。
[0060] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑包含減毒的致病性菌株的單株，優(yōu) 選減毒的單一腸炎沙門(mén)氏菌和/或鼠傷寒沙門(mén)氏菌的株，正如一種或多種單菌株培養(yǎng)物一 樣。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑優(yōu)選含有IX IO2至IX 10 6,優(yōu)選IX IO3至5 XlO 5,尤其是 5 X IO3至I X 105火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞和/或I X 105至I X 10 11，優(yōu)選I X IO7 至5父101°，尤其是5\107至1父101°細(xì)菌細(xì)胞。
[0062] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑配制成劑量形式，即它已經(jīng)被 配制成待施用而無(wú)需其它分隔/配制/分離的步驟。
[0063] 通過(guò)以下實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不限制于此。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0064] 圖1顯示PCR，其表明在獲得細(xì)菌單株培養(yǎng)物的過(guò)程的不同步驟中火雞組織滴蟲(chóng) 的存在以及細(xì)菌的減少。從（1)異生培養(yǎng)物、（2)抗生素處理前的細(xì)胞懸液，（3)抗生素處 理后的細(xì)胞懸液以及（4)洗滌步驟之后的細(xì)胞懸液分離的DNA。針對(duì)火雞組織滴蟲(chóng)（A)和 細(xì)菌（B)的特異性引物。M :分子量標(biāo)記物（IOObp梯）。
[0065] 圖2顯示與各種菌株一起生長(zhǎng)的火雞組織滴蟲(chóng)不同世代（P1-P3)的生長(zhǎng)行為，有 細(xì)菌富集（B+)和無(wú)細(xì)菌富集（B)。（A)含火雞組織滴蟲(chóng)的細(xì)菌單株培養(yǎng)物的百分比。（B) 含有各種菌株的細(xì)菌單株培養(yǎng)物中火雞組織滴蟲(chóng)的細(xì)胞數(shù)目（平均值土SD)。
[0066] 圖3顯示在細(xì)菌單株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物中測(cè)試的菌株生長(zhǎng)曲線，（A)沒(méi)有細(xì)菌 的富集和（B)有細(xì)菌的富集。在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)始和孵育3天后，通過(guò)計(jì)數(shù)菌落形成單位 (cfu)確定細(xì)胞數(shù)目。
[0067] 圖4顯示和大腸桿菌DH5 a pGFPuv -起生長(zhǎng)的細(xì)菌單株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的共 聚焦激光顯微圖像。穿透標(biāo)記有多克隆抗組織滴蟲(chóng)血清的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞（通過(guò)Alexa Fluor 568觀察，紅色）和大腸桿菌DH5apGFPuv (綠色）的8個(gè)連續(xù)部分的系列（z-stack, 0. 318 μ m的Z-軸增益）。寄生蟲(chóng)的核和細(xì)菌DNA用DAPI (藍(lán)色）染色。GFP陽(yáng)性菌被發(fā)現(xiàn) 附著到火雞組織滴蟲(chóng)的表面上（A-B，G-H;箭）并且由原生動(dòng)物包圍（C-F，箭頭）。比例尺， 2 μ m〇
[0068] 圖5顯示由于感染細(xì)菌單株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物體外世代295(HM+DH5 α P295)、 細(xì)菌單株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物體外世代20 (HM+DH5 α Ρ20)、異生火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物體外 世代20 (HM異生Ρ20)以及大腸桿菌DH5 α培養(yǎng)物（DH5 α )導(dǎo)致的火雞組織滴蟲(chóng)病的累積 死亡率。

【具體實(shí)施方式】
[0069] 實(shí)施例
[0070] 材料和方法
[0071] 1.火雞組織滴蟲(chóng)的培養(yǎng)
[0072] 使用了體外增殖的同一單真核培養(yǎng)物的兩個(gè)不同世代（10和290次）以及指定的 火雞組織滴蟲(chóng)土耳其/奧地利/2922-C6/04。最初，用來(lái)自死于組織滴蟲(chóng)病的火雞的約Ig盲 腸成分（content)以及刮離自盲腸壁的材料建立培養(yǎng)物。將材料置于含有Earle氏鹽、L-谷 氨醜胺、25mM HEPES 和 L-氨基酸（GibcoTM，Invitrogen)的 9ml Mediuml99 中。此外，力口 入 15%熱滅活的胎牛血清 FBS (GibcoTM，Invitrogen)和 Ilmg 大米淀粉（Sigma-Aldrich)。 如最近描述的，通過(guò)顯微操作和克隆寄生蟲(chóng)的體外增殖來(lái)生產(chǎn)單真核培養(yǎng)物（Hess等人， 2006)。在液氮中存儲(chǔ)后，將克隆的培養(yǎng)物解凍并用于本實(shí)驗(yàn)。含有15% FBS并且將大米淀 粉增加至20mg的相同Mediuml99用作火雞組織滴蟲(chóng)體外培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)。每2-3天通過(guò)將Iml 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有9ml新鮮介質(zhì)的新的無(wú)菌50ml管（Sarstedt)中進(jìn)行細(xì)胞傳代。
[0073] 2.異生克隆培養(yǎng)物中菌群的表征和殺滅
[0074] 為了進(jìn)行細(xì)菌學(xué)調(diào)查，異生培養(yǎng)物的等分試樣轉(zhuǎn)移到含有5%綿羊血的Schaedler 瓊脂（SCS)、補(bǔ)充有 5%綿羊血的 Columbia瓊脂（COS) (BioM6rieux)、MacConkey 瓊脂（McC) (LABM)和Coliform瓊脂（CF) (Merck)。在37°C，除SCS板以外的所有瓊脂板進(jìn)行24小時(shí)的 需氧孵育，SCS 板進(jìn)行厭氧孵育。按照 Bauer 等人（Am. J. Clin. Pathol. 45(1966)，493-496)， 使用所有分離的菌株進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試。使用如下的抗生素盤(pán)：氯霉素30 μ g、復(fù)方 新諾明25 μ g、二氟沙星10 μ g、恩諾沙星5 μ g、卡那霉素30 μ g、林可霉素15 μ g、馬波沙星 5 μ g、美羅培南10 μ g、新霉素30 μ g、利福平30 μ g、大觀霉素 IOOyg和鏈霉素25 μ g。敏 感性測(cè)試的結(jié)果用來(lái)選擇用于殺滅異生培養(yǎng)物中細(xì)菌的抗生素。
[0075] 為了制備鞭毛細(xì)胞將其用于建立具有單菌株的培養(yǎng)物，在室溫（RT)下以300 Xg 將IOml的異生培養(yǎng)物離心5分鐘，除去上清并將沉淀物重懸于9ml含有15% FBS的新鮮 Medium 199中。為了殺滅細(xì)菌，用多利培南50 μ g/ml、新霉素500 μ g/ml和利福平300 μ g/ ml的抗生素混合物在40°C對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行20小時(shí)的處理。孵育后，在室溫以300 Xg將細(xì) 胞懸液離心5分鐘。用補(bǔ)充有15% FBS的5ml新鮮Medium 199將細(xì)胞沉淀物洗滌三次，并 重懸于9ml新鮮介質(zhì)。
[0076] 3.細(xì)菌的破壞
[0077] PCR和在瓊脂板上計(jì)數(shù)菌落形成單位（cfu)被用來(lái)評(píng)估抗生素處理殺滅異生培養(yǎng) 物中菌群的效率。對(duì)于DNA的提取，使用Iml原始異生培養(yǎng)物的細(xì)胞材料、抗生素處理之前 和之后重懸的細(xì)胞沉淀物、或在3次洗滌步驟后重懸的細(xì)胞沉淀物。以500 Xg將樣本離心 5分鐘，除去上清后將沉淀物冷凍在-20°C。在RT將它們解凍，并重懸于200 μ I PBS中，以 便按照用于從動(dòng)物血液或細(xì)胞純化總DNA的規(guī)程（旋轉(zhuǎn)柱規(guī)程）使用lDNeasy?Ji液和組 織試劑盒（Qiagen)進(jìn)行DNA提取。
[0078] 用于擴(kuò)增部分小亞基核糖體RNA基因以用于PCR的引物對(duì)是：
[0079] Hmf 5, -GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3,（SEQ. ID. NO. 1)以及
[0080] Hmr 5' -GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3'（SEQ. ID. NO. 2)的對(duì)，其用于火雞組織滴蟲(chóng) 18S rRNA 基因 （Grabensteiner 等人，Parasitology 142 (2006)，223-230)，以及通用對(duì)
[0081] 16S F 5' -GGCGGCRKGCCTAAYACATGCAAGT-3'（SEQ. ID. NO. 3)以及
[0082] 16S R 5' -GACGACARCCATGCASCACCTGT-3'（SEQ. ID. NO. 4)，其用于細(xì)菌的 16S rRNA 基因 （Carroll 等人，J. Clin. Microbiol. 38 (2000)，1753-1757)。在 25 μ 1 反應(yīng)混合物中采 用 HotStarTaq Master Mix 試劑盒（Qiagen)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)混合物由 12. 5μ I HotStarTaq Master Mix、8 μ 1蒸饋水、1 μ 1正向引物、1 μ 1反向引物（所有引物以lOpmol/μ 1的濃度 使用）和2. 5 μ 1的DNA模板組成。在95°C進(jìn)行15分鐘的起始變性步驟之后，使用Biometra T3熱循環(huán)儀使反應(yīng)混合物進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的94°C下熱變性30秒、針對(duì)Hmf/Hmr在55°C下 和針對(duì)16S F/16S R在60°C下進(jìn)行1分鐘的引物退火、以及在72°C下進(jìn)行DNA延伸1.5分 鐘，接著是72°C下進(jìn)行10分鐘最終的延伸步驟。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。
[0083] 為了評(píng)估PCR結(jié)果，將分離自原始異生培養(yǎng)物的DNA的1:10的系列稀釋物作為模 板，使用引物對(duì)16S F/16S R以及適用于擴(kuò)增的程序，進(jìn)行半定量PCR。
[0084] 為了確定菌落形成單位，抗生素處理以及三個(gè)洗滌步驟后的100μ1培養(yǎng)材 料在COS (BioM6rieux)和CF瓊脂（Merck)上劃線。在37 °C，COS瓊脂板在微需氧 (microaerobically)以及CF瓊脂板在需氧條件下孵育24小時(shí)。
[0085] 4.用大腸桿菌DH5a和DH5apGFPuv建立單菌株培養(yǎng)物
[0086] 根據(jù)細(xì)胞懸液中鞭毛蟲(chóng)的數(shù)目，在20-30 μ I Medium 199的體積中總共有100個(gè) 火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞用于在無(wú)菌1.5ml Eppendorf管中接種單菌株培養(yǎng)物。用血球計(jì)數(shù)器計(jì) 數(shù)活的原生動(dòng)物。用等量的臺(tái)盼藍(lán)染料0.4% (Invitrogen)與樣本混合以區(qū)分活的和死的 細(xì)胞。
[0087] 對(duì)于和火雞組織滴蟲(chóng)的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，在9ml補(bǔ)充有15% FBS和20mg大米淀粉的 Medium 199中在37°C下，以225rpm振蕩，讓菌株大腸桿菌DH5 a (Invitrogen)和轉(zhuǎn)化有 pGFPuv載體的DH5 a (Clontech ;提供綠色熒光蛋白和Amp抗性的表達(dá)）生長(zhǎng)20小時(shí)至穩(wěn) 定期。加入新鮮的15% FBS、以及對(duì)于DH5 a而言加入抗生素萘啶酸100 μ g/ml和青霉素 G 100 μ g/ml、以及對(duì)于DH5 a pGFPuv而言加入萘啶酸100 μ g/ml和氨芐青霉素100 μ g/ml 之后，在I. 5ml Eppendorf管中將細(xì)菌培養(yǎng)物分成500 μ 1的等份。然后加入火雞組織滴蟲(chóng) 細(xì)胞。抗生素用來(lái)殺滅來(lái)自野生型盲腸菌群的殘留細(xì)菌，而不影響DH5 a和DH5 a pGFPuv 的生長(zhǎng)。在40°C將培養(yǎng)物孵育3天。通過(guò)顯微鏡檢查原生動(dòng)物的存在來(lái)監(jiān)測(cè)是否成功建 立單菌株培養(yǎng)物。通過(guò)將培養(yǎng)材料在COS (BioM6rieux)和CF瓊脂（Merck)上劃線檢測(cè)細(xì) 菌的存在。在37°C，COS瓊脂板在微需氧以及CF瓊脂板在需氧條件下孵育24小時(shí)。每 2-3天通過(guò)將100 μ 1舊培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有900 μ 1新鮮Medium 199的新無(wú)菌2. Oml Eppendorf管（Sarstedt)中使培養(yǎng)物傳代三次，其中Medium 199含有15% FBS、2mg大米 淀粉和抗生素萘啶酸100 μ g/ml以及青霉素 G 100 μ g/ml或者萘啶酸100 μ g/ml和氨芐青 霉素100 μ g/ml。每次2-3天通過(guò)將Iml的舊培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的含9ml新鮮介質(zhì)的無(wú) 菌50ml管（Sarstedt)中進(jìn)行隨后的傳代。
[0088] 5.用不同的菌株建立單菌株培養(yǎng)物
[0089] 為了以不同菌株產(chǎn)生單菌株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物，將IOml含有大腸桿菌DH5 α的 單菌株培養(yǎng)物，在40°C用抗生素混合物（多利培南50 μ g/ml、新霉素500 μ g/ml和利福平 300 μ g/ml)處理20小時(shí)。洗滌細(xì)胞沉淀物并制備細(xì)胞懸液后，在I. 5ml Eppendorf管中用 如上所述的100個(gè)火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞接種具有不同菌株的單菌株培養(yǎng)物。
[0090] 菌株產(chǎn)氣莢膜梭菌野生株P(guān)A10/2010 (內(nèi)部診斷編號(hào)，維也納獸醫(yī)大學(xué)，爬行動(dòng)物 和魚(yú)類醫(yī)學(xué)，禽類臨床部）、糞腸球菌ATCC29212、鼠傷寒血清型沙門(mén)氏菌ATCC14028、腸炎 血清型沙門(mén)氏菌ATCC13076、大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌野生株P(guān)A10/10643和綠 膿假單胞菌ATCC27853,在40°C在補(bǔ)充有15% FBS和20mg大米淀粉的9mlMedium 199中不 搖動(dòng)生長(zhǎng)20小時(shí)。在600nm測(cè)量光密度，如果需要的話，用補(bǔ)充有15% FBS的Medium 199 稀釋細(xì)菌懸液得到5 X IO8至9 X 10 8個(gè)細(xì)胞/ml范圍內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。加入新鮮的15% FBS之 后，在無(wú)菌I. 5ml Eppendorf管中將細(xì)菌培養(yǎng)物分成500 μ 1的等份，然后加入火雞組織滴 蟲(chóng)細(xì)胞。在40°C將培養(yǎng)物孵育3天。
[0091] 通過(guò)計(jì)數(shù)菌落形成單位（Cfu)確定共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)細(xì)菌的確切數(shù)目。針對(duì)產(chǎn)氣 莢膜梭菌在SCS瓊脂（BioM6rieu X)上，針對(duì)糞腸球菌、金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌在 COS瓊脂（Bi〇M6rieux)上，針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌在CF瓊脂（Merck)上，以 及針對(duì)大腸桿菌在McC瓊脂（LABM)上進(jìn)行細(xì)菌學(xué)調(diào)查。除了 SCS瓊脂板，所有板在37°C需 氧孵育24小時(shí)。SCS板在37°C厭氧孵育24小時(shí)。每2-3天通過(guò)將100 μ 1舊培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移 到一個(gè)含有900 μ 1新鮮Medium 199的新無(wú)菌2. Oml Eppendorf管（Sarstedt)中使培養(yǎng) 物傳代2次，其中Medium 199含有15% FBS和2mg大米淀粉。
[0092] 為了驗(yàn)證所有三個(gè)世代的單菌株性質(zhì)，用血球計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼藍(lán)染料0.4 % (Invitrogen)計(jì)數(shù)來(lái)自培養(yǎng)物的活火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞。為了進(jìn)行細(xì)菌學(xué)調(diào)查，用上述瓊脂 板計(jì)數(shù)菌落形成單位。每個(gè)生長(zhǎng)研究進(jìn)行四次一式五份。對(duì)于所有20個(gè)樣本的計(jì)數(shù)平均 值被用來(lái)評(píng)估原生動(dòng)物和細(xì)菌的生長(zhǎng)行為。SPSS程序用于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0093] 在培養(yǎng)物中富集細(xì)菌細(xì)胞的條件下，用產(chǎn)氣莢膜梭菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球 菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌進(jìn)行相同的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。在第一生長(zhǎng)期，持續(xù)3天，每24 小時(shí)將細(xì)菌細(xì)胞（200 μ IMedium 199中范圍從2 X IO8至5 X 10 8個(gè)細(xì)胞）添加到單菌株培 養(yǎng)物中。對(duì)于第二生長(zhǎng)期，將100 μ 1舊培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有900 μ 1適當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)物而非 新鮮Medium 199的新無(wú)菌2. Oml Eppendorf管（Sarstedt)中。對(duì)于第三生長(zhǎng)期，ΙΟΟμΙ 培養(yǎng)物傳代入補(bǔ)充有15 % FBS和2mg大米淀粉的900 μ 1新鮮Medium 199中。
[0094] 6.共聚焦激光顯微鏡
[0095] 用于共聚焦激光顯微鏡的樣本獲自IOml具有大腸桿菌DH5 a pGFPuv的火雞組織 滴蟲(chóng)培養(yǎng)物。用來(lái)自含100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂板額外的大腸桿菌DH5 a PGFPuv 接種2天齡的培養(yǎng)物，并在40°C孵育20小時(shí)。以2665 X g將培養(yǎng)物離心10分鐘，從而在介 質(zhì)中產(chǎn)生結(jié)合有大米淀粉的沉淀物。將沉淀物放置在活檢包埋盒中，于RT在3. 5%福爾馬 林中固定3小時(shí)，包埋于石錯(cuò)中并切成10 μ m的片。將切片放置在Superfrost Ultra Plus 玻片上（Menzel- GISser, Braunschweig,德國(guó)），在 Neoclear (Merck)中脫錯(cuò)，并在一系列的 梯度乙醇（100%、96%和70% )和蒸餾水中再水化。在補(bǔ)充有1. 5%過(guò)氧化氫的甲醇中將 玻片孵育30分鐘，在pH 7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)中洗滌20分鐘，并在潮濕室中于RT 在10%正常山羊血清中封閉1小時(shí)。除去血清并且將切片覆蓋上純化的多克隆兔抗組織滴 蟲(chóng)血清，I :10,000稀釋，并在潮濕室中在4°C孵育過(guò)夜。在PBS中洗滌后，在潮濕室中于RT 用I :500稀釋的偶聯(lián)有Alexa Fluor568的抗兔IgG(Invitrogen)孵育1小時(shí)，隨后在PBS 中洗滌并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Roche)染5分鐘。在PBS中再次洗滌切片， 之后用Aquatex(Merck)將玻片安裝在蓋玻片下。使用配備有Zeiss 510META激光掃描模 塊的Zeiss Axiovert 200M(Carl Zeiss,德國(guó)）拍攝共聚焦顯微圖像。用63χ/1· 4油浸物 鏡以1024Χ 1024的像素和(λ 318 μ m的ζ軸增益進(jìn)行圖像棧（stack)的掃描。使用Adobe Photoshop CS2 (Adobe Systems, San Jose, CA)調(diào)整最終圖像的亮度和對(duì)比度。
[0096] 7.用單菌株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
[0097] 在實(shí)驗(yàn)中，在禽舍中在厚墊草上在負(fù)壓下，飼養(yǎng)30只1日齡的火雞 (Converter, Hybrid Europe, Malgu6nac,法國(guó)）。每只鳥(niǎo)單獨(dú)標(biāo)有編號(hào)的標(biāo)簽（Swiftack?; Heartland Animal Health Inc. ,Fair Play, M0)。除了在感染之后即刻進(jìn)行的5小時(shí)飼料 限制期以外，飼料（商業(yè)火雞育雛料）和水隨意提供。
[0098] 倫理委員會(huì)討論并批準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，由奧地利法律給予許可（許可證號(hào) BMWF-68. 205/0256-BrGT/2005)〇
[0099] 產(chǎn)生具有大腸桿菌DH5 α的單菌株培養(yǎng)物之前，具有野生型菌群的異生培養(yǎng)物火 雞組織滴蟲(chóng)/ 土耳其/奧地利/2922-C6/04 (Hess等人，2006)體外培養(yǎng)10和290個(gè)世代。進(jìn) 一步在體外進(jìn)行10和5次傳代后（總共體外傳代20和295次），單菌株培養(yǎng)物用作感染的 接種物。此外，將異生火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的體外世代20以及大腸桿菌DH5a的過(guò)夜培養(yǎng) 物用作對(duì)照。為了進(jìn)行感染，在補(bǔ)充有15% FBS和0. 66mg大米淀粉的300 μ IMedium 199中 的IO4個(gè)原生動(dòng)物細(xì)胞、或者生長(zhǎng)在相同介質(zhì)中的300 μ 1細(xì)菌培養(yǎng)物，使用常規(guī)Eppendorf 移液器通過(guò)泄殖腔施用至鳥(niǎo)。
[0100] 實(shí)驗(yàn)設(shè)置有4個(gè)不同的組。組A和B分別含有10只感染有單菌株火雞組織滴蟲(chóng) 培養(yǎng)物體外世代295和世代20的鳥(niǎo)。作為對(duì)照，組C和D的每5只鳥(niǎo)中有一只分別感染有 異生培養(yǎng)物體外世代20和大腸桿菌DH5 a培養(yǎng)物。所有鳥(niǎo)在出生第14天接受接種。
[0101] 每天記錄臨床體征。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程（Hess等人，Avian Pathol. 35 (2006)，280-235 ( "Hess 等人，（2006b) "）感染后的第 0、2、5、9、12、16 和 19 天，獲取用于寄生蟲(chóng)體外再分離的泄殖腔拭子。在感染后的第〇、2和5天收集額外的泄殖 腔拭子，用于在CF瓊脂（Merck)上進(jìn)行細(xì)菌學(xué)調(diào)查。所有瓊脂板在37°C需氧孵育24小 時(shí)。解剖所有死亡或因嚴(yán)重疾病而需要安樂(lè)死或?qū)嶒?yàn)結(jié)束時(shí)被處死的火雞。篩選鳥(niǎo)的盲 腸和肝臟用于組織滴蟲(chóng)病的病理變化指標(biāo)。使用先前建立的病變?cè)u(píng)分來(lái)區(qū)分器官中發(fā)現(xiàn) 的病變嚴(yán)重程度（Windisch 等人，Paras. Immunol. 32 (2010) ,29-35 ;Zahoor 等人，Avian Dis. 55 (2011)，29-34)。使用感染有單菌株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物（組A的5只鳥(niǎo)和組B的 所有鳥(niǎo)）或者僅細(xì)菌培養(yǎng)物大腸桿菌DH5 α (組D的3只鳥(niǎo)）的火雞的盲腸和肝臟進(jìn)行細(xì) 菌學(xué)調(diào)查。來(lái)自器官的組織材料劃線到不同的瓊脂板上。CF(Merck)和McC瓊脂板（LABM) 在37°C需氧孵育24小時(shí)，而SCS瓊脂板（BioM6rieu X)在37°C厭氧孵育24小時(shí)。
[0102] 結(jié)果
[0103] 1.野生型菌群的交換以及提供具有大腸桿菌DH5ci的單菌株培養(yǎng)物
[0104] 為了產(chǎn)生火雞組織滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物，需要表征異生培養(yǎng)物中的菌群。原始異 生培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)目為IO 9個(gè)細(xì)菌/ml，以及大腸桿菌、鏈球菌屬和變形桿菌屬在瓊脂板上 分離。易感性測(cè)試表明，菌株對(duì)除美羅培南、新霉素和利福平以外的大多數(shù)抗生素具有抗 性，所以這些抗生素進(jìn)一步用于提供單菌株培養(yǎng)物。多利培南也用在制劑中，因?yàn)槎嗬?南也屬于碳青霉烯類的組并且作用非常類似于美羅培南。對(duì)各種濃度的多利培南（20至 50 μ g/ml)、新霉素（50至500 μ g/ml)和利福平（200至300 μ g/ml)進(jìn)行了殺滅菌群測(cè)試。 用多利培南50 μ g/ml、新霉素500 μ g/ml和利福平300 μ g/ml的混合物獲得殺滅大多數(shù)細(xì) 菌但是保持原生動(dòng)物細(xì)胞存活的最好結(jié)果?？股靥幚砗拖礈旌蟮木湫纬蓡挝唬╟fu)計(jì) 數(shù)表明在瓊脂板上生長(zhǎng)少量（120個(gè)細(xì)菌/ml)大腸桿菌和變形桿菌屬單菌落。用引物對(duì) Hmf/Hmr進(jìn)行的PCR證實(shí)火雞組織滴蟲(chóng)仍然存在于細(xì)胞懸液中（圖1)。用引物對(duì)16S F/16S R進(jìn)行的PCR顯示細(xì)菌DNA的減少，并且這一發(fā)現(xiàn)得到半定量PCR結(jié)果的支持。如瓊脂板上 所顯示的，單菌株培養(yǎng)物的生產(chǎn)期間加入抗生素萘啶酸和青霉素 G導(dǎo)致殘留菌群的完全消 除。大腸桿菌DH5ci仍然存在于單菌株培養(yǎng)物中，并能根據(jù)IacZ基因特定部分的刪除通過(guò) 大腸桿菌DH5a的生長(zhǎng)行為得以鑒定。成功建立單菌株培養(yǎng)物并且從2. Oml Eppendorf?管 轉(zhuǎn)移到50ml的管中后，在隨后的世代中同大腸桿菌DH5 a -起生長(zhǎng)的原生動(dòng)物細(xì)胞的數(shù)目 與異生培養(yǎng)物中的數(shù)目（大約50X 104細(xì)胞/ml)相當(dāng)，而無(wú)論世代水平如何。
[0105] 2.具有不同菌株的單菌株培養(yǎng)物中火雞組織滴蟲(chóng)的生長(zhǎng)
[0106] 提供火雞組織滴蟲(chóng)連同各種菌株的單菌株培養(yǎng)物后，使用血球計(jì)數(shù)器顯微研究活 原生動(dòng)物細(xì)胞的存在。
[0107] 樣本含火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞的最高數(shù)目見(jiàn)于和大腸桿菌共同孵育的培養(yǎng)物中（30% 至45% )、隨后是鼠傷寒沙門(mén)氏菌（5 %至20% )和綠膿假單胞菌（10% )的（圖2A)。在 和腸炎沙門(mén)氏菌的單菌株培養(yǎng)物中，原生動(dòng)物細(xì)胞只能在第一世代（5% )后檢測(cè)到，以及 在和產(chǎn)氣莢膜梭菌的單菌株培養(yǎng)物中，只能在第三世代（10% )后檢測(cè)到。在含有糞腸球菌 或金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物細(xì)胞。在和綠膿假單胞菌的單菌株培養(yǎng) 物中計(jì)數(shù)到鞭毛蟲(chóng)的最高細(xì)胞數(shù)目，高達(dá)61 X IO4細(xì)胞/ml (圖2B)。在具有大腸桿菌和鼠 傷寒沙門(mén)氏菌的培養(yǎng)物中，原生動(dòng)物的細(xì)胞數(shù)目幾乎相同，分別高達(dá)19. 4X IO4細(xì)胞/ml和 16. 6X IO4細(xì)胞/ml。
[0108] 在第二組實(shí)驗(yàn)中，富集細(xì)菌細(xì)胞之后，在和產(chǎn)氣莢膜梭菌、糞腸球菌、金黃色葡萄 球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌的單菌株培養(yǎng)物中分析了火雞組織滴蟲(chóng)的生長(zhǎng)。幾 乎所有和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物（80%至86. 7% )含有原生動(dòng)物細(xì)胞（圖2A)。根據(jù) 世代數(shù)，和鼠傷寒沙門(mén)氏菌或腸炎沙門(mén)氏菌共孵育的樣本中26. 7 %至66. 7 %以及6. 7 %至 53. 3%發(fā)現(xiàn)為陽(yáng)性。在任何與產(chǎn)氣莢膜梭菌和糞腸球菌的培養(yǎng)物中沒(méi)有檢測(cè)到火雞組織滴 蟲(chóng)細(xì)胞。在與鼠傷寒沙門(mén)氏菌的單菌株培養(yǎng)物中計(jì)數(shù)到高達(dá)20X IO4原生動(dòng)物細(xì)胞/ml，以 及在與腸炎沙門(mén)氏菌的培養(yǎng)物中高達(dá)12. 6X IO4細(xì)胞/ml (圖2B)。與金黃色葡萄球菌的培 養(yǎng)物中鞭毛蟲(chóng)細(xì)胞的最大數(shù)目為9. 8 X IO4細(xì)胞/ml。
[0109] 在和火雞組織滴蟲(chóng)的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)以及3天孵育期之后，通過(guò)計(jì)數(shù)菌落形成 單位（cfu)確定單菌株培養(yǎng)物中的細(xì)菌數(shù)目。對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌，達(dá)到細(xì)菌的最高增多， 其次是綠膿假單胞菌和大腸桿菌（圖3A)。孵育期間，對(duì)于腸炎沙門(mén)氏菌、糞腸球菌、金黃色 葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的細(xì)胞數(shù)目大致保持穩(wěn)定。從一開(kāi)始，單菌株培養(yǎng)物中金黃色葡 萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的細(xì)胞數(shù)目低于其它菌株的細(xì)胞數(shù)目，因?yàn)檫@些細(xì)菌在火雞組織滴 蟲(chóng)的最佳體外生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)不良。對(duì)于這兩種菌株，以可用的最高數(shù)目的細(xì)胞開(kāi)始共培 養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。單菌株培養(yǎng)物中富集細(xì)菌之后，鼠傷寒沙門(mén)氏菌是唯一數(shù)目隨時(shí)間而增加的細(xì)菌 (圖3B)。腸炎沙門(mén)氏菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)目或多或少地強(qiáng) 烈降低。
[0110] 3.共聚焦熒光顯微鏡
[0111] 共聚焦熒光顯微鏡被用來(lái)研究在火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞中大腸桿菌DH5apGFPuv的 存在，并研究其在原生動(dòng)物內(nèi)的分布。發(fā)現(xiàn)表達(dá)GFP的細(xì)菌附著于火雞組織滴蟲(chóng)表面，并被 鞭毛蟲(chóng)包圍（圖4)。原生動(dòng)物內(nèi)以及在培養(yǎng)基中，DAPI染色火雞組織滴蟲(chóng)的核，以及很多 細(xì)長(zhǎng)的輪廓對(duì)應(yīng)著細(xì)菌DNA。一些DAPI陽(yáng)性細(xì)菌缺乏GFP信號(hào)，這是因?yàn)榫G色熒光蛋白的 穩(wěn)定性有限。
[0112] 4.用單菌株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
[0113] 死亡的或者由于組織滴蟲(chóng)病需要安樂(lè)死的火雞的累積死亡率示于圖5中。組B的 兩只鳥(niǎo)由于同類相食在感染后第2和3天死亡，而被排除在分析之外。感染有單菌株火雞 組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物體外世代20的組B中所有剩余的鳥(niǎo)，以及感染有異生火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物 體外世代20的組C中所有鳥(niǎo)，顯示出組織滴蟲(chóng)病臨床癥狀，比如堅(jiān)起羽毛、嗜睡和硫磺色的 腹瀉。在臨床癥狀的出現(xiàn)和死亡率方面，組B和組C之間大約有一周的延遲。來(lái)自這兩個(gè) 組的死于組織滴蟲(chóng)病的所有鳥(niǎo)的尸檢顯示出盲腸和肝臟的嚴(yán)重破壞，其中最高病變?cè)u(píng)分為 4。研究過(guò)程中組A和D中沒(méi)有火雞顯示出任何臨床癥狀。感染后5周在實(shí)驗(yàn)后期將它們 處死。尸檢時(shí)，感染有單菌株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物體外世代295的組A中的10只鳥(niǎo)有4只 顯示出盲腸壁的零星增厚（病變?cè)u(píng)分1)，以及一只鳥(niǎo)具有兩個(gè)盲腸壁均強(qiáng)烈增厚（病變?cè)u(píng) 分3)。其它5只鳥(niǎo)都沒(méi)有顯示任何盲腸發(fā)炎癥狀（病變?cè)u(píng)分0)。此外，所有鳥(niǎo)的肝臟均正 常（病變?cè)u(píng)分〇)。來(lái)自感染有大腸桿菌DH5 α培養(yǎng)物的組D中的鳥(niǎo)的盲腸和肝臟沒(méi)有顯示 任何臨床異常（病變?cè)u(píng)分〇)。
[0114] 活的原生動(dòng)物細(xì)胞重新分離自感染有特定火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的各組不同火雞。 正如預(yù)期的那樣，來(lái)自對(duì)照組D的鳥(niǎo)的所有樣本仍為陰性。
[0115] 在感染后第0天、2和5天取樣的泄殖腔拭子在CF瓊脂上的細(xì)菌學(xué)調(diào)查顯示野生 型大腸桿菌和枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter sp.)的存在，但是未見(jiàn)大腸桿菌DH5a。此外， 從取自火雞盲腸和肝臟的材料無(wú)法分離出大腸桿菌DH5 a，其中火雞感染有單菌株火雞組 織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物或細(xì)菌培養(yǎng)物大腸桿菌DH5 a。然而，除了野生型大腸桿菌，在受試所有鳥(niǎo)的 盲腸中觀察到球菌菌株。綠膿假單胞菌見(jiàn)于感染有單菌株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物體外世代 20(組B)的兩只鳥(niǎo)的盲腸中，以及在另一只鳥(niǎo)的盲腸中檢測(cè)到產(chǎn)氣莢膜梭菌。肝臟的細(xì)菌 學(xué)調(diào)查顯示在受試所有鳥(niǎo)中存在球菌菌株。此外，來(lái)自組B鳥(niǎo)的肝臟樣本中的62. 5%可以 分離到野生型大腸桿菌。
[0116] 討論
[0117] 自上世紀(jì)初已在體外培養(yǎng)火雞組織滴蟲(chóng)。已使用多種培養(yǎng)基和條件，但只有來(lái)自 分離自盲腸的糞便材料的某些活細(xì)菌存在于培養(yǎng)物中時(shí)，才支持良好且快速的生長(zhǎng)（如 Hauck等人，2010)。因?yàn)樵谝号葜幸灿^察到這些細(xì)菌，因此假設(shè)它們作為鞭毛蟲(chóng)的食物。 火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞的電子顯微鏡檢查也表明通過(guò)原生動(dòng)物的吞噬作用攝入細(xì)菌（Mazet等 人，Int. J. ParasitoL 38 (2008)，177-190)。在本申請(qǐng)中報(bào)道的，有大腸桿菌 DH5 a pGFPuv 的火雞組織滴蟲(chóng)生長(zhǎng)的共聚焦激光顯微鏡分析清楚地證實(shí)了原生動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存在， 并表明大腸桿菌是待摻入的菌株之一。
[0118] 在本調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌最強(qiáng)烈地促進(jìn)原生動(dòng)物的生長(zhǎng)，其次是鼠傷寒沙門(mén) 氏菌。大腸桿菌的積極作用與先前的研究一致。Goedbloed等人（1962)中描述火雞 組織滴蟲(chóng)從死于組織滴蟲(chóng)病的火雞新鮮肝臟材料成功轉(zhuǎn)移到預(yù)先接種有活大腸桿菌的 Boeck-Drbohlav和Dobell-Laidlaw培養(yǎng)介質(zhì)。埃希氏桿菌屬和沙門(mén)氏菌屬屬于腸桿菌科 并且是革蘭氏陰性、兼性厭氧、棒狀細(xì)菌，其利用需氧或厭氧呼吸以獲得能量。在厭氧條件 下和不存在最終電子受體時(shí)，通過(guò)發(fā)酵驅(qū)動(dòng)它們的生長(zhǎng)。因此，實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)火雞組織滴蟲(chóng) 生長(zhǎng)的積極影響的一個(gè)原因就是細(xì)菌的快速分裂，從而產(chǎn)生原生動(dòng)物消化的細(xì)胞材料。此 夕卜，細(xì)菌有效消耗培養(yǎng)管中的氧氣。因此，它們改善火雞組織滴蟲(chóng)厭氧代謝的條件，這是至 關(guān)重要的，因?yàn)榛痣u組織滴蟲(chóng)是一種厭氧鞭毛蟲(chóng)并且它的生長(zhǎng)被氧氣抑制。
[0119] 有趣的是，在促進(jìn)火雞組織滴蟲(chóng)生長(zhǎng)方面，腸炎沙門(mén)氏菌不如鼠傷寒沙門(mén)氏菌。 這種發(fā)現(xiàn)的一種解釋是腸炎沙門(mén)氏菌在所用條件下較低的生長(zhǎng)速度。先前已經(jīng)表明，該 屬的腸道原生動(dòng)物納氏蟲(chóng)屬（Naegleria)、棘阿米巴屬（Acanthamoeba)和哈氏變形蟲(chóng)屬 (Hartmanella)在各種腸道沙門(mén)氏菌血清型之間從抗原角度而言是不同的，導(dǎo)致對(duì)獵食的 區(qū)分和選擇。
[0120] 綠膿假單胞菌是假單胞菌科的革蘭氏陰性、兼性厭氧、棒狀的細(xì)菌。它通常被描述 為喜歡需氧生長(zhǎng)條件，但在氧限制性條件下它可以使用厭氧呼吸或發(fā)酵來(lái)獲得能量。盡管 能量代謝和大腸桿菌類似并且生長(zhǎng)速度快，在和綠膿假單胞菌的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中只有10%的 樣本呈火雞組織滴蟲(chóng)陽(yáng)性。一種解釋是綠膿假單胞菌形成生物膜的能力，這可能會(huì)妨礙支 持效果。用鞭毛蟲(chóng)鼻吻滴蟲(chóng)（Rhynchomonas nasuta)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示鞭毛蟲(chóng)誘導(dǎo)的細(xì)菌生 物膜中小菌落的形成，這使原核細(xì)胞能夠抵抗原生動(dòng)物的捕食（grazing)。
[0121] 當(dāng)金黃色葡萄球菌被用于共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，只可能在富集細(xì)菌細(xì)胞之后建立細(xì)菌單 株培養(yǎng)物。金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌科。球菌革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌是兼性厭氧的，并且其 能量代謝基于有氧或無(wú)氧呼吸。因此，它滿足在培養(yǎng)管中降低氧水平的要求。孵育期間向 樣本加入新鮮細(xì)菌來(lái)補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)菌的低生長(zhǎng)速度并支持單菌株培養(yǎng)物中鞭毛蟲(chóng)的 生長(zhǎng)。也需要牢記的是，單個(gè)大腸桿菌的大小是金黃色葡萄球菌細(xì)胞的高達(dá)10倍，所以需 要大量金黃色葡萄球菌細(xì)胞滿足原生動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需要。
[0122] 兩種細(xì)菌產(chǎn)氣莢膜梭菌和糞腸球菌是革蘭氏陽(yáng)性的、分別是厭氧或兼性厭氧、梭 菌科和腸球菌科的原核生物，其能量代謝取決于發(fā)酵。因此，它們不消耗培養(yǎng)管中的氧氣， 并且不能支持火雞組織滴蟲(chóng)的生長(zhǎng)。第三次傳代之后，在與產(chǎn)氣莢膜梭菌的共培養(yǎng)物中見(jiàn) 到少量的細(xì)菌單株火雞組織滴蟲(chóng)，可以解釋為此菌株所用的發(fā)酵模式。在丁酸發(fā)酵期間，產(chǎn) 生二氧化碳，并可以在培養(yǎng)物中替換一些氧氣，從而使條件更少需氧。然而，替換僅在低水 平時(shí)起作用，在共培養(yǎng)物中產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)不良，因?yàn)樗且环N專性厭氧菌。相比之下， 糞腸球菌（一種耐氧厭氧菌）生長(zhǎng)得更好。這種細(xì)菌利用同型乳酸發(fā)酵將葡萄糖轉(zhuǎn)換成乳 酸以產(chǎn)生能量，而無(wú)需生成二氧化碳。因此，培養(yǎng)物中的氧水平保持不變，這解釋了為什么 火雞組織滴蟲(chóng)沒(méi)有在這種細(xì)菌單株培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。
[0123] 用不同的菌株成功建立細(xì)菌單株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物后，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)調(diào)查大 腸桿菌DH5ci對(duì)鞭毛蟲(chóng)致病性的影響。接受異生或細(xì)菌單株火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物體外傳 代20次的所有鳥(niǎo)都死亡了或者因組織滴蟲(chóng)病而被安樂(lè)死。尸檢顯示嚴(yán)重的炎癥以及盲腸 和肝臟壞死，這顯示了最高病變?cè)u(píng)分。感染有體外僅傳了幾代的寄生蟲(chóng)后的鳥(niǎo)隨后染上 (contract)臨床癥狀，這一事實(shí)與之前的實(shí)驗(yàn)相符（Hess等人，（2006b) ;Hess等人，2008)。 Goedbloed等人（1962)也表示感染有同大腸桿菌一起生長(zhǎng)的火雞組織滴蟲(chóng)的細(xì)菌單株培 養(yǎng)物的火雞染上組織滴蟲(chóng)病。此外，存在一種明確的菌株比如內(nèi)臟中的大腸桿菌或中間性 大腸桿菌（Escherichia intermedia)對(duì)于原始動(dòng)物表達(dá)其傳染性和致病性是有效的。相 反，用無(wú)菌火雞以及無(wú)菌盲腸的火雞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，在腸道中尤其在盲腸中存在細(xì)菌對(duì) 于產(chǎn)生組織滴蟲(chóng)病是必要的。
[0124] 比較感染有細(xì)菌單株或者火雞組織滴蟲(chóng)異生培養(yǎng)物的組中的鳥(niǎo)，注意到臨床癥狀 的出現(xiàn)和死亡大約1周的延遲，兩者都傳代時(shí)間較短?？梢约僭O(shè)存在于異生培養(yǎng)物中的細(xì) 菌類似于實(shí)驗(yàn)中所用火雞的腸道菌群。此外，相較于細(xì)菌單株培養(yǎng)物，異生火雞組織滴蟲(chóng)培 養(yǎng)物包含大量細(xì)菌細(xì)胞，因?yàn)榇竽c桿菌DH5a在這些條件下生長(zhǎng)效率較低。其結(jié)果是，火雞 組織滴蟲(chóng)在感染有異生培養(yǎng)物的鳥(niǎo)的腸道中或多或少地具有了更好的生長(zhǎng)條件。接種物中 的大量細(xì)菌細(xì)胞以及原生動(dòng)物對(duì)這些野生型細(xì)菌的適應(yīng)使它們能夠更快增殖，而產(chǎn)生所預(yù) 期的后果。
[0125] 大腸桿菌DH5 a在宿主中不復(fù)制，因?yàn)樗诟腥竞髲奈粗匦路蛛x。此外，當(dāng)火雞僅 感染細(xì)菌培養(yǎng)物時(shí)，沒(méi)有觀察到臨床效果。
[0126] 盡管鳥(niǎo)被一直維持到感染后5周，感染有體外傳代295次的單菌株火雞組織滴蟲(chóng) 培養(yǎng)物的火雞都沒(méi)有顯示任何臨床癥狀。驗(yàn)尸調(diào)查期間，在一些盲腸中注意到一些細(xì)微的 變化，而肝臟中沒(méi)有看出病變。這些發(fā)現(xiàn)與以前的研究相符（如Liebhart等人，2011)。
[0127] 感染了細(xì)菌單株培養(yǎng)物的火雞的盲腸和肝臟細(xì)菌學(xué)調(diào)查表明，原生動(dòng)物感染可能 促進(jìn)肝臟感染上大腸桿菌，可能是由于腸粘膜的滲透性提高。最近報(bào)道在天然感染的鳥(niǎo)中 組織滴蟲(chóng)病和大腸桿菌感染之間的相互作用，其中一些文獻(xiàn)傾向于認(rèn)為大腸桿菌誘導(dǎo)大腸 桿菌病。出人意料的是，Goedbloed等人（1962)在通過(guò)直腸、肝內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑感染這種 細(xì)菌單株培養(yǎng)物的鳥(niǎo)的肝臟中，沒(méi)有檢測(cè)到大腸桿菌。
[0128] 總之，在本申請(qǐng)中，從含有排泄物菌群的兩個(gè)不同世代的火雞組織滴蟲(chóng)克隆異生 培養(yǎng)物建立了細(xì)菌單株培養(yǎng)物。由于細(xì)菌交換為大腸桿菌DH5a不影響火雞組織滴蟲(chóng)的致 病性，培養(yǎng)物看起來(lái)不僅非常適于調(diào)查火雞組織滴蟲(chóng)的某些生物學(xué)方面和體外減毒的基本 機(jī)制，還是提供用來(lái)預(yù)防感染火雞組織滴蟲(chóng)所致疾病的疫苗制劑的極好材料。
[0129] 優(yōu)選的實(shí)施方式
[0130] 本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式如下定義：
[0131] 1. -種用于生產(chǎn)火雞組織滴蟲(chóng)（H. meleagridis)單菌株培養(yǎng)物的方法，其特征在 于以下步驟：
[0132] (a)提供包含火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞和野生型菌群的火雞組織滴蟲(chóng)的異生培養(yǎng)物，
[0133] (b)用抗生素混合物處理異生培養(yǎng)物，從而殺滅野生型菌群，
[0134] (C)離心并洗滌火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞，
[0135] (d)控制步驟（b)的有效性，
[0136] (e)重懸洗滌的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞，
[0137] (f)向重懸的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞中添加一種或多種單菌株，以及
[0138] (g)將一種或多種單菌株和重懸的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞一起培養(yǎng)以便獲得火雞組織 滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物。
[0139] 2、根據(jù)實(shí)施方式1所述的方法，其中所述火雞組織滴蟲(chóng)的異生培養(yǎng)物是火雞組織 滴蟲(chóng)的克隆培養(yǎng)物，優(yōu)選通過(guò)火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的顯微操作所建立的克隆培養(yǎng)物。
[0140] 3、根據(jù)實(shí)施方式1或2中所述的方法，其中所述抗生素混合物包含至少三種不同 的抗生素，優(yōu)選多利培南、新霉素和利福平的混合物。
[0141] 4、根據(jù)實(shí)施方式1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)在步驟（b)或（c)之后確 定菌落形成單位來(lái)進(jìn)行步驟（d)，以及其中還優(yōu)選，如果野生型菌群沒(méi)有完全從火雞組織滴 蟲(chóng)細(xì)胞中除去，則重復(fù)步驟（d)。
[0142] 5、根據(jù)實(shí)施方式1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（f)中添加選自如下的 一種或多種菌株的單菌株培養(yǎng)物：大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和/或綠膿假單胞菌。
[0143] 6、根據(jù)實(shí)施方式1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（f)中添加選自如下 的一種或多種菌株的單菌株培養(yǎng)物：梭菌屬，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌，尤其是產(chǎn)氣莢膜梭菌野 生株P(guān)A10/2010 ;腸球菌屬，優(yōu)選糞腸球菌，尤其是糞腸球菌ATCC29212 ;沙門(mén)氏菌屬，優(yōu)選 鼠傷寒血清型沙門(mén)氏菌，尤其是鼠傷寒血清型沙門(mén)氏菌ATCC14028 ;沙門(mén)氏菌屬，優(yōu)選腸 炎血清型沙門(mén)氏菌，尤其是腸炎血清型沙門(mén)氏菌ATCC13076 ;大腸桿菌，尤其是大腸桿菌 ATCC25922、大腸桿菌DH5 α或者轉(zhuǎn)化有載體pGFPuv的大腸桿菌；葡萄球菌屬，優(yōu)選金黃色 葡萄球菌，尤其是金黃色葡萄球菌野生株P(guān)A10/10643和/或假單胞菌屬，優(yōu)選綠膿假單胞 菌，尤其是綠膿假單胞菌ATCC27853。
[0144] 7、根據(jù)實(shí)施方式1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞保持在培養(yǎng) 基中，培養(yǎng)基含有胎牛血清，優(yōu)選還含有緩沖液、氨基酸和碳水化合物源，尤其是淀粉。
[0145] 8、根據(jù)實(shí)施方式1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述火雞組織滴蟲(chóng)的異生培養(yǎng) 物是減毒的火雞組織滴蟲(chóng)，優(yōu)選減毒的火雞組織滴蟲(chóng)克隆培養(yǎng)物，尤其是火雞組織滴蟲(chóng)土 耳其/奧地利/2922-C6/04。
[0146] 9、根據(jù)實(shí)施方式1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)如下步驟將步驟（f)中添 加的一種或多種單菌株替換為一種或多種其它單菌株：
[0147] (h)用抗生素或抗生素混合物處理步驟（g)中獲得的火雞組織滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng) 物從而殺滅步驟（f)中添加的菌株，其中所述抗生素或抗生素混合物特異性殺滅步驟（f) 中添加的一種或多種單菌株，
[0148] (i)離心、洗滌并重懸火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞，
[0149] (j)向重懸的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞中添加一種或多種單菌株，以及
[0150] (k)將一種或多種單菌株和重懸的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞一起培養(yǎng)以便獲得火雞組織 滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物。
[0151] 10、根據(jù)實(shí)施方式1至9任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（j)中添加選自如下的一 種或多種菌株的單菌株培養(yǎng)物：產(chǎn)氣莢膜梭菌野生株P(guān)A10/2010、糞腸球菌ATCC29212、鼠 傷寒血清型沙門(mén)氏菌八了0：14028、腸炎血清型沙門(mén)氏菌4了0：13076、大腸桿菌4了0：25922、金 黃色葡萄球菌野生株P(guān)A10/10643和/或綠膿假單胞菌ATCC27853。
[0152] 11、根據(jù)實(shí)施方式1至10中的任一項(xiàng)所述的方法，其中分析步驟（a)中提供的異 生培養(yǎng)物的細(xì)菌組成，優(yōu)選通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)試尤其是確定菌落形成單位，或通過(guò)采用分子 生物學(xué)方法，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)。
[0153] 12、根據(jù)實(shí)施方式1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中以5至500、優(yōu)選10至100、 尤其是30至70 μ g/ml多利培南，50至5000、優(yōu)選100至1000、尤其是300至700 μ g/ml新 霉素以及30至3000、優(yōu)選50至1500、尤是100至500 μ g/ml利福平的濃度應(yīng)用步驟（b) 中的抗生素混合物。
[0154] 13、根據(jù)實(shí)施方式1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟（b)中的抗生素混合物 包含至少兩種，優(yōu)選至少三種選自如下的抗生素：氯霉素、復(fù)方新諾明、二氟沙星、多利培 南、恩諾沙星、卡那霉素、林可霉素、馬波沙星、美羅培南、新霉素、利福平、大觀霉素和鏈霉 素。
[0155] 14、根據(jù)實(shí)施方式1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少步驟（g)和任選步驟（k) 在35至45 °C，優(yōu)選38至42 °C的溫度下進(jìn)行。
[0156] 15、根據(jù)實(shí)施方式1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟（b)和任選步驟（h)在 35至45 °C，優(yōu)選38至42 °C的溫度下進(jìn)行。
[0157] 16、根據(jù)實(shí)施方式1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟（b)和任選步驟（h)進(jìn) 行至少1小時(shí)，優(yōu)選至少5小時(shí)，尤其至少10小時(shí)。
[0158] 17、根據(jù)實(shí)施方式1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中單菌株是兼性厭氧或需氧菌 株。
[0159] 18、根據(jù)實(shí)施方式1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟（f)中添加的單菌株是 遺傳修飾的菌株.
[0160] 19、根據(jù)實(shí)施方式9至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟（j)中添加的單菌株是 未經(jīng)遺傳修飾的菌株。
[0161] 20、根據(jù)實(shí)施方式1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中用培養(yǎng)溶液進(jìn)行洗滌步驟。
[0162] 21、一種疫苗制劑，其由如下組成：
[0163] -組織滴蟲(chóng)成分，其由減毒的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物組成，
[0164] -細(xì)菌成分，其由一種或多種單菌株培養(yǎng)物組成，以及
[0165] -藥學(xué)上可接受的非生物制劑化合物。
[0166] 22、根據(jù)實(shí)施方式21所述的疫苗制劑，其中組織滴蟲(chóng)成分和細(xì)菌成分是作為火雞 組織滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物而提供的，尤其是作為根據(jù)實(shí)施方式1至20中的任一項(xiàng)可獲得的 火雞組織滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物而提供的。
[0167] 23、根據(jù)實(shí)施方式21或22所述的疫苗制劑，其中細(xì)菌成分含有一種單菌株 培養(yǎng)物，優(yōu)選選自如下的菌株：梭菌屬，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌，尤其是產(chǎn)氣莢膜梭菌野生 株P(guān)A10/2010 ;腸球菌屬，優(yōu)選糞腸球菌，尤其是糞腸球菌ATCC29212 ;沙門(mén)氏菌屬，優(yōu)選 鼠傷寒血清型沙門(mén)氏菌，尤其是鼠傷寒血清型沙門(mén)氏菌ATCC14028 ;沙門(mén)氏菌屬，優(yōu)選腸 炎血清型沙門(mén)氏菌，尤其是腸炎血清型沙門(mén)氏菌ATCC13076 ;大腸桿菌，尤其是大腸桿菌 ATCC25922 ;葡萄球菌屬，優(yōu)選金黃色葡萄球菌，尤其是金黃色葡萄球菌野生株P(guān)A10/10643 和/或假單胞菌屬，優(yōu)選綠膿假單胞菌，尤其是綠膿假單胞菌ATCC27853。
[0168] 24、根據(jù)實(shí)施方式21至23中任一項(xiàng)所述的疫苗制劑，其中減毒的火雞組織滴蟲(chóng)是 減毒的火雞組織滴蟲(chóng)克隆培養(yǎng)物，尤其是火雞組織滴蟲(chóng)土耳其/奧地利/2922-C6/04。
[0169] 25、根據(jù)實(shí)施方式21至24中任一項(xiàng)所述的疫苗制劑，其中所述制劑用于預(yù)防組織 滴蟲(chóng)病，優(yōu)選在禽，尤其是火雞和雞當(dāng)中，以及在獵禽，尤其是山雞、鷓鴣、珍珠雞和鵪鶉當(dāng) 中。
[0170] 26、根據(jù)實(shí)施方式21至25中任一項(xiàng)所述的疫苗制劑，其中藥學(xué)上可接受的非生物 制劑化合物是緩沖液、佐劑尤其氫氧化鋁、防腐劑、填充劑、穩(wěn)定劑、營(yíng)養(yǎng)物、或其組合。
[0171] 27、根據(jù)實(shí)施方式21至24中任一項(xiàng)所述的疫苗制劑，其中制劑是片劑尤其包衣片 齊?、膠囊劑、油包水乳液、食品、噴霧制劑、液體制劑尤其是飲用水添加劑、可注射制劑尤其 是已經(jīng)包裝在注射器中的可注射制劑、作為凝膠、作為凝膠墊、或其組合。
[0172] 28、根據(jù)實(shí)施方式21至27中任一項(xiàng)所述的疫苗制劑，其中一種或多種單菌株培養(yǎng) 物是減毒的致病性菌株的單株，優(yōu)選減毒的單一腸炎沙門(mén)氏菌和/或鼠傷寒沙門(mén)氏菌株。
[0173] 29、根據(jù)實(shí)施方式21至28中任一項(xiàng)所述的疫苗制劑，其中制劑含有IX IO2至 IX 1〇6,優(yōu)選IX IO3至5 X 10 5,尤其是5 X IO3至IX 10 5火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞火雞組織滴蟲(chóng)細(xì) 胞和/或I X IO5至I X 10 η，優(yōu)選I X IO7至5 X 10 1(1，尤其是5 X IO7至I X 10 1(1細(xì)菌細(xì)胞。
[0174] 30、根據(jù)實(shí)施方式21至29中任一項(xiàng)所述的疫苗制劑，其中疫苗制劑配制成劑量形 式。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于生產(chǎn)火雞組織滴蟲(chóng)化.meleagridis)單菌株培養(yǎng)物的方法，該方法的特征 在于W下步驟： (a)提供包含火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞和野生型菌群的火雞組織滴蟲(chóng)的異生培養(yǎng)物， 化）用抗生素混合物處理異生培養(yǎng)物，從而殺滅野生型菌群， (C)離也并洗涂火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞， (d) 控制步驟化）的有效性， (e) 重息洗涂的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞， (f) 向重息的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞中添加一種或多種單菌株，W及 (g) 將一種或多種單菌株和重息的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞一起培養(yǎng)W便獲得火雞組織滴蟲(chóng) 的單菌株培養(yǎng)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述火雞組織滴蟲(chóng)的異生培養(yǎng)物是火雞組織滴蟲(chóng) 的克隆培養(yǎng)物，優(yōu)選通過(guò)火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物的顯微操作所建立的克隆培養(yǎng)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述抗生素混合物包含至少H種不同的抗生 素，優(yōu)選多利培南、新霉素和利福平的混合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)在步驟化）或（C)之后確定菌 落形成單位來(lái)進(jìn)行步驟（d)，W及其中還優(yōu)選，如果野生型菌群沒(méi)有完全從火雞組織滴蟲(chóng)細(xì) 胞中除去，則重復(fù)步驟（d)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟訊中添加選自如下 的一種或多種菌株的單菌株培養(yǎng)物：大腸桿菌巧schericia coli)、鼠傷寒沙口氏菌 (Salmonella Typhimurium)、腸炎沙 口氏菌（Salmonella enteritidis)、金黃色葡萄球 菌（Staphlyococ州S aureus)、產(chǎn)氣芙膜梭菌（Clostridium perfringens)、糞腸球菌 巧nterococcus faecal is)和 / 或綠賊假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（f)中添加選自如下的一 種或多種菌株的單菌株培養(yǎng)物：梭菌屬，優(yōu)選產(chǎn)氣芙膜梭菌，尤其是產(chǎn)氣芙膜梭菌野生株 PA10/2010 ;腸球菌屬，優(yōu)選糞腸球菌，尤其是糞腸球菌ATCC29212 ;沙口氏菌屬，優(yōu)選鼠傷 寒血清型沙口氏菌Salmonella enterica serovar Typhimurium sp.，尤其是鼠傷寒血 清型沙口氏菌ATCC14028 ;沙口氏菌屬，優(yōu)選腸炎血清型沙口氏菌Salmonella enterica serovar化teritidis sp.，尤其是腸炎血清型沙口氏菌ATCC13076;大腸桿菌，尤其是大腸 桿菌ATCC25922、大腸桿菌D冊(cè)a或者轉(zhuǎn)化有載體pGFPuv的大腸桿菌；葡萄球菌屬，優(yōu)選金 黃色葡萄球菌，尤其是金黃色葡萄球菌野生株P(guān)A10/10643和/或假單胞菌屬，優(yōu)選綠賊假 單胞菌，尤其是綠賊假單胞菌ATCC27853。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞保持在培養(yǎng)基中， 所述培養(yǎng)基含有胎牛血清，優(yōu)選還含有緩沖液、氨基酸和碳水化合物源，尤其是淀粉。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述火雞組織滴蟲(chóng)的異生培養(yǎng)物是 減毒的火雞組織滴蟲(chóng)，優(yōu)選減毒的火雞組織滴蟲(chóng)克隆培養(yǎng)物，尤其是火雞組織滴蟲(chóng)±耳其/ 奧地利 /2922-C6/04(H. meleagridis I\irk巧/Austria/2922-C6/04)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)如下步驟將步驟（f)中添加的 一種或多種單菌株替換為一種或多種其它單菌株： 化）用抗生素或抗生素混合物處理步驟（g)中獲得的火雞組織滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物從 而殺滅步驟（f)中添加的菌株，其中所述抗生素或抗生素混合物特異性殺滅步驟（f)中添 加的一種或多種單菌株， (i) 離也、洗涂并重息火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞， (j) 向重息的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞中添加一種或多種單菌株，W及 化）將一種或多種單菌株和重息的火雞組織滴蟲(chóng)細(xì)胞一起培養(yǎng)W便獲得火雞組織滴蟲(chóng) 的單菌株培養(yǎng)物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（j)中添加選自如下的 一種或多種菌株的單菌株培養(yǎng)物：梭菌屬，優(yōu)選產(chǎn)氣芙膜梭菌，尤其是產(chǎn)氣芙膜梭菌野生 株P(guān)A10/2010 ;腸球菌屬，優(yōu)選糞腸球菌，尤其是糞腸球菌ATCC29212 ;沙口氏菌屬，優(yōu)選 鼠傷寒血清型沙口氏菌，尤其是鼠傷寒血清型沙口氏菌ATCC14028 ;沙口氏菌屬，優(yōu)選腸 炎血清型沙口氏菌，尤其是腸炎血清型沙口氏菌ATCC13076 ;大腸桿菌，尤其是大腸桿菌 ATCC25922 ;葡萄球菌屬，優(yōu)選金黃色葡萄球菌，尤其是金黃色葡萄球菌野生株P(guān)A10/10643 和/或假單胞菌屬，優(yōu)選綠賊假單胞菌，尤其是綠賊假單胞菌ATCC27853。
11. 一種疫苗制劑，其由如下組成： -組織滴蟲(chóng)成分，其由減毒的火雞組織滴蟲(chóng)培養(yǎng)物組成， -細(xì)菌成分，其由一種或多種單菌株組成，W及 -藥學(xué)上可接受的非生物制劑化合物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗制劑，其中組織滴蟲(chóng)成分和細(xì)菌成分是作為火雞組織 滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物而提供的，尤其是作為根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)可獲得的火雞組 織滴蟲(chóng)的單菌株培養(yǎng)物而提供的。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的疫苗制劑，其中細(xì)菌成分含有一種單菌株培養(yǎng)物，優(yōu) 選選自如下的菌株：梭菌屬，優(yōu)選產(chǎn)氣芙膜梭菌，尤其是產(chǎn)氣芙膜梭菌野生株P(guān)A10/2010 ; 腸球菌屬，優(yōu)選糞腸球菌，尤其是糞腸球菌ATCC29212 ;沙口氏菌屬，優(yōu)選鼠傷寒血清型沙 口氏菌，尤其是鼠傷寒血清型沙口氏菌ATCC14028 ;沙口氏菌屬，優(yōu)選腸炎血清型沙口氏 菌，尤其是腸炎血清型沙口氏菌ATCC13076 ;大腸桿菌，尤其是大腸桿菌ATCC25922 ;葡萄球 菌屬，優(yōu)選金黃色葡萄球菌，尤其是金黃色葡萄球菌野生株P(guān)A10/10643和/或假單胞菌屬， 優(yōu)選綠賊假單胞菌，尤其是綠賊假單胞菌ATCC27853。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)所述的疫苗制劑，其中減毒的火雞組織滴蟲(chóng)是減毒 的火雞組織滴蟲(chóng)克隆培養(yǎng)物，尤其是火雞組織滴蟲(chóng)±耳其/奧地利/2922-C6/04。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的疫苗制劑，其中所述制劑用于預(yù)防組織滴蟲(chóng) 病，優(yōu)選在禽，尤其是火雞和雞當(dāng)中，W及在獵禽，尤其是山雞、蹲鷹、珍珠雞和鶴冀當(dāng)中。
【文檔編號(hào)】A61K35/68GK104471054SQ201380035336
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月2日
【發(fā)明者】M·赫斯, P·加納 申請(qǐng)人:維也納獸醫(yī)大學(xué)